Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ملاقط بصرية لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين في تنظيم الترجمة

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62589
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

يقدم هذا البروتوكول سير عمل تجريبي كامل لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الملاقط البصرية. يتم تحديد العديد من الاجهزة التجريبية المحتملة بما في ذلك الجمع بين الملاقط البصرية مع المجهر confocal.

Abstract

يعتمد الجيش الملكي النيبالي طيات هيكلية متنوعة ، والتي تعتبر ضرورية لوظائفه وبالتالي يمكن أن تؤثر على العمليات المتنوعة في الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل بنية ووظيفة الحمض النووي الريبي من خلال عوامل مختلفة عابرة للمفعول ، مثل البروتينات أو الأيض أو الحمض النووي الريبي الآخر. فجزيئات الحمض النووي الريبي المتحولة الإطارية، على سبيل المثال، هي RNAs تنظيمية تقع في مناطق الترميز، والتي تترجم الريبوسومات مباشرة إلى إطار قراءة مفتوح بديل، وبالتالي تعمل كمفاتيح جين. كما أنها قد تعتمد طيات مختلفة بعد ربط البروتينات أو غيرها من العوامل العابرة. لتشريح دور البروتينات الملزمة للجيش الملكي النيبالي في الترجمة وكيفية تعديل هيكل واستقرار الحمض النووي الريبي ، من الأهمية بمكان دراسة التفاعل والسمات الميكانيكية لهذه المجمعات بروتين الحمض النووي الريبي في وقت واحد. يوضح هذا العمل كيفية استخدام ملاقط بصرية مقترنة بجزيء واحد لاستكشاف المناظر الطبيعية التوافقية والديناميكية الحرارية لمجمعات بروتين الحمض النووي الريبي بدقة عالية. وكمثال على ذلك، يتم تفصيل تفاعل عنصر نقل الإطارات الريبوسومية المبرمجة سارس-CoV-2 مع العامل العابر للمفعول القصير isoform من البروتين المضاد للفيروسات بإصبع الزنك. وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد الريبوسومات ذات العلامات الفلورية باستخدام الوحدة الكونفوكوكال، التي ستمكن في نهاية المطاف من دراسة استطالة الترجمة. يمكن تطبيق المقايسة الفلورية المقترنة OT على نطاق واسع لاستكشاف مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي المتنوعة أو العوامل العابرة للمفعول التي تنظم الترجمة ويمكن أن تسهل دراسات تنظيم الجينات القائم على الحمض النووي الريبي.

Introduction

نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي إلى البروتينات من خلال الحمض النووي الريبي هو عملية كيميائية حيوية معقدة، والتي يتم تنظيمها بدقة على جميع المستويات من خلال التفاعلات الجزيئية الكلية داخل الخلايا. للتنظيم الترجمي، تمنح التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين دورا حاسما للتفاعل بسرعة مع مختلف المحفزات والإشارات1,2. تؤثر بعض التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين على استقرار الحمض النووي الريبي وبالتالي تغير الوقت الذي يكون فيه الحمض النووي الريبي نشطا بشكل ترجمي. وترتبط التفاعلات الأخرى بين الحمض النووي الريبي والبروتين بآليات إعادة ترميز مثل إعادة معاينة وقف كودون، أو تجاوز، أو برمجة الريبوسومات frameshifting (PRF)3،4،5،6،7. في الآونة الأخيرة، تم إثبات عدد من البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs) للتفاعل مع عناصر مرنا التحفيزية وآلية الترجمة لإملاء متى وكم إعادة ترميز سيحدث في الخلية7،8،9،10،11. وهكذا، لتشريح دور البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي في الترجمة وكيف تعدل هيكل الجيش الملكي النيبالي والاستقرار، فمن المحوري لدراسة مبادئ التفاعل والخصائص الميكانيكية لهذه المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين بالتفصيل.

وقد أرست عقود من العمل الأساس لدراسة عملية الترجمة متعددة الخطوات والمتعددة المكونات، والتي تعتمد على التواصل المعقد بين الحمض النووي الريبي ومكونات البروتين في آلية الترجمة لتحقيق السرعة والدقة12,13,14. وتتمثل الخطوة الحاسمة التالية في فهم الأحداث التنظيمية المعقدة في تحديد القوى والجداول الزمنية والمحددات الهيكلية أثناء الترجمة بدقة عالية12,15,16,17. وقد تم تسليط الضوء على دراسة الديناميات تشكيل الحمض النووي الريبي وخاصة كيف تعمل العوامل المساعدة عبر المفعول على هيكل الجيش الملكي النيبالي أثناء الترجمة من خلال ظهور أدوات جزيء واحد، بما في ذلك ملاقط بصرية أو أدلة موجة وضع الصفر16،17،18،19،20،21،22،23،24 25,26

تمثل الملاقط البصرية (OT) تقنية جزيء واحد دقيقة للغاية ، والتي تم تطبيقها لدراسة أنواع عديدة من العمليات الديناميكية المعتمدة على الحمض النووي الريبي بما في ذلك النسخ والترجمة26،27،28،29،30،31،32. وقد سمح استخدام الملاقط البصرية التحقيق في التفاعلات الجزيئية، وهياكل الحمض النووي، والخصائص الحرارية، والحركية، وحيوية من هذه العمليات بالتفصيل16،17،22،33،34،35،36،37،38،39 . ويستند المقايسة ملاقط البصرية على الفخ من الأجسام المجهرية مع شعاع ليزر مركزة. في تجربة OT النموذجية ، يرتبط جزيء الاهتمام بين حبتين شفافتين (عادة البوليسترين) (الشكل 1A)27. ثم يتم القبض على هذه الخرز من قبل الفخاخ البصرية، والتي تتصرف مثل الينابيع. وهكذا، يمكن حساب القوة المطبقة على الجزيء على أساس إزاحة الخرزة من مركز شعاع الليزر المركز (مركز الفخ). في الآونة الأخيرة، تم الجمع بين الملاقط البصرية مع المجهر الكونفوج (الشكل 1B)، مما مكن من الفلورسينس أو Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) القياسات40،41،42. وهذا يفتح مجالا جديدا كليا للتجارب الممكنة التي تسمح بالقياس المتزامن، وبالتالي الارتباط الدقيق لبيانات التحليل الطيفي للقوة والفلورسينس.

هنا، ونحن نظهر التجارب باستخدام ملاقط بصرية جنبا إلى جنب مع المجهر confocal لدراسة التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي تنظيم تحويل الإطارات المترجمة. بين الهدف والمكثف، خلية تدفق مع خمس قنوات تمكن التطبيق عينة مستمرة مع تدفق صفح. من خلال قنوات microfluidic ، يمكن حقن مكونات مختلفة مباشرة ، مما يقلل من الوقت العملي بالإضافة إلى السماح باستهلاك عينة قليلة جدا طوال التجربة.

أولا ، يقترح مبدأ توجيهي أساسي للمساعدة في تصميم تجارب OT ويتم مناقشة مزايا وكذلك مزالق الأجهزة المختلفة. بعد ذلك، يتم وصف إعداد العينات وسير العمل التجريبي، ويتم توفير بروتوكول لتحليل البيانات. لتمثيل مثال على ذلك، نوضح النتائج التي تم الحصول عليها من تجارب تمديد الحمض النووي الريبي لدراسة عنصر الحمض النووي الريبي المتحول من سارس-CoV-2 (الشكل 2A) مع عامل المفعول العابر للنمط القصير من البروتين المضاد للفيروسات بأصابع الزنك (ZAP)، والذي يغير ترجمة الحمض النووي الريبي الفيروسي من إطار قراءة بديل43. بالإضافة إلى ذلك، فإنه ثبت أن الريبوسومات ذات العلامات الفلورية يمكن استخدامها في هذا الفحص الكونفوجال OT، والتي من شأنها أن تكون مفيدة لرصد عملية وسرعة آلات الترجمة. يمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا لاختبار تأثير المخازن المؤقتة المختلفة أو الليجاند أو المكونات الخلوية الأخرى بسرعة لدراسة جوانب مختلفة من الترجمة. وأخيرا، تتم مناقشة المزالق التجريبية الشائعة وكيفية استكشافها وإصلاحها. فيما يلي بعض النقاط الحاسمة في التصميم التجريبي موضحة.

تصميم البناء
من حيث المبدأ ، هناك نهجان مشتركان لإنشاء بناء الحمض النووي الريبي المتوافق مع OT. يستخدم النهج الأول جزيء الحمض النووي الريبي الطويل الذي يتم تهجينه مع مقابض الحمض النووي التكميلية ، مما يؤدي إلى بناء يتكون من منطقتين هجينتين من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي يحيطان بتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي التقطعت به السبل في الوسط (الشكل 2B). ويستخدم هذا النهج في معظم التجارب OT الجيش الملكي النيبالي33,44,45.

النهج الثاني يستفيد من مقابض dsDNA مع قصيرة (حوالي 20 NT) يتدلى15,17. ثم يتم تهجين هذه المعلقات مع جزيء الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن أكثر تعقيدا في التصميم، واستخدام مقابض dsDNA يتغلب على بعض القيود المفروضة على الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي الهجين النظام. من حيث المبدأ ، حتى مقابض طويلة جدا (>10kb) يمكن تنفيذها ، وهو أكثر ملاءمة لقياسات confocal. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ربط جزيء الحمض النووي الريبي بمقابض الحمض النووي لزيادة استقرار الحبل.

استراتيجية وضع العلامات النهائية
يجب ربط البناء بالخرز عن طريق تفاعل جزيئي قوي. في حين أن هناك نهج متاحة للترابط التكافؤي للمقابض إلى الخرز46 ، فإن التفاعلات القوية ولكن غير التكافؤية مثل streptavidin-biotin و digoxigenin-antibody تستخدم عادة في تجارب OT15،33،35،45. في البروتوكول الموصوف ، يتم تسمية البناء بالبيوتين أو الديجوكسيجينين ، والخرز مغلف بالستريبتافيدين أو الأجسام المضادة ضد الديجوكسيجينين ، على التوالي (الشكل 1A). وسيكون هذا النهج مناسبا لتطبيق القوات التي تصل إلى حوالي 60 pN (لكل حبل)47. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مختلف استراتيجيات وضع العلامات 5 و 3 'تسمح بتحديد اتجاه الحبل شكلت بين الخرز17.

وضع العلامات على البروتين لقياسات الفلورسينس
للتصوير الكونفوكوكال، هناك العديد من النهج الشائعة الاستخدام لعلامات الفلورسينس. على سبيل المثال، يمكن ربط الفلوروفوريس بشكل مشترك ببقايا الأحماض الأمينية الموجودة أصلا في البروتينات أو التي يتم إدخالها عن طريق تكوين الطفرات الموجه من الموقع من خلال مجموعة عضوية تفاعلية. يمكن استخدام الأصباغ الثيول أو أمين التفاعلية لتسمية بقايا السيستين واليسين، على التوالي. هناك العديد من طرق الحماية القابلة للعكس لزيادة خصوصية وضع العلامات48,49 ، ولكن عادة ما يتم تصنيف البروتينات الأصلية على بقايا متعددة. على الرغم من أن صغر حجم الفلوروفور قد يمنح ميزة، إلا أن وضع العلامات غير المحددة قد يتعارض مع نشاط البروتين وبالتالي قد تختلف كثافة الإشارة49. أيضا، اعتمادا على كثافة إشارة كفاءة وضع العلامات قد تختلف بين التجارب المختلفة. لذلك، يجب إجراء فحص نشاط قبل التجربة.

في حالة أن البروتين من الفائدة يحتوي على علامة N- أو C-المحطة الطرفية، مثل له العلامة أو بكتيريا العلامة، وسم محددة من هذه العلامات يمثل نهجا آخر شعبية. وعلاوة على ذلك، فإن وضع العلامات المستهدفة يقلل من فرصة تدخل الفلوروفور في نشاط البروتين ويمكن أن يعزز قابلية الذوبان49. ومع ذلك، فإن وضع العلامات الخاصة بالعلامة عادة ما ينتج بروتينات أحادية الفلوروفورية، والتي قد يكون من الصعب اكتشافها. ويمكن تحقيق طريقة أخرى للوسم محددة من خلال استخدام الأجسام المضادة.

إعداد الموائع الدقيقة
مزيج من OT مع نظام microfluidics يسمح الانتقال السريع بين الظروف التجريبية المختلفة. وعلاوة على ذلك، تستفيد الأنظمة الحالية من الحفاظ على تدفق صفح داخل خلية التدفق، مما يحول دون خلط السوائل من قنوات أخرى في الاتجاه العامودي بالنسبة لاتجاه التدفق. لذلك ، فإن تدفق صفح مفيد بشكل خاص للتصميم التجريبي. حاليا، يتم استخدام خلايا التدفق مع ما يصل إلى 5 قنوات عادة (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد العينة

