本方案介绍了一种利用光镊研究RNA-蛋白质相互作用的完整实验流程。文中概述了多种可能的实验装置，包括光镊与共聚焦显微镜联用的设置。
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本文内容
摘要
摘要
RNA 采用多种多样的结构折叠形式，这些结构对其功能至关重要，因而能够影响细胞内的多种过程。此外，RNA 的结构和功能可受到多种反式作用因子的调控，例如蛋白质、代谢物或其他 RNA。例如，移码 RNA 分子是一类位于编码区的调控性 RNA，可引导正在翻译的核糖体进入替代的开放阅读框，从而发挥基因开关的作用。这些 RNA 在与蛋白质或其他反式作用因子结合后，也可能形成不同的折叠构象。为了深入解析 RNA 结合蛋白在翻译过程中的作用及其对 RNA 结构与稳定性的调控机制，同时研究这些 RNA-蛋白质复合物之间的相互作用及其力学特性显得尤为关键。 本研究展示了如何利用单分子荧光耦合光镊技术，以高分辨率探究 RNA-蛋白质复合物的构象变化及热力学特征。以 SARS-CoV-2 程序性核糖体移码元件与锌指抗病毒蛋白短亚型这一反式作用因子的相互作用为例进行了详细阐述。此外，通过共聚焦单元对荧光标记的核糖体进行实时监测，最终有望实现对翻译延伸过程的研究。这种荧光耦合光镊检测方法可广泛应用于探索多种调控翻译的 RNA-蛋白质复合物或反式作用因子，有助于推动基于 RNA 的基因调控研究。
引言
遗传信息通过mRNA从DNA传递到蛋白质的过程是一种复杂的生化过程，细胞内大分子相互作用在各个水平上对其进行精确调控。在翻译调控中，RNA-蛋白质相互作用对于快速响应各种刺激和信号具有关键作用1,2。某些RNA-蛋白质相互作用影响mRNA的稳定性，从而改变RNA处于可翻译状态的时间。另一些RNA-蛋白质相互作用则与重编码机制相关，例如终止密码子通读、跳跃翻译或程序性核糖体移码（PRF）3,4,5,6,7。最近研究表明，多种RNA结合蛋白（RBPs）能够与刺激性mRNA元件及翻译机制相互作用，决定细胞内重编码发生的时间和程度7,8,9,10,11。因此，要深入解析RNA结合....
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方案
1. 样品制备
- 将目标序列克隆至含有λ DNA片段的载体中，这些λ DNA片段作为手柄序列图2)43,50.
- 首先生成用于后续的DNA模板 体外 通过PCR进行转录图2B；反应1）。在此PCR步骤中，T7启动子被添加至正义DNA分子的5'端32,33,43,50. 按照以下条件设置PCR反应 表1. 在PCR仪中运行PCR程序 50 µL 在热循环仪中用适当的循环次数分装等量样品。
- 通过两次独立的PCR反应制备引物表1, 图2B；反应2和3）。首先，通过PCR生成5'端接头。然后，使用5'端标记地高辛的引物，扩增生成3'端接头并同时用地高辛进行标记32
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结果
本节主要介绍利用荧光光镊测量RNA-蛋白质/配体相互作用的方法。有关常规RNA光镊实验及其代表性结果的描述，请参见32。关于RNA/DNA-蛋白质相互作用的更详细讨论，还可参见1,2,26,59,60。
原则上，RBP 或任何其他分子的结合 转录-作用的目标因子对RNA可起到稳定、去稳定作用，或可能改变分子的构象。以下展示了每种效应对应的机械可观测参数。然而，特定RNA-蛋白质复合物所表现出的实际效应并不局限于上述几种情况。
稳定化
RNA 结构可被蛋白质或其他配体特异性识别并结合
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讨论
本文展示了使用荧光耦合光镊研究RNA分子与各种配体之间相互作用及动态行为的方法。下文将讨论该技术的关键步骤及其局限性。
实验方案中的关键步骤
与许多其他方法一样，样品的质量对于获得可靠数据至关重要。因此，为了获得尽可能高质量的样品，投入时间优化样品制备流程是十分必要的。优化步骤包括引物的合理设计、退火温度的确定，以及RNA和蛋白质的纯化步骤。
在整个实验过程中，使用带滤芯的吸头和溶液对于维持无RNase环境至关重要。此外，微流控系统在不使用时应保存在漂白剂中。开始测量前，必须用硫代硫酸钠和无RNase水对系统进行充分清洗，以彻底去除系统中的漂白剂。
如果在整个实验过程中使用相同尺寸的微珠，则无需每次进行力校准。然而，为了确保实验的可重复性，应定期进行力校准检查。
方法的改进与故障排除
荧光团稳定性和光漂白
荧光测量.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Anuja Kibe和准教授Redmond Smyth对稿件的审阅。感谢Tatyana Koch提供的专业技术支持。感谢Kristyna Pekarkova在实验视频录制过程中提供的帮助。我们实验室的工作得到了亥姆霍兹协会以及欧洲研究理事会（ERC）资助项目编号948636（资助对象：NC）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌菌株 | |||
| 大肠杆菌 HB101 | 实验室合集 | N/A | 载体的克隆 |
| 化学品和酶 | |||
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 31424 | 缓冲液 |
| Biotin-16-dUTP | 罗氏 | 11093070910 | 生物素标记 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | 缓冲液 |
| 过氧化氢酶 | Lumicks | N/A | 氧气清除系统 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Melford Labs | D11000 | 缓冲液 |
| 牛胰腺来源的DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | 体外转录 |
| dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | 缓冲液 |
| 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | 11814320001 | 缓冲液 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | 氧气清除系统 |
| 葡萄糖氧化酶 | Lumicks | N/A | 氧气清除系统 |
| HEPES | 卡尔·罗斯 | HN78.3 | 缓冲液 |
| 氯化镁 | 卡尔·罗斯 | 2189.1 | 缓冲液 |
| Phusion DNA聚合酶 | NEB | M0530L | Gibson 组装，克隆 |
| 氯化钾 | 默克 | 529552-1KG | 缓冲液 |
| PrimeSTAR GXL DNA聚合酶 | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
| 焦磷酸酶，耐热型，无机 | NEB | M0296L | 体外转录 |
| RNase抑制剂 | Molox | 1000379515 | 缓冲液 |
| rNTPs | life technologies | R0481 | 体外转录 |
| 硫代硫酸钠 | Sigma-Aldrich | S6672-500G | 漂白剂失活 |
| Sytox Green | Lumicks | N/A | 共聚焦测量 |
| T4 DNA 聚合酶 | NEB | M0203S | 生物素标记 |
| T5核酸外切酶 | NEB | M0363S | Gibson 组装，克隆 |
| T7 RNA聚合酶 | 自行生产 | N/A | 体外转录 |
| Taq DNA聚合酶 | NEB | M0267S | PCR |
| Taq连接酶 | Biozym | L6060L | Gibson 组装，克隆 |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | 缓冲液 |
| 试剂盒 | |||
| Monolith 蛋白质标记试剂盒 RED-NHS 第二代（胺反应性） | Nanotemper | MO-L011 | 用于核糖体标记 |
| Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | 用于标记的核糖体 |
| 寡核苷酸 | |||
| 5' 手柄 T7 正向引物 | Microsynth | 定制订单 | 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3’用于在PCR 1中体外转录生成光镊实验模板 |
| 3’ 处理逆转 | Microsynth | 定制订单 | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3'，用于在PCR1中生成光镊体外转录模板 |
| 5' 手柄正向引物 | Microsynth | 定制订单 | 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3'，用于在PCR 2中生成5'接头 |
| 5’ 处理逆转 | Microsynth | 定制订单 | 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’，用于在PCR 2中生成5'接头 |
| 3’ 处理正向 | Microsynth | 定制订单 | 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3'，用于在PCR 3中生成3'接头 |
| 3’ 反向手柄 5’用地高辛标记 | Microsynth | 定制订单 | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3'，用于在PCR 3中生成3'接头 |
| DNA 载体 | |||
| pMZ_OT | 自行制备 | N/A | 进一步描述见 "Cardiovirus 2A 蛋白的结构研究揭示了 RNA 识别与翻译调控的分子基础" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035；doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
| 软件与算法 | |||
| 原子 | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
| Bluelake | Lumicks | N/A | |
| Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
| InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
| Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
| POTATO | https://github.com/lpekarek/POTATO.git | N/A | |
| RNA结构 | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
| 斯派德 | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
| 其他 | |||
| 链霉亲和素包被的聚苯乙烯微粒，1.5–1.9 µm，5 ml，1.0%（w/v） | Spherotech | SVP-15-5 | |
| 抗地高辛包被的聚苯乙烯微粒，2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| 注射器 | VWR | TERUMO SS+03L1 | |
| 设备 | |||
| C-trap | Lumicks | N/A | 共聚焦显微镜耦合的光镊 |
参考文献
- Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096(2019).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G.
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重印与许可
