Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/62387
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

Summary

בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה בוירוס הפטיטיס B (HBV), ניתן להעריך תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV במקביל לזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T.

Abstract

תאי CD4 T ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של הפטיטיס B כרונית. כאוכלוסיית תאים רב-תכליתית, תאי CD4 T סווגו כתת-קבוצות תפקודיות מובחנות בהתבסס על הציטוקינים שהם מפרישים: לדוגמה, IFN-γ עבור תאי עוזר CD4 T 1, IL-4 ו- IL-13 עבור תאי עוזר CD4 T 2, IL-21 עבור תאי עוזר זקיקי CD4 T, ו- IL-17 עבור תאי עוזר CD4 T 17. ניתוח של נגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD4 T תאים המבוססים על הפרשת ציטוקינים לאחר גירוי פפטידים נגזר HBV יכול לספק מידע לא רק על הגודל של HBV ספציפי CD4 T-cell תגובה, אלא גם על תת קבוצות פונקציונליות של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות חדשניות, כגון ניתוח תמלול ומטבולומיה, יכולות לספק מידע פונקציונלי מפורט יותר על תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות אלה דורשות בדרך כלל בידוד של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV המבוססים על ריבוי ריבוי היסטופלים של היסטו-II, בעוד שכרגע המידע על אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell מוגבל. בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה ב- HBV, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T CD4 ספציפיות ל- HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית באמצעות דגימות תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים מחולי זיהום HBV כרוניים.

Introduction

נכון לעכשיו, ישנן 3 גישות עיקריות לנתח תאי T ספציפיים אנטיגן. הגישה הראשונה מבוססת על האינטראקציה בין קולטן תא ה- T לפפטיד (אפיטופ). תאי T ספציפיים לאנטיגן יכולים להיות מוכתמים ישירות עם ריבוי קומפלקס היסטו-תאימות (MHC) גדול פפטיד. היתרון של שיטה זו הוא שהיא יכולה להשיג תאי T ספציפיים אנטיגן קיימא, מתאים לניתוח תמלול במורד הזרם / מטבולומיה. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על התגובה כולה של תא T אנטיגן מסוים, כפי שהוא דורש פפטידים epitope מאומת בעוד מספר אפיטופים מזוהים עבור אנטיגן מסוים מוגבל לעת עתה. בהשוואה לנגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD8 T-cell epitopes, פחות אפיטופים ספציפיים HBV CD4 T-cell זוהו1,2, מה שהפך שיטה זו פחות ישימה לניתוח של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV כיום.

הגישה השנייה מבוססת על upregulation של סדרה של סמנים המושרה הפעלה לאחר גירוי פפטיד אנטיגן3. הסמנים הנפוצים כוללים CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. שיטה זו שימשה כעת לניתוח תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן אצל אנשים מחוסנים5,6, זיהום וירוס חיסוני אנושיחולים 7, ותסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 חולי זיהום8,9. שלא כמו הבדיקה המבוססת על ריבוי פפטיד-MHC, שיטה זו אינה מוגבלת על ידי אפיטופים מאומתים ויכולה להשיג תאים ברי קיימא לניתוח במורד הזרם. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על פרופיל ציטוקינים של תאי T ספציפי אנטיגן. כמו כן, הביטוי של סמנים אלה המושרה הפעלה על ידי כמה תאים אנטיגן-ספציפיים מופעלים עשוי לתרום אותות הרקע בניתוח, אשר יכול להיות בעיה במיוחד כאשר תאי T אנטיגן ספציפיים היעד הם נדירים. נכון לעכשיו, קיים יישום מוגבל של שיטה זו בתאי CD4 T ספציפיים ל- HBV4. השאלה אם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV באופן אמין זקוקה לחקירה נוספת.