  1. استنساخ تسلسل الاهتمام في المتجه الذي يحتوي على شظايا الحمض النووي لامبدا، والتي هي بمثابة تسلسل مقبض (الشكل 2)43،50.
  2. أولا توليد قالب الحمض النووي للنسخ اللاحق في المختبر عن طريق PCR (الشكل 2B؛ رد الفعل 1). في هذه الخطوة PCR، تتم إضافة المروج T7 في نهاية 5 'من جزيء الحمض النووي الشعور32،33،43،50. تعيين رد فعل PCR وفقا للجدول 1. تشغيل PCR في 50 μL aliquots مع دورات مناسبة في thermocycler.
  3. إعداد المقابض بواسطة اثنين من ردود الفعل PCR منفصلة (الجدول 1، الشكل 2B؛ رد الفعل 2 و 3). أولا، قم بإنشاء مقبض 5 'بواسطة PCR. ثم، وتوليد مقبض 3 'وتسمية في وقت واحد مع digoxigenin باستخدام 5 'digoxigenin المسمى التمهيدي32،33،43،50.
  4. بعد PCR، تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تدور السيليكا.
  5. تنفيذ رد فعل النسخ في المختبر باستخدام T7 RNA بوليمراز (الجدول 2)32,33,43,50. احتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة اعتمادا على طول الحمض النووي الريبي. بعد ذلك، أضف DNase I إلى التفاعل واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم قالب الحمض النووي. تنقية الجيش الملكي النيبالي باستخدام أعمدة تدور السيليكا.
  6. خلال رد فعل وضع العلامات من مقبض 5 '(الجدول 3)، إضافة البيوتين-16-dUTP في نهاية 3 'من المقبض بواسطة T4 الحمض النووي بوليمراسي38،50. أداء رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. بعد ذلك، تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تدور السيليكا.
    ملاحظة: منذ يجب أن يكون المسمى مؤشر 5 'في نهاية 3 '(الشكل 2B) ، لا يمكن إجراء وضع العلامات أثناء PCR.
  7. مزيج المكونات المذكورة أعلاه - 5' مقبض (3'المسمى مع البيوتين)، 3' مقبض (5' المسمى مع ديغوكسيجينين)، والجيش الملكي النيبالي - في نسبة الضرس 1:1:1 في العازلة التمام (80٪ فورماميد، 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, pH 8), للحصول على الهجين الحمض النووي الريبي / الحمض النووي المطلوب (الجدول 4). سخني خليط اللحاء حتى 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم ابردي ببطء إلى 4 درجات مئوية.
  8. اخلط العينة المهزجة مع 1/10 من حجم خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5)، 3 مجلدات من الإيثانول البارد الجليدي واحتضان في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  9. طرد العينات في 15،000 × غرام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وتجفيف بيليه (عادة غير مرئية) تحت فراغ.
  10. وأخيرا، ريسوسبند، بيليه في 50 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase وجعل aliquots. تخزين الأسعار في -80 درجة مئوية حتى استخدامها. للتخزين على المدى القصير، يمكن أيضا تخزين العينات في -20 درجة مئوية.

2. إعداد الصك

ملاحظة: البروتوكول التالي هو الأمثل للملاقط البصرية التجارية الصك C-فخ من شركة LUMICKS. لذلك، قد تكون التعديلات على الخطوات المعروضة ضرورية أثناء استخدام أدوات ملاقط بصرية أخرى. إذا لم يتم استخدامه ، يتم الاحتفاظ بنظام microfluidics للآلة في التبييض (محلول هيبوكلوريت الصوديوم) ويجب غسله قبل الاستخدام.

  1. تجاهل التبييض وملء المحاقن مع 1 مل من المياه الخالية من RNase.
  2. أضف 50 ميكرولتر من ثيوسولفيت الصوديوم 0.5 م إلى 1 مل على الأقل من الماء الخالي من RNase واغسل النظام جيدا (شريط واحد، 0.5 مل على الأقل) للقضاء على التبييض المتبقي في النظام.
  3. تجاهل محلول ثيوسلفيت الصوديوم من المحاقن. استبدل المحاقن بأخرى طازجة واغسل النظام بما لا يقل عن 0.5 مل من المياه الخالية من RNase.
    ملاحظة: كن حذرا، أن نظام microfluidics أبدا تشغيل الجافة لتجنب فقاعات الهواء في النظام.
  4. ضع قطرتين من زيت الغمر (مؤشر الانكسار 1.33) أو ما يقرب من 70 ميكرولتر من الماء فوق الهدف.
  5. ضع خلية التدفق داخل إطار الضغط في موضعها.
  6. وضع 2 قطرات من زيت الغمر (مؤشر الانكسار من 1.51) على رأس الخلية تدفق.
  7. قم بتشغيل جهاز الليزر في آلة الملاقط. بمجرد تشغيله، قم بتشغيل الليزر المحاصر في واجهة البرنامج بنسبة 100٪.
  8. باستخدام كاميرات التشخيص (Z-الباحث)، ضبط المحور Z إلى منتصف الغرفة بين الثاني والثالث انعكاسات (واجهات) حيث حلقات الانكسار هي أكبر، عن طريق تحويل المسمار الصغير.
    ملاحظة: في كل مرة يتم نقل الهدف أقرب إلى غرفة القياس والطائرة المحورية من الهدف يعبر واجهة بين مرحلتين، يمكن التعرف على انعكاس في وضع الباحث Z. هناك 4 واجهات ممكنة: (1) الماء / زيت الغمر والزجاج السفلي (ii) الزجاج السفلي والعازل داخل الغرفة (3) العازلة داخل الغرفة والزجاج العلوي (iv) الزجاج العلوي وزيت الغمر للمكثف.
  9. ضبط موقف المكثف (تعيين الليزر محاصرة إلى ما يقرب من 50٪) بحيث يلمس المكثف زيت الغمر على رأس غرفة القياس.
  10. ضبط التركيز عن طريق التحرك ببطء إلى أسفل / حتى مع المكثف، لذلك يتم عرض ما يقرب من 10 نطاقات الضوء في وضع القمر (كاميرات التشخيص).

3. قياس العينة

  1. احتضان الخرز المغلف بمضادات الديجوكسيجينين (AD) مع بناء العينة (3 ميكرولتر من 0.1٪ (ث / v) تعليق حبة AD + 4 ميكرولتر من العينة) ومع 1 ميكرولتر من مثبطات RNase و 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتقييس (300 مللي متر كلكل، 5 م MGCl2، 20 م م HEPES، الرقم الحموضة 7.6، 0.05٪ توين 20، 5 MM DTT) في RT لمدة 10-20 دقيقة. بعد الحضانة، تمييع العينة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للآساءة.
    ملاحظة: يوصى بإضافة زبالين الأكسجين، خاصة أثناء قياسات الفلورسينس إلى العازلة من أجل منع الضرر التأكسدي. هنا تم استخدام نظام زبال الأكسجين الذي يحتوي على الجلوكوز (8.3 ملغم / مل) ، وأوكسيديز الجلوكوز (40 U / mL) والكاتالاس (185 U / mL).
  2. مزيج 0.8 ميكرولتر من 1٪ (ث / الخامس) خرز المغلفة streptavidin (SA) مع 1 مل من المخزن المؤقت المقايسة.
  3. تجاهل المياه من المحاقن وملء المحاقن مع تعليق كل منهما / حلول. يغسل لمدة 2 دقيقة على الأقل في ما يقرب من 1 بار، ومن ثم البدء في اصطياد الخرز.
    ملاحظة: اعتمادا على الإعداد التجريبي، يمكن استخدام ترتيبات قنوات مختلفة (الشكل 3). عادة، يتم تعبئة قناة تدفق واحدة مع حبات مضادة للديجوكسيجينين تحمل جزيء الحمض النووي الريبي. تمتلئ قناة ثانية بالخرز المغلف بالستريبتافيدين. يتم استخدام قناة المخزن المؤقت لتشكيل الحبال. ويمكن استخدام قناة رابعة لتحميل بروتين ربط الحمض النووي الريبي (الشكل 3C)، أو بدلا من ذلك يمكن إضافة RBP مباشرة في القناة العازلة (الشكل 3B).
  4. لالتقاط الخرز، حرك الفخاخ البصرية بعيدا عن بعضها البعض. الانتقال الأول إلى قناة AD والتقاط AD-حبة في فخ 1. بعد ذلك، نقل المرحلة إلى قناة SA والتقاط حبة SA واحد بواسطة فخ 2.
    ملاحظة: حاول البقاء في واجهة المخزن المؤقت وقنوات حبة لتجنب فقدان حبة تم التقاطها مسبقا أو لمنع اصطياد حبات متعددة بواسطة نفس trap.
  5. بمجرد التقاط الخرز من الحجم الصحيح، انتقل إلى قناة المخزن المؤقت وتوقف تدفق صفح. بعد ذلك، قم بإجراء معايرة القوة للتحقق من صلابة الفخ. يجب ألا تختلف قيم الصلابة ذات الصلة في محور x/y بأكثر من 10-15٪.
    ملاحظة: ضبط طاقة الليزر أو تقسيم الليزر بين traps وفقا لحجم حبة. لا يلزم إجراء معايرة القوة لكل زوج حبة طالما تطابق قوالب الخرز (نقاط التشابه > 0.9). ومع ذلك، يجب أن يتم تنفيذها بانتظام، أو على الأقل في كل مرة يتم تغيير شروط الفحص.
  6. بدء الصيد عن الحبل عن طريق تحريك الخرز على مقربة من بعضها البعض، والانتظار لبضع ثوان، ومن ثم نقلها مرة أخرى بعيدا، كرر حتى يتم تشكيل حبل. تشكيل الحبل يؤدي إلى زيادة القوة المقاسة عند سحب الخرزين بعيدا عن بعضها البعض.
    ملاحظة: لتجنب تشكيل الحبال متعددة، لا ينبغي نقل الخرز قريبة جدا. عند اصطياد حبل بين حبتين، يمكن التحقق من جودة الحبل من خلال العثور على هضبة فوق التمدد. يجب أن تكون الهضبة بين 50 إلى 60 pN للربط واحد.
  7. عند الحصول على حبل، ابدأ القياس. اعتمادا على الظاهرة درس ينبغي اختيار الاجهزة قياس مختلفة (الشكل 1B-D).
    ملاحظة: عادة في بداية التجربة، يتم إجراء تجربة منحدر القوة للتحقق من جودة الحبل والتحقيق في السلوك. بعد ذلك، يمكن للمرء أيضا أن يبدأ تجارب القوة الثابتة أو الموقف الثابت لدراسة التحولات الدولة كذلك. وبمجرد إجراء عدد كاف من القياسات على عينة الحمض النووي الريبي لتحديد سلوكها، يمكن إضافة عوامل تحمل علامات إلى النظام لإجراء قياسات كونفوجكال.
  8. لإجراء قياسات الفلورسينس، قم بتشغيل الليزر البؤري ووحدة عداد الفوتون في أداة الملاقط البصرية.
  9. قم بتشغيل ليزر الإثارة للطول الموجي المطلوب في واجهة البرنامج وحدد قوة الليزر إلى 5٪ أو أعلى ، اعتمادا على الفلوروفور.
    ملاحظة: في حين لا قياس خفض إعداد الطاقة من ليزر الإثارة إلى 0٪ لتجنب photodamage المفرط للعينة.
  10. بدء تصوير العينة باستخدام وظائف صورة البرنامج.
    ملاحظة: من أجل الحصول على صور مركزة بشكل جيد ، يجب محاذاة المستوى البؤري للمجهر الكونفوجال والفخاخ البصرية. لهذا الغرض، يمكن استخدام autofluorescence من حبات البوليسترين في قناة الليزر الأزرق. يتم نقل المستوى البؤري من الفخاخ البصرية لأعلى أو لأسفل في المحور z حتى تصل صورة الخرز إلى أعلى قطر لها. في هذا الموضع ، يمكن قياس إشارة الفلورسينس من الجزيء المربوط بين الخرز.
  11. لاستخدام وظيفة kymograph، حدد موضع x-y لمحور الكيموجراف بحيث يسمح بالكشف عن الحبل بين الخرز.
  12. في جميع أنحاء القياس، يمكن تغيير تكوين المخزن المؤقت بسهولة إما عن طريق نقل الخرز إلى قنوات مختلفة أو عن طريق تغيير المخزن المؤقت المقدم في نظام microfluidics.

4. تحليل البيانات

  1. معالجة البيانات الأولية مسبقا
    1. باستخدام برنامج نصي بسيط، downsample البيانات الخام بما فيه الكفاية ل(1) السماح أسرع معالجة البيانات اللاحقة ولكن (2) لا تزال تحتوي على جميع المعلومات الهامة (الشكل 4A). عادة، 100-5000 هرتز مناسبة لهذا الغرض.
      ملاحظة: غالبا ما يكون تردد جمع البيانات في تجارب الملاقط البصرية أعلى مما هو ضروري للتحليل - في التجارب المعروضة ، يتم تعيين تردد جمع البيانات إلى 78 125 هرتز افتراضيا. نظرا لأن مساحة التخزين محدودة ، فمن المريح والموقت تقليل معدل أخذ العينات للبيانات. هنا ، تم تقليص البيانات الخام بعامل 30.
    2. بعد ذلك، استخدم فلتر إشارة لتقليل ضوضاء قياس التردد العالي من الإشارة (الشكل 4A). ضبط درجة التصفية ومعلمات التردد المقطوع وفقا لذلك لتحسين إخراج البيانات من التجارب المختلفة (الشكل 5).
      ملاحظة: من بين مرشحات الإشارات، مرشح بتروورث51 هي واحدة من الأكثر استخداما على نطاق واسع. يتم توفير نص بيثون مكتوب خصيصا يسمح بالمعالجة المسبقة للبيانات الخام في البيانات التكميلية. يجب تحسين معلمات تصفية الاختزال والإشارات (التردد المقطوع ودرجة التصفية) لإجراء تجارب مختلفة.
  2. لتحليل البيانات force-ramp استخدم الخطوات التالية.
    1. وضع علامة على الخطوات إما يدويا عن طريق البحث عن نقاط المقابلة على رسم مسار القوة أو باستخدام البرامج النصية المكتوبة خصيصا. وتتميز الخطوات التي تتكشف بانخفاض مفاجئ في القوة جنبا إلى جنب مع زيادة في المسافة في منحنى مسافة القوة (FD).
    2. بمجرد وضع علامة الأحداث التي تتكشف، تناسب مناطق مختلفة من منحنى FD باستخدام النماذج المناسبة (الشكل 4D).
      ملاحظة: بالنسبة للمنطقة قبل الخطوة الأولى unfolding، يمكن اعتبار الحبل "double-stranded" وهو عادة صالح باستخدام نموذج سلسلة تشبه Worm القابلة للتوسعة (WLC)47,52,53. وتعتبر الأجزاء بعد الحدث الأول تتكشف مزيجا من النيوكليوتيدات المزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (مقابض) والنيوكليوتيدات واحد تقطعت بهم السبل (جزيء الحمض النووي الريبي تكشفت). لذلك ، فإن تركيب البيانات أكثر تعقيدا - عادة ما يتم استخدام مزيج من نموذجين WLC أو نماذج WLC وسلسلة مشتركة بحرية (FJC) 36،39،52. يحتوي طراز WLC القابل للتوسعة على معلمات تناسب رئيسيين طول كفاف (LC) وطول الثبات (LP). طول كفاف يتوافق مع طول جزيء امتدت بالكامل وطول المثابرة يحدد خصائص الانحناء من جزيء الفائدة. يمكن وصف النموذج بالمعادلة التالية (1). يمكن استخدام WLC لنمذجة سلوك كل من المناطق المطوية وكذلك التي تم الكشف عنها ، على الرغم من أنه لكل من هذه النماذج المنفصلة مع معلمات مختلفة يجب استخدامها.
      (1) Equation 1
      حيث x هو التمديد، LC هو طول كفاف، F هو القوة، LP هو طول المثابرة، KB هو بولتزمان ثابت، T هو درجة الحرارة الحرارية، وS هو معامل التمدد.
      النموذج الثاني يسمى سلسلة مشتركة بحرية (FJC) يستخدم عادة لوصف سلوك المناطق التي تقطعت بها السبل واحدة تتكشف. ويستخدم معلمات مماثلة من البوليمرات ولكن يعامل كل وحدة من "سلسلة" كقضيب جامدة، وهنا المقابلة لنوكليوتيدات المنطقة التي تقطعت بها السبل واحدة تكشفت. تصف المعادلة التالية (2) هذا الطراز:
      (2) Equation 2
      ملاحظة: طور مختبرنا مؤخرا خوارزمية تسمح بمعالجة الدفعات لبيانات منحدر القوة الخام تسمى "تحليل ملاقط بصرية عملية TOol (POTATO)54". الخوارزمية downsamples وتصفية البيانات ، ثم يحدد الخطوات التي تتكشف ممكنة ، وأخيرا ينفذ المناسب للبيانات. تم تصميم البطاطس في واجهة مستخدم رسومية سهلة الاستخدام (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. معالجة بيانات القوة الثابتة كما يلي:
    ملاحظة: يمكن تطبيق الإرشادات التالية بشكل مماثل على بيانات الموضع الثابت.
    1. بالنسبة لبيانات القوة الثابتة، رسم المسافة عبر الزمن (الشكل 5). إن الرسم البياني الذي يظهر تكرار (عدد) التشكلات المختلفة على التغير النسبي في الموضع هو طريقة مفيدة لتوصيف مختلف الحالات المهيمنة والثانوية (الشكل 7).
    2. تناسب الرسم البياني باستخدام (متعددة) وظائف الغاوسية لتقدير النسبة المئوية الإجمالية للمتوافقين الفردية في قوة معينة (الشكل 7C). الغاوسية يناسب، موقف يعني، والانحراف المعياري يحدد العلاقة ذات الصلة بالقوة بين مختلف السكان.
      ملاحظة: يتم توفير نص بيثون مكتوب خصيصا يسمح بالمعالجة المسبقة وتركيب Gaussian ثنائي الوسائط الأساسي لبيانات القوة الثابتة في البيانات التكميلية. يجب تحسين المعلمات (التردد المقطوع ودرجة التصفية والوسائل المتوقعة وقيم الانحراف المعياري والسعة) للتجارب المختلفة.
    3. بعد ذلك، استخدم نموذج ماركوف المخفية لمزيد من تحليل الدول، والتي قد تكشف وسيطة قابلة للطي إضافية (conformers)55. لمزيد من المعلومات حول نموذج القوة الثابتة وماركوف المخفية، يمكن للمرء أن يشير إلى 55،56،57،58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا القسم، يتم التركيز بشكل رئيسي على قياسات التفاعلات بين الحمض النووي الريبي وبروتين/ليغاند بواسطة الملاقط البصرية الفلورية. للحصول على وصف لتجارب ملاقط RNA البصرية العامة والنتائج التمثيلية المقابلة ، انظر32. لمزيد من التفاصيل حول التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين الحمض النووي، انظر أيضا 1,2,26,59,60.

من حيث المبدأ، ملزمة من RBP أو أي عامل آخر عبر المفعول من الفائدة على الحمض النووي الريبي يستقر، يزعزع الاستقرار، أو قد يغير تشكيل الجزيء. أدناه، يتم عرض تصوير للملاحظة الميكانيكية لكل تأثير. ومع ذلك ، فإن التأثير الفعلي الملاحظ لمجمع بروتين الحمض النووي الريبي معين لا يقتصر على هذه السيناريوهات المذكورة أدناه.

تحقيق الاستقرار
هيكل الجيش الملكي النيبالي يمكن التعرف عليها على وجه التحديد وملزمة من البروتين أو ligands45 أخرى، 61،62،63،64. ويرافق تشكيل السندات من قبل الإفراج عن الطاقة. لذلك ، يجب التغلب على حاجز إضافي نشط من أجل كشف هيكل الحمض النووي الريبي المعطى. ونتيجة لذلك، يمكن ملاحظة زيادة في متوسط القوة الآخذة في التكشف 50,65. استقرار هيكل الحمض النووي الريبي عن طريق ربط عامل خارجي (البروتين، جزيء صغير، عوامل أخرى عبر المفعول) قد يؤدي أيضا إلى تغيير الحركية للطي من structure45. لذلك، يمكن إجراء المزيد من القياسات في وضع القوة الثابتة، حيث يمكن ملاحظة انتقالات أقل تواترا بين الوسيطات القابلة للطي وكذلك تحول القوة في التوازن.

زعزعه الاستقرار
تتعرف بعض البروتينات على بعض زخارف التسلسل بدلا من هياكل الحمض النووي الريبي المحددة. قد تختلف المواقع الملزمة من فكرة محددة للغاية إلى نمط أكثر عمومية مثل GC أو AU الغنية تمتد60،66. ومع ذلك ، إذا كان البروتين يرتبط بشكل تفضيلي لتكشف تشكيل الحمض النووي الريبي واحد تقطعت بهم السبل ، يمكن تحويل التوازن بين الدولة مطوية وتكشفت نحو الدولة التي تكشفت 364367. في الشكل 6 والشكل 7 يتم تصوير أمثلة من هذا السلوك.

تغيير الهيكل
وفي بعض الحالات، قد تجمع الممارسات القائمة على النتائج (أو غيرها من الليجاندات) بين الآليتين المذكورتين أعلاه بطريقة تؤدي إلى زعزعة استقرار تشكيل الممارسات القائمة على النتائج الذي كان مهيمنا في السابق وتحويل التوازن نحو هيكل بديل للجيش الملكي النيبالي(44,68,69). وقد يؤدي التحول إلى حالة بديلة إلى حدوث تغيير في ترددات السكان المطابقة الملاحظة وكذلك حدوث حالات قابلة للطي أو اختفائها. ويمكن ملاحظة هذه التغيرات لأول مرة في تجارب منحدر القوة ويمكن مواصلة التحقيق فيها من خلال تجارب القوة الثابتة (أو الوضع الثابت).

تأثير عامل عبر المفعول على RNA للطي / تتكشف
هنا، تمت دراسة تسلسل الحمض النووي الريبي المقابل لعنصر نقل الإطارات الريبوسومية المبرمجة -1 من السارس-CoV-2. ومن المتوقع أن يشكل هذا العنصر من الجيش الملكي النيبالي pseudoknot70,71 من النوع H. في مسارات قوة المسافة المثال، الجيش الملكي النيبالي تتكشف وتطوي في خطوتين متتاليتين (الشكل 6A). هذه الخطوات اثنين من المحتمل أن تتوافق مع الحلقات الجذعية اثنين التي هي الشرط المسبق لتشكيل pseudoknot. في هذه الحالة، لم يلاحظ pseudoknot إما لأن الجيش الملكي النيبالي لم أضعاف تماما أو شكلت بنية بديلة تتنافس مع pseudoknot. 10- عند إضافة العامل العابر للمفعول ZAP، لوحظ اختفاء مفاجئ لأحداث إعادة طيها وعلامة زسترة ضخمة (الشكل 6ب)43. وهذا يشير إلى أن البروتين يرتبط بحالة واحدة تقطعت بهم السبل من الجيش الملكي النيبالي، مما يعوق تشكيل الهياكل الثانوية. وعلاوة على ذلك، تؤكد تجارب القوة الثابتة نتائج تجارب منحدر القوة. وبناء على ذلك، في حين أن الحمض النووي الريبي مطوي بالكامل عند حوالي 10 pN (الشكل 7A)، فإن وجود البروتين يحول إعادة طيه نحو قوى أقل، وعند 10 pN لا يزال الجيش الملكي النيبالي يحتل في الغالب الحالة التي تم الكشف عنها (الشكل 7B).

قياسات OT مقرونة بالمنظار المجهري الكونفوشيكال
بعد ذلك ، تظهر نتائج مثالية للربط غير المحدد وكذلك المحدد للفلوروفوريس المختلفة والريبوسومات المسماة (الشكل 8). في المثال الأول ، تم استخدام صبغة SYTOX Green لتسمية هجين الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المربوط. مع زيادة القوة، وربط صبغ هو أكثر وفرة مما أدى إلى ارتفاع إشارة مضان. بمجرد أن تكون القوة عالية جدا، ينكسر الحبل، وتضيع إشارة الفلورسينس (الشكل 8A). بالنسبة للتجارب مع الريبوسومات البكتيرية (الشكل 8B) ، تم استخدام وضع علامات غير محددة لمخلفات الليسين باستخدام N-hydroxysuccinimide (NHS) المقترنة بصبغة فلورية حمراء. على الرغم من أن هناك خطر من خفض نشاط البروتين المسمى / معقدة، والميزة الكبيرة هي أقوى إشارة تحققت كما هو كل ريبوسوم (في المتوسط) المسمى من قبل الفلوروفوريس متعددة. يحتوي بناء الحمض النووي الريبي على موقع ربط ريبوسوم (RBS) معترف به من قبل الريبوسومات البكتيرية ، والذي تم وضعه في القرب من تسلسل الحمض النووي الريبي المدروس 5. عند ربط الريبوسومات ، لوحظت إشارة الفلورسينس على الحبل. ويمكن مواصلة تحليل البيانات الفلورية باستخدام أدوات تحليل الصور72، ويمكن الجمع بين النتائج وبيانات القوة، مما يسمح بدراسة التحولات القابلة للطي.

Figure 1
الشكل 1: تخطيط تجربة OT ونهج القياس الممكنة. (أ) التخطيطي الذي يوضح تجارب الملاقط البصرية مع الحمض النووي الريبي المتحول إطاري سارس-CoV-2 في الوسط. يتم تهجين الحمض النووي الريبي لمقابض SSDNA وشل الحركة على الخرز. وتستخدم هذه لممارسة قوة سحب على الجيش الملكي النيبالي مع شعاع ليزر مركزة. يتم زيادة القوة تدريجيا حتى يتم الكشف عن الحمض النووي الريبي (أسفل). (ب) التخطيطي من المجهر confocal جنبا إلى جنب مع ملاقط بصرية لرصد ربط عامل المسمى إلى الجيش الملكي النيبالي. (ج) يمكن الحصول على مثال لبيانات القوة الثابتة عن طريق تحديد القوة بقيمة ثابتة مع مرور الوقت، مما يسمح بقياس وقت سكن المطابقين بدقة. (د) مثال منحنى مسافة القوة (FD) الذي تم الحصول عليه من قياس قوة منحدر. ويلاحظ أن الخطوة تتكشف كتمزق مفاجئ في الملف الشخصي FD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط عام لتجميع عينة OT. (أ) تسلسل المثال والهيكل الثانوي المتوقع لرنا المتحول الإطاري سارس-كوف-2 المستخدم في الدراسة. (ب) ناقل يحتوي على تسلسل الاهتمام (SoI) محاطة منطقتين مقبض بمثابة نموذج لتوليد بناء الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في 3 ردود فعل PCR. يتم تصوير التمهيديات ورقمها في المخطط وفقا لمواقع الربط الخاصة بها في PCR المقابلة. PCR 1 ينتج قالب النسخ في المختبر ، والذي يستخدم في وقت لاحق لرد فعل النسخ في المختبر (IVT) لتوليد جزيء الحمض النووي الريبي الطويل (الأزرق الفاتح). PCR 2 تسفر عن 5 ' مقبض, الذي هو في وقت لاحق 3 'المسمى مع البيوتين. PCR 3 باستخدام التمهيدي الأمامي اقترانها إلى digoxigenin تنتج مقبض 3 'digoxigenin المسمى. وأخيرا، يتم صلب مقابض اثنين والجيش الملكي النيبالي لإعطاء بناء هجين الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي مناسبة لقياسات ملاقط البصرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توضيح لمختلف الاجهزة قناة microfluidics. (أ) مخطط لخلية التدفق مع قنوات microfluidics 5. (B) و (C) هما تكبير المنطقة ذات اللون الأحمر المتقطع ( A). (ب) إعداد بسيط من 3 قنوات مع حبات ال AD وخرز SA في القناتين 1 و3 على التوالي. تم العثور على عامل في القناة 2. هذا الإعداد هو مناسبة للبروتينات مستقرة مع تقارب عالية، وبالتالي يفضل تركيز منخفض لضمان خلفية الفلورسنت منخفضة. قنوات حبة على الجانب تسمح التوجيه حبل ثابتة والتوظيف السريع للخرز جديدة إذا لزم الأمر. (ج) إعداد 4 قنوات مع عامل في القناة 4. وهذا الترتيب مفيد بشكل خاص بالنسبة إلى الحد الأدنى من استهلاك العينات. ويمكن إجراء القياس مباشرة في القناة 4. وبدلا من ذلك، ولتجنب إشارة الفلورسينس الخلفية، يمكن تشكيل المجمع في القناة 4 ومن ثم يمكن إجراء القياس في القناة 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: سير عمل تحليل البيانات لتجارب قوة المنحدر. (أ) المخطط الانسيابي لسير عمل تحليل البيانات. يتم أولا downsampled ملفات البيانات الخام وتصفيتها، ثم يتم وضع علامة الخطوات ويتم تركيب الحالات الفردية إلى النموذج المقابل. (ب) تحتوي البيانات الأولية على كمية كبيرة من الضوضاء، التي تعوق تحديد الأحداث الجارية/القابلة لإعادة طيها. أيضا ، في معظم التجارب ، وتواتر جمع البيانات أعلى من اللازم. (ج) ولذلك، يتم استخدام downsampling والترشيح إشارة لصقل ملف البيانات. (د) وأخيرا يتم تركيب المنحنيات المجهزة باستخدام نموذج WLC عندما يكون الجزيء لا يزال في حالة مطوية (قبل الحدث تتكشف)، مزيج من WLC مع نماذج FJC أو نموذج WLC الثاني عندما يكون الجزيء في حالة تتكشف (بعد الحدث تتكشف). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: أثر انقطاع التردد على إخراج البيانات. في حين أن إخراج البيانات الخام قد يكون مثقلا بضوضاء الإشارة (الأعلى) ، فمن الأهمية بمكان اختيار معلمات ترشيح الإشارات المناسبة لتحليل البيانات. على الرغم من أن الترشيح السليم من شأنه أن يساعد في تحديد وسيطة قابلة للطي (تردد قطع 0.1، وسط)، أكثر من الترشيح (تردد قطع <0.001، أسفل) قد يؤدي إلى فقدان القرار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مثال مسارات FD في غياب ZAP ووجوده. (أ) تتكشف (الوردي) وإعادة طي (الأزرق) آثار سارس-CoV-2 الجيش الملكي النيبالي في غياب ZAP. تظهر العينة إعادة طي بسهولة مع الغشاء النجمي الصغير فقط. (ب) تتكشف (الوردي) وإعادة طي (الأزرق) آثار الحمض النووي الريبي في وجود عامل عبر ZAP (400 nM). تظهر العينة غشاء التنويم المغناطيسي الضخم ، مما يشير إلى أن البروتين يرتبط بالحمى الريبية الوحيدة التي تقطعت بها السبل ويمنع إعادة طيه. (ج) مخطط شريطي يوضح عدد الخطوات المتكشفة (الوردية) والخطوات (الزرقاء) في غياب ZAP أو وجوده. في حين أن توزيع الخطوات التي تتكشف لا يزال تقريبا لا يتأثر بوجود ZAP، هناك انخفاض واضح في عدد خطوات إعادة طي مع ZAP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: مثال على بيانات القوة الثابتة في غياب ZAP ووجوده. (أ) بيانات القوة الثابتة التي تم الحصول عليها في القوات التي تتراوح بين 10 (أعلى) إلى 13 (أسفل) pN تبين التحول من حالة مطوية بالكامل إلى حالة تتكشف تماما من سارس-CoV-2 عنصر الحمض النووي الريبي frameshifting. يتضمن كل رسم بياني الموضع مقابل الوقت (يسار) ورسم تخطيطي (يمين). (ب) بيانات القوة الثابتة التي تم الحصول عليها في وجود ZAP (400 nM). عند ربط البروتين ، يضعف إعادة طيه. في 10 pN، على النقيض من الجيش الملكي النيبالي وحده، في وجود الجيش الملكي النيبالي ZAP موجود في الغالب في حالة تتكشف. ولذلك، يشار إلى حدوث تحول في قوة التوازن نحو القوى الدنيا. (ج) يمكن تحليل الرسم البياني لبيانات الموضع عن طريق تركيب البيانات على وظائف الغاوسية لتحقيق وفرة نسبية لكل ولاية (مشتقة من المنطقة تحت المنحنى لكل ولاية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: OT جنبا إلى جنب مع المجهر confocal. (أ) مثال على ذلك كيموغراف الحبل المسمى SYTOX Green (إلى اليسار). لاحظ الزيادة في كثافة الإشارة في زيادة القوى. يمثل السهم الأسود حدث كسر الحبل، مما يؤدي إلى فقدان الإشارة. تصوير الحبل مع صبغة ملزمة به (ملزمة) وبعد الكسر دون صبغ (لا إشارة) (يمين). (ب) مثال kymograph من ربط محددة من ريبوسوم على مرنا (يسار). يمكن ملاحظة الحدث الملزم كإشارة مضان على الحمض النووي الريبي المربوط بين الخرزين. تصوير الحبل بدون (لا إشارة) ومع الريبوسومات ذات العلامات الفلورية المقيدة (ملزمة) (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تركيز المخزون التركيز النهائي حجم
حجم رد الفعل - - 500 ميكرولتر
10× المخزن المؤقت 10× 1× 50 ميكرولتر
مزيج dNTP 10 مليون متر 0.2 مليون متر 10 ميكرولتر
عالية الدقة الحمض النووي بوليمراز 1.25 U/μL 0.025 U/μL 10 ميكرولتر
التمهيدي 1 10 ميكرومتر 0.4 ميكرومتر 20 ميكرولتر
التمهيدي 2 10 ميكرومتر 0.4 ميكرومتر 20 ميكرولتر
قالب 100 نانوغرام/ميكرولتر 1 نانوغرام/ميكرولتر 5 ميكرولتر
الماء - - 385 ميكرولتر

الجدول 1: مخطط الأنابيب لPCR لتوليد الملقط البصرية يبني.

تركيز المخزون التركيز النهائي حجم
حجم رد الفعل - - 300 ميكرولتر
5× المخزن المؤقت 5× 1× 60 ميكرولتر
مزيج rNTP 25 مليون متر 5 مليون متر 60 ميكرولتر
مثبطات RNase 40 U/μL 0.7 U/μL 5 ميكرولتر
بيروفوسفاتاز 100 U/mL 1.7 وحدة/ميكرولتر 4 ميكرولتر
DTT 100 مليون متر 3.3 مليون متر 10 ميكرولتر
T7 RNA بوليمراز 50 يو/ميكرولتر 3.3 U/μL 20 ميكرولتر
قالب 120 نانوغرام/ميكرولتر 2 نانوغرام/ميكرولتر 5 ميكرولتر
الماء - - 136 ميكرولتر

الجدول 2: مخطط الأنابيب للنسخ في المختبر .

تركيز المخزون التركيز النهائي حجم
حجم رد الفعل - - 100 ميكرولتر
10× المخزن المؤقت (NEB 2.1) 10× 1× 10 ميكرولتر
جيش صرب البوسنه 1 ميكروغرام/مل 100 نانوغرام/ميكرولتر 1 ميكرولتر
البيوتين-16-dUTP 1 مليون متر 50 ميكرومتر 5 ميكرولتر
T4 دي إن أي بوليمراز 30 U/μL 1.5 U/μL 5 ميكرولتر
مقبض الحمض النووي 5 '(20-60 ميكروغرام) 300 نانوغرام/ميكرولتر 237 نانوغرام/ميكرولتر 79 ميكرولتر

الجدول 3: مخطط الأنابيب ل3 'نهاية الوسم البيوتين.

تركيز المخزون التركيز النهائي المبلغ النهائي حجم
حجم رد الفعل - - - 300 ميكرولتر
المخزن المؤقت لطين 1.25× 1× - 240 ميكرولتر
مثبطات الرناز 40 U/μL 0.5 U/μL - 5 ميكرولتر
5' مقبض الحمض النووي البيوتينية 300 نانوغرام/ميكرولتر 10 نانوغرام/ميكرولتر 3 ميكروغرام 10 ميكرولتر
3' مقبض الحمض النووي 300 نانوغرام/ميكرولتر 10 نانوغرام/ميكرولتر 3 ميكروغرام 10 ميكرولتر
حمض الريبونوكلييك (RNA) 150 نانوغرام/ميكرولتر 10 نانوغرام/ميكرولتر 3 ميكروغرام 20 ميكرولتر
الماء - - - 5 ميكرولتر

الجدول 4: مخطط الأنابيب لتكليس بناء الملاقط البصرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، ونحن نظهر استخدام الملاقط البصرية المفلورة إلى جانب لدراسة التفاعلات والسلوك الديناميكي لجزيئات الحمض النووي الريبي مع مختلف ليغاندس. فيما يلي، تتم مناقشة الخطوات والقيود الهامة لهذه التقنية.

الخطوات الهامة في البروتوكول
أما بالنسبة للعديد من الطرق الأخرى، فإن جودة العينة محورية للحصول على بيانات موثوقة. لذلك ، للحصول على أعلى عينات الجودة الممكنة ، يجدر قضاء بعض الوقت لتحسين الإجراء لإعداد العينات. وتشمل خطوات التحسين التصميم التمهيدي المناسب ودرجات الحرارة الصلبة والحمرنا الريبي وخطوات تنقية البروتين.

في جميع أنحاء التجربة استخدام نصائح وحلول تصفية أمر بالغ الأهمية من أجل الحفاظ على ظروف خالية من RNase. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الاحتفاظ بنظام microfluidics في التبييض عندما لا تكون قيد الاستخدام. قبل بدء القياسات، من المهم غسل النظام بشكل صحيح مع ثيوسلفتات الصوديوم والمياه الخالية من RNase لإزالة التبييض من النظام.

في حالة استخدام الخرز بنفس الحجم طوال التجربة ، لا يلزم إجراء معايرة القوة في كل مرة. ومع ذلك، ينبغي إجراء فحوص معايرة القوة بانتظام لإعادة إنتاج التجارب.

تعديلات واستكشاف أخطاء الأسلوب وإصلاحها
استقرار فلوروفور وbleaching الضوئي
مضاعفات أثناء قياسات الفلورسينس هو photobleaching. وبما أنه يمكن تمديد الإطار الزمني لرصد الترجمة من ثوان إلى دقائق حسب النظام، ينبغي أيضا النظر في إجراء قياسات ضوئية أثناء القياسات وتقليلها إلى أدنى حد ممكن73. ويتمثل أحد الخيارات في استخدام الفلوروفوريس الأكثر استقرارا، والتي هي أقل عرضة للbleaching الضوئي، مثل النقاط الكمومية التي أدخلت مؤخرا49,74,75. كما يتحقق المزيد من الاستقرار عن طريق إزالة جزيئات الأكسجين باستخدام نظام "زبال الأكسجين"، مثل أوكسيداز الجلوكوز إلى جانب الكاتالاسي. يزيل الجلوكوز أوكسيداز الأكسجين من البيئة عن طريق تحويله إلى بيروكسيد الهيدروجين ، والذي يتم تحلله بعد ذلك عن طريق الكاتالاسي. ويمكن أيضا استخدام نظم بديلة لمسح الأكسجين 76,77.

ميكروفلويديس
الحفاظ على تدفق صفح مستمر أمر ضروري للقياسات المناسبة. والأهم من ذلك، لا ينبغي للنظام أن يجف أبدا. ولسوء الحظ، فإن الممارسات التجارية القائمة على النتائج أو غيرها من العوامل العابرة للمفعول ذات الأهمية لا تتوفر في كثير من الأحيان إلا بكميات صغيرة للتجارب، وبالتالي فإن الحفاظ على التدفق المستمر يمكن أن يكون صعبا وكثيف التكلفة. إذا تم إدخال فقاعات الهواء في النظام أثناء تطبيق العينة ، فإن الضغط اليدوي أو غسل الإيثانول عادة ما يكون كافيا لإزالتها.

قيود الأسلوب
مزيج من OT مع المجهر confocal يجلب أيضا بعض القيود. أولا، يجب أن تكون الطائرة المحورية للوحدة الكونفوجكال متوائمة بشكل صحيح مع مراكز الفخ للسماح بالتسجيل الصحيح للإشارة الفلورية. وعلاوة على ذلك، لقياسات confocal، وعادة ما تكون هناك حاجة مقابض من 2 كيلوبايت على الأقل في كل موقع17. على الرغم من أن استخدام مقابض أطول ممكن من حيث المبدأ ، ينبغي للمرء أن ينظر في مساهمة الطاقة من مقابض والتغيير في طول الثبات لدقة تحليل البيانات78. نقطة حاسمة أخرى هي زبالي الأكسجين ، والتي تستخدم لزيادة نصف عمر الفلوروفوريس ، تؤدي أيضا إلى تغييرات سريعة نسبيا في درجة الحموضة من الحلول76. ويمكن تعويض هذه التغيرات جزئيا بزيادة تركيز مركب التخزين المؤقت؛ ومع ذلك، أثناء القياسات، ينبغي تجديد العينات بانتظام (كل 30-60 دقيقة) لضمان ظروف متسقة من خلال التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر أنوجا كيبي و جون البروفيسور ريدموند سميث على المراجعة النقدية للمخطوطة. نشكر تاتيانا كوخ على المساعدة التقنية الخبيرة. نشكر كريستينا بيكاركوفا على المساعدة في تسجيل مقاطع الفيديو التجريبية. يتم دعم العمل في مختبرنا من قبل جمعية هيلمهولتز وتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) غرانت nr. 948636 (إلى NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 180،
ملاقط بصرية لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين في تنظيم الترجمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N.… More

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter