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Immunology and Infection

Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62448

Summary

São descritas técnicas para a geração de uma biblioteca de peptídeos curtos que podem ativar células de mastro através do receptor MRGPRX2. As técnicas associadas são fáceis, baratas e podem ser estendidas a outros receptores celulares.

Abstract

Identificar ligantes específicos para receptores celulares terapeuticamente significativos é crucial para muitas aplicações, incluindo o projeto e o desenvolvimento de novas terapêuticas. O receptor de proteína G-X2 (MRGPRX2) é um receptor importante que regula a ativação de células de mastro e, portanto, direciona a resposta imune geral. Numerosos ligantes para MRGPRX2 foram identificados e incluem peptídeos endógenos como PAMPs, defensinas, LL-37 e outros fragmentos de proteína (ou seja, albumina degradada). A identificação adicional de ligantes específicos MRGPRX2 requer a triagem de um grande número de peptídeos (ou seja, biblioteca de peptídeos); no entanto, as células de mastro são difíceis e caras de manter in vitro e, portanto, não são econômicas de usar para triagem de grandes números de moléculas. O presente artigo demonstra um método para projetar, desenvolver e selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos usando mrGPRX2 expressando células HEK. Esta linha celular é relativamente fácil e barata de manter e pode ser usada para análise in vitro de alto rendimento. Um corante fluorescente Fura-2 sensível ao cálcio para marcar o fluxo de cálcio intracelular após a ativação foi usado para monitorar a ativação. A razão de intensidade de fluorescência de Fura-2 a 510 nm contra comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm foi usada para calcular a concentração de cálcio. A biblioteca de peptídeos utilizada para verificar este sistema foi baseada no endogeno proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12), que é conhecido por ligar MRGPRX2 com alta especificidade e afinidade. Peptídeos subsequentes foram gerados através de truncação de aminoácidos e técnicas de escaneamento de alanina aplicadas ao PAMP-12. O método descrito aqui é simples e barato, mas robusto para a triagem de uma grande biblioteca de compostos para identificar domínios de ligação e outros parâmetros importantes que desempenham um papel importante na ativação do receptor.

Introduction

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As células de mastro são parte integrante do sistema imunológico e desempenham um papel crucial nas respostas imunes inatas e adaptativas. As células de mastro são ativadas principalmente pela ligação de um antígeno à imunoglobulina E (IgE) - Complexo receptor fcεRI, ou pelo receptor de proteína G recentemente descoberto- X2 (MRGPRX2)1. A ativação mrGPRX2 tem sido associada a diversas doenças imunológicas e inflamatórias e, portanto, é importante compreender o mecanismo de ligação do receptor aos seus ligantes2. Para isso, uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos foi desenvolvida e rastreada contra receptores MRGPRX2 que foram superexpressos em células HEK. No estudo, a biblioteca de peptídeos foi construída utilizando-se técnicas simples e versáteis de escaneamento de alanina e truncação de aminoácidos. A varredura alanina envolve a substituição de aminoácidos específicos por um resíduo de alanina. Alanina sendo pequena e neutra, tira o peptídeo das propriedades específicas conferidas pelo resíduo substituído e destaca consecutivamente a significância das respectivas propriedades fisioquímicas do aminoácido nas interações receptoras. Pelo contrário, na truncação de aminoácidos, são projetadas sequências de peptídeos de tal forma que faltam um ou mais resíduos de aminoácidos do terminal N, terminal C, ou ambos. Este conjunto de peptídeos foi utilizado para identificar as sequências de aminoácidos cruciais para a ligação MRGPRX2.

A experiência com linhas de células de mastro humanos (LAD-2) mostrou que essas células são difíceis de cultivar e manter in vitro: um tempo de duplicação de duas semanas, suplementos médios caros e atenção direta necessária durante a passagem3. Esses atributos tornam as células inadequadas para a triagem em larga escala de ligantes potenciais. Aqui, células HEK transfectadas com estalagem expressando receptor MRGPRX2 (HEK-X2) foram usadas para tela da biblioteca de peptídeos1. As células HEK-293 são amplamente utilizadas e estudadas para a expressão heteróloga dos receptores superficiais devido à sua alta eficiência de transfecção, taxa de duplicação mais rápida e a necessidade de suplementos médios não caros para serem cultivados em laboratório4. O protocolo para transfetar a linha celular HEK-293 foi demonstrado e está bem estabelecido5. As células HEK-293 expressando o receptor MRGPRX2 (passagem 13-19) foram ativadas com os peptídeos gerados através de N-truncation, C-truncation, N+C-truncation e alanina scaning1. As células HEK do tipo selvagem (HEK-WT) (passagem 16-21) foram utilizadas como controle. A liberação intracelular de cálcio após a ativação foi monitorada para estudar a ativação baseada em MRGPRX2.