הגישה השלישית מבוססת על הפרשת הציטוקינים לאחר גירוי פפטיד אנטיגן. בדומה לניתוח מבוסס סמן המושרה על-ידי הפעלה, שיטה זו אינה מוגבלת על-ידי אפיטופים מאומתים. שיטה זו יכולה לחשוף ישירות את פרופיל הציטוקינים של תאי T ספציפיים לאנטיגן. הרגישות של שיטה זו נמוכה יותר מאשר השיטה מבוססת סמן המושרה הפעלה כפי שהוא מסתמך על הפרשת ציטוקינים של תאי T ספציפיים אנטיגן ומספר ציטוקינים נבדק מוגבל בדרך כלל. נכון לעכשיו, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב בניתוח של תאי T ספציפיים ל- HBV. כמו ציטוקינים הפרשת תאי T ספציפיים HBV בקושי ניתן לזהות על ידי גירוי פפטיד ex vivo ישיר10,11, פרופיל ציטוקינים של תאי T ספציפיים HBV מנותח בדרך כלל לאחר 10 ימים במבחנה פפטיד מגורההרחבה 12,13,14,15,16. סידור של בריכות פפטיד בצורת מטריצה נוצל כדי להקל על זיהוי של אפיטופים ספציפיים אנטיגן17,18. עם השילוב של מטריצת פפטיד וניתוח הפרשת ציטוקינים, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית16. בפרוטוקול זה, הפרטים של שיטה זו מתוארים. אנטיגן הליבה HBV נבחר כדוגמה של הדגמה בפרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל מטופל שנכלל במחקר. פרוטוקול המחקר תואם את ההנחיות האתיות של הצהרת הלסינקי משנת 1975, כפי שבאו לידי ביטוי באישור מוקדם של ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים סאות'ווסט.

1. עיצוב מטריצת הפפטיד שמקורה ב-HBV

  1. הורד רצפי חומצות אמינו של אנטיגן הליבה HBV ממסדי נתונים NCBI (GenBank: AFY98989.1).
  2. רכישת פפטידים שמקורם באנטיגן ליבה HBV (פאנל של פפטידים 15-mer חופפים על ידי 10 שאריות, טוהר > 90%, 4 מ"ג / פפטיד) מספק שירות סינתזת פפטיד.
  3. הגדר מטריצת פפטיד מרובעת של 6×6 עם כל מיקום במטריצה המכילה פפטיד אחד בלבד. ישנן 12 בריכות פפטיד: 6 בריכות פפטיד בשורה ו-6 בריכות פפטידים, 5-6 פפטידים בכל בריכה16. בריכות הפפטיד בשורה ובריכות הפפטיד בעמודה במטריצה מייצגות 2 תצורות נפרדות של אנטיגן ליבת HBV.
  4. עבור 3/4 של פפטידים שנרכשו, לערבב פפטידים באותה שורה / עמודה של המטריצה לתוך 12 בריכות פפטיד נפרדות על ידי המסת אותם יחד דימתיל סולפוקסיד (DMSO) (2 מיקרוגרם / μL עבור כל פפטיד). יש לאחסן ב- -80 °C לניתוח תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV.
  5. ממיסים את שאר הפפטידים בנפרד (10 מיקרוגרם/מיקרו-לן) ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לזיהוי אפיטופ.

2. בידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs)

  1. דגימה 5 מ"ל של דם ורידים מחולי זיהום HBV כרוניים.
    הערה: נפח הדם צריך להיות מוערך בערך על פי מספר בריכות פפטיד בתוספת 1 בקרת רקע ושליטה חיובית אחת. ניתוח של מאגר פפטיד אחד צריך 3 x 105 מחשבים אישיים. בממוצע, 1 x 106 PBMCs ניתן להשיג מ 1 מ"ל של דם.
  2. בודדו מחשבים אישיים מדם באמצעות צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית בצפיפות פיקול (800 × גרם, 20 דקות) והקפאו מחשבי PBMCs מבודדים בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.
  3. השתמש פיפטה פסטר כדי לאסוף גרנולוציטים בין שכבת פיקול ברורה לשכבת תא הדם האדום. לחלץ DNA גנומי מגרנולוציטים באמצעות ערכת טיהור DNA גנומית על פי פרוטוקול היצרן.
  4. שלח את דגימת הדנ"א לספקי שירותי genotyping כדי לקבוע את הגנוטיפ HLA-DRB1.

