Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62589
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Этот протокол представляет собой полный экспериментальный рабочий процесс для изучения РНК-белковых взаимодействий с использованием оптического пинцета. Описано несколько возможных экспериментальных установок, включая комбинацию оптического пинцета с конфокальной микроскопией.

Abstract

РНК принимает различные структурные складки, которые необходимы для ее функций и, таким образом, могут влиять на различные процессы в клетке. Кроме того, структура и функция РНК могут модулироваться различными транс-действующими факторами, такими как белки, метаболиты или другие РНК. Например, молекулы РНК со сдвигом кадров представляют собой регуляторные РНК, расположенные в кодирующих областях, которые направляют трансляцию рибосом в альтернативную открытую рамку считывания и, таким образом, действуют как переключатели генов. Они также могут принимать различные складки после связывания с белками или другими транс-факторами. Чтобы проанализировать роль РНК-связывающих белков в трансляции и то, как они модулируют структуру и стабильность РНК, крайне важно одновременно изучить взаимодействие и механические особенности этих РНК-белковых комплексов. Эта работа иллюстрирует, как использовать одномолекулярные флуоресцентно-связанные оптические пинцеты для изучения конформационного и термодинамического ландшафта РНК-белковых комплексов с высоким разрешением. В качестве примера разработано взаимодействие запрограммированного рибосомного элемента сдвига рамки SARS-CoV-2 с короткой изоформой трансактивного фактора противовирусного белка цинк-пальцев. Кроме того, флуоресцентно-меченые рибосомы контролировали с использованием конфокальной единицы, что в конечном итоге позволило бы изучать удлинение трансляции. Флуоресцентный связанный анализ OT может быть широко применен для изучения различных РНК-белковых комплексов или транс-действующих факторов, регулирующих трансляцию, и может облегчить исследования регуляции генов на основе РНК.

Introduction

Передача генетической информации от ДНК к белкам через мРНК – сложный биохимический процесс, который точно регулируется на всех уровнях посредством макромолекулярных взаимодействий внутри клеток. Для трансляционной регуляции РНК-белковые взаимодействия играют решающую роль в быстрой реакции на различные раздражители и сигналы1,2. Некоторые РНК-белковые взаимодействия влияют на стабильность мРНК и тем самым изменяют время, в течение которого РНК является трансляционно активной. Другие РНК-белковые взаимодействия связаны с механизмами перекодирования, такими как стоп-кодон, обход или запрограммированное рибосомное сдвиги кадра (PRF)3,4,5,6,7. Недавно было продемонстрировано, что ряд РНК-связывающих белков (RBP) взаимодействуют со стимулирующими элементами мРНК и механизмом трансляции, чтобы диктовать, когда и сколько перекодирования произойдет в клетке7,8,9,10,11. Таким образом, чтобы проанализировать роль РНК-связывающих белков в трансляции и то, как они модулируют структуру и стабильность РНК, важно детально изучить принципы взаимодействия и механические свойства этих РНК-белковых комплексов.

Десятилетия работы заложили основу для изучения многоступенчатого и многокомпонентного процесса трансляции, который опирается на сложную связь между РНК и белковыми компонентами механизма трансляции для достижения скорости и точности12,13,14. Следующим важным шагом в понимании сложных регуляторных событий является определение сил, временных шкал и структурных детерминант во время трансляции с высокой точностью12,15,16,17. Изучение конформационной динамики РНК и особенно того, как трансдействующие вспомогательные факторы действуют на структуру РНК во время трансляции, было дополнительно освещено появлением одномолекулярных инструментов, включая оптические пинцеты или волноводы нулевого режима16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Оптический пинцет (OT) представляет собой высокоточный одномолекулярный метод, который был применен для изучения многих видов РНК-зависимых динамических процессов, включая транскрипцию и трансляцию26,27,28,29,30,31,32. Использование оптического пинцета позволило детально исследовать молекулярные взаимодействия, структуры нуклеиновых кислот и термодинамические свойства, кинетику и энергетику этих процессов16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Оптический пинцет основан на захвате микроскопических объектов сфокусированным лазерным лучом. В типичном эксперименте с ОТ интересующая молекула привязана между двумя прозрачными (обычно полистирольными) шариками (рисунок 1А)27. Эти бусины затем захватываются оптическими ловушками, которые ведут себя как пружины. Таким образом, сила, приложенная к молекуле, может быть рассчитана на основе смещения шарика от центра сфокусированного лазерного луча (центра ловушки). В последнее время оптический пинцет был объединен с конфокальной микроскопией (рисунок 1B), что позволяет проводить флуоресценцию или измерения резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET)40,41,42. Это открывает совершенно новую область возможных экспериментов, позволяющих одновременно измерять и, следовательно, точно соотносить данные силовой спектроскопии и флуоресценции.