A ativação celular pelo MRGPRX2 é seguida por uma mobilização citosolítica de cálcio. Esta liberação de cálcio intracelular regulada em células de mastro é regulada pela entrada de cálcio operada na loja (SOCE), coordenada pela molécula de interação estromal 1 (STIM1); e é central para a cascata de resposta imune6,7. Vários métodos têm sido utilizados para detectar concentração intracelular de cálcio, incluindo grampos de remendo e corantes fluorescentes8. De todas as técnicas disponíveis, corantes fluorométricos de cálcio em conjugação com várias técnicas de detecção estão sendo amplamente utilizados9. Dois tipos de corantes fluorométricos que ganharam interesses são: corantes de comprimento de onda único como Fluo-4, e corantes complexos de comprimento de onda duplos como Indo -1 e Fura-2. A vantagem que os corantes de comprimento de onda duplo trazem sobre corantes de comprimento de onda único é que os corantes ratiométricos corretos para erros experimentais como carregamento de corante, branqueamento de fotos e foco10,11.

Fura-2 acetoximethyl ester (Fura-2 AM) é uma célula permeada, corante verde-fluorescente cuja excitação muda para um comprimento de onda mais baixo sobre a ligação de cálcio. Experimentalmente, a Fura-2 está animada em 340 e 380 nm, enquanto a emissão é registrada em 510 nm. Após a ligação de cálcio, a intensidade fluorescente a 340 nm aumenta enquanto a de 380 nm diminui, como mostra a Figura 1. Os dados são representados como uma razão de intensidade de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a intensidade após excitação em 380 nm (F380) ou seja, F340/F380. A razão F340/F380 é proporcional ao cálcio intracelular, o valor pode ser calculado pela equação de Grynkiewicz12. Uma vez que o sinal de fluorescência é obtido a partir da excitação do corante em dois comprimentos de onda (340 nm e 380 nm), a razão dos sinais de fluorescência corrige para fatores experimentais como carregamento de corante, vazamento de corante, fotobleaching e densidades celulares.

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Protocol

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1. Projeto e desenvolvimento da biblioteca de peptídeos

  1. Para identificar os ligantes do receptor MRGPRX2 da célula de mastro baseado em um ligante conhecido, ou seja, PAMP-1213, siga os passos abaixo.
    1. Gerar biblioteca de peptídeos truncados truncados truncando os resíduos de aminoácidos n-terminal do ligante, em sucessão, por síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS).
    2. Gerar biblioteca de peptídeos truncados C truncando os resíduos de aminoácidos terminais C do ligante conhecido, sucessivamente, por SPPS.
    3. Com base nos resultados de 1.1.1 e 1.1.2, gerar uma biblioteca de peptídeos truncado N+C utilizando SPPS truncando os resíduos desejados do terminal N e C, respectivamente.
    4. Use a síntese de peptídeos de fase sólida para sintetizar os peptídeos13.
    5. Modifique o terminal N para o grupo acetil (Ac) e o terminal C para o grupo amide.
    6. Caracterize o peptídeo para sua pureza usando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e para a massa usando um espectrofotômetro de massa.
  2. Para estudar a significância de aminoácidos específicos dentro da molécula pamp-12 pai, siga os passos abaixo.
    1. Gere uma biblioteca de peptídeos de varredura alanina substituindo os respectivos resíduos de aminoácidos na molécula de peptídeo por alanina, um de cada vez usando SPPS. Modifique o terminal N para o grupo acetil (Ac) e o terminal C para o grupo amide.
    2. Caracterize o peptídeo para sua pureza usando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e para a massa usando um espectrofotômetro de massa.
      NOTA: Certifique-se de que os peptídeos sintetizados são de alta pureza. Caracterize os peptídeos usando espectroscopia de massa e HPLC.

2. Cultura celular in vitro

  1. Cultura HEK-X2 e células HEK-WT seguindo os passos abaixo.
    1. Prepare o meio cultura suplementando dMEM de alta glicose com 10% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-Glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
    2. Passagem as células na cultura tecidual (TC) trataram frascos de cultura T-75 e crescem em uma incubadora a 37 °C contendo 5% de CO2, até que sejam 75-80% confluentes.
    3. Uma vez 75% confluente, lave as células e adicione 2-3 mL de trippsina por 2 - 3 min. Incubar em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 para desprender as células.
    4. Uma vez que as células se desgrudam, colete as células em trippsina. Adicione 6-9 mL de meio fresco.
    5. Centrifugar as células a 1620 x g por 3-5 min.
    6. Após a centrifugação, descarte o sobrenatante para coletar a pelota. Resuspend as células em um novo meio de cultura. Diluir as células de acordo com a concentração desejada.
      NOTA: As células HEK são células de rápido crescimento e, portanto, otimizam os suplementos médios celulares. As células HEK são células aderentes; passá-los em frascos de cultura tratados com TC para apoiar a adesão.
  2. Prepare uma placa de ensaio 96 para o experimento.
    1. Adicione 200 μL da suspensão celular em cada poço, com uma concentração de 200.000 células/mL, para semear 40.000 células/bem.
    2. Cresça as células por 24 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
      NOTA: Otimize a densidade celular por poço com base no tamanho da placa e no tipo de tensão celular. Conduza o experimento em triplicados em uma placa de poço tc-tratada com TC preto com fundo transparente plano.

3. Ensaio de cálcio fura-2 AM

  1. Prepare o corante seguindo os passos abaixo.
    1. Use corante Fura-2 AM para o experimento.
    2. Prepare o tampão tampão hepes-tyrode (HTB) contendo tampão HEPES de 25 mM, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/mL de glicose, 1 mg/mL de colagem de soro bovino (BSA) e recém-adicionado 1,8 mM CaCl2 em água esterilizada autoclave.
    3. Adicione 50 μL de DMSO em 50 frascos fura-2 AM para preparar a solução de estoque de 1 mM de corante Fura-2 AM. Adicione 1 μL de 1 mM de corante Fura-2 AM por mL de meio fresco para preparar o meio de carregamento de corante com concentração de corante de 1 μM.
    4. Retire a placa de 96 poços da incubadora e descarte o meio. Substitua o meio por um meio de carregamento de tingimento fresco. Adicione 200 μL de meio de carregamento de corante em cada poço. Incubar as células por 30-40 min em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 .
    5. Após 40 minutos de incubação, remova o meio. Lave as células com o tampão HTB. Adicione 100 μL de tampão HTB para leitura de fluorescência. Leve o prato para leitura de fluorescência.
      NOTA: Otimize a concentração de corante no meio de carregamento de corante. Vazamento de corante e fotobleaching são possíveis preocupações associadas ao corante. Adicione o CaCl2 fresco no buffer HTB para evitar a precipitação.

4. Ativação celular e leitura fluorescente

NOTA: Leitor de placa de fluorescência com sistema automatizado de pipetização permite a transferência automática de compostos de uma fonte composta para a placa de ensaio sem tirar a placa do leitor de placas.

  1. Enquanto as células estão sendo incubadas, defina o Leitor de Placas.
    1. A temperatura é de 37 °C.
    2. Em Configurações, selecione Flex.
    3. Defina o modo de leitura para fluorescência e leitura inferior.
    4. Em Comprimentos de Onda, defina o número de comprimentos de onda para 2. Defina a Excitação para 340 nm e 380 nm. Defina a emissão para 510 nm.
    5. Deixe a sensibilidade ao padrão.
    6. Em Tempo, defina o intervalo para 3,9 s. Defina o Tempo de Execução para 94 s para obter 25 leituras.
    7. Em seguida, selecione o tipo de placa de ensaio.
    8. Em seguida, selecione os Poços para Ler.
    9. Em Transferência composta,defina transferências para 1 e volume inicial para 100 μL. Ajuste a altura da pipeta para 100 μL, volume de 50 μL e Ponto de Tempo para 36 s, para adicionar o composto na 10ª leitura.
    10. Em seguida, selecione o tipo de placa de origem composta.
    11. Deixe triturate para não utilizado.
    12. Selecione as dicas no Layout de Dicas de Pipeta.
    13. Para colunas compostos e pontas,certifique-se de que os compostos a serem transferidos estejam na coluna 1 da placa composta. Defina a Coluna de Ponta para 1 e Coluna composta para 1.
    14. Deixe o Autocalibrate como ON.
    15. Clique em OK.
  2. Quando a temperatura atingir 37 °C, carregue as placas no Leitor de Placas.
    1. Pressione a Câmara de Leitura para colocar a placa de ensaio no leitor de placasde fluorescência .
    2. Pressione a Fonte para colocar a placa composta. Prepare a Placa Composta adicionando 200 μL de peptídeos respectivos, ionomicina e etileno glycol-bis (β-aminoetil ether)-N,N',N′,N′-tetraacético (EGTA)-Triton X-100.
    3. Pressione o rack de ponta para colocar a caixa de ponta. Use uma ponta preta para evitar a autofluorescência da ponta.
    4. Uma vez que as placas estejam carregadas, revise as configurações do software e pressione Read.

5. Análise de dados

  1. Determine a concentração de cálcio da razão de fluorescência pela equação de Grynkiewicz -
    Equation 1
    onde, Kd é a constante de dissociação de Fura-2 AM, R é a razão de emissão após excitação em 340 nm e 380 nm (F340/F380) para os respectivos peptídeos, Rmax é a relação máxima de fluorescência observada pela adição de 50 μL de 30 μM ionomicina, Rmin é a fluorescência mínima observada pela adição de 50 μL de 100 mM EGTA/2,5%Tritão X-100, e F380min e F380max são a intensidade absoluta de fluorescência de Fura-2 AM em estado livre de cálcio e vinculado, respectivamente.
    NOTA: A máquina dispensa o líquido com alguma força. Não ajuste a altura de distribuição de peptídeo muito perto da parte inferior da placa; pode desprender as células. Use pontas de pipeta pretas para evitar autofluorescência. Leia a fluorescência máxima e a fluorescência mínima para cada placa para cada experimento.

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Representative Results

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A tabela 1 contém as sequências de peptídeos geradas através da truncação de aminoácidos terminais e da varredura alanina. Como mostrado na Tabela 1,a sequência de peptídeos RKKWNKWALSR carece de fenilalanina n-terminal (F) em relação ao seu pamp-12 pai e, portanto, é um peptídeo representativo na biblioteca N-truncada. Da mesma forma, em FRKKWNKWALS, a serina terminal PAMP-12 foi removida, representando uma biblioteca de peptídeos truncado c derivado do PAMP-12. Na biblioteca de peptídeos truncados N+C, aminoácidos do terminal N e C são removidos. A truncação de 4 aminoácidos do terminal N e 1 resíduo do terminal C de PAMP-12 resulta em WNKWALS. A biblioteca de peptídeos derivada da alanina tem um aminoácido substituído por alanina, como com ARKKWNKWALSR, onde a fenilalanina n-terminal é substituída por alanina. O corante FURA-2 AM foi utilizado para estudar o potencial de ativação dos peptídeos contra as células HEK transfectadas MRGPRX21. Os dados foram registrados em um leitor de placas de fluorescência. Se o ligante de peptídeo ativou a célula, a fluorescência bombeada a 340 nm (F340) aumenta, enquanto o mesmo diminui para comprimento de onda de 380 nm (F380)(Figura 1a). Para um peptídeo em branco (ou para esse assunto não ativando peptídeo ou controle HEK-WT) no entanto, o aumento e a diminuição relativos seriam respectivamente baixos, como mostrado na Figura 2a. A concentração de cálcio é, no entanto, representada pela razão F340/F380, conforme mostrado na Figura 1b,2b. A razão F340/F380 pode ser substituída na equação de Grynkiewicz para obter a concentração de cálcio usando calibrações in situ(Figura 3). Os peptídeos listados na Tabela 1 foram caracterizados pela espectroscopia de massa (Figura 4a) e HPLC (Figura 4b) e encontrados como de alta pureza.

Técnica de Peptídeo Representante Peptídeo
Peptídeo dos pais Ac-FRKKWNKWALSR-Amide
N-Truncation Ac-RKKWNKWALSR-Amide
C-Truncation Ac-FRKKWNKWALS-Amide
N+C-Truncation Ac-WNKWALS-Amide
Alanine Scanning Ac-ARKKWNKWALSR-Amide

Tabela 1: Sequências representativas de peptídeos geradas após N, C e N+C - truncação e escaneamento de alanina. O terminal N dos peptídeos foi modificado por acetil, enquanto o Terminal C continha um grupo de amide.

Figure 1
Figura 1: Dados representativos para um peptídeo ativador. (a) A fluorescência sinaliza para um peptídeo ativador. Os dados representados correspondem ao PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Peptídeo foi adicionado após gerar uma linha de base para 10 ciclos de leitura (36 s), como mostrado pela seta. (b) A razão da emissão de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nm (F380) (F340/F380). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Dados representativos para o espaço em branco. aOs sinais de fluorescência para o Blank. O HTB foi adicionado após a geração de uma linha de base para 10 ciclos de leitura (36 s), como mostrado pela seta. (b) A razão da emissão de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nm (F380) (F340/F380). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Dados representativos para as normas de calibração de corantes. (a) A ionomicina foi adicionada em 10leituras, como mostrado pela seta, para obter fluorescência máxima em ca+2 estado vinculado. EGTA-Triton X-100 foi adicionado após 20 leituras, como mostrado pela seta, para obter um sinal mínimo. (b) A razão da emissão de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nm (F380) (F340/F380). Esses valores são ainda colocados na equação de Grynkiewicz para obter a concentração intracelular de cálcio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Caracterização de um peptídeo representativo para confirmar a sequência e a pureza. (a) A massa teórica da sequência de peptídeos representativo WNKWAL foi de 857,90 Da, o que foi mostrado pela razão m/z na espectroscopia de massa. bA pureza do peptídeo de 99% confirmada pelo HPLC. Este peptídeo pertence à biblioteca de peptídeos truncados N+C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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A sinalização de cálcio é central para a degranulação de células de mastro e tem sido amplamente utilizada no estudo de interações receptor-ligantes, identificação de ligantes e descoberta de medicamentos14. MRGPRX2 é um receptor de células de mastro recentemente descoberto que tem sido encontrado para desempenhar um papel fundamental em muitas doenças inflamatórias como coceira, asma e dermatite atópica, entre outras2. Além disso, vários medicamentos aprovados têm sido mostrados para obter uma resposta inflamatória através do receptor MRGPRX215. É, portanto, imperativo estudar a interação ligante-receptor, identificar novos ligantes e entender o mecanismo de ativação. Este estudo mostra o uso de técnicas comuns de peptídeo na concepção de uma biblioteca de peptídeos(Tabela 1) e no estudo da ativação da célula de mastro baseada em MRGPRX2. A mobilização subjacente ao cálcio foi empregada como indicador de ativação de células de mastro.

Fura-2 é um corante sensível ao cálcio usado para medir a concentração de cálcio intracelular. A variante do ér de acetoximilotila (Fura-2 AM) aumenta a permeabilidade da membrana celular produzindo um método fácil para quantificar as liberações citoplasmáticas de cálcio. O corante tem sido frequentemente utilizado com várias técnicas de caracterização, como citômetro de fluxo, microscopia e fluoriímetros9,16,17. Embora amplamente utilizados, existem desafios associados ao corante, que precisam ser enfrentados antes que estes possam ser eficientemente empregados. A ligação intracelular de cálcio depende da desestreza do corante, que é em grande parte dependente das condições de carregamento de corante, sistema celular e cultura celular. A desesterificação parcial resulta em sinais inadequados de fluorescência. Além disso, a desemorificação incompleta também resulta na localização do corante nas organelas celulares, resultando em dados imprecisos. O vazamento de corante deseparandido da célula é outro problema enfrentado com a Fura-210,11.

Além do carregamento de corante, o uso da técnica de detecção também desempenha um papel importante. A incapacidade dos citómetros de fluxo para operar com lasers UV torna-os desfavoráveis para o corante9. Da mesma forma, as técnicas de imagem fluorescente requerem treinamento avançado na operação do microscópio. A natureza transitória da liberação de cálcio após a ativação do ligante requer uma resposta rápida na mudança nos comprimentos de onda e, portanto, uma velocidade mais rápida do obturador do microscópio. Além disso, o uso de câmaras especializadas de imagem celular, uso de tampas e foco constante de imagem torna-se uma técnica complicada para triagem em larga escala16.

Foi investido um tempo significativo na otimização do método. Fluorômetro à base de cuvette, em que as células após a separação do frasco de cultura, foram incubadas com o meio carregado de corante no escuro e, em seguida, foram lavadas e resuspended no tampão de HTB para o estudo. As células suspensas no tampão HTB foram tomadas em uma cuvette e foram lidas usando um fluorômetro baseado em fotomultiplier. Os sistemas de detecção só podiam conter poucos (2-4) cuvetas de cada vez e, portanto, não eram adequados para a triagem em larga escala de peptídeos. Além disso, as células HEK sendo células aderentes, a leitura de suspensão celular mostrou grandes variações dentro de repetições individuais dentro de um experimento. Consequentemente, foi utilizada técnica de imagem fluorescente, que novamente provou ser tediosa e lenta. A exigência de um microscópio avançado com capacidade rápida de mudança de comprimento de onda, câmaras celulares específicas de microscópio e excelentes habilidades de imagem impediram o estudo. Além disso, a simulação de peptídeo in situ foi extensa e resultou na perda de dados importantes. A técnica de processamento celular ineficiente resultou em flutuações celulares durante as leituras, o que dificultou o foco e deu resultados inconsistentes.

Um sistema de leitor de placas de fluorescência com um sistema automatizado de pipetting que pode dispensar compostos durante experimentos foi usado para o estudo. O fato de que muitas amostras são lidas em rápida sucessão em uma placa de 96 poços é um benefício adicional desta técnica. Os resultados mostraram que as leituras foram mais consistentes quando as células foram anexadas em comparação com a suspensão. A contagem celular de 40.000 células/poço em uma placa de 96 bem tratada por TC cultivada por um dia deu os melhores resultados. Um tempo de incubação de corantes de 30-40 min a 37 °C incubadora foi ótimo. No entanto, quando os experimentos foram feitos com repetições experimentais, foram observadas variações nos poços correspondentes de diferentes colunas. Para superar isso, foi utilizado um controle positivo (PAMP-12) e um controle negativo (Em branco) para cada coluna da placa. Isso deu dados mais consistentes e reprodutíveis. O método descrito aqui é um método fácil e versátil, que pode ser eficientemente empregado para rastreamento em larga escala à base de cálcio. No entanto, existem vários fatores que determinam a qualidade dos dados e, portanto, o método precisa ser otimizado para um determinado sistema de instrumentos celulares.

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Disclosures

Os autores declaram que não há interesses concorrentes.

Acknowledgments

A SR e a LDU gostariam de reconhecer a concessão do Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC e NSERC-Discovery para este projeto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich 5470
Calcium Chloride Sigma Aldrich 793939
Corning 96 Well Sigma Aldrich CLS3603
Black Polystyrene Microplate Sigma Aldrich CLS3603
DMEM Thermo Fischer 11995065 High Glucose
DMSO Thermo Fischer D12345 Sterile, biological grade
EGTA Sigma Aldrich E3889
Fetal Bovine Serum Thermo Fischer 12483-020
Flexstation 3 Molecular devices FV06060
Fura-2 AM Thermo Fischer F1221
Glucose Sigma Aldrich D8270
HEPES buffer Thermo Fischer 15630-080
Ionomycin Sigma Aldrich I9657
L Glutamine Thermo Fischer 25030-081
Pen Strep Thermo Fischer 15140122
Peptides RS Syntehsis Custom ≥95% pure;
N terminal - acetyl group
C terminal - amide group
Potassium Chloride Sigma Aldrich 12636
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9888
TritonX-100 DOW Chemical 166704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519, (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138, (3), 700-710 (2016).
  3. Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
  4. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, (3), 187-200 (2005).
  5. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
  6. Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
  7. Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9, (1), 81-88 (2008).
  8. Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355, (6358), 353-356 (1992).
  9. Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10, (4), 0122527 (2015).
  10. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11, (2-3), 63-73 (1990).
  11. Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105, (5), 2145-2155 (1987).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260, (6), 3440-3450 (1985).
  13. Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10, (7), 6107-6117 (2018).
  14. Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13, (5), 529-536 (2017).
  15. Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8, (1), 11628 (2018).
  16. Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. 163-172 (2019).
  17. Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269, (3), 212-220 (2018).
Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas
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Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).More

Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).

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