Real-Time kvantificering af reaktive iltarter i neutrofiler inficeret med meningitiske Escherichia Coli

Summary

Escherichia coli er den hyppigste årsag til neonatal Gram-negativ bakteriel meningitis. Under bakterieinfektionen spiller reaktive iltarter produceret af neutrofiler en stor bakterierolle. Her introducerer vi en metode til påvisning af de reaktive iltarter i neutrofiler som reaktion på meningitis E. coli.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) er den mest almindelige Gram-negative bakterier forårsager neonatal meningitis. Forekomsten af bakteriæmi og bakteriel penetration gennem blod-hjerne barrieren er uundværlige skridt for udviklingen af E. coli meningitis. Reaktive iltarter (ROS) repræsenterer neutrofilers store bakteriemekanismer for at ødelægge de invaderede patogener. I denne protokol blev den tidsafhængige intracellulære ROS-produktion i neutrofiler inficeret med meningitisk E. coli kvantificeret ved hjælp af fluorescerende ROS-sonder opdaget af en realtids fluorescensmikropladelæser. Denne metode kan også anvendes ved vurderingen af produktionen af ros i pattedyrceller under interaktioner mellem patogen og vært.

Introduction

Neonatal bakteriel meningitis er en almindelig pædiatrisk smitsom sygdom. Escherichia coli (E. coli) med en K1 kapsel er den mest almindelige Gram-negative patogen forårsager neonatal bakteriel meningitis, tegner sig for omkring 80% af den samlede forekomst^1,2,3. På trods af fremskridtene i antimikrobiel kemoterapi og understøttende pleje er bakteriel meningitis stadig en af de mest ødelæggende tilstande med høj sygelighed og^{dødelighed 4}.

Forekomsten af neonatal bakteriel meningitis begynder normalt med bakterielæmi forårsaget af indtræden af patogene bakterier i den perifere cirkulation fra de nyfødtes lokale læsioner efterfulgt af penetration gennem blod-hjerne-barrieren (BBB) i hjernen, hvilket resulterer i betændelse i meninges⁴. Starten af bakteriæmi afhænger af samspillet mellem bakterier og værts immunceller, herunder neutrofiler og makrofager osv. Neutrofiler, som tegner sig for ~ 50-70% af hvide blodlegemer, er den første forsvarslinje mod bakterielle infektioner^5,6. Under invasionen af bakterier rekrutteres de aktiverede neutrofiler til de smitsomme steder og frigiver reaktive iltarter (ROS), herunder superoxidion, hydrogenperoxid, hydroxylradikaler og singlet ilt⁷. ROS gennemgår redoxreaktioner med cellemembranen, nukleinsyremolekyler og proteiner i bakterierne, hvilket resulterer i skade og død af de invaderende bakterier⁸. Mitokondrier er det vigtigste sted for ROS produktion i eukaryote celler, og forskellige oxidaser (f.eks nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (NADPH) oxidase kompleks, lipoxygenase system, protein kinase C og cyclooxygenase system) mægle produktionen af ROS^9,10. Realtidsmålingen af produktionen af ROS, der repræsenterer den primære antimikrobielle mekanisme i neutrofiler, er en nyttig metode til at studere værtsforsvar under bakterieværtsinteraktionen.

I denne protokol blev den tidsafhængige ROS-produktion i neutrofiler inficeret med meningitisk E. coli kvantificeret med en fluorescerende ROS-sonde DHE, opdaget af en realtids fluorescensmikropladelæser. Denne metode kan også anvendes ved vurderingen af produktionen af ros i andre pattedyrceller under interaktionen mellem patogen og vært.

Protocol

Perifert blod fra frivillige, der anvendes i denne forskning, blev godkendt af Institutional Review Board på det første Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).

1. Fremstilling af reagenser og dyrkningsmedium

1. Forbered den røde blodlegemer lysis buffer ved at tilføje 8,29 g NH₄Cl, 1 g KHCO_3,37,2 mg Na₂EDTA i 1 L dobbelt destilleret vand og justere pH til 7,2-7,4. Bakterierne fjernes ved filtrering med 0,22 μm filtre.
2. Forbered forsøgskulturmedium til neutrofiler ved at tilsætte 5% føtalt kvægserum til RPMI 1640 medium og opbevare ved 4 °C. Ekvilibrere til stuetemperatur før brug.
   BEMÆRK: Brug RPMI 1640-mediet uden phenolrød.
3. Fosfatbuffer saltvand (PBS) fremstilles ved tilsætning af 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄,2H₂O og 0,2 g KH₂PO₄ til 1 L dobbeltdestilleret vand i en 1 L glaskolbe. PH-vinduet justeres til 7,2-7,4. Autoklave det i 15 min ved 121 °C.
4. Rifampicinopløsning fremstilles ved opløsning af 0,5 g rifampicinpulver i 10 ml dimethylsulfoxid (DMSO) for at give en 50 mg/mL rifampicinopløsning.
5. Forbered LB agar opløsning ved at tilsætte 10 g NaCl, 10 g tryptone, 5 g gærekstrakt og 15 g agarpulver i 1 L dobbeltdestilleret vand og autoklave blandingen. Petriskålene fyldes til halvdelen af volumenet ved at hælde varm LB agaropløsning indeholdende 100 μg/mL rifampicin. Den afkølede faste plade opbevares ved 4 °C.
6. Forbered hjernehjerte infusion (BHI) bouillon passende for bakteriestammer ved at opløse 37 g BHI pulver i 1 L dobbelt destilleret vand. Juster pH-vinduet til 7,2, og autoklaver det.
7. Fluorescerende probe dihydroethidium (DHE) opløses i DMSO-opløsningsmiddel for at give en opløsning på 10 mM. Bland forsigtigt før brug.
   BEMÆRK: Aliquot bestanden opløsningen straks i lys-bevis hætteglas. Holdbarheden af stamopløsningen er 6 måneder ved -20 °C.

2. Forberedelse af E44 bakterier stamme

BEMÆRK: E44 er en mutant stamme af meningitisk E. coli med rifampicinresistens.

1. Dyp den kryopreserverede E44-koloni med en steril pipettespids, pod E44-stammen på LB-agarpladen, der indeholder 100 μg/mL rifampicin, ved at tegne linjer. Sæt pladen på hovedet i inkubatoren ved 37 °C natten over.
2. En dag før forsøget skal du plukke en E44-koloni fra pladen med en steril pipettespids og lægge den i 5 mL BHI-bouillon indeholdende 100 μg/mL rifampicin i en 50 mL kolbe. Bakteriekulturen inkuberes ved 37 °C med 90 omdrejninger i minuttet i 17 timer i en inkubations shaker.

3. Isolering af neutrofiler fra humant perifert blod

1. Der udtages 5 mL blodprøve fra frivillige intravenøst til vakuumblodopsamlingsrøret, der indeholder EDTA til antikoagulation.
2. Centrifuge de perifere blodprøver ved 500 x g i 5 min. Blodprøverne er opdelt i tre lag ved centrifugering, som fra bund til top er det røde blodlegeme (RBC) lag, det hvide blodlegeme (WBC) lag og plasmalaget, sekventielt.
3. Indsug det hvide blodlegemer lag med en pipet til et nyt rør med 3x RBC lysis buffer. Blend blandingen grundigt og sted ved stuetemperatur i 5 min.
4. Centrifuge røret ved 500 x g i 5 min. Aspirér supernatanten helt og kassér.
   1. Gentag lysis-proceduren med RBC lysis buffer 1-2 gange, indtil bundfaldet bliver hvidt.
5. Vask cellerne ved at genbruge bundfaldet med 2 mL PBS. Derefter centrifuge ved 300 x g i 5 minutter for at lade cellerne slå sig ned til bunden af røret.
6. Neutrofilerne mærkes med CD16-mikroperler ved at genbruge sedimentet med 50 μL forudkølet magnetisk cellesorteringsbuffer. Derefter blandes med 50 μL af humane CD16 mikroperler grundigt. Blandingen inkuberes ved 4 °C i 30 min.
   BEMÆRK: Opløsningerne skal forkøles for at forhindre udjævning af antistoffer på celleoverfladen og ikke-specifik mærkning. De fleste voksne har omkring 4.000 til 10.000 hvide blodlegemer pr mikroliter af blod, blandt hvilke neutrofiler tegner sig for ca 50-70%. Ved skøn er antallet af samlede hvide blodlegemer i 5 mL af humant perifert blod normalt op til 2-5 x 10⁷.
7. Cellerne vaskes ved at tilsætte 2 mL magnetisk cellesorteringsbuffer og centrifuge ved 4 °C, 300 x g i 10 min. Supernatanten kasseres fuldstændigt, og bundfaldet opsættes igen med 500 μL sorteringsbuffer.
8. Saml den magnetiske kolonne og adskillelse hylde. Flyt separatoren til hylden med den magnetiske kolonne, og skyl kolonnen med 3 mL sorteringsbuffer.
9. Slip celleaffjedringen i kolonnen, så de neutrofiler, der er mærket af magnetperlerne, kan fastgøres til den magnetiske kolonne.
10. De celler, der ikke er mærket, vaskes af ved at tilføje 3 mL magnetisk cellesorteringsbuffer 3 gange, så det sikres, at kolonnebeholderen er tom hver gang.
11. Fjern kolonnen fra den magnetiske separator og læg den på et 15 mL rør. Føj 5 mL magnetisk cellesorteringsbuffer til kolonnen. Skub de magnetiske mærkede celler ud ved hjælp af et stempel.
    BEMÆRK: For at forbedre neutrofilernes renhed kan sorteringstrinnene gentages ved hjælp af en ny kolonne.
12. Centrifuge røret ved 300 x g i 5 min, kassér supernatanten helt og genbrug bundfaldet med 1 mL dyrkningsmedium. Bestem cellenummeret med en celletæller, og forbered cellerne til yderligere eksperimenter.

4. Måling af fortjeneste ved salg

1. Centrifuge de isolerede neutrofiler ved 300 x g i 5 min., opsætte udfaldet og justere cellekoncentrationen til 2 x 10⁶/mL med dyrkningsmedium indeholdende 5 μM DHE fluorescenssonde.
2. Neutrofilerne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter for at indlæse DHE-sonden, og celleaffjedringen tildeles derefter til en 96-brønds sort polystyrenmikroplade med 200 μL pr. brønd.
3. Tænd for mikropladelæseren, og åbn detektionssoftwaren. Vælg uigennemsigtig 96-brønde plade format og bestemme læseområdet.
   1. Fluorescensen (Ex/Em = 518/605 nm) indstilles i kinetisk tilstand hvert 5. minut i 60 minutter ved 37 °C. Sørg for at ryste pladen i 3 s før hver læsning.
4. Tag mikropladen ud af inkubatoren, tilsæt den kultiverede E44 (MOI=100) eller phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) (100 ng/mL) til hver brønd, der indeholder forudindlæste neutrofiler med 3 replikater. Brug PMA som et positivt kontrolelement.
5. Placer pladen i mikropladelæseren, og start analysen med det samme.

Representative Results

Ved hjælp af protokollen, der er skitseret i denne artikel, blev neutrofilerne isoleret fra humant perifert blod og fyldt med fluorescenssonde DHE for at opdage ændringerne i ROS-niveauerne som reaktion på E44-infektion. Her leverer vi repræsentative data, der demonstrerer ROS-produktionen fremkaldt af E44-stamme bestemt af en mikropladelæser i realtid. Ved at tilføje E44-stammer ved en MOI på 100 steg ROS-niveauerne øjeblikkeligt og viste en kontinuerlig opadgående tendens med en tidsafhængig måde (figur 1). Ved at tilføje PMA, en velkendt ROS inducer af intracellulær ROS i neutrofiler, observerede vi en S-formet kurve, der præsenterer en flad kurve i den indledende fase efterfulgt af en betydelig stigning fra 20 min til 40 min og endelig toppede ved 60 min (Figur 1).

Figur 1. Tidsafhængig ROS-produktion i neutrofiler inficeret med meningitisk E. coli. Neutrofiler isoleret fra humant perifert blod blev fyldt med DHE-farvestof, en E44-stamme (MOI = 100) blev tilføjet, og den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) blev straks bestemt med en mikropladelæser. Neutrofiler behandlet med PMA (100 ng/mL) blev anvendt som en positiv kontrol. Alle data blev normaliseret til den oprindelige værdi for at opnå den relative DHE-intensitet og præsenteret som middel ± SEM (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Neutrofiler fungerer som den mest rigelige del af hvide blodlegemer i menneskers blodcirkulation. De er vigtige effektorceller i det medfødte menneskelige immunsystem, som bygger den første forsvarslinje mod invasionen af patogener¹¹. Generationen af ROS repræsenterer en af de største bakteriedræbende mekanismer hos neutrofiler efter fagocytose¹¹. Nylige undersøgelser har vist , at en net-lignende struktur udgivet af en neutrofil kaldet neutrofil ekstracellulær fælde (NET) er også involveret i bakterier drab proces^6,11,12.

Det er blevet rapporteret, at ros produceret af neutrofiler forårsaget af stimulering af patogene mikroorganismer hovedsagelig skyldes aktivering af NADPH-oxidase, som består af to membranbindingsunderenheder (gp91^phox og p22^phox) og tre cytosoliske underenheder (p47^phox, p67^phoxog p40^phox)⁵. De opslugte bakterier aktivere en række kinaser inde i neutrofiler, såsom protein kinase C (PKC), protein kinase A (PKA), og mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK), at fosforlat den cytosoliske subunits p47^phox af NADPH oxidase. Så en cytosolic trimer bestående af p47^phox, p67^phox, og p40^phox translokater til membranen til at kombinere med membranen bindende subunit gp91^phox og p22^phox, danner den fulde NADPH oxidase kompleks. Det samlede NADPH-oxidasekompleks overfører NADPH-afledte elektroner til molekylærE O₂, genererer superoxidioner og aktiverer de bakterielle funktioner^13,14,15. Det rapporteres også, at ROS produceret af neutrofiler også kan være forbundet med NET-dannelsen af neutrofiler^16,17. Derfor vil påvisning af ROS-produktion bidrage til den videre undersøgelse af neutrofilers bakteriedræbende mekanisme.

I denne protokol er de neutrofiler, der er isoleret fra perifert blod, forudindlæst med fluorescenssonde DHE og allokeret til en 96-brønd sort polystyren mikroplade. ROS-intensiteten registreres af en mikropladelæser i realtid, efter at meningitisk Escherichia coli er tilføjet.

Det indsamlede blod antikoaguleres ved hjælp af EDTA eller citrat for at undgå aktivering af neutrofiler ved supplement¹⁸. Da neutrofiler er terminalt differentierede og har en kort levetid (ca. 4-8 timer) i det cirkulerende blod, skal isolationstrinnene udføres så hurtigt som muligt efter blodopsamling¹⁹. Mange isolerende reagenser, såsom Ficoll-Hypaque og Percoll, er blevet brugt til at isolere neutrofiler fra perifert blod^11,19,20. I denne protokol isoleres neutrofiler af CD16 mikroperlevalg efter erythrocyt lysis fra det perifere blod. Det giver betydelige forbedringer i hastighed, enkelhed og renhed. For at opnå renere neutrofiler kan der påføres en tæthedsgradient centrifugering før isoleringen med CD16 magnetiske perler.

En række anerkendte lysstofrør sonder, såsom dihydroethidium (DHE), 2', 7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat (H₂DCF-DA) og dihydrorhodamin 123 (DHR), der passerer frit gennem cellemembranen, kan anvendes til bestemmelse af intracellulær ROS ved strømningscytometri, konfokal mikroskopi eller mikropladelæser^21,22,23,24. Ud over påvisning af DHE-fluorescenssonde med mikropladelæser kan flowcytometri og konfokal mikroskopi også anvendes til at påvise ændringer i DHE's fluorescensintensitet på de angivne tidspunkter for måling af produktionen af fortjeneste ved salg i neutrofiler.

Denne protokol giver en lettere måde at opdage ROS produktion i realtid måde og kan bruges i en række forskellige scenarier til at opdage ROS generation i vært pattedyr celler inficeret med patogene mikroorganismer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes	KIRGEN	KG2611
96-well plate	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Autuomated cell counter	Bio-rad	508BR03397
Biological Safety Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion	BD	237500
CD16 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-701
Centrifuge	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Fetal bovine serum	Cellmax	SA211.02
Incubator	Heraeus	Hera Cell
MACS separation buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Thermostatic shaker	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Yeast extract	OXOID	LP0021