3. הרחבה במבחנה של מחשבים אישיים באמצעות מטריצת פפטיד HBV

  1. הפשר מחשבים אישיים.
    1. RPMI חם 1640 בתוספת 1:10,000 בנזונאז (25 U/mL) עד 37 °C (50 °F) באמבט מים.
      הערה: בנזונאז עוזר להגביל את גושי התאים במהלך ההפשרה. כל מדגם ידרוש 20 מ"ל של RPMI 1640 עם בנזונאז. חשב את הסכום הדרוש להפשרת כל הדגימות, והכן aliquot נפרד של מדיה (37 °C) עם 1:10,000 בנזונאז (25 U / mL). להפשיר לא יותר מ-5 דגימות בכל פעם.
    2. הסר דגימות חנקן נוזלי ולהפשיר במהירות בקבוקונים קפואים באמבט מים (37 °C (37 °F).
    3. העבר את השעיית התא המופשרת לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של בנזונאז RPMI 1640 (37 °C) טיפה לצינור. לאט להוסיף 6 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) לצינור הצנטריפוגה, לשטוף cryovial עם עוד 2 מ"ל של RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) כדי לאחזר את כל התאים. המשך עם שאר הדגימות מהר ככל האפשר.
      הערה: דילול איטי של דגימות cryopreserved הוא המפתח כדי לשמור על הכדאיות של תאים מופשרים.
    4. צנטריפוגה (400 × גרם, 10 דקות), להסיר את supernatant, ולשחרר את הכדור על ידי הקשה על הצינור.
    5. בעדינות resuspend הכדור ב 1 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז חם. מערבבים בעדינות ומסננים תאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר במידת הצורך (כלומר, אם קיים גוש גלוי).
    6. Aliquot השעיה 10 μL לדלל מלוחים פוספט של Dulbecco חוצץ (DPBS), להוסיף כחול טריפן (0.04%), לטעון על hemocytometer, לחכות 1 דקה, ולספור את מספר התאים קיימא (תאים ברורים).
    7. הוסף 9 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) לצינור, צנטריפוגה (400 × גרם, 10 דקות), להסיר את supernatant, ולשחרר את הכדור על ידי הקשה על הצינור.
  2. PBMCs resuspend ב RPMI 1640 בתוספת 25 mM HEPES, 2 mM L-גלוטמין, 1 mM נתרן pyruvate, 100 פניצילין U / mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 10% סרום AB אנושי (מדיום תרבות מלאה). התאם את צפיפות התאים ל- 1.5 x 106 תאים/מ"ל. צלחת PBMCs בלוחות 96-באר (תחתון שטוח) בצפיפות של 3 x 105 תאים / טוב.
  3. הוסף בריכות פפטיד נגזר HBV (2 מיקרוגרם / מ"ל עבור כל פפטיד יחיד) לכל באר. עבור בארות של בקרת רקע ושליטה חיובית, הוסף את אותה כמות ממס (DMSO, 1 μL / mL). הוסף 10 U /mL IL-2 ו 10 ננוגרם / מ"ל IL-7. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
  4. ביום 3, תוספת תרבות בינוני עם 50 U/mL של IL-2 ו 10 ננוגרם / מ"ל של IL-7.
    הערה: במהלך היום הראשון עד יום 3, לא תצפה התפשטות ברורה של תאי T. מספר התא הכולל יקטן בדרך כלל ב- 1/3 עד 1/2, עקב מותם של תאים שאינם T כגון תאי B, תאי NK, תאי NKT ומונוציטים.
  5. ביום 7, החליפו חצי מהמדיום התרבותי במדיום טרי המכיל פפטידים (4 מיקרוגרם/מ"ל), IL-2 (100 U/mL) ו-IL-7 (20 ננוגרם/מ"ל).
    הערה: כדי למנוע הפרעה לתאים בתחתית, pipette על 90 μL של תרבות בינוני בזהירות מהחלק העליון של המדיום. במהלך היום 3 עד יום 7, התפשטות תאי T חזקה תיצפה, ותאי T מתרבים בדרך כלל מצטברים כדי ליצור אשכולות.
  6. ביום 10, בעדינות pipette תרבית תאים בכל באר 7-9 פעמים כדי disaggregate אשכולות תאים, לספור את מספר התאים קיימא, ולהעביר2×10 5 תאים בכל באר ללוח 96 באר (תחתית עגולה) עבור ניתוח תגובת תאי T-T ספציפי HBV.
  7. המשך פולחן שאר התאים לזיהוי אפיטופ ביום 12, להתאים את נפח של מדיום תרבית עד 100 μL (השלכת מדיום מוגזם), ותוספת תרבות עם 100 μL של מדיום תרבות מלאה טרי המכיל פפטידים (4 מיקרוגרם / מ"ל), IL-2 (100 U / mL), ו IL-7 (20 ננוגרם / מ"ל).
    הערה: במהלך היום 7 עד יום 10, תאי T ממשיכים להתרבות במרץ. החלף את מדיום התרבות כמו בשלב 3.5 אם המדיום הופך צהוב. באופן כללי, מספר התא יעלה על 6×105 ביום 10. כל באר מציגה בדרך כלל מספר תא דומה, סופרת מספר תא ב- 3 בארות ומשתמשת בערך הממוצע כהערכה של מספר התא עבור כל הבארות.

4. ניתוח תגובות תאי T-T ספציפיים ל- CD4 HBV על ידי ציטומטריית זרימה תאית

  1. מחשבים אישיים מגרה עם בריכות פפטיד
    1. עבור התאים שהועברו ללוח 96 באר (תחתית עגולה), לשטוף 3 פעמים בצלחת (550 × גרם, 3 דקות). השתמש 200 μL של בינוני עבור כל לשטוף (RPMI 1640 עבור 2 שטיפות הראשונות, תרבות מלאה בינונית עבור הכביסה האחרונה). זרוק את אנטנטי העל.
      הערה: הסרת ציטוקינים שיורית בתרבות על ידי כביסה חוזרת עלולה להפחית ביעילות את הרקע בניתוח ציטומטריית זרימה תאית.
    2. עבור כל באר של תאים מגורה עם בריכת פפטיד ספציפית, להוסיף 200 μL של מדיום תרבות מלאה בתוספת אותן בריכות פפטיד (2 מיקרוגרם / מ"ל עבור כל פפטיד יחיד). לקבלת הבאר של בקרת רקע, להוסיף מדיום תרבות מלאה בתוספת 1 μL / mL של DMSO. עבור הבאר של שליטה חיובית, להוסיף מדיום תרבות מלאה בתוספת 1 μL / mL של DMSO, 150 ng / mL של פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA), ו 1 מיקרומול / L של ionomycin.
      הערה: מינון גבוה של DMSO יחסום את הפרשת ציטוקינים של תאי T (המשמעותי ביותר עבור TNF-α). מינון של DMSO גבוה מ 5 μL / mL אינו מומלץ. בדרך כלל, המינון של DMSO בניסוי שלנו אינו עולה על 1 μL / mL.
    3. דגירה ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 6 שעות.
    4. לאחר שעה אחת של דגירה, להוסיף Monensin (1.37 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות.
  2. ציטומטריית זרימה
    1. אחרי 6 שעות של דגירה. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה (550 ×, 3 דקות), לשטוף תאים פעם אחת עם 200 μL של DPBS (550 × גרם, 3 דקות), סמני משטח כתם (CD3, CD4, ו- CD8) וסמן קיימא (באמצעות צבע קיימא תיקון) במקרר 4 °C למשך 30 דקות.
    2. לשטוף פעם אחת עם 200 μL של DPBS (550 × גרם, 3 דקות). לתאים מקובעים ומחלחלים, ולהכתים ציטוקינים תאיים (TNF-α ו-IFN-γ) במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    3. לאחר השטיפה הסופית בהכתמה תאית, תאים resuspend ב 150 μL של חוצץ cytometry זרימה (DPBS + 0.5% BSA).
    4. השג נתוני ציטומטריית זרימה על ציטומטר זרימה.
  3. ניתוח תוצאות ציטומטריית הזרימה
    1. הגדרה של טוב חיובי: שקול גם כמו חיובי אם יש לו תדירות של ציטוקינים הפרשת תאי T לפחות פעמיים של בקרת הרקע היטב (איור 1).
    2. על פי הנוסחה הבאה, חשב את שיעור התגובה עבור כל ציטוקין שנותח (איור 2):
      Equation 1
      הערה: מאגר הפפטיד בשורה ובריכות הפפטיד בעמודה במטריצה מייצגות 2 תצורות נפרדות של אנטיגן ליבה HBV, כך שקצב התגובה הסופי צריך להיות מחולק ב- 2.

5. זיהוי אפיטופים מוגבלים של תאי T HLA-DR HLA-DR

  1. להפשיר ולשמור על קווי תאים לימפובלסטואידים B אלוגניים (BLCLs) בבקבוקון T-75 (5-20 ×106 תאים, 20 מ"ל של מדיום תרבית מלאה).
    הערה: כדי להבטיח את המצב הטוב של BLCLs, שלב זה צריך להיות יזם 2 שבועות לפני הפשרת PBMCs של חולים. BLCLs חייב להיות הומוזיגוס ב אליל HLA-DRB1. על פי התוצאה genotyping, חולים צריכים לחלוק את אותו אלל HLA-DRB1 כמו BLCLs.
  2. הקרנת פפטידים מועמדים לזיהוי (איור 3)
    1. על פי תוצאות שיעור התגובה לתאי T ביום 10, לסנן 2 בריכות פפטיד עם שיעור התגובה הגבוה ביותר (בריכת פפטיד שורה 1 ובריכת פפטיד 1 עמודה).
    2. הגדר את הפפטיד ב 2 בריכות אלה כמו פפטיד מועמד אם מאגר פפטיד האחר המכיל פפטיד זה גם מראה תוצאה חיובית בניתוח תגובת תא T. השתמש PBMCs מורחב עם מאגר פפטיד אחרים לזיהוי epitope מאוחר יותר.
  3. BLCLs פועם עם פפטיד
    1. ביום 12, לספור את מספר BLCLs קיימא, להעביר תאים צינורות צנטריפוגות 15 מ"ל, צנטריפוגה (350 × גרם, 10 דקות) ולהסיר את supernatant. resuspend את גלולה התא במדיום תרבות מלאה, ו aliquot BLCLs לצלחת 96-well (תחתית עגולה) ב 4×104 תאים / גם במדיום תרבות מלאה 80 μL.
    2. הוסף פפטיד יחיד (10 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה ב 37 °C (5% CO2 עבור 2 שעות. הגדר 2 בקרת רקע: פפטיד פועם עם חסימת HLA-DR (טיפול מקדים עם אנטי HLA-DR (10 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 1 שעה); DMSO (1 μL/mL) פועם. הנפח הסופי של מדיום תרבות שלמה בכל באר הוא 100 μL.
    3. הוסף mitomycin C (100 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה ב 37 °C ו 5% CO2 עבור 1 שעה.
    4. לשטוף 3 פעמים עם 200 μL של RPMI 1640 (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת כדי להסיר פפטיד לא פעמו mitomycin C. עבור לשטוף הראשון, להשלים את תרבות הדגירה עם 100 μL של RPMI 1640.
    5. תאים resuspend ב 120 μL של מדיום תרבות מלאה.
  4. PBMCs מגרה עם BLCLs פעום פפטיד.
    1. ביום 12, להעביר PBMCs לצלחת 96 באר (תחתית עגולה).
    2. הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת, לשטוף פעמיים עם 200 μL של RPMI 1640 (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת.
      הערה: הסרת שאריות ציטוקינים ופפטידים בתרבות על ידי כביסה חוזרת היא הצעד העיקרי להקטנת הרקע בניתוח ציטומטריית זרימה תאית. במיוחד עבור פפטידים שיורית, זה יהיה להיקשר BLCLs ולהגדיל באופן משמעותי את הרקע.
    3. מחשבי PBMd resuspend בכל באר עם 210 μL של מדיום תרבות מלאה.
    4. עבור הבאר של PBMCs שנבחרו לזיהוי epitope, לערבב את aliquot (70 μL כל אחד) עם BLCLs פעימה פפטיד (3 בארות, כולל 2 פקדי רקע).
      הערה: ביום 12, מספר בריכות הפפטידים המורחבות PBMCs יגיע בדרך כלל מעל 5-7×105 לבאר, כך היחס של PBMCs / BLCLs הוא על 6/1 עד 4/1.
    5. דגירה ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 6 שעות.
    6. לאחר שעה אחת של דגירה, להוסיף Monensin (1.37 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות. הנפח הסופי של מדיום תרבות שלמה בכל באר הוא 200 μL.
  5. ציטומטריית זרימה
    1. חזור על אותן פעולות כמו בשלב 4.2.
  6. ניתוח תוצאות ציטומטריית הזרימה
    1. אמת פפטיד כאפיטופה מוגבלת של תאי T CD4 מוגבלים של HLA-DR אם מחשבי PBMCs דוגרים עם BLCLs פפטידי זה פעמו להראות תדירות של ציטוקינים מפרישים תאי CD4 T לפחות פעמיים של PBMCs דגירה עם פקדי רקע (פפטיד פועם עם HLA-DR מראש חסימה; DMSO פועם) (איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התדירות של תאי CD4 T מפרישים ציטוקינים מחושבת כסכום של מפיקים בודדים ומפיקים כפולים. כפי שהודגם באיור 1, התדירות של תאי CD4 T4 T מפרישים α ותדירות תאי ה-CD4 T מפרישים Γ IFN בבקרת רקע (DMSO) הם 0.154% ו-0.013% בהתאמה. התדירות של תאי CD4 T4 מפרישים α TNF והתדירות של IFN-γ מפריש תאי CD4 T ספציפיים למאגר פפטיד Core11 הם 0.206 ו- 0.017 בהתאמה, כך שגם TNF-α הפרשת תגובת תאי T של CD4 וגם תגובת תאי T של Γ IFN-γ להפרישת CD4 T-cell עבור מאגר פפטיד זה נחשבים שליליים. התדירות של תאי CD4 T4 T4 מפרישים α והתדירות של תאי CD4 T מפרישים Γ IFN ספציפיים למאגר פפטיד Core09 הם 2.715% ו- 0.973% בהתאמה, כך שגם TNF-α מפריש תגובת תא T-T4 וגם הפרשת Γ תגובת תאי T של CD4 עבור מאגר פפטידים זה נחשבים לחיוביים.

כפי שמדגימים באיור 2, בארות חיוביות מסומנות עם רקע אפור. בעת חישוב HBV ספציפי לליבת TNF-α הפרשת CD4 T-cell קצב התגובה, נתונים של בריכות פפטיד Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09, ו Core10 יש לכלול. בעת חישוב קצב התגובה של תאי T-γ T ספציפיים לליבת HBV, המפשתים CD4 T, נתונים של מאגרי פפטיד Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 ו- Core10 כלולים.

כפי שמדגים באיור 3, פפטידים מועמדים לזיהוי אפיטופ מסומנים באדום. Core01 כולל את שיעור התגובה הגבוה ביותר הן עבור תאי CD4 T מפרישים α TNF והן עבור IFN-γ הפרשת תאי CD4 T במאגרי פפטידים של עמודות. פפטידים C1-15, C31-45, C61-75 ו- C91-105 בבריכת פפטיד זו מוגדרים פפטידים מועמדים כמו בריכות פפטידים שורה המכיל פפטידים אלה גם מראה תוצאות חיוביות בתגובת תא T. מחשבי ה-PBMCs שהורחבו עם בריכות הפפטידים Core07, Core08, Core09 ו-Core10 משמשים לזיהוי אפיטופה של פפטידים C1-15, C31-45, C61-75 ו-C91-105, בהתאמה. Core09 כולל את שיעור התגובה הגבוה ביותר הן עבור תאי CD4 T מפרישים α TNF והן עבור תאי CD4 T מפרישים Γ IFN בבריכות פפטיד שורה. פפטידים C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 ו- C86-100 בבריכת פפטיד זו מוגדרים פפטידים מועמדים כמו בריכות פפטידים עמודה המכיל פפטידים אלה גם מראה תוצאה חיובית תגובת תא T. מחשבי ה-PBMCs שהורחבו עם בריכות הפפטיד Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 ו-Core06 משמשים לזיהוי אפיטופ של פפטידים C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 ו-C86-100, בהתאמה.

כפי שהודגם באיור 4, עבור מאגר פפטיד Core08 מורחב PBMCs, לאחר גירוי עם BLCLs פעמו C31-45 פפטיד, התדירות של TNF-α הפרשת תאי CD4 T ואת התדירות של IFN-γ הפרשת CD4 T תאים הם 0.995% ו 0.131% בהתאמה, אשר גבוהים יותר מפי 2 מאשר פקדי רקע (פפטיד C31-45 BLCLs פעמו עם HLA-DR טרום חסימה, BLCLs פעום DMSO). לכן, פפטיד C31-45 מאומת כמו HLA-DR מוגבל CD4 T-cell epitope. עבור בריכת פפטיד Core10 מורחב PBMCs, לאחר גירוי עם פפטיד C91-105 BLCLs פעמו, התדירות של תאי CD4 T4 מפרישים α TNF והתדירות של תאי CD4 T מפרישים Γ IFN הם 0.221% ו- 0.000% בהתאמה, שאינם עולים על 2 פעמים של פקדי רקע (פפטיד C91-45 BLCLs פעמו עם חסימה מוקדמת של HLA-DR, BLCLs פעמו DMSO), כך פפטיד C91-105 אינו מאומת כמו HLA-DR מוגבל CD4 T-cell epitope.

Figure 1
איור 1: הדגמת ציטומטריה זורמת של TNF-α/IFN-γ הפרשת תאי CD4 T בבריכות פפטידים מורחבות PBMCs לאחר גירוי עם בריכות הפפטיד המתאימות שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדגמת הניתוח הספציפי לליבת HBV TNF-α/IFN-γ מפריש תאי CD4 T. TNF/DMSO ו- IFN-Ƴ/DMSO מציינים את היחסים בין התדרים של תאי CD4 T4 α/IFN-γ מפרישים בכל באר של מאגר פפטיד מגורה PBMCs חלקי התדירות של TNF-α/IFN-γ הפרשת תאי CD4 T בבאר של בקרת DMSO. רקע אפור מציין בארות עם תגובה חיובית של תאי T של CD4 שנשפטו בהשוואה לבקרת רקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדגמת הקרנת פפטידים מועמדים לזיהוי אפיטופה. TNF/DMSO ו- IFN-Ƴ/DMSO מציינים את היחסים בין התדרים של תאי CD4 T4 α/IFN-γ מפרישים בכל באר של מאגר פפטיד מגורה PBMCs חלקי התדירות של TNF-α/IFN-γ הפרשת תאי CD4 T בבאר של בקרת DMSO. רקע אפור מציין בארות עם תגובה חיובית של תאי T של CD4 שנשפטו בהשוואה לבקרת רקע. פפטידים באדום מצביעים על פפטידים מועמדים על פי קריטריוני הסינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הדגמת ציטומטריה זורמת של תוצאות זיהוי אפיטופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה מפורטים באופן הבא: 1) מספיק מחשבי PBMCs בעלי כדאיות גבוהה כדי להתחיל הרחבת מחשבים אישיים; 2) סביבה מתאימה להרחבת מחשבים אישיים; ו -3) הסרה מלאה של שאריות בריכות פפטיד בתרבות PBMCs לפני זיהוי אפיטופ.

כל הניתוח בפרוטוקול זה תלוי בשגשוג החזק של תאי CD4 T. באופן כללי, מספר מחשבי PBMCs לאחר הרחבה של 10 ימים יהיה פי 2-3 מהמספר ההתחלתי. מספר התא והיכולת של מחשבים אישיים הם 2 גורמי מפתח בהרחבת מחשבים אישיים. אם המטרה היא רק לנתח תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV ללא זיהוי אפיטופ, סביר להפחית את מספר ה- PBMCs הראשוני, במיוחד כאשר נפח דגימת הדם מוגבל. בעוד, מניסיוננו, הרחבת PBMCs מוצלחת בקושי ניתן להשיג אם מספר ההתחלה של PBMCs הוא מתחת 1.5×105 תאים / טוב. בעת שימוש במחשבי PBMCs טריים להרחבה, הכדאיות של התא לא תהיה בעיה. בעוד בעת שימוש בקריופ שמורות PBMCs להרחבה, שימור קריופרה והפשרה של מחשבים אישיים צריך להתבצע בזהירות רבה כדי לשמור על הכדאיות של מחשבים אישיים.

בניתוח פונקציונלי של תאי T ספציפיים ל- HBV, IL-12 משמש בדרך כלל בהרחבת PBMCs כדי לשפר את הפונקציה של תאי CD8 T. כמו IL-12 יכול לגרום בידול של תאי CD4 T כלפי תאי עוזר זקיקי CD4 T, ציטוקינים זה יש להימנע בניתוח פונקציונלי של תאי CD4 T ספציפיים HBV. בפרוטוקול שלנו, רק IL-2 (להרחבת תאי T) ו- IL-7 (להישרדות תאי T) מתווספים לשמירה על הפרופיל התפקודי של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV במהלך התרחבות שלמים ככל האפשר. בדקנו 5 ציטוקינים לניתוח פונקציונלי של תאי CD4 T ספציפיים ל-HBV: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 ו-IL-21. בדגימות המנותחות שלנו, TNF-α ו- IFN-γ הם 2 ציטוקינים עיקריים המופרשים על ידי תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV16. בניתוח הפרופיל הפונקציונלי של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV, מומלץ לבדוק כמה שיותר ציטוקינים כדי לקבל את פרטי הפרופיל הפונקציונלי המפורטים. בעוד זיהוי epitope, מומלץ לנתח רק TNF-α ו- IFN-γ, לשיקול כלכלי.

מספיק תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV חיוניים לזיהוי אפיטופ מוצלח, ולכן יש לשקול זיהוי אפיטופ בחולים עם תגובת תאי T HBV ספציפית גבוהה ל- CD4, כגון חולי התלקחות הפטיטיס B (TNF-α תגובה חזקה לתאי T T ספציפיים ל- HBV) וחולים עם סיווג ויראלי (תגובת תאי T T T( תגובה חזקה של תאי T מסוג HBV ספציפי ל- CDN-γ CD4)16 . חשוב מאוד להסיר פפטידים שיורית בבריכת הפפטידים הרחב PBMCs על ידי כביסה חוזרת לפני הדגירה תאים אלה עם BLCLs לזיהוי epitope. שאריות הפפטידים ייקשרו ל- BLCLs עם פעימות DMSO, יפעילו תאי CD4 T ספציפיים לפפטיד, ובכך יגדילו את הרקע במידה רבה.

אנטיגן HBV מסוימים יש רצפים משתנים גנוטיפים HBV שונים (למשל, אנטיגן פני השטח HBV). פתרון הוא לקבוע מראש את הגנוטיפים הספציפיים של HBV בחולים ולתכנן בריכות פפטיד ספציפיות לגנוטיפ HBV עבור חולים עם גנוטיפים שונים של HBV. בעוד הגנוטיפ HBV אינו מדיד בחולים עם עומסים ויראליים HBV נמוכים (למשל, HBeAg חולים שליליים עם טיפול אנטי ויראלי קבוע), בתרחיש זה, הפתרון הוא לערבב פפטידים מגנוטיפים שונים של HBV יחד לאותן בריכות פפטיד, כפי שעשינו במחקר קודם16. החיסרון של אסטרטגיית תערובת זו הוא כי epitope עשוי להיות מזוהה כמו זוג פפטיד אבל לא פפטיד אחד, כמו כמה עמדות במטריצה פפטידים מכילים זוג פפטיד באותו שבר של האנטיגן.

חיסרון מרכזי בשיטה זו הוא הרחבת מחשבים אישיים של 10 ימים הגוזלים זמן רב. נכון לעכשיו, ניתוח ex vivo של הפרשת ציטוקינים לא יכול לזהות תאי CD4 T ספציפיים HBV בצורה אמינה. באמצעות BLCLs אלוגניים פעמו כמו ממריצים בדרך כלל זיהה יותר פפטיד ספציפי CD4 T תאים PBMCs מורחב פפטיד, לעומת פשוט מגרה עם פפטידים16. כדאי לחקור אם שימוש בתאי B אוטולוגיים פעמו פפטיד כתאי מצגת אנטיגן יכול לעזור לזהות באופן אמין תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV ex vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81930061), הקרן למדעי הטבע צ'ונגצ'ינג (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ומפתח סיני
פרויקט מתמחה במחלות זיהומיות (2018ZX10723203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 176 וירוס הפטיטיס B CD4 תגובת תאי T אפיטופ
ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng,… More

Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter