Summary
该协议为使用光学镊子研究RNA-蛋白质相互作用提供了完整的实验工作流程。概述了几种可能的实验设置，包括光学镊子与共聚焦显微镜的组合。
Abstract
RNA采用不同的结构褶皱，这对其功能至关重要，因此可以影响细胞中的不同过程。此外，RNA的结构和功能可以通过各种 反式作用因子（例如蛋白质，代谢物或其他RNA）来调节。例如，移码RNA分子是位于编码区域的调节RNA，它们直接将核糖体翻译成替代的开放阅读框，从而充当基因开关。在与蛋白质或其他 反式因子结合后，它们也可能采用不同的褶皱。为了剖析RNA结合蛋白在翻译中的作用以及它们如何调节RNA结构和稳定性，同时研究这些RNA-蛋白复合物的相互作用和力学特征至关重要。这项工作说明了如何利用单分子荧光耦合光学镊子以高分辨率探索RNA-蛋白质复合物的构象和热力学景观。例如，详细阐述了SARS-CoV-2程序性核糖体移码元件与锌指抗病毒蛋白 的反式作用因子短同种型的相互作用。此外，使用共聚焦单元监测荧光标记的核糖体，这最终将实现翻译伸长率的研究。荧光偶联OT测定可广泛用于探索各种RNA-蛋白复合物或调节翻译的 跨作用因子，并有助于研究基于RNA的基因调控。
Introduction
通过mRNA将遗传信息从DNA传递到蛋白质是一个复杂的生化过程，通过细胞内的大分子相互作用在各个层面上进行精确调节。对于翻译调控，RNA-蛋白相互作用赋予了对各种刺激和信号快速反应的关键作用1，2。一些RNA-蛋白质相互作用会影响mRNA的稳定性，从而改变RNA翻译活性的时间。其他RNA-蛋白质相互作用与重新编码机制有关，例如停止密码子读通，旁路或程序化核糖体移码（PRF）3，4，5，6，7。最近，许多RNA结合蛋白（RMP）已被证明与刺激性mRNA元件和翻译机制相互作用，以决定何时以及在细胞中发生多少重新编码7，8，9，10，11。因此，为了剖析RNA结合蛋白在翻译中的作用以及它们如何调节RNA结构和稳定性，详细研究这些RNA-蛋白复合物的相互作用原理和力学性质至关重要。
数十年的工作为研究翻译的多步骤和多组分过程奠定了基础，该过程依赖于翻译机器的RNA和蛋白质组分之间的复杂通信来实现速度和准确性12，13，14。理解复杂调节事件的关键下一步是在高精度平移过程中确定力、时间尺度和结构决定因素12，15，16，17。单分子工具的出现进一步阐明了RNA构象动力学的研究，特别是反式辅助因子在翻译过程中如何作用于RNA结构，这些工具的出现进一步阐明了16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26.
光学镊子（OT）代表了一种高度精确的单分子技术，已被应用于研究多种RNA依赖性动态过程，包括转录和翻译26，27，28，29，30，31，32。光学镊子的使用允许详细探测这些过程的分子相互作用，核酸结构以及热力学性质，动力学和能量学16，17，22，33，34，35，36，37，38，39.光学镊子测定基于用聚焦激光束捕获微观物体。在典型的OT实验中，感兴趣的分子被拴在两个透明（通常是聚苯乙烯）珠子之间（图1A）27。然后，这些珠子被光学陷阱捕获，其行为类似于弹簧。因此，施加在分子上的力可以基于磁珠从聚焦激光束中心（陷阱中心）的位移来计算。最近，光学镊子与共聚焦显微镜相结合（图1B），可实现荧光或Förster共振能量转移（FRET）测量40，41，42。这开辟了一个全新的可能实验领域，允许同时测量，从而精确地将力光谱和荧光数据联系起来。
在这里，我们展示了使用光学镊子结合共聚焦显微镜的实验，以研究调节翻译移帧的蛋白质 - RNA相互作用。在物镜和冷凝器之间，具有五个通道的流通池可实现层流连续的样品应用。通过微流体通道，可以直接注射各种组分，这减少了动手时间，并且在整个实验过程中允许非常少的样品消耗。
首先，提出了辅助OT实验设计的基本指南，并讨论了各种设置的优点和缺点。接下来，描述了样品的制备和实验工作流程，并提供了数据分析方案。为了代表一个例子，我们概述了从RNA拉伸实验中获得的结果，以研究SARS-CoV-2移码RNA元件（图2A）， 其反式因子锌指抗病毒蛋白（ZAP）的短同种型改变了病毒RNA从替代阅读框架的翻译43。此外，还证明荧光标记的核糖体可用于这种OT共聚焦测定，这对于监测翻译机制的处理能力和速度是有用的。这里介绍的方法可用于快速测试不同缓冲液，配体或其他细胞组分的作用，以研究翻译的各个方面。最后，讨论了常见的实验陷阱以及如何排除故障。下面，概述了实验设计中的一些关键点。
施工设计
原则上，有两种常见的方法来创建OT兼容的RNA构建体。第一种方法采用长RNA分子，该分子与互补的DNA手柄杂交，从而产生由两个RNA / DNA杂交区域组成的构建体，中间是单链RNA序列的两侧（图2B）。大多数OT RNA实验都采用了这种方法33，44，45。
第二种方法利用具有短悬伸（约20 nt）的dsDNA句柄15，17。然后将这些悬垂与RNA分子杂交。虽然设计上更复杂，但dsDNA手柄的使用克服了DNA/RNA杂交系统的一些局限性。原则上，即使是非常长的手柄（>10kb）也可以实现，这对于共聚焦测量更方便。此外，RNA分子可以连接到DNA手柄上，以提高系留稳定性。
