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Biochemistry

अनुवाद विनियमन में आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62589
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

यह प्रोटोकॉल ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करके आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक पूर्ण प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है। कई संभावित प्रयोगात्मक setups confocal माइक्रोस्कोपी के साथ ऑप्टिकल चिमटी के संयोजन सहित रेखांकित कर रहे हैं.

Abstract

आरएनए विविध संरचनात्मक सिलवटों को अपनाता है, जो इसके कार्यों के लिए आवश्यक हैं और इस प्रकार सेल में विभिन्न प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, एक आरएनए की संरचना और कार्य को विभिन्न ट्रांस-एक्टिंग कारकों, जैसे कि प्रोटीन, मेटाबोलाइट्स या अन्य आरएनए द्वारा संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फ्रेमशिफ्टिंग आरएनए अणु, कोडिंग क्षेत्रों में स्थित नियामक आरएनए हैं, जो राइबोसोम को एक वैकल्पिक खुले पढ़ने के फ्रेम में सीधे अनुवाद करते हैं, और इस तरह जीन स्विच के रूप में कार्य करते हैं। वे प्रोटीन या अन्य ट्रांस-कारकों के लिए बाध्य होने के बाद विभिन्न सिलवटों को भी अपना सकते हैं। अनुवाद में आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन की भूमिका को विच्छेदित करने के लिए और वे आरएनए संरचना और स्थिरता को कैसे संशोधित करते हैं, इन आरएनए-प्रोटीन परिसरों की इंटरप्ले और यांत्रिक विशेषताओं का एक साथ अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। यह काम दिखाता है कि एक उच्च रिज़ॉल्यूशन पर आरएनए-प्रोटीन परिसरों के संरचनात्मक और थर्मोडायनामिक परिदृश्य का पता लगाने के लिए एकल-अणु-प्रतिदीप्ति-युग्मित ऑप्टिकल चिमटी को कैसे नियोजित किया जाए। एक उदाहरण के रूप में, सार्स-कोव -2 प्रोग्राम किए गए राइबोसोमल फ्रेमशिफ्टिंग तत्व की बातचीत जस्ता-उंगली एंटीवायरल प्रोटीन के ट्रांस-एक्टिंग फैक्टर शॉर्ट आइसोफॉर्म के साथ विस्तृत है। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति-लेबल वाले राइबोसोम की निगरानी कॉन्फोकल इकाई का उपयोग करके की गई थी, जो अंततः अनुवाद बढ़ाव के अध्ययन को सक्षम करेगा। प्रतिदीप्ति युग्मित ओटी परख व्यापक रूप से विविध आरएनए-प्रोटीन परिसरों या ट्रांस-अभिनय कारकों का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है जो अनुवाद को विनियमित करते हैं और आरएनए-आधारित जीन विनियमन के अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

एमआरएनए के माध्यम से डीएनए से प्रोटीन में आनुवंशिक जानकारी का हस्तांतरण एक जटिल जैव रासायनिक प्रक्रिया है, जिसे कोशिकाओं के अंदर मैक्रोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन के माध्यम से सभी स्तरों पर सटीक रूप से विनियमित किया जाता है। ट्रांसलेशनल विनियमन के लिए, आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन विभिन्न उत्तेजनाओं और संकेतों पर तेजी से प्रतिक्रिया करने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका प्रदान करता है1,2। कुछ आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन एमआरएनए स्थिरता को प्रभावित करते हैं और इस तरह एक आरएनए के ट्रांसलेशनल रूप से सक्रिय होने के समय को बदल देते हैं। अन्य आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन रीकोडिंग तंत्र से जुड़े होते हैं जैसे कि स्टॉप-कोडोन रीडथ्रू, बाईपासिंग, या प्रोग्राम किए गए राइबोसोमल फ्रेमशिफ्टिंग (पीआरएफ) 3,4,5,6,7। हाल ही में, उत्तेजक एमआरएनए तत्वों और अनुवाद मशीनरी के साथ बातचीत करने के लिए कई आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) का प्रदर्शन किया गया है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि सेल 7,8,9,10,11 में कब और कितना रीकोडिंग होगा। इस प्रकार, अनुवाद में आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन की भूमिका को विच्छेदित करने के लिए और वे आरएनए संरचना और स्थिरता को कैसे संशोधित करते हैं, इन आरएनए-प्रोटीन परिसरों के इंटरैक्शन सिद्धांतों और यांत्रिक गुणों का विस्तार से अध्ययन करना महत्वपूर्ण है।

दशकों के काम ने अनुवाद की बहु-चरणीय और बहु-घटक प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए नींव रखी है, जो गति और सटीकता प्राप्त करने के लिए अनुवाद मशीनरी के आरएनए और प्रोटीन घटकों के बीच जटिल संचार पर निर्भर करता है12,13,14। जटिल नियामक घटनाओं को समझने में एक महत्वपूर्ण अगला कदम उच्च परिशुद्धता 12,15,16,17 पर अनुवाद के दौरान बलों, टाइमस्केल और संरचनात्मक निर्धारकों का निर्धारण कर रहा है। आरएनए संरचनात्मक गतिशीलता का अध्ययन और विशेष रूप से अनुवाद के दौरान आरएनए संरचना पर ट्रांस-अभिनय सहायक कारक कैसे कार्य करते हैं, ऑप्टिकल चिमटी या शून्य-मोड वेवगाइड 16,17,18,19,20,21,22,23,24 सहित एकल-अणु उपकरणों के उद्भव से और अधिक रोशन किया गया है। ,25,26.

ऑप्टिकल चिमटी (ओटी) एक अत्यधिक सटीक एकल-अणु तकनीक का प्रतिनिधित्व करती है, जिसे प्रतिलेखन सहित कई प्रकार की आरएनए-निर्भर गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है, और अनुवाद 26,27,28,29,30,31,32। ऑप्टिकल चिमटी के उपयोग ने आणविक इंटरैक्शन, न्यूक्लिक एसिड संरचनाओं, और थर्मोडायनामिक गुणों, कैनेटीक्स और इन प्रक्रियाओं के ऊर्जावानों की जांच की अनुमति दी है16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . ऑप्टिकल चिमटी परख एक केंद्रित लेजर बीम के साथ सूक्ष्म वस्तुओं के फंसाने पर आधारित है। एक विशिष्ट ओटी प्रयोग में, ब्याज के अणु को दो पारदर्शी (आमतौर पर पॉलीस्टीरीन) मोतियों (चित्रा 1 ए) 27 के बीच जोड़ा जाता है। इन मोतियों को तब ऑप्टिकल जाल द्वारा पकड़ा जाता है, जो स्प्रिंग्स की तरह व्यवहार करते हैं। इस प्रकार, अणु पर लागू बल की गणना केंद्रित लेजर बीम (जाल केंद्र) के केंद्र से मनका के विस्थापन के आधार पर की जा सकती है। हाल ही में, ऑप्टिकल चिमटी confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1B) के साथ संयुक्त किया गया है, प्रतिदीप्ति या Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) माप 40,41,42 सक्षम. यह एक साथ माप की अनुमति देने वाले संभावित प्रयोगों का एक नया क्षेत्र खोलता है और इसलिए, बल स्पेक्ट्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति डेटा का सटीक सहसंबंध।

यहां, हम ट्रांसलेशनल फ्रेमशिफ्टिंग को विनियमित करने वाले प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करके प्रयोगों का प्रदर्शन करते हैं। उद्देश्य और संघनित्र के बीच, पांच चैनलों के साथ एक प्रवाह सेल लैमिनर प्रवाह के साथ निरंतर नमूना आवेदन को सक्षम बनाता है। माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के माध्यम से, विभिन्न घटकों को सीधे इंजेक्ट किया जा सकता है, जो हाथों पर समय को कम करने के साथ-साथ पूरे प्रयोग में बहुत कम नमूना खपत की अनुमति देता है।

सबसे पहले, ओटी प्रयोगों के डिजाइन की सहायता के लिए एक बुनियादी दिशानिर्देश प्रस्तावित किया गया है और विभिन्न सेटअपों के लाभों के साथ-साथ नुकसान पर चर्चा की जाती है। अगला, नमूनों और प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो की तैयारी का वर्णन किया गया है, और डेटा विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए, हम सार्स-कोव-2 फ्रेमशिफ्टिंग आरएनए तत्व (चित्रा 2 ए) का अध्ययन करने के लिए आरएनए स्ट्रेचिंग प्रयोगों से प्राप्त परिणामों को ट्रांस-एक्टिंग फैक्टर के साथ जस्ता-उंगली एंटीवायरल प्रोटीन (जैप) के छोटे आइसोफॉर्म के साथ रेखांकित करते हैं, जो एक वैकल्पिक रीडिंग फ्रेम 43 से वायरल आरएनए के अनुवाद को बदल देता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शित किया जाता है कि प्रतिदीप्ति-लेबल राइबोसोम को इस ओटी कॉन्फोकल परख में नियोजित किया जा सकता है, जो अनुवाद मशीनरी की प्रक्रियाशीलता और गति की निगरानी के लिए उपयोगी होगा। यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग अनुवाद के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए विभिन्न बफर, लिगैंड, या अन्य सेलुलर घटकों के प्रभाव का तेजी से परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, आम प्रयोगात्मक नुकसान और उन्हें समस्या निवारण करने के तरीके पर चर्चा की जाती है। नीचे, प्रयोगात्मक डिजाइन में कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं को रेखांकित किया गया है।

डिजाइन बनाएँ
सिद्धांत रूप में, एक ओटी-संगत आरएनए निर्माण बनाने के लिए दो सामान्य दृष्टिकोण हैं। पहला दृष्टिकोण एक लंबे आरएनए अणु को नियोजित करता है जिसे पूरक डीएनए हैंडल के साथ संकरित किया जाता है, इस प्रकार दो आरएनए / डीएनए हाइब्रिड क्षेत्रों से मिलकर एक निर्माण होता है जो बीच में एक एकल-फंसे हुए आरएनए अनुक्रम को फ्लैंक करता है (चित्रा 2 बी)। इस दृष्टिकोण को अधिकांश ओटी आरएनए प्रयोगों 33,44,45 में नियोजित किया गया है।

दूसरा दृष्टिकोण dsDNA हैंडल का लाभ लेता है जिसमें कम (लगभग 20 nt) overhangs15,17 होता है। इन overhangs तो आरएनए अणु के साथ संकरित कर रहे हैं. हालांकि डिजाइन में अधिक जटिल, डीएसडीएनए हैंडल का उपयोग डीएनए / आरएनए-हाइब्रिड सिस्टम की कुछ सीमाओं को दूर करता है। सिद्धांत रूप में, यहां तक कि बहुत लंबे हैंडल (>10kb) को लागू किया जा सकता है, जो कॉन्फोकल माप के लिए अधिक सुविधाजनक है। इसके अलावा, आरएनए अणु को टीथर स्थिरता बढ़ाने के लिए डीएनए हैंडल पर लिगेट किया जा सकता है।

एंड-लेबलिंग रणनीति
निर्माण को एक मजबूत आणविक बातचीत के माध्यम से मोतियों से जोड़ा जाना चाहिए। जबकि मोतियों के लिए हैंडल के सहसंयोजक बंधन के लिए दृष्टिकोण उपलब्ध हैं46, मजबूत लेकिन गैर-सहसंयोजक इंटरैक्शन जैसे कि स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन और डिगॉक्सिजेनिन-एंटीबॉडी आमतौर पर ओटी प्रयोगों में उपयोग किए जाते हैं15,33,35,45। वर्णित प्रोटोकॉल में, निर्माण को बायोटिन या डिगोक्सीजेनिन के साथ लेबल किया जाता है, और मोतियों को क्रमशः डिगॉक्सिजेनिन के खिलाफ स्ट्रेप्टाविडिन या एंटीबॉडी के साथ लेपित किया जाता है (चित्रा 1 ए)। यह दृष्टिकोण लगभग 60 पीएन (प्रति टेदर) 47 तक बलों को लागू करने के लिए उपयुक्त होगा। इसके अलावा, विभिन्न 5 'और 3' लेबलिंग रणनीतियों का उपयोग मोतियों के बीच गठित टेदर के अभिविन्यास को निर्धारित करने की अनुमति देता है17।

प्रतिदीप्ति माप के लिए प्रोटीन लेबलिंग
कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए, प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण हैं। उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोरस को अमीनो एसिड अवशेषों से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जा सकता है जो प्रोटीन में मूल रूप से पाए जाते हैं या एक प्रतिक्रियाशील कार्बनिक समूह के माध्यम से साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा पेश किए जाते हैं। थिओल या अमाइन-प्रतिक्रियाशील रंजक का उपयोग क्रमशः सिस्टीन और लाइसिन अवशेषों के लेबलिंग के लिए किया जा सकता है। लेबलिंग 48,49 की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए कई प्रतिवर्ती सुरक्षा विधियां हैं, हालांकि देशी प्रोटीन को आमतौर पर कई अवशेषों पर लेबल किया जाएगा। यद्यपि फ्लोरोफोर का छोटा आकार एक लाभ प्रदान कर सकता है, गैर-विशिष्ट लेबलिंग प्रोटीन गतिविधि में हस्तक्षेप कर सकती है और इस प्रकार सिग्नल तीव्रता अलग-अलग हो सकती है। इसके अलावा, लेबलिंग दक्षता संकेत तीव्रता के आधार पर विभिन्न प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकता है। इसलिए, प्रयोग से पहले एक गतिविधि की जांच की जानी चाहिए।

यदि ब्याज के प्रोटीन में एक एन- या सी-टर्मिनल टैग होता है, जैसे कि हिज़-टैग या स्ट्रेप-टैग, इन टैग की विशिष्ट लेबलिंग एक और लोकप्रिय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। इसके अलावा, टैग-लक्षित लेबलिंग प्रोटीन गतिविधि के साथ हस्तक्षेप करने वाले फ्लोरोफोर की संभावना को कम करती है और घुलनशीलता को बढ़ा सकती है। हालांकि, टैग-विशिष्ट लेबलिंग आमतौर पर मोनो-फ्लोरोफोर लेबल वाले प्रोटीन की पैदावार करती है, जो पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है। विशिष्ट लेबलिंग का एक और तरीका एंटीबॉडी को नियोजित करके पूरा किया जा सकता है।

माइक्रोफ्लुइडिक्स सेटअप
एक माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम के साथ ओटी का संयोजन विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच तेजी से संक्रमण की अनुमति देता है। इसके अलावा, वर्तमान प्रणालियां प्रवाह सेल के अंदर लैमिनर प्रवाह को बनाए रखने का लाभ उठाती हैं, जो प्रवाह दिशा के सापेक्ष लंबवत दिशा में अन्य चैनलों से तरल पदार्थों के मिश्रण को रोकती है। इसलिए, लैमिनर प्रवाह प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए विशेष रूप से फायदेमंद है। वर्तमान में, 5 चैनलों तक प्रवाह कोशिकाओं को आमतौर पर नियोजित किया जाता है (चित्रा 3)।

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Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. लैम्ब्डा डीएनए टुकड़े वाले वेक्टर में ब्याज के अनुक्रम को क्लोन करें, जो हैंडल अनुक्रमों (चित्रा 2) 43,50 के रूप में कार्य करता है।
  2. पहले पीसीआर के माध्यम से बाद में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए एक डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करें (चित्रा 2 बी; प्रतिक्रिया 1)। इस पीसीआर चरण में, T7 प्रमोटर को भावना डीएनए अणु 32,33,43,50 के 5 'अंत में जोड़ा जाता है। तालिका 1 के अनुसार PCR प्रतिक्रिया सेट करें। thermocycler में उपयुक्त चक्र के साथ 50 μL ऐलीकोट में पीसीआर चलाएँ।
  3. दो अलग-अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं द्वारा हैंडल तैयार करें (तालिका 1, चित्रा 2 बी; प्रतिक्रिया 2 और 3)। सबसे पहले, पीसीआर द्वारा 5 'हैंडल उत्पन्न करें। फिर, 3 'हैंडल उत्पन्न करें और साथ ही साथ इसे 5'digoxigenin-लेबल वाले प्राइमर 32,33,43,50 का उपयोग करके digoxigenin के साथ लेबल करें।
  4. पीसीआर के बाद, सिलिका स्पिन कॉलम का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें।
  5. टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ (तालिका 2) 32,33,43,50 का उपयोग करके इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया करें। आरएनए की लंबाई के आधार पर 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, प्रतिक्रिया के लिए DNase I जोड़ें और डीएनए टेम्पलेट को पचाने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सिलिका स्पिन स्तंभों का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध करें।
  6. 5 'हैंडल (तालिका 3) की लेबलिंग प्रतिक्रिया के दौरान, T4 डीएनए पोलीमरेज़ 38,50 द्वारा हैंडल के 3 'अंत में बायोटिन -16-dUTP जोड़ें। 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करें। इसके बाद, सिलिका स्पिन कॉलम का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें।
    नोट:: चूंकि 5' हैंडल को इसके 3' अंत (चित्रा 2B) पर लेबल किया जाना चाहिए, इसलिए PCR के दौरान लेबलिंग नहीं की जा सकती.
  7. ऊपर उल्लिखित घटकों को मिलाएं - 5 'हैंडल (3' बायोटिन के साथ लेबल किया गया), 3' हैंडल (5' डिगॉक्सिजेनिन के साथ लेबल किया गया), और आरएनए - एनीलिंग बफर में 1: 1: 1 दाढ़ अनुपात में (80% फॉर्मामाइड, 400 एमएम NaCl, 40 mM HEPES, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, pH 8), वांछित आरएनए / डीएनए हाइब्रिड (तालिका 4) प्राप्त करने के लिए। एनीलिंग मिश्रण को 10 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और फिर धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  8. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5) की मात्रा के 1/10 के साथ annealed नमूने को मिलाएं, बर्फ-ठंडे इथेनॉल के 3 संस्करणों और कम से कम 1 घंटे या -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 × जी पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant त्यागें और निर्वात के तहत गोली (आमतौर पर दिखाई नहीं देता है) सूखी.
  10. अंत में, resuspend, RNase मुक्त पानी के 50 μL में गोली और एलीकोट बनाने के लिए। उपयोग किए जाने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर ऐलीकोट को स्टोर करें। अल्पकालिक भंडारण के लिए, नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत किया जा सकता है।

2. साधन सेटअप

नोट:: निम्न प्रोटोकॉल वाणिज्यिक ऑप्टिकल चिमटी साधन C-ट्रैप LUMICKS कंपनी से के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है। इसलिए, अन्य ऑप्टिकल चिमटी उपकरणों का उपयोग करते समय प्रस्तुत चरणों के लिए समायोजन आवश्यक हो सकता है। यदि उपयोग नहीं किया जाता है, तो मशीन के माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम को ब्लीच (सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान) में रखा जाता है और उपयोग से पहले धोया जाना चाहिए।

  1. ब्लीच को त्यागें और 1 मिलीलीटर RNase-मुक्त पानी के साथ सिरिंज भरें।
  2. RNase मुक्त पानी के कम से कम 1 मिलीलीटर करने के लिए 0.5 एम सोडियम थायोसल्फेट के 50 μL जोड़ें और सिस्टम में शेष ब्लीच को खत्म करने के लिए सिस्टम (1 बार, कम से कम 0.5 मिलीलीटर) को अच्छी तरह से धो लें।
  3. सिरिंज से सोडियम थायोसल्फेट समाधान को छोड़ दें। ताजा लोगों के साथ सिरिंज को बदलें और RNase मुक्त पानी के कम से कम 0.5 मिलीलीटर के साथ सिस्टम को धोलें।
    नोट: सावधान रहें, कि माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम सिस्टम में हवा के बुलबुले से बचने के लिए कभी भी सूखा नहीं चलता है।
  4. विसर्जन तेल की 2 बूँदें (1.33 का अपवर्तक सूचकांक) या उद्देश्य के शीर्ष पर लगभग 70 μL पानी डालें।
  5. होल्डिंग फ्रेम के अंदर प्रवाह सेल को उसकी स्थिति में रखें।
  6. प्रवाह सेल के शीर्ष पर विसर्जन तेल (1.51 का अपवर्तक सूचकांक) की 2 बूँदें रखो।
  7. चिमटी मशीन में लेजर डिवाइस चालू करें। एक बार जब यह चल रहा है, तो 100% पर सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस में फँसाने वाले लेजर को चालू करें।
  8. नैदानिक कैमरों (जेड-फाइंडर) का उपयोग करके, जेड-अक्ष को दूसरे और तीसरे प्रतिबिंब (इंटरफेस) के बीच कक्ष के बीच में समायोजित करें, जहां अपवर्तन के छल्ले माइक्रो स्क्रू को बदलकर सबसे बड़े होते हैं।
    नोट: हर बार जब उद्देश्य को मापने वाले कक्ष के करीब ले जाया जाता है और उद्देश्य का फोकल प्लेन दो चरणों के बीच इंटरफ़ेस को पार करता है, तो Z-finder मोड में एक प्रतिबिंब को पहचाना जा सकता है। 4 इंटरफेस संभव हैं: (i) पानी / विसर्जन तेल और नीचे कांच (ii) कक्ष के अंदर नीचे कांच और बफर (iii) कक्ष के अंदर बफर और शीर्ष ग्लास (iv) संघनित्र के लिए शीर्ष ग्लास और विसर्जन तेल।
  9. संघनित्र स्थिति को समायोजित करें (लगभग 50% तक फँसाने वाले लेजर सेट करें) ताकि संघनित्र मापने वाले कक्ष के शीर्ष पर विसर्जन तेल को छू सके।
  10. कंडेनसर के साथ धीरे-धीरे नीचे / ऊपर जाकर फोकस को समायोजित करें, इसलिए चंद्रमा मोड (नैदानिक कैमरों) में लगभग 10 प्रकाश बैंड दिखाए जाते हैं।

3. नमूना माप

  1. नमूना निर्माणों (0.1% (डब्ल्यू / वी) के 3 μL एडी मनका निलंबन + नमूना के 4 μL) के साथ और 1 μL RNase अवरोधकों के 1 μL और परख बफर के 8 μL (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7.6, 0.05% Tween 20, 5 mM DTT के साथ) के साथ इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, परख बफर के 500 μL में नमूना पतला.
    नोट: ऑक्सीडेटिव क्षति को रोकने के लिए बफर में विशेष रूप से प्रतिदीप्ति माप के दौरान ऑक्सीजन स्कैवेंजर को जोड़ने की सिफारिश की जाती है। यहां ग्लूकोज (8.3 मिलीग्राम / एमएल), ग्लूकोज ऑक्सीडेज (40 यू / एमएल) और कैटालेज (185 यू / एमएल) युक्त ऑक्सीजन स्कैवेंजर सिस्टम का उपयोग किया गया था।
  2. 1% (डब्ल्यू / वी) स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित (एसए) मोतियों के 0.8 μL को परख बफर के 1 एमएल के साथ मिलाएं।
  3. सिरिंज से पानी को छोड़ दें और संबंधित निलंबन / समाधान के साथ सिरिंज को भरें। लगभग 1 बार में कम से कम 2 मिनट के लिए धोएं, और फिर मोतियों को पकड़ना शुरू करें।
    नोट:: प्रयोगात्मक सेट-अप के आधार पर, विभिन्न चैनल व्यवस्थाओं का उपयोग किया जा सकता है (चित्र3)। आमतौर पर, एक प्रवाह चैनल आरएनए अणु को ले जाने वाले एंटी-डिगॉक्सिजेनिन मोतियों से भरा होता है। एक दूसरा चैनल स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों से भरा हुआ है। बफर चैनल का उपयोग टेदर बनाने के लिए किया जाता है। आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (चित्रा 3 सी) को लोड करने के लिए एक चौथे चैनल को नियोजित किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से आरबीपी को सीधे बफर चैनल (चित्रा 3 बी) में जोड़ा जा सकता है।
  4. मोतियों पर कब्जा करने के लिए, ऑप्टिकल ट्रैप को एक दूसरे से अलग ले जाएं। पहले एडी चैनल पर जाएं और ट्रैप 1 में एक एडी-मनका को पकड़ें। इसके बाद, एसए-चैनल पर मंच को स्थानांतरित करें और ट्रैप 2 द्वारा एक एकल एसए मनका को पकड़ें।
    नोट:: पहले से ही पकड़े गए मनका को खोने से बचने के लिए, या एक ही जाल द्वारा एकाधिक मोतियों को पकड़ने से रोकने के लिए बफ़र और मनका चैनलों के इंटरफ़ेस पर रहने का प्रयास करें।
  5. एक बार सही आकार के मोतियों पर कब्जा कर लिया जाता है, बफर चैनल पर जाएं और लैमिनर प्रवाह को रोकें। अगला, जाल कठोरता की जांच करने के लिए बल अंशांकन करें। संबंधित कठोरता मान ों को x/y अक्ष में 10-15% से अधिक भिन्न नहीं होना चाहिए।
    नोट: लेजर शक्ति या मनका आकार के अनुसार जाल के बीच लेजर विभाजन को समायोजित करें। बल अंशांकन प्रत्येक मनका जोड़ी के लिए तब तक नहीं किया जाना चाहिए जब तक कि मनका टेम्पलेट्स मेल खाते हैं (समानता स्कोर > 0.9)। हालांकि, यह नियमित रूप से प्रदर्शन किया जाना चाहिए, या कम से कम हर बार परख शर्तों को बदल दिया जाता है।
  6. मोतियों को एक दूसरे के करीब ले जाकर, कुछ सेकंड के लिए इंतजार करके, और फिर उन्हें वापस अलग करने के लिए एक टीथर के लिए मछली पकड़ना शुरू करें, जब तक कि एक टीथर का गठन न हो जाए। एक टीथर गठन के परिणामस्वरूप दो मोतियों को एक दूसरे से दूर खींचने पर मापा बल की वृद्धि होती है।
    नोट: एकाधिक tethers के गठन से बचने के लिए, मोतियों को बहुत करीब नहीं ले जाया जाना चाहिए। दो मोतियों के बीच एक टीथर को पकड़ने पर, टेदर की गुणवत्ता को ओवरस्ट्रेचिंग पठार को ढूंढकर जांचा जा सकता है। पठार एक टीथर के लिए 50 से 60 पीएन के बीच होना चाहिए।
  7. एक टेदर प्राप्त करने पर, माप शुरू करें। अध्ययन की गई घटना के आधार पर विभिन्न माप सेटअप ों को चुना जाना चाहिए (चित्रा 1 बी-डी)।
    नोट: आमतौर पर प्रयोग की शुरुआत में, टेदर की गुणवत्ता की जांच करने और व्यवहार की जांच करने के लिए एक बल-रैंप प्रयोग आयोजित किया जाता है। इसके बाद, कोई भी राज्य संक्रमणों का आगे अध्ययन करने के लिए निरंतर-बल या निरंतर-स्थिति प्रयोगों को शुरू कर सकता है। एक बार जब इसके व्यवहार को निर्धारित करने के लिए आरएनए नमूने पर पर्याप्त संख्या में माप किए जाते हैं, तो लेबल किए गए कारकों को कॉन्फोकल माप करने के लिए सिस्टम में जोड़ा जा सकता है।
  8. प्रतिदीप्ति माप करने के लिए, ऑप्टिकल चिमटी उपकरण में कॉन्फोकल लेजर और फोटॉन काउंटर यूनिट को चालू करें।
  9. सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस में वांछित तरंग दैर्ध्य के उत्तेजना लेजर को चालू करें और फ्लोरोफोर के आधार पर लेजर की शक्ति को 5% या उससे अधिक पर सेट करें।
    नोट: जबकि मापने के लिए 0% के लिए उत्तेजना लेजर की शक्ति सेटिंग कम करने के लिए नमूने के लिए अत्यधिक photodamage से बचने के लिए.
  10. सॉफ़्टवेयर के छवि फ़ंक्शंस का उपयोग करके नमूना इमेजिंग प्रारंभ करें.
    नोट: अच्छी तरह से केंद्रित छवियों को प्राप्त करने के लिए, confocal माइक्रोस्कोप और ऑप्टिकल जाल के फोकल विमान को संरेखित किया जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, नीले लेजर चैनल में polystyrene मोतियों के autofluorescence नियोजित किया जा सकता है। ऑप्टिकल ट्रैप के फोकल प्लेन को जेड-अक्ष में ऊपर या नीचे ले जाया जाता है जब तक कि मोतियों की छवि अपने उच्चतम व्यास तक नहीं पहुंच जाती। इस स्थिति में, मोतियों के बीच बंधे अणु से प्रतिदीप्ति संकेत को मापा जा सकता है।
  11. Kymograph फ़ंक्शन का उपयोग करने के लिए, kymograph अक्ष की x-y स्थिति निर्दिष्ट करें ताकि यह मोतियों के बीच टेदर का पता लगाने की अनुमति दे सके।
  12. माप के दौरान, बफर संरचना को या तो मोतियों को विभिन्न चैनलों पर ले जाकर या माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम में आपूर्ति किए गए बफर को बदलकर आसानी से बदला जा सकता है।

4. डेटा विश्लेषण

  1. कच्चा डेटा पूर्व-संसाधन
    1. एक साधारण स्क्रिप्ट का उपयोग करके, कच्चे डेटा को पर्याप्त डाउनसैम्पल करने के लिए (i) तेजी से बाद के डेटा प्रोसेसिंग की अनुमति देता है लेकिन (ii) अभी भी सभी महत्वपूर्ण जानकारी (चित्रा 4 ए) शामिल है। आमतौर पर, 100-5000 हर्ट्ज इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त है।
      नोट: ऑप्टिकल चिमटी प्रयोगों में डेटा इकट्ठा करने की आवृत्ति अक्सर विश्लेषण के लिए आवश्यक से अधिक होती है - प्रस्तुत प्रयोगों में, डेटा इकट्ठा करने की आवृत्ति डिफ़ॉल्ट रूप से 78 125 हर्ट्ज पर सेट होती है। चूंकि भंडारण स्थान सीमित है, इसलिए डेटा की नमूना दर को कम करने के लिए यह सुविधाजनक और समय-बचत है। यहां, कच्चे डेटा को 30 के कारक द्वारा डाउनसैम्पल किया गया था।
    2. अगला, सिग्नल (चित्रा 4 ए) से उच्च आवृत्ति माप शोर को कम करने के लिए एक सिग्नल फ़िल्टर को नियोजित करें। विभिन्न प्रयोगों के डेटा आउटपुट को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए तदनुसार फ़िल्टर डिग्री और कट-ऑफ आवृत्ति पैरामीटर समायोजित करें (चित्रा 5)।
      नोट: सिग्नल फिल्टर के बीच, Butterworth filter51 सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है में से एक है। कच्चे डेटा के पूर्व-प्रसंस्करण की अनुमति देने वाली एक कस्टम-लिखित पायथन स्क्रिप्ट पूरक डेटा में प्रदान की जाती है। डाउनसैम्पलिंग और सिग्नल फ़िल्टरिंग पैरामीटर (कट-ऑफ आवृत्ति, फ़िल्टर डिग्री) को विभिन्न प्रयोगों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
  2. फोर्स-रैंप डेटा विश्लेषण के लिए, निम्न चरणों का उपयोग करें।
    1. या तो मैन्युअल रूप से बल प्रक्षेपवक्र प्लॉट पर संगत बिंदुओं को ढूँढकर या कस्टम-लिखित स्क्रिप्ट का उपयोग करके चरणों को चिह्नित करें। खुला कदम बल-दूरी (एफडी) वक्र में दूरी में वृद्धि के साथ संयुक्त बल में अचानक गिरावट की विशेषता है।
    2. एक बार घटनाओं को चिह्नित करने के बाद, उचित मॉडल (चित्रा 4 डी) का उपयोग करके एफडी वक्र के विभिन्न क्षेत्रों को फिट करें।
      नोट: पहले प्रकट चरण से पहले क्षेत्र के लिए, टेदर को "डबल-फंसे हुए" माना जा सकता है और आमतौर पर एक्सटेंसिबल वर्म-जैसे-चेन मॉडल (डब्ल्यूएलसी) 47,52,53 का उपयोग करके फिट होता है। पहली घटना के बाद के हिस्सों को डबल-फंसे हुए न्यूक्लियोटाइड्स (हैंडल) और एकल-फंसे हुए न्यूक्लियोटाइड्स (आरएनए अणु) का संयोजन माना जाता है। इसलिए, डेटा फिटिंग अधिक जटिल है - आमतौर पर 2 डब्ल्यूएलसी मॉडल या डब्ल्यूएलसी और स्वतंत्र रूप से संयुक्त श्रृंखला (एफजेसी) मॉडल का संयोजन 36,39,52 नियोजित होता है। एक्सटेंसिबल डब्ल्यूएलसी मॉडल में दो मुख्य फिट पैरामीटर हैं समोच्च लंबाई (एलसी) और दृढ़ता लंबाई (एलपी)। समोच्च लंबाई पूरी तरह से फैले अणु की लंबाई से मेल खाती है और दृढ़ता की लंबाई ब्याज के अणु के झुकने वाले गुणों को परिभाषित करती है। मॉडल को निम्नलिखित समीकरण (1) के साथ वर्णित किया जा सकता है। WLC का उपयोग मुड़े हुए और साथ ही खुले हुए दोनों क्षेत्रों के व्यवहार को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि इनमें से प्रत्येक के लिए अलग-अलग मापदंडों के साथ एक अलग मॉडल को नियोजित किया जाना चाहिए।
      (1) Equation 1
      जहां x विस्तार है, LC समोच्च लंबाई है, F बल है, LP दृढ़ता लंबाई है, kB बोल्ट्जमान स्थिरांक है, T थर्मोडायनामिक तापमान है, और S खिंचाव मापांक है।
      दूसरा मॉडल जिसे फ्रीली-जॉइंटेड चेन (एफजेसी) कहा जाता है, आमतौर पर सामने आए एकल फंसे हुए क्षेत्रों के व्यवहार का वर्णन करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह पॉलिमर के समान मापदंडों का उपयोग करता है, लेकिन "श्रृंखला" की प्रत्येक इकाई को एक कठोर रॉड के रूप में मानता है, यहां सामने आए एकल फंसे हुए क्षेत्र के न्यूक्लियोटाइड्स के अनुरूप है। निम्न समीकरण (2) इस मॉडल का वर्णन करता है:
      (2) Equation 2
      नोट: हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में एक एल्गोरिथ्म विकसित किया है जो कच्चे बल-रैंप डेटा के बैच प्रसंस्करण की अनुमति देता है जिसे "व्यावहारिक ऑप्टिकल चिमटी विश्लेषण TOol (POTATO)54" कहा जाता है। एल्गोरिथ्म डेटा को डाउनसैम्पल्स और फ़िल्टर करता है, फिर यह संभावित खुलासे वाले चरणों की पहचान करता है और अंत में डेटा फिटिंग करता है। आलू एक उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO) में बनाया गया है।
  3. निरंतर-बल डेटा को निम्नानुसार संसाधित करें:
    नोट:: निम्न निर्देशों को निरंतर-स्थिति डेटा पर analogically लागू किया जा सकता है।
    1. निरंतर-बल डेटा के लिए, समय के साथ दूरी को प्लॉट करें (चित्र5)। स्थिति में सापेक्ष परिवर्तन पर विभिन्न संरचनाओं की आवृत्ति (गिनती) को दिखाने वाला हिस्टोग्राम विभिन्न प्रमुख और मामूली राज्यों को चिह्नित करने का एक उपयोगी तरीका है (चित्रा 7)।
    2. किसी दिए गए बल (चित्रा 7 C) पर व्यक्तिगत संरूपकों के समग्र प्रतिशत का अनुमान लगाने के लिए (एकाधिक) गाऊसी कार्यों का उपयोग करके हिस्टोग्राम को फिट करें। गाऊसी फिट बैठता है, मतलब की स्थिति, और मानक विचलन विभिन्न आबादी के बीच बल से संबंधित संबंधों को रेखांकित करता है।
      नोट: एक कस्टम-लिखित पायथन स्क्रिप्ट पूर्व-प्रसंस्करण और मूल bimodal गाऊसी निरंतर बल डेटा की फिटिंग की अनुमति अनुपूरक डेटा में प्रदान की जाती है। पैरामीटर (कट-ऑफ आवृत्ति, फ़िल्टर डिग्री, अपेक्षित साधन, मानक विचलन मान और आयाम) को विभिन्न प्रयोगों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
    3. इसके बाद, राज्यों का आगे विश्लेषण करने के लिए हिडन मार्कोव मॉडल को नियोजित करें, जो अतिरिक्त तह मध्यवर्ती (संरूपक) 55 को उजागर कर सकता है। निरंतर-बल और हिडन मार्कोव मॉडल के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कोई भी 55,56,57,58 का उल्लेख कर सकता है।

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Representative Results

इस अनुभाग में, फोकस मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल चिमटी द्वारा आरएनए-प्रोटीन / लिगैंड इंटरैक्शन के माप पर दिया जाता है। सामान्य आरएनए ऑप्टिकल चिमटी प्रयोगों और इसी प्रतिनिधि परिणामों के विवरण के लिए, see32. आरएनए / डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन की अधिक विस्तृत चर्चा के लिए, 1,2,26,59,60 भी देखें।

सिद्धांत रूप में, आरएनए पर एक आरबीपी या ब्याज के किसी अन्य ट्रांस-एक्टिंग कारक का बंधन स्थिर, अस्थिर, या अणु की संरचना को बदल सकता है। नीचे, प्रत्येक प्रभाव के लिए यांत्रिक अवलोकन का एक चित्रण दिखाया गया है। हालांकि, किसी दिए गए आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के लिए मनाया गया वास्तविक प्रभाव इन नीचे उल्लिखित परिदृश्यों तक सीमित नहीं है।

स्थिरीकरण
आरएनए संरचना को विशेष रूप से पहचाना जा सकता है और प्रोटीन या अन्य लिगेंड 45,61,62,63,64 द्वारा बाध्य किया जा सकता है। बांड का गठन ऊर्जा की रिहाई के साथ होता है। इसलिए, दिए गए आरएनए संरचना को प्रकट करने के लिए एक अतिरिक्त ऊर्जावान बाधा को दूर किया जाना चाहिए। नतीजतन, माध्य प्रकट बल में वृद्धि देखी जा सकती है50,65। एक बाहरी एजेंट (प्रोटीन, छोटे अणु, अन्य ट्रांस-एक्टिंग कारकों) के बंधन द्वारा आरएनए संरचना के स्थिरीकरण के परिणामस्वरूप संरचना के तह कैनेटीक्स में भी बदलाव हो सकता है। इसके लिए, निरंतर-बल मोड में आगे के माप किए जा सकते हैं, जहां तह मध्यवर्ती के बीच कम लगातार संक्रमण के साथ-साथ संतुलन में बल-बदलाव भी देखा जा सकता है।

अस्थिरता
कुछ प्रोटीन विशिष्ट आरएनए संरचनाओं के बजाय कुछ अनुक्रम रूपांकनों को पहचानते हैं। बाध्यकारी साइटें एक अत्यधिक विशिष्ट आकृति से अधिक सामान्य पैटर्न जैसे कि जीसी या एयू समृद्ध स्ट्रेच60,66 तक भिन्न हो सकती हैं। फिर भी, यदि प्रोटीन अधिमानतः प्रकट एकल-फंसे हुए आरएनए संरचना को बांधता है, तो मुड़ी हुई और प्रकट की गई स्थिति के बीच संतुलन को उजागर राज्य 36,43,67 की ओर स्थानांतरित किया जा सकता है। चित्र 6 और चित्र 7 में इस तरह के व्यवहार के उदाहरणों को दर्शाया गया है।

संरचना परिवर्तन
कुछ उदाहरणों में, आरबीपी (या अन्य लिगेंड) ऊपर उल्लिखित दोनों तंत्रों को इस तरह से जोड़ सकते हैं कि आरबीपी पहले से प्रमुख संरचना को अस्थिर करता है और संतुलन को वैकल्पिक आरएनए संरचना 44,68,69 की ओर स्थानांतरित करता है। एक वैकल्पिक स्थिति में स्विच के परिणामस्वरूप मनाया गया संरचनात्मक जनसंख्या आवृत्तियों के साथ-साथ व्यक्तिगत तह राज्यों की घटना या गायब होने में परिवर्तन हो सकता है। इन परिवर्तनों को पहले बल-रैंप प्रयोगों में देखा जा सकता है और निरंतर-बल (या निरंतर-स्थिति) प्रयोगों द्वारा आगे की जांच की जा सकती है।

आरएनए तह / खुलासा पर ट्रांस-एक्टिंग कारक का प्रभाव
यहां, सार्स-कोव -2 के -1 क्रमादेशित राइबोसोमल फ्रेमशिफ्टिंग तत्व के अनुरूप एक आरएनए अनुक्रम का अध्ययन किया गया था। इस आरएनए तत्व को एच-टाइप स्यूडोकनोट70,71 बनाने की भविष्यवाणी की गई है। उदाहरण बल-दूरी प्रक्षेपवक्र में, आरएनए दो लगातार चरणों (चित्रा 6 ए) में प्रकट होता है और फिर से मुड़ता है। ये दो चरण संभवतः दो स्टेम लूप के अनुरूप हैं जो स्यूडोकनोट गठन के लिए पूर्वशर्त हैं। इस मामले में, स्यूडोक्नोट को या तो नहीं देखा गया था क्योंकि आरएनए ने पूरी तरह से गुना नहीं किया था या स्यूडोक्नॉट के साथ प्रतिस्पर्धा करने वाली एक वैकल्पिक संरचना का गठन नहीं किया था। ट्रांस-अभिनय कारक जैप के अलावा, रिफोल्डिंग घटनाओं और एक विशाल हिस्टैरिसिस का अचानक गायब हो जाना देखा गया था (चित्रा 6 बी)43। इससे पता चलता है कि प्रोटीन आरएनए के एकल-फंसे हुए राज्य को बांधता है, जो माध्यमिक संरचनाओं के गठन में बाधा डालता है। इसके अलावा, निरंतर-बल प्रयोग बल-रैंप प्रयोगों के परिणामों की पुष्टि करते हैं। तदनुसार, जबकि आरएनए पूरी तरह से लगभग 10 पीएन (चित्रा 7 ए) पर मुड़ा हुआ है, प्रोटीन की उपस्थिति कम बलों की ओर रीफोल्डिंग को स्थानांतरित करती है, और 10 पीएन पर आरएनए अभी भी ज्यादातर खुले राज्य पर कब्जा कर रहा है (चित्रा 7 बी)।

ओटी माप confocal माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित
इसके बाद, अनुकरणीय परिणाम गैर-विशिष्ट के साथ-साथ विभिन्न फ्लोरोफोरस और लेबल राइबोसोम के विशिष्ट बंधन के लिए दिखाए जाते हैं (चित्रा 8)। पहले उदाहरण में, SYTOX ग्रीन डाई का उपयोग टेदर किए गए डीएनए / आरएनए हाइब्रिड को लेबल करने के लिए किया गया था। बढ़ते बल के साथ, डाई बाइंडिंग अधिक प्रचुर मात्रा में होती है जिसके परिणामस्वरूप उच्च प्रतिदीप्ति संकेत होता है। एक बार जब बल बहुत अधिक हो जाता है, तो टेदर टूट जाता है, और प्रतिदीप्ति संकेत खो जाता है (चित्रा 8 ए)। बैक्टीरियल राइबोसोम (चित्रा 8 बी) के साथ प्रयोगों के लिए, लाइसिन अवशेषों के गैर-विशिष्ट लेबलिंग को लाल फ्लोरोसेंट डाई के लिए संयुग्मित एन-हाइड्रॉक्सीसुसिनिमाइड (एनएचएस) का उपयोग करके नियोजित किया गया था। यद्यपि लेबल किए गए प्रोटीन / कॉम्प्लेक्स की गतिविधि को कम करने का जोखिम है, बड़ा लाभ मजबूत संकेत प्राप्त होता है क्योंकि प्रत्येक राइबोसोम (औसतन) कई फ्लोरोफोर द्वारा लेबल किया जाता है। आरएनए निर्माण में एक राइबोसोम बाइंडिंग साइट (आरबीएस) शामिल थी, जिसे बैक्टीरियल राइबोसोम द्वारा मान्यता प्राप्त थी, जिसे अध्ययन किए गए आरएनए अनुक्रम की 5 'निकटता में रखा गया था। राइबोसोम के बंधन पर, प्रतिदीप्ति संकेत टेदर पर मनाया जाता है। प्रतिदीप्ति डेटा को छवि विश्लेषण टूल 72 का उपयोग करके आगे विश्लेषण किया जा सकता है, और परिणामों को बल डेटा के साथ जोड़ा जा सकता है, जिससे तह संक्रमण के अध्ययन की अनुमति मिलती है।

Figure 1
चित्रा 1: ओटी प्रयोग और संभावित माप दृष्टिकोण की योजनाबद्ध। (ए) मध्य में सार्स-कोव-2 फ्रेमशिफ्टिंग आरएनए के साथ ऑप्टिकल चिमटी प्रयोगों को दर्शाने वाली योजनाबद्ध। आरएनए को एसएसडीएनए हैंडल के लिए संकरित किया जाता है और मोतियों पर स्थिर किया जाता है। इनका उपयोग एक केंद्रित लेजर बीम के साथ आरएनए पर खींचने वाले बल को लागू करने के लिए किया जाता है। बल को धीरे-धीरे तब तक बढ़ाया जाता है जब तक कि आरएनए को उजागर नहीं किया जाता है (नीचे)। (ख) आरएनए के लिए लेबल किए गए कारक के बंधन की निगरानी करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी के साथ संयुक्त कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की योजनाबद्ध। (सी) उदाहरण निरंतर-बल डेटा को समय के साथ स्थिर मूल्य पर बल को ठीक करके प्राप्त किया जा सकता है, जो संरूपकों के रहने के समय को ठीक से मापने की अनुमति देता है। (D) एक बल-रैंप माप से प्राप्त उदाहरण बल-दूरी (एफडी) वक्र। खुलासा कदम एफडी प्रोफ़ाइल में अचानक टूटने के रूप में मनाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ओटी नमूना संश्लेषण की एक सामान्य योजना। (ए) अध्ययन में नियोजित सार्स-कोव-2 फ्रेमशिफ्टिंग आरएनए के उदाहरण अनुक्रम और अनुमानित द्वितीयक संरचना। (बी) एक वेक्टर जिसमें दो हैंडल क्षेत्रों द्वारा फ्लैंक किए गए ब्याज के अनुक्रम (एसओआई) होते हैं, 3 पीसीआर प्रतिक्रियाओं में डीएनए / आरएनए निर्माण के उत्पादन के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। प्राइमरों को संबंधित पीसीआर में उनकी बाध्यकारी साइटों के अनुसार योजना में चित्रित और क्रमांकित किया जाता है। पीसीआर 1 इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन टेम्पलेट को उत्पन्न करता है, जिसका उपयोग बाद में लंबे आरएनए अणु (हल्के नीले) को उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) प्रतिक्रिया के लिए किया जाता है। पीसीआर 2 5 'हैंडल की पैदावार करता है, जिसे बाद में बायोटिन के साथ लेबल किया गया 3' है। पीसीआर 3 digoxigenin करने के लिए संयुग्मित आगे प्राइमर का उपयोग कर 3 'digoxigenin लेबल हैंडल का उत्पादन करता है. अंत में, ऑप्टिकल चिमटी माप के लिए उपयुक्त डीएनए / आरएनए हाइब्रिड निर्माण देने के लिए दो हैंडल और आरएनए को annealed किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न माइक्रोफ्लुइडिक्स चैनल सेटअप का चित्रण। (ए) 5- माइक्रोफ्लुइडिक्स चैनलों के साथ प्रवाह सेल की एक योजना। (बी) और (सी) (ए) के लाल-डैश्ड क्षेत्र के ज़ूम-इन हैं। (बी) चैनल 1 और 3 में क्रमशः एडी मोतियों और एसए मोतियों के साथ एक सरल 3- चैनल सेटअप। कारक चैनल 2 में पाया जाता है। यह सेटअप उच्च आत्मीयता के साथ स्थिर प्रोटीन के लिए उपयुक्त है, इस प्रकार कम फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए कम एकाग्रता को प्राथमिकता दी जाती है। पक्ष पर मनका चैनल निश्चित टेदर अभिविन्यास और यदि आवश्यक हो तो नए मोतियों की त्वरित भर्ती की अनुमति देते हैं। (C) चैनल 4 में कारक के साथ 4-चैनल सेटअप। इस तरह की व्यवस्था न्यूनतम नमूना खपत के लिए विशेष रूप से फायदेमंद है। माप सीधे चैनल 4 में किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत से बचने के लिए, कॉम्प्लेक्स को चैनल 4 में बनाया जा सकता है और फिर माप को चैनल 3 में किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बल-रैंप प्रयोगों के लिए डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो. (A) डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का फ़्लोचार्ट. कच्चे डेटा फ़ाइलों को पहले डाउनसैम्पल और फ़िल्टर किया जाता है, फिर चरणों को चिह्नित किया जाता है और अलग-अलग राज्यों को संबंधित मॉडल में फिट किया जाता है। (बी) कच्चे डेटा में काफी मात्रा में शोर होता है, जो खुलासा / रीफोल्डिंग घटनाओं की पहचान में बाधा डालता है। इसके अलावा, अधिकांश प्रयोगों में, डेटा एकत्र करने की आवृत्ति आवश्यक से अधिक है। (c) इसलिए, डेटा प्रोफ़ाइल को चिकना करने के लिए डाउनसैम्पलिंग और सिग्नल निस्पंदन को नियोजित किया जाता है। (डी) संसाधित वक्रों को अंततः डब्ल्यूएलसी मॉडल का उपयोग करके फिट किया जाता है जब अणु अभी भी मुड़ी हुई स्थिति में होता है (सामने आने वाली घटना से पहले), एफजेसी मॉडल के साथ डब्ल्यूएलसी का संयोजन या दूसरा डब्ल्यूएलसी मॉडल जब अणु एक प्रकट अवस्था में होता है (सामने आने वाली घटना के बाद)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: डेटा आउटपुट पर कट-ऑफ-फ्रीक्वेंसी का प्रभाव। जबकि कच्चे डेटा आउटपुट पर सिग्नल शोर (शीर्ष) का बोझ हो सकता है, डेटा विश्लेषण के लिए उचित सिग्नल निस्पंदन मापदंडों का चयन करना महत्वपूर्ण है। यद्यपि उचित निस्पंदन तह मध्यवर्ती (कट-ऑफ आवृत्ति 0.1, मध्य) की पहचान में मदद करेगा, निस्पंदन पर (कट-ऑफ आवृत्ति <0.001, नीचे) के परिणामस्वरूप रिज़ॉल्यूशन का नुकसान हो सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: ZAP की अनुपस्थिति और उपस्थिति में उदाहरण एफडी प्रक्षेपवक्र। (ए) जैप की अनुपस्थिति में सार्स-कोव-2 आरएनए के सामने आना (गुलाबी) और रीफोल्डिंग (नीले) के निशान। नमूना केवल छोटे हिस्टैरिसिस के साथ आसानी से refolding दिखाता है। (बी) ट्रांस-फैक्टर जैप (400 एनएम) की उपस्थिति में आरएनए के सामने आना (गुलाबी) और रीफोल्डिंग (नीला) निशान। नमूना विशाल हिस्टैरिसीस दिखाता है, यह सुझाव देता है कि प्रोटीन एकल-फंसे हुए आरएनए को बांधता है और इसके रीफोल्डिंग को रोकता है। (C) एक बार चार्ट जो ZAP की अनुपस्थिति या उपस्थिति में खुलासा (गुलाबी) और रीफोल्डिंग (नीले) चरणों की संख्या को दर्शाता है। जबकि खुलासा चरणों का वितरण ZAP की उपस्थिति से लगभग अप्रभावित रहता है, ZAP के साथ refolding चरणों की संख्या में एक स्पष्ट गिरावट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: उदाहरण ZAP की अनुपस्थिति और उपस्थिति में निरंतर बल डेटा। (ए) 10 (ऊपर) से 13 (नीचे) पीएन के बीच के बलों पर प्राप्त निरंतर बल डेटा सार्स-कोव-2 फ्रेमशिफ्टिंग आरएनए तत्व की पूरी तरह से मुड़ी हुई स्थिति में पूरी तरह से मुड़ी हुई स्थिति में बदलाव को दर्शाता है। प्रत्येक ग्राफ में स्थिति बनाम समय (बाएं) और एक हिस्टोग्राम प्लॉट (दाएं) शामिल हैं। (बी) ZAP (400 nM) की उपस्थिति में प्राप्त निरंतर बल डेटा। प्रोटीन बाइंडिंग पर, refolding बिगड़ा हुआ है। 10 पीएन पर, अकेले आरएनए के विपरीत, जैप आरएनए की उपस्थिति में ज्यादातर प्रकट राज्य में मौजूद है। इसलिए, संतुलन बल में निचले बलों की ओर एक बदलाव का संकेत दिया जाता है। (सी) स्थिति डेटा के हिस्टोग्राम का विश्लेषण प्रत्येक राज्य की सापेक्ष बहुतायत (प्रत्येक राज्य के लिए वक्र के तहत क्षेत्र से व्युत्पन्न) उत्पन्न करने के लिए गाऊसी कार्यों के लिए डेटा को फिट करके किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: ओटी confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त. (ए) SYTOX ग्रीन लेबल टेदर (बाएं) का एक उदाहरण kymograph. बढ़ती ताकतों पर संकेत तीव्रता में वृद्धि पर ध्यान दें। काला तीर टेदर टूटने की घटना को चिह्नित करता है, जो संकेत के नुकसान की ओर जाता है। डाई के साथ टेदर का चित्रण जो इसके लिए बाध्य है (बाइंडिंग) और डाई के बिना टूटने के बाद (कोई संकेत नहीं) (दाएं)। (बी) एमआरएनए (बाईं ओर) पर राइबोसोम के विशिष्ट बंधन का उदाहरण किमोग्राफ। बाध्यकारी घटना को दो मोतियों के बीच टेदर किए गए आरएनए पर एक प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में देखा जा सकता है। (कोई संकेत नहीं) के बिना टेदर का चित्रण और प्रतिदीप्ति-लेबल वाले राइबोसोम बाउंड (बाइंडिंग) (दाएं) के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता आयतन
अभिक्रिया आयतन - - 500 μL
10× बफर 10× 1× 50 μL
dNTP मिश्रण 10 mM 0.2 mM 10 μL
उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ 1.25 U/μL 0.025 U/μL 10 μL
प्राइमर 1 10 μM 0.4 μM 20 μL
प्राइमर 2 10 μM 0.4 μM 20 μL
साँचा 100 ng/μL 1 ng/μL 5 μL
पानी - - 385 μL

तालिका 1: ऑप्टिकल चिमटी निर्माणों को उत्पन्न करने के लिए पीसीआर के लिए पिपेटिंग योजना।

स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता आयतन
अभिक्रिया आयतन - - 300 μL
5× बफर 5× 1× 60 μL
rNTP मिश्रण 25 mM 5 mM 60 μL
RNase अवरोधक 40 U/μL 0.7 U/μL 5 μL
पाइरोफॉस्फेट 100 U/mL 1.7 mU/μL 4 μL
DTT 100 mM 3.3 mM 10 μL
T7 आरएनए पोलीमरेज़ 50 U/μL 3.3 U/μL 20 μL
साँचा 120 ng/μL 2 ng/μL 5 μL
पानी - - 136 μL

तालिका 2: इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए पिपेटिंग योजना।

स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता आयतन
अभिक्रिया आयतन - - 100 μL
10× बफर (NEB 2.1) 10× 1× 10 μL
BSA 1 μg/ml 100 ng/μL 1 μL
बायोटिन-16-dUTP 1 mM 50 μM 5 μL
T4 डीएनए पोलीमरेज़ 30 U/μL 1.5 U/μL 5 μL
डीएनए 5 'संभाल (20-60 μg) 300 ng/μL 237 ng/μL 79 μL

तालिका 3: 3 'अंत बायोटिन लेबलिंग के लिए Pipetting योजना.

स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता अंतिम राशि आयतन
अभिक्रिया आयतन - - - 300 μL
एनीलिंग बफर 1.25× 1× - 240 μL
RNase अवरोधक 40 U/μL 0.5 U/μL - 5 μL
5 ' biotinylated डीएनए हैंडल 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
3' डीएनए हैंडल 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
RNA 150 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 20 μL
पानी - - - 5 μL

तालिका 4: ऑप्टिकल चिमटी निर्माण के एनीलिंग के लिए Pipetting योजना.

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Discussion

यहां, हम विभिन्न लिगैंडों के साथ आरएनए अणुओं के इंटरैक्शन और गतिशील व्यवहार का अध्ययन करने के लिए प्रतिदीप्ति-युग्मित ऑप्टिकल चिमटी के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। नीचे, वर्तमान तकनीक के महत्वपूर्ण चरणों और सीमाओं पर चर्चा की गई है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
कई अन्य तरीकों के लिए, नमूने की गुणवत्ता विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, उच्चतम संभव गुणवत्ता वाले नमूने प्राप्त करने के लिए, नमूना तैयारी के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए समय बिताने के लिए यह लायक है। अनुकूलन चरणों में उचित प्राइमर डिजाइन, एनीलिंग तापमान, आरएनए और प्रोटीन शुद्धिकरण चरण शामिल हैं।

फ़िल्टर किए गए सुझावों और समाधानों के प्रयोग के दौरान RNase-मुक्त स्थितियों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम को उपयोग में नहीं होने पर ब्लीच में रखा जाता है। माप शुरू करने से पहले, सिस्टम से ब्लीच को हटाने के लिए सोडियम थायोसल्फेट और आरनेस-मुक्त पानी के साथ सिस्टम को ठीक से धोना महत्वपूर्ण है।

यदि पूरे प्रयोग के दौरान एक ही आकार के मोतियों का उपयोग किया जाता है, तो हर बार बल अंशांकन करने की आवश्यकता नहीं होती है। फिर भी, प्रयोगों की पुनरुत्पादकता के लिए बल अंशांकन जांच नियमित रूप से की जानी चाहिए।

विधि के संशोधन और समस्या निवारण
फ्लोरोफोर स्थिरता और फोटोब्लीचिंग
प्रतिदीप्ति माप के दौरान एक जटिलता photobleaching है। चूंकि अनुवाद की निगरानी करने के लिए समय सीमा को सिस्टम के आधार पर सेकंड से मिनट तक बढ़ाया जा सकता है, इसलिए माप के दौरान फोटोब्लीचिंग पर भी विचार किया जाना चाहिए और जितना संभव हो उतना कम किया जाना चाहिए। एक विकल्प अधिक स्थिर फ्लोरोफोर को नियोजित करना है, जो फोटोब्लीचिंग के लिए कम प्रवण हैं, जैसे कि हाल ही में पेश किए गए क्वांटम डॉट्स 49,74,75। आगे की स्थिरता एक "ऑक्सीजन स्कैवेंजर" प्रणाली का उपयोग करके ऑक्सीजन अणुओं को हटाकर भी प्राप्त की जाती है, जैसे कि ग्लूकोज ऑक्सीडेज कैटालेज के साथ युग्मित। ग्लूकोज ऑक्सीडेज ऑक्सीजन को हाइड्रोजन पेरोक्साइड में बदलकर पर्यावरण से हटा देता है, जिसे तब कैटालेज द्वारा विघटित किया जाता है। वैकल्पिक ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग सिस्टम को भी 76,77 नियोजित किया जा सकता है।

माइक्रोफ्लुइडिक्स
उचित माप के लिए निरंतर लैमिनर प्रवाह को बनाए रखना आवश्यक है। सबसे महत्वपूर्ण बात, सिस्टम को कभी भी सूखा नहीं चलना चाहिए। दुर्भाग्य से, आरबीपी या ब्याज के अन्य ट्रांस-अभिनय कारक अक्सर प्रयोगों के लिए केवल छोटी मात्रा में उपलब्ध होते हैं, इसलिए निरंतर प्रवाह को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण और लागत गहन हो सकता है। यदि नमूना आवेदन के दौरान सिस्टम में हवा के बुलबुले पेश किए जाते हैं, तो मैनुअल दबाव या इथेनॉल वॉश आमतौर पर उन्हें हटाने के लिए पर्याप्त होता है।

विधि की सीमाएँ
Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ ओटी का संयोजन भी कुछ सीमाएं लाता है। सबसे पहले, कॉन्फोकल इकाई के फोकल प्लेन को प्रतिदीप्ति संकेत की उचित रिकॉर्डिंग की अनुमति देने के लिए जाल केंद्रों के साथ ठीक से संरेखित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, confocal माप के लिए, प्रत्येक साइट पर कम से कम 2 KB के हैंडल आमतौर पर 17 की आवश्यकता होती है। यद्यपि सिद्धांत रूप में लंबे हैंडल का उपयोग करना संभव है, किसी को हैंडल के ऊर्जा योगदान और डेटा विश्लेषण की सटीकता के लिए दृढ़ता की लंबाई में परिवर्तन पर विचार करना चाहिए78। एक और महत्वपूर्ण बिंदु ऑक्सीजन स्कैवेंजर है, जिसका उपयोग फ्लोरोफोरस के आधे जीवन को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जो समाधान 76 के पीएच में अपेक्षाकृत त्वरित परिवर्तन भी करते हैं। इन परिवर्तनों को बफरिंग यौगिक की एकाग्रता को बढ़ाकर आंशिक रूप से मुआवजा दिया जा सकता है; हालांकि, माप के दौरान, नमूनों को प्रयोग के माध्यम से सुसंगत स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से (हर 30-60 मिनट) फिर से भरा जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम अनुजा किबे और जून प्रोफेसर रेडमंड स्मिथ को पांडुलिपि की गंभीर रूप से समीक्षा करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए तात्याना कोच को धन्यवाद देते हैं। हम प्रयोगात्मक वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ मदद के लिए Kristyna Pekarkova धन्यवाद. हमारी प्रयोगशाला में काम हेल्महोल्ट्ज़ एसोसिएशन द्वारा समर्थित है और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) ग्रांट एनआर 948636 (नेकां के लिए) से वित्त पोषण करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy

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Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).

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