Здесь мы демонстрируем эксперименты с использованием оптического пинцета в сочетании с конфокальной микроскопией для изучения белково-РНК-взаимодействий, регулирующих трансляционное смещение кадра. Между объективом и конденсатором проточная ячейка с пятью каналами обеспечивает непрерывное применение пробы с ламинарной подачей. Через микрофлюидные каналы различные компоненты могут быть введены напрямую, что уменьшает практическое время, а также позволяет очень мало потреблять образец на протяжении всего эксперимента.

Во-первых, предлагается базовое руководство, помогающее в разработке экспериментов ОТ, и обсуждаются преимущества, а также подводные камни различных установок. Далее описывается подготовка образцов и экспериментальные рабочие процессы, а также предоставляется протокол анализа данных. Чтобы представить пример, мы излагаем результаты, полученные в результате экспериментов по растяжению РНК для изучения элементов РНК, изменяющих кадр SARS-CoV-2 (рисунок 2A) с трансдействующим фактором короткой изоформой противовирусного белка цинк-пальца (ZAP), который изменяет трансляцию вирусной РНК из альтернативного кадра считывания43. Кроме того, показано, что флуоресцентно-меченые рибосомы могут быть использованы в этом конфокальном анализе ОТ, который был бы полезен для мониторинга процессивности и скорости машины перевода. Метод, представленный здесь, может быть использован для быстрого тестирования эффекта различных буферов, лигандов или других клеточных компонентов для изучения различных аспектов трансляции. Наконец, обсуждаются распространенные экспериментальные подводные камни и способы их устранения. Ниже изложены некоторые важные моменты в экспериментальном проектировании.

Проектирование конструкций
В принципе, существует два общих подхода к созданию OT-совместимой конструкции РНК. Первый подход использует длинную молекулу РНК, которая гибридизуется с комплементарными ручками ДНК, что дает конструкцию, состоящую из двух гибридных областей РНК/ДНК, фланкирующих одноцепочечную последовательность РНК посередине (рисунок 2B). Этот подход используется в большинстве экспериментов с ОТ РНК33,44,45.

Второй подход использует преимущества дескрипторов dsDNA с короткими (около 20 нт) свесами15,17. Эти выступы затем гибридизуются с молекулой РНК. Несмотря на более сложную конструкцию, использование дескрипторов dsDNA преодолевает некоторые ограничения гибридной системы ДНК/РНК. В принципе, могут быть реализованы даже очень длинные ручки (>10кб), что более удобно для конфокальных измерений. Кроме того, молекула РНК может быть лигирована на ручки ДНК для повышения стабильности троса.

Стратегия конечной маркировки
Конструкция должна быть привязана к бусинам посредством сильного молекулярного взаимодействия. Хотя существуют подходы к ковалентному связыванию ручек с бусинами46, сильные, но нековалентные взаимодействия, такие как стрептавидин-биотин и дигоксигенин-антитело, обычно используются в экспериментах OT15,33,35,45. В описанном протоколе конструкция маркирована биотином или дигоксигенином, а шарики покрыты стрептавидином или антителами против дигоксигенина соответственно (фиг.1А). Этот подход был бы пригоден для приложения сил примерно до 60 пН (на трос)47. Кроме того, использование различных стратегий маркировки 5' и 3' позволяет определить ориентацию троса, образованного между бусинами17.

Маркировка белка для измерения флуоресценции
Для конфокальной визуализации существует несколько широко используемых подходов к флуоресцентной маркировке. Например, флуорофоры могут быть ковалентно присоединены к аминокислотным остаткам, которые находятся в белках или вводятся сайт-направленным мутагенезом через реакционноспособную органическую группу. Тиоловые или амино-реактивные красители могут быть использованы для маркировки остатков цистеина и лизина соответственно. Существует несколько обратимых методов защиты для повышения специфичности маркировки48,49, однако нативные белки обычно маркируются несколькими остатками. Хотя небольшой размер флуорофора может дать преимущество, неспецифическая маркировка может влиять на активность белка и, таким образом, интенсивность сигнала может варьироваться49. Также в зависимости от эффективности маркировки интенсивность сигнала может отличаться в разных экспериментах. Поэтому перед экспериментом следует выполнить проверку активности.

В случае, если интересующий белок содержит N- или C-концевую метку, такую как His-tag или strep-tag, специфическая маркировка этих меток представляет собой другой популярный подход. Кроме того, маркировка, нацеленная на метки, снижает вероятность вмешательства флуорофора в активность белка и может повысить растворимость49. Тем не менее, маркировка, специфичная для метки, обычно дает монофлуорофорные меченые белки, которые может быть трудно обнаружить. Другой способ специфической маркировки может быть достигнут путем использования антител.

Настройка микрофлюидики
Сочетание ОТ с системой микрофлюидики позволяет быстро переходить между различными экспериментальными условиями. Кроме того, современные системы используют преимущества поддержания ламинарного потока внутри проточной ячейки, что исключает смешивание жидкостей из других каналов в перпендикулярном направлении относительно направления потока. Поэтому ламинарный поток особенно выгоден для экспериментального проектирования. В настоящее время обычно используются проточные ячейки с 5 каналами (рисунок 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Пробоподготовка

  1. Клонируйте интересующую последовательность в вектор, содержащий фрагменты лямбда-ДНК, которые служат дескрипторными последовательностями (рисунок 2)43,50.
  2. Сначала сгенерируют шаблон ДНК для последующей транскрипции in vitro с помощью ПЦР (рисунок 2B; реакция 1). На этом этапе ПЦР промотор Т7 добавляется в 5' конец молекулы ДНК 32,33,43,50. Устанавливают реакцию ПЦР согласно таблице 1. Запустите ПЦР в 50 мкл аликвот с соответствующими циклами в термоциклере.
  3. Подготавливают ручки двумя отдельными реакциями ПЦР (табл. 1, рис. 2В; реакции 2 и 3). Во-первых, сгенерируйте 5-футовую ручку с помощью ПЦР. Затем сгенерируйте ручку 3' и одновременно пометьте ее дигоксигенином с помощью 5'-дигоксигениновой грунтовки32,33,43,50.
  4. После ПЦР очистите ДНК с помощью спиновых колонн кремнезема.
  5. Проводят реакцию транскрипции in vitro с использованием Т7 РНК-полимеразы (табл. 2)32,33,43,50. Инкубируют реакцию при 37 °С в течение 2-4 ч в зависимости от длины РНК. Затем добавляют ДНКазу I в реакцию и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин для переваривания шаблона ДНК. Очистите РНК с помощью спиновых столбиков кремнезема.
  6. Во время реакции маркировки 5' ручки (таблица 3) добавляют биотин-16-dUTP на 3' конце ручки ДНК-полимеразой T438,50. Проводят реакцию при комнатной температуре в течение 1-2 ч. После этого очистите ДНК с помощью спиновых колонн кремнезема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ручка 5' должна быть маркирована на ее 3' конце (рисунок 2B), маркировка не может быть выполнена во время ПЦР.
  7. Смешайте упомянутые выше компоненты - ручку 5' (3' помеченную биотином), 3' ручку (5' помеченную дигоксигенином) и РНК - в молярном соотношении 1:1:1 в буфере отжига (80% формамид, 400 мМ NaCl, 40 мМ HEPES, рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8), чтобы получить желаемый гибрид РНК/ДНК (таблица 4). Нагрейте смесь для отжига до 85 °C в течение 10 мин, а затем медленно охладите до 4 °C.
  8. Смешайте отожженный образец с 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН 5), 3 объемами ледяного этанола и инкубируйте при -80 °C в течение не менее 1 ч или при -20 °C в течение ночи.
  9. Центрифугируйте образцы при 15 000 × г в течение 30 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и высушите гранулу (обычно не видимую) под вакуумом.
  10. Наконец, повторно суспендируют гранулы в 50 мкл воды без РНКазы и делают аликвоты. Храните аликвоты при -80 °C до использования. Для краткосрочного хранения образцы могут также храниться при -20 °C.

2. Настройка приборов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол оптимизирован для коммерческого оптического пинцета прибора C-Trap от компании LUMICKS. Поэтому при использовании других оптических пинцетов может потребоваться корректировка представленных этапов. Если не используется, система микрофлюидики машины хранится в отбеливателе (раствор гипохлорита натрия) и должна быть вымыта перед использованием.

  1. Отбеливатель и наполните шприцы 1 мл воды без РНКазы.
  2. Добавьте 50 мкл 0,5 М тиосульфата натрия по меньшей мере к 1 мл воды без РНКазы и тщательно промыть систему (1 бар, по меньшей мере 0,5 мл) для устранения оставшегося отбеливателя в системе.
  3. Выбросьте раствор тиосульфата натрия из шприцев. Замените шприцы на свежие и промойте систему не менее чем 0,5 мл воды без РНКазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы система микрофлюидики никогда не пересыхала, чтобы избежать пузырьков воздуха в системе.
  4. Нанесите 2 капли погружного масла (показатель преломления 1,33) или примерно 70 мкл воды поверх объектива.
  5. Поместите проточную ячейку внутрь удерживающей рамы в ее положении.
  6. Нанесите 2 капли погружного масла (показатель преломления 1,51) поверх проточной ячейки.
  7. Включите лазерное устройство в пинцете. Как только он запустится, включите улавливающий лазер в программном интерфейсе на 100%.
  8. Используя диагностические камеры (Z-finder), отрегулируйте ось Z к середине камеры между вторым и третьим отражениями (интерфейсами), где кольца преломления являются самыми большими, повернув микровинт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз, когда объектив перемещается ближе к измерительной камере и фокальная плоскость объектива пересекает границу раздела между двумя фазами, отражение может быть распознано в режиме Z-finder. Возможны 4 интерфейса: (i) вода/иммерсионное масло и нижнее стекло (ii) нижнее стекло и буфер внутри камеры (iii) буфер внутри камеры и верхнее стекло (iv) верхнее стекло и погружное масло для конденсатора.
  9. Отрегулируйте положение конденсатора (установите улавливающий лазер примерно на 50%) таким образом, чтобы конденсатор касался погружного масла поверх измерительной камеры.
  10. Отрегулируйте фокусировку, медленно двигаясь вниз / вверх с конденсатором, поэтому около 10 световых полос отображаются в режиме Луны (диагностические камеры).

3. Измерение образца

  1. Инкубировать шарики с антидигоксигениновым покрытием (AD) с конструкциями образца (3 мкл 0,1% (мас./об.) суспензии бусин AD + 4 мкл образца) и с 1 мкл ингибиторов РНКАЗЫ и 8 мкл буфера анализа (300 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 20 мМ HEPES, рН 7,6, 0,05% Tween 20, 5 мМ DTT) при РТ в течение 10-20 мин. После инкубации разбавляют образец в 500 мкл буфера анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять поглотители кислорода, особенно во время флуоресцентных измерений, в буфер, чтобы предотвратить окислительное повреждение. Здесь использовалась кислородная система поглотителей, содержащая глюкозу (8,3 мг/мл), глюкозооксидазу (40 Ед/мл) и каталазу (185 Ед/мл).
  2. Смешайте 0,8 мкл 1% (мас./об.) шариков, покрытых стрептавидином (SA), с 1 мл буфера анализа.
  3. Выбросьте воду из шприцев и наполните шприцы соответствующими суспензиями/растворами. Мойте не менее 2 минут примерно при 1 баре, а затем начинайте ловить бусины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальной установки могут использоваться различные схемы каналов (рисунок 3). Как правило, один проточный канал заполнен анти-дигоксигениновыми шариками, несущими молекулу РНК. Второй канал заполнен бусинами, покрытыми стрептавидином. Буферный канал используется для формирования тросов. Четвертый канал может быть использован для загрузки РНК-связывающего белка (рисунок 3C), или, альтернативно, RBP может быть добавлен непосредственно в буферный канал (фиг.3B).
  4. Чтобы захватить бусины, отодвиньте оптические ловушки друг от друга. Сначала перейдите на канал AD и поймайте AD-бусину в ловушку 1. Далее переместите сцену в SA-канал и поймайте одну бусину SA ловушкой 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь оставаться на границе буферных и бисежных каналов, чтобы избежать потери уже пойманной бусины или предотвратить ловлю нескольких бусин одной и той же ловушкой.
  5. Как только бусины нужного размера будут захвачены, переместитесь в буферный канал и остановите ламинарный поток. Затем выполните калибровку силы, чтобы проверить жесткость ловушки. Соответствующие значения жесткости не должны отличаться по оси x/y более чем на 10-15%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте мощность лазера или лазерное разделение между ловушками в соответствии с размером шарика. Силовая калибровка не должна выполняться для каждой пары бусин, если шаблоны бусин совпадают (показатель сходства > 0,9). Тем не менее, он должен выполняться регулярно или, по крайней мере, каждый раз, когда изменяются условия анализа.
  6. Начните ловлю на трос, переместив бусины близко друг к другу, подождав несколько секунд, а затем раздвинув их обратно, повторяйте до тех пор, пока не сформируется трос. Образование троса приводит к увеличению измеренной силы при оттягивании двух бусин друг от друга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать образования нескольких привязок, бусины не следует перемещать слишком близко. Поймав трос между двумя бусинами, качество троса можно проверить, найдя растянутое плато. Плато должно составлять от 50 до 60 пН для одного троса.
  7. Получив страховочный трос, приступайте к измерению. В зависимости от изучаемого явления следует выбирать различные измерительные установки (рис. 1В-Д).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно в начале эксперимента проводится эксперимент с силовой рампой, чтобы проверить качество троса и исследовать поведение. После этого можно также начать эксперименты с постоянной силой или постоянным положением для дальнейшего изучения переходов состояний. После того, как на образце РНК было выполнено достаточное количество измерений для определения его поведения, помеченные факторы могут быть добавлены в систему для выполнения конфокальных измерений.
  8. Для выполнения флуоресцентных измерений включите конфокальные лазеры и блок счетчика фотонов в приборе оптического пинцета.
  9. Включите лазер возбуждения нужной длины волны в программном интерфейсе и установите мощность лазера на 5% или выше, в зависимости от флуорофора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При неизмерении понизьте настройку мощности лазера возбуждения до 0%, чтобы избежать чрезмерных фотоповреждений образца.
  10. Запустите создание образа образца с помощью функций изображения программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить хорошо сфокусированные изображения, фокальная плоскость конфокального микроскопа и оптические ловушки должны