最终标签策略
该结构必须通过强分子相互作用拴附到珠子上。虽然有一些方法可用于手柄与珠子的共价键合46，但强但非共价的相互作用，如链霉亲和素 - 生物素和地高辛 - 抗体通常用于OT实验15，33，35，45。在所描述的方案中，构建体用生物素或地高丝宁标记，并且珠子分别涂有链霉亲和素或针对地高辛的抗体（图1A）。这种方法适用于施加高达约60 pN（每系绳）的力47。此外，使用不同的5'和3'标记策略可以确定珠子之间形成的系绳的方向17。
用于荧光测量的蛋白质标记
对于共聚焦成像，有几种常用的荧光标记方法。例如，荧光团可以共价附着在蛋白质中的氨基酸残基上，或者通过反应性有机基团通过位点导向诱变引入。硫醇或胺反应性染料可分别用于半胱氨酸和赖氨酸残基的标记。有几种可逆的保护方法可以增加标记的特异性48，49，但是天然蛋白质通常会在多个残基处标记。虽然荧光团的小尺寸可能带来优势，但非特异性标记可能会干扰蛋白质活性，因此信号强度可能会变化49。此外，根据标记效率的不同，不同实验之间的信号强度可能会有所不同。因此，应在实验之前执行活动检查。
如果感兴趣的蛋白质含有N端或C端标签，例如His标签或链球菌标签，则这些标签的特定标记代表了另一种流行的方法。此外，标签靶向标记可降低荧光团干扰蛋白质活性的机会，并可提高溶解度49。然而，标签特异性标记通常产生单荧光团标记的蛋白质，这可能很难检测。另一种特异性标记方法可以通过使用抗体来完成。
微流体设置
OT与微流体系统的结合允许在不同的实验条件之间快速过渡。此外，电流系统利用了维持流通池内部的层流，这排除了相对于流动方向的垂直方向上来自其他通道的液体的混合。因此，层流对于实验设计特别有利。目前，通常使用多达5个通道的流通池（图3）。
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Protocol
1. 样品制备
- 将感兴趣的序列克隆到含有Lambda DNA片段的载体中，这些载体用作手柄序列（图2）43，50。
- 首先生成DNA模板，用于随后通过PCR 进行体外 转录（图2B;反应1）。在此PCR步骤中，T7启动子被添加到感测DNA分子的5'末端32，33，43，50。根据 表1设置PCR反应。在热循环仪中以适当的循环在50μL等分试样中运行PCR。
- 通过两个单独的PCR反应制备手柄（表1，图2B;反应2和3）。首先，通过 PCR 生成 5' 句柄。然后，生成3'手柄，并使用5'地高辛标记的引物32，33，43，50同时用地高辛标记。
- PCR后，使用二氧化硅离心柱纯化DNA。
- 使用T7 RNA聚合酶进行 体外 转录反应（表2）32，33，43，50。根据RNA的长度在37°C下孵育反应2-4小时。接下来，将DNase I加入反应中，并在37°C下孵育30分钟以消化DNA模板。使用二氧化硅离心柱纯化RNA。
- 在5'手柄的标记反应期间（表3），通过T4 DNA聚合酶38，50在手柄的3'末端加入生物素-16-dUTP。在室温下进行反应1-2小时。之后，使用二氧化硅离心柱纯化DNA。
注意：由于5'手柄必须在其3'端标记（图2B），因此在PCR期间无法进行标记。 - 将上述组分 - 5'手柄（3'用生物素标记），3'手柄（用地高辛标记的5'）和RNA - 在退火缓冲液中以1：1：1的摩尔比混合（80%甲酰胺，400mM NaCl，40 mM HEPES，pH 7.5，0.5 mM EDTA，pH 8），以获得所需的RNA / DNA杂交（表4）。将退火混合物加热至85°C10分钟，然后缓慢冷却至4°C。
- 将退火样品与1/10体积的3M乙酸钠（pH 5），3体积的冰冷乙醇混合，并在-80°C下孵育至少1小时或在-20°C下过夜。
- 将样品在4°C下以15，000× g 离心30分钟。 弃去上清液并在真空下干燥沉淀（通常不可见）。
- 最后，将沉淀重悬于50μL无RNase水中并制成等分试样。将等分试样储存在-80°C直至使用。对于短期储存，样品也可以储存在-20°C。
2. 仪器设置
注意：以下协议针对 LUMICKS 公司的商用光学镊子仪器 C-Trap 进行了优化。因此，在使用其他光学镊子仪器时，可能需要对所提出的步骤进行调整。如果不使用，机器的微流体系统保存在漂白剂（次氯酸钠溶液）中，必须在使用前清洗。
- 丢弃漂白剂，用1 mL无RNase水填充注射器。
- 将50μL0.5M硫代硫酸钠加入至少1mL无RNase水中，并彻底洗涤系统（1 bar，至少0.5mL）以消除系统中剩余的漂白剂。
- 从注射器中丢弃硫代硫酸钠溶液。用新鲜的注射器替换注射器，并用至少0.5毫升不含RNase的水清洗系统。
注意：请注意，微流体系统永远不会干涸，以避免系统中出现气泡。 - 将2滴浸没油（折射率为1.33）或约70μL水放在物镜顶部。
- 将储料盒内的流通池放在其位置。
- 将2滴浸油（折射率为1.51）滴在流通池顶部。
- 打开镊子机中的激光设备。运行后，以100%打开软件界面中的陷印激光器。
- 使用诊断相机（Z-finder），通过转动微螺钉，将Z轴调整到第二和第三反射（接口）之间的腔室中间，其中折射环最大。
注：每次物镜靠近测量室，物镜的焦平面穿过两相之间的界面时，在Z-finder模式下都可以识别反射。可能有4个接口：（i）水/浸油和底部玻璃（ii）腔室内的底部玻璃和缓冲器（iii）腔室内的缓冲器和顶部玻璃（iv）冷凝器的顶部玻璃和浸没油。 - 调整冷凝器位置（将捕获激光器设置为约50%），使冷凝器接触到测量室顶部的浸没油。
- 通过使用聚光镜缓慢向下/向上移动来调整焦点，因此在月球模式（诊断相机）中显示大约10个光带。
3. 样品测量
- 在室温下，将抗地高辛包被的珠子（AD）与样品结构（3μL 0.1%（w / v）AD珠悬浮液+ 4μL样品）和1μLRNase抑制剂和8μL测定缓冲液（300mM KCl，5 mM MgCl2，20mM HEPES，pH 7.6，0.05%吐温20，5 mM DTT）孵育10-20分钟。孵育后，将样品稀释在500μL测定缓冲液中。
注意：建议添加除氧剂，特别是在荧光测量期间添加到缓冲液中，以防止氧化损伤。这里使用含有葡萄糖（8.3 mg / mL），葡萄糖氧化酶（40 U / mL）和过氧化氢酶（185 U / mL）的氧气清除系统。 - 将0.8μL1%（w / v）链霉亲和素包被（SA）微球与1 mL测定缓冲液混合。
- 丢弃注射器中的水，并用相应的悬浮液/溶液填充注射器。在大约1巴处洗涤至少2分钟，然后开始捕捉珠子。
注：根据实验设置，可以使用不同的通道排列（图3）。通常，一个流道中充满了携带RNA分子的抗地高辛珠。第二个通道充满链霉亲和素包被的珠子。缓冲通道用于形成系绳。可以使用第四个通道来加载RNA结合蛋白（图3C），或者可以直接在缓冲通道中添加RBP（图3B）。 - 要捕获磁珠，请将光学陷阱彼此分开。首先移动到AD通道，并在陷阱1中捕获AD珠。接下来，将舞台移动到 SA 通道，并通过陷阱 2 捕获单个 SA 珠。
注意：尽量保持在缓冲液和磁珠通道的接口处，以避免丢失已捕获的磁珠，或防止同一陷阱捕获多个磁珠。 - 一旦捕获了合适尺寸的磁珠，移动到缓冲通道并停止层流。接下来，执行力校准以检查疏水阀刚度。相应的刚度值在 x/y 轴上的差值不应超过 10-15%。
注：根据磁珠尺寸调整激光功率或陷阱之间的激光分割。只要磁珠模板匹配，就不必对每个磁珠对进行力校准（相似性分数>0.9）。但是，应定期进行，或者至少在每次改变测定条件时进行。 - 开始钓鱼，方法是将珠子彼此靠近，等待几秒钟，然后将它们移开，重复直到形成系绳。系绳形成导致在将两颗珠子彼此拉开时测量的力增加。
注意：为避免形成多个系绳，磁珠不应移动得太近。在两颗珠子之间抓住系绳后，可以通过找到过度拉伸的平台来检查系绳质量。对于单个系绳，平台应介于 50 至 60 pN 之间。 - 获得系绳后，开始测量。根据所研究的现象，应选择不同的测量设置（图1B-D）。
注意：通常在实验开始时，会进行力斜坡实验以检查系绳质量并探测行为。之后，还可以开始恒定力或恒定位置实验，以进一步研究状态转换。一旦对RNA样品进行了足够数量的测量以确定其行为，就可以将标记因子添加到系统中以执行共聚焦测量。 - 要进行荧光测量，请打开光学镊子仪器中的共聚焦激光器和光子计数器单元。
- 在软件界面中打开所需波长的激发激光器，并根据荧光团将激光器的功率设置为5%或更高。
注：在不测量时，激发激光器的功率设置降低至0%，以避免对样品造成过度的光损伤。 - 使用软件的图像功能开始对样品进行成像。
注：为了获得聚焦良好的图像，共聚焦显微镜和光学陷阱的焦平面必须对齐。为此，可以采用蓝色激光通道中聚苯乙烯微球的自发荧光。光学陷阱的焦平面在z轴上上或下移动，直到磁珠的图像达到其最大直径。在这个位置，可以测量来自磁珠之间拴住的分子的荧光信号。 - 要使用运动记录仪功能，请指定运动记录仪轴的x-y位置，以便它允许检测磁珠之间的系绳。
- 在整个测量过程中，通过将微珠移动到不同的通道或通过改变微流体系统中提供的缓冲液，可以很容易地改变缓冲液成分。
4. 数据分析
- 原始数据预处理
- 通过使用简单的脚本，对原始数据进行足够低采样，以（i）允许更快的后续数据处理，但（ii）仍然包含所有关键信息（图4A）。通常，100-5000 Hz适用于此目的。
注意：光学镊子实验中的数据收集频率通常高于分析所需的频率 - 在所提出的实验中，数据收集频率默认设置为78 125 Hz。由于存储空间有限，因此降低数据的采样率既方便又省时。在这里，原始数据被缩减了 30 倍的采样。 - 接下来，采用信号滤波器来降低来自信号的高频测量噪声（图4A）。相应地调整滤波度和截止频率参数，以优化不同实验的数据输出（图5）。
注：在信号滤波器中，巴特沃斯滤波器51 是使用最广泛的滤波器之一。补充数据中提供了一个自定义编写的python脚本，允许对原始数据进行预处理。需要针对不同的实验优化降采样和信号滤波参数（截止频率、滤波器度）。
- 通过使用简单的脚本，对原始数据进行足够低采样，以（i）允许更快的后续数据处理，但（ii）仍然包含所有关键信息（图4A）。通常，100-5000 Hz适用于此目的。
- 对于力斜坡数据分析，请使用以下步骤。
- 通过在力轨迹图上找到相应的点或使用自定义编写的脚本手动标记步骤。展开步骤的特征是力突然下降，力-距离（FD）曲线的距离增加。
- 一旦标记了展开事件，使用适当的模型拟合FD曲线的不同区域（图4D）。
注意：对于第一个展开步骤之前的区域，系绳可以被认为是"双绞合的"，并且通常使用可扩展的蠕虫状链模型（WLC）47，52，53进行拟合。第一次展开事件之后的部分被认为是双链核苷酸（手柄）和单链核苷酸（未折叠RNA分子）的组合。因此，数据拟合更加复杂 - 通常采用2个WLC模型或WLC和自由连接链（FJC）模型的组合36，39，52。可扩展 WLC 模型具有两个主要拟合参数：轮廓长度 （LC） 和持久性长度 （LP）。轮廓长度对应于完全拉伸分子的长度，持久性长度定义了目标分子的弯曲特性。该模型可以用下面的等式（1）来描述。WLC可用于对折叠区域和展开区域的行为进行建模，尽管对于每个区域，必须使用具有不同参数的单独模型。
(1)
其中 x 是延伸，LC 是等值线长度，F 是力，LP 是持久性长度，kB 是玻尔兹曼常数，T 是热力学温度，S 是拉伸模量。
第二种称为自由连接链（FJC）的模型通常用于描述展开的单链区域的行为。它使用聚合物的相似参数，但将"链"的每个单元视为刚性杆，这里对应于未展开的单链区域的核苷酸。以下等式 （2） 描述了此模型：
(2)
注意：我们的实验室最近开发了一种算法，允许对原始力斜坡数据进行批处理，称为"实用光学镊子分析TOol（POTATO）54"。该算法对数据进行缩减采样和过滤，然后识别可能的展开步骤，最后执行数据拟合。POTATO内置于用户友好的图形用户界面（GUI）（https://github.com/REMI-HIRI/POTATO）。
- 按如下方式处理恒力数据：
注意：以下指令可以类比应用于恒定位置数据。- 对于恒定力数据，绘制随时间变化的距离（图5）。直方图显示不同构象在位置相对变化上的频率（计数）是表征各种显性和次要状态的有用方法（图7）。
- 使用（多个）高斯函数拟合直方图，以估计给定力下单个构象的总体百分比（图7C）。高斯拟合、平均位置和标准差概述了不同总体之间的力相关关系。
注：补充数据中提供了一个自定义编写的python脚本，允许对恒定力数据进行预处理和基本双峰高斯拟合。参数（截止频率、滤波器度、预期均值、标准偏差值和幅度）需要针对不同的实验进行优化。 - 接下来，使用隐马尔可夫模型进一步分析状态，这可能会发现额外的折叠中间体（构象）55。有关恒力和隐马尔可夫模型的更多信息，可以参考55，56，57，58。
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Representative Results
在本节中，重点主要放在荧光光学镊子对RNA-蛋白质/配体相互作用的测量上。有关一般RNA光学镊子实验的描述和相应的代表性结果，请参见32。有关RNA / DNA - 蛋白质相互作用的更详细讨论，另见1，2，26，59，60。
原则上，RBP或任何其他 反式作用的感兴趣因子在RNA上的结合会稳定，破坏或可能改变分子的构象。下面显示了每种效应的机械可观察量的描述。然而，对于给定的RNA-蛋白质复合物观察到的实际效果不限于以下这些情况。
稳定
RNA结构可以被蛋白质或其他配体特异性识别和结合45，61，62，63，64。键的形成伴随着能量的释放。因此，必须克服额外的能量屏障才能展开给定的RNA结构。结果，可能观察到平均展开力的增加50，65。通过结合外部试剂（蛋白质，小分子，其他反式作用因子）来稳定RNA结构也可能导致结构折叠动力学的变化45。为此，可以在恒定力模式下进行进一步的测量，其中可以观察到折叠中间体之间的不太频繁的转换以及平衡中的力移位。
失 稳
一些蛋白质识别某些序列基序而不是特定的RNA结构。结合位点可以从高度特异性的基序到更一般的模式，例如GC或富含AU的拉伸60，66。然而，如果蛋白质优先与未折叠的单链RNA构象结合，则折叠和未折叠状态之间的平衡可以向未折叠状态转移36，43，67。在 图 6 和 图 7 中，描述了此类行为的示例。
结构改造
在某些情况下，RBP（或其他配体）可能将上述两种机制结合起来，使得RBP破坏先前占主导地位的构象的稳定性，并将平衡转向替代RNA结构44，68，69。切换到替代状态可能导致观察到的构象群体频率的变化以及单个折叠状态的发生或消失。这些变化可以首先在力斜坡实验中观察到，并且可以通过恒定力（或恒定位置）实验进一步研究。
反式作用因子对RNA折叠/展开的影响
本文研究了与SARS-CoV-2的-1程序核糖体移码元件相对应的RNA序列。该RNA元素被预测形成H型假结70，71。在力-距离轨迹的例子中，RNA以两个连续的步骤展开和重合（图6A）。这两个步骤可能对应于两个茎环，它们是假结形成的先决条件。在这种情况下，没有观察到假结，因为RNA没有完全折叠或形成与假结竞争的替代结构。在添加 反作用因子ZAP后，观察到重合事件的突然消失和巨大的滞后（图6B）43。这表明蛋白质与RNA的单链状态结合，阻碍了二级结构的形成。此外，恒力实验证实了力斜坡实验的结果。因此，虽然RNA在10 pN左右完全折叠（图7A），但蛋白质的存在将重新折叠向较低的力移动，并且在10 pN时RNA仍然主要占据未折叠状态（图7B）。
OT测量与共聚焦显微镜相结合
接下来，显示了不同荧光团和标记核糖体的非特异性和特异性结合的示例性结果（图8）。在第一个例子中，SYTOX绿色染料用于标记系留的DNA / RNA杂交种。随着力的增加，染料结合更加丰富，从而产生更高的荧光信号。一旦力过高，系绳就会断裂，荧光信号丢失（图8A）。对于细菌核糖体的实验（图8B），使用与红色荧光染料偶联的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对赖氨酸残基进行非特异性标记。虽然存在降低标记蛋白质/复合物活性的风险，但最大的优点是实现了更强的信号，因为每个核糖体（平均）由多个荧光团标记。RNA构建体包含细菌核糖体识别的核糖体结合位点（RBS），该位点被放置在所研究的RNA序列的5'附近。在核糖体结合后，在系绳上观察到荧光信号。可以使用图像分析工具72进一步分析荧光数据，并且可以将结果与力数据相结合，从而可以研究折叠过渡。
图1：OT实验示意图和可能的测量方法。（A） 示意图，示意图说明光学镊子实验在中间使用SARS-CoV-2移码RNA。RNA杂交到ssDNA手柄上并固定在磁珠上。这些用于用聚焦的激光束对RNA施加拉力。力逐渐增加，直到RNA展开（底部）。 （B） 共聚焦显微镜与光学镊子相结合以监测标记因子与RNA结合的示意图。 （C） 示例恒定力数据可以通过将力固定在随时间变化的恒定值来获得，从而可以精确测量构象的停留时间。 （D） 从力斜坡测量中获得的示例力-距离（FD）曲线。展开步骤被观察到为FD轮廓的突然破裂。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：OT样品合成的一般方案。（A） 研究中采用的SARS-CoV-2移码RNA的实例序列和预测的二级结构。 （B） 含有目的序列（SoI）的载体，两侧是两个处理区域，可作为在3个PCR反应中生成DNA /RNA构建体的模板。引物在方案中根据其在相应PCR中的结合位点进行描述和编号。PCR 1产生 体外 转录模板，随后用于 体外 转录（IVT）反应以产生长RNA分子（浅蓝色）。PCR 2产生5'手柄，后来用生物素标记3'。PCR 3使用与地高昔宁偶联的前向引物产生3'地高辛标记的手柄。最后，对两个手柄和RNA进行退火，以产生适合光学镊子测量的DNA / RNA杂交结构。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：不同微流体通道设置的图示。（A） 具有5-微流体通道的流通池方案。 （B） 和 （C） 是 （A） 的红色虚线区域的放大。 （B） 简单的 3 通道设置，分别在通道 1 和 3 中使用 AD 磁珠和 SA 磁珠。因子位于通道 2 中。该装置适用于具有高亲和力的稳定蛋白质，因此低浓度是首选，以确保低荧光背景。侧面的珠道允许固定的系绳方向，并在必要时快速招募新珠子。 （C） 4 通道设置，系数在通道 4 中。这种安排对于最小的样品消耗特别有利。测量可以直接在通道4中进行。或者，为了避免背景荧光信号，可以在通道4中形成复合物，然后在通道3中进行测量。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：力斜坡实验的数据分析工作流。（一） 数据分析工作流程的流程图。首先对原始数据文件进行缩减采样和过滤，然后标记步骤并将各个状态拟合到相应的模型中。 （B） 原始数据含有大量噪声，妨碍了对展开/重新折叠事件的识别。此外，在大多数实验中，数据收集的频率高于必要的频率。 （C） 因此，采用缩减采样和信号过滤来平滑数据配置文件。 （D） 当分子仍处于折叠状态（在展开事件之前）时，最终使用WLC模型，当分子处于展开状态（在展开事件之后）时，使用WLC与FJC模型的组合或第二个WLC模型来拟合处理后的曲线。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：截止频率对数据输出的影响。 虽然原始数据输出可能会受到信号噪声（上图）的影响，但为数据分析选择适当的信号滤波参数至关重要。虽然适当的过滤有助于识别折叠中间体（截止频率0.1，中间），但过度过滤（截止频率<0.001，底部）可能导致分辨率损失。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：不存在和存在ZAP时的FD轨迹示例。（A） 在没有ZAP的情况下，SARS-CoV-2 RNA的展开（粉红色）和重折叠（蓝色）痕迹。该样品显示易于重新折叠，只有很小的滞后。 （B） 在 存在跨因子ZAP（400 nM）的情况下，RNA的展开（粉红色）和重折叠（蓝色）痕迹。样品显示出巨大的滞后，表明蛋白质与单链RNA结合并阻止其重新折叠。 （C） 显示在没有或不存在ZAP的情况下展开（粉红色）和重新折叠（蓝色）步骤数的条形图。虽然展开步骤的分布几乎不受ZAP存在的影响，但使用ZAP的重新折叠步骤的数量明显下降。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：不存在和存在 ZAP 时的恒定力数据示例。（A） 在10（向上）至13（底部）pN之间的力范围内获得的恒定力数据，显示了SARS-CoV-2移码RNA元件从完全折叠状态到完全展开状态的转变。每个图表都包含位置与时间的关系（左图）和直方图（右图）。 （B） 在存在ZAP（400 nM）的情况下获得的恒定力数据。蛋白质结合后，重新折叠受损。在10 pN时，与单独的RNA相比，在ZAP的存在下，RNA主要以未折叠状态存在。因此，表明平衡力向较低力的偏移。 （C） 位置数据的直方图可以通过将数据拟合到高斯函数来分析，以产生每个状态的相对丰度（从每个状态的曲线下的面积导出）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图8：OT与共聚焦显微镜相结合。（A） SYTOX绿色标记系绳的示例运动记录仪（左）。请注意，在力增加时信号强度增加。黑色箭头标记系绳断裂事件，这会导致信号丢失。描绘带有染料的系绳（装订）和破损后无染料（无信号）（右）。 （B） 核糖体在mRNA上特异性结合的动作记录仪示例（左）。结合事件可以作为两个磁珠之间系留RNA上的荧光信号来观察。描绘没有（无信号）和荧光标记的核糖体结合的系绳（结合）（右）。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 库存集中度 | 最终浓度 | 卷 | |
| 反应体积 | - | - | 500 μL |
| 10×缓冲区 | 10× | 1× | 50 μL |
| dNTP 混合 | 10 毫米 | 0.2 毫米 | 10 μL |
| 高保真DNA聚合酶 | 1.25 U/μL | 0.025 U/μL | 10 μL |
| 底漆 1 | 10 微米 | 0.4 微米 | 20 μL |
| 底漆 2 | 10 微米 | 0.4 微米 | 20 μL |
| 模板 | 100 纳克/μL | 1 纳克/微升 | 5 μL |
| 水 | - | - | 385 μL |
表1：PCR生成光学镊子结构的移液方案。
| 库存集中度 | 最终浓度 | 卷 | |
| 反应体积 | - | - | 300 μL |
| 5× 缓冲区 | 5× | 1× | 60 μL |
| rNTP 混合 | 25 毫米 | 5 毫米 | 60 μL |
| RNase 抑制剂 | 40 U/μL | 0.7 U/μL | 5 μL |
| 焦磷酸酶 | 100 微毫升 | 1.7 毫微微单位/微升 | 4 μL |
| 断续器 | 100 平方米 | 3.3 毫米 | 10 μL |
| T7 核糖核酸聚合酶 | 50 U/μL | 3.3 U/μL | 20 μL |
| 模板 | 120 纳克/μL | 2 纳克/微升 | 5 μL |
| 水 | - | - | 136 μL |
表2：体外转录移液方案 。
| 库存集中度 | 最终浓度 | 卷 | |
| 反应体积 | - | - | 100 μL |
| 10×缓冲器 （NEB 2.1） | 10× | 1× | 10 μL |
| 软件支持 | 1微克/毫升 | 100 纳克/μL | 1 μL |
| 生物素-16-dUTP | 1 毫米 | 50 微米 | 5 μL |
| T4 DNA聚合酶 | 30 U/μL | 1.5 U/μL | 5 μL |
| DNA 5' 手柄 （20-60 μg） | 300 纳克/微升 | 237 纳克/微升 | 79 μL |
表3：用于3'末端生物素标记的移液方案。
| 库存集中度 | 最终浓度 | 最终金额 | 卷 | |
| 反应体积 | - | - | - | 300 μL |
| 退火缓冲液 | 1.25× | 1× | - | 240 μL |
| RNase 抑制剂 | 40 U/μL | 0.5 U/μL | - | 5 μL |
| 5' 生物素化 DNA 手柄 | 300 纳克/微升 | 10 纳克/μL | 3微克 | 10 μL |
| 3' DNA 手柄 | 300 纳克/微升 | 10 纳克/μL | 3微克 | 10 μL |
| 核糖核酸 | 150 纳克/微升 | 10 纳克/μL | 3微克 | 20 μL |
| 水 | - | - | - | 5 μL |
表4：用于光学镊子结构退火的移液方案。
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Discussion
在这里，我们展示了使用荧光耦合光学镊子来研究RNA分子与各种配体的相互作用和动态行为。下面，将讨论当前技术的关键步骤和局限性。
协议中的关键步骤
与许多其他方法一样，样品的质量对于获得可靠数据至关重要。因此，为了获得尽可能高质量的样品，值得花时间优化样品制备的程序。优化步骤包括正确的引物设计、退火温度、RNA 和蛋白质纯化步骤。
在整个实验过程中，使用过滤的吸头和溶液对于保持无RNase条件至关重要。此外，微流体系统在不使用时保持在漂白剂中。在开始测量之前，重要的是要用硫代硫酸钠和不含RNase的水正确清洗系统，以从系统中除去漂白剂。
如果在整个实验过程中使用相同尺寸的磁珠，则不需要每次都执行力校准。然而，应定期进行力校准检查，以确保实验的可重复性。
方法的修改和故障排除
荧光团稳定性和光漂白
荧光测量过程中的一个复杂因素是光漂白。由于监测翻译的时间范围可以从几秒钟延长到几分钟，具体取决于系统，因此还应考虑并尽可能减少测量过程中的光漂白73。一种选择是采用更稳定的荧光团，它们不易发生光漂白，例如最近引入的量子点49，74，75。通过使用"寻氧剂"系统去除氧分子，例如葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶偶联，还可以实现进一步的稳定性。葡萄糖氧化酶通过将氧气转化为过氧化氢来从环境中除去氧气，然后被过氧化氢酶分解。也可以使用替代的除氧系统76，77。
微流体
保持连续的层流对于正确测量至关重要。最重要的是，系统永远不应该干涸。不幸的是，限制性商业惯例或其他感兴趣的 反作用因素通常只能少量用于实验，因此保持连续流动可能具有挑战性和成本密集。如果在样品应用期间将气泡引入系统，则手动压力或乙醇洗涤通常足以将其去除。
该方法的局限性
OT与共聚焦显微镜的结合也带来了一些局限性。首先，共聚焦单元的焦平面必须与陷阱中心正确对齐，以便正确记录荧光信号。此外，对于共聚焦测量，通常需要每个站点至少 2 kb 的手柄17。虽然原则上可以使用更长的句柄，但为了数据分析的准确性，应该考虑句柄的能量贡献和持久性长度的变化78。另一个关键点是用于增加荧光团半衰期的除氧剂，也会导致溶液pH值的相对快速变化76。这些变化可以通过增加缓冲化合物的浓度来部分补偿;然而，在测量过程中，应定期补充样品（每30-60分钟），以确保通过实验的一致条件。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Anuja Kibe和Jun. Prof. Redmond Smyth对手稿的批判性审查。我们感谢塔季扬娜·科赫的专家技术援助。我们感谢Kristyna Pekarkova帮助录制实验视频。我们实验室的工作得到了亥姆霍兹协会的支持，并得到了欧洲研究理事会（ERC）Grant Nr. 948636（到NC）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| E. coli HB101 | lab collection | N/A | cloning of the vectors |
| Chemicals and enzymes | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 31424 | Buffers |
| Biotin-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinylation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Buffers |
| Catalase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford Labs | D11000 | Buffers |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4527 | in vitro transcription |
| dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Buffers |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 11814320001 | Buffers |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | Oxygen scavanger system |
| Glucose-oxidase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
| HEPES | Carl Roth | HN78.3 | Buffers |
| Magnesium chloride | Carl Roth | 2189.1 | Buffers |
| Phusion DNA polymerase | NEB | M0530L | Gibson assembly, cloning |
| Potassium chloride | Merck | 529552-1KG | Buffers |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
| Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic | NEB | M0296L | in vitro transcription |
| RNase Inhibitor | Molox | 1000379515 | Buffers |
| rNTPS | life technologies | R0481 | in vitro transcription |
| Sodium thiosulophate | Sigma-Aldrich | S6672-500G | Bleach deactivation |
| Sytox Green | Lumicks | N/A | confocal measurements |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | Biotinylation |
| T5 exonuclease | NEB | M0363S | Gibson assembly, cloning |
| T7 RNA polymerase | Produced in-house | N/A | in vitro transcription |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0267S | PCR |
| Taq ligase | Biozym | L6060L | Gibson assembly, cloning |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
| Kits | |||
| Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) | Nanotemper | MO-L011 | Used for ribosome labeling |
| Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | Ribosomes used for the labeling |
| Oligonucleotides | |||
| 5' handle T7 forward | Microsynth | custom order | 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
| 3’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
| 5' handle forward | Microsynth | custom order | 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2 |
| 5’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2 |
| 3’ handle forward | Microsynth | custom order | 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
| 3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin | Microsynth | custom order | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
| DNA vectors | |||
| pMZ_OT | produced in-house | N/A | further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
| Software and Algorithms | |||
| Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
| Bluelake | Lumicks | N/A | |
| Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
| InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
| Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
| POTATO | https://github.com/lpekarek/POTATO.git | N/A | |
| RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
| Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
| Other | |||
| Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
| Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Syringes | VWR | TERUMO SS+03L1 | |
| Devices | |||
| C-trap | Lumicks | N/A | optical tweezers coupled with confocal microscopy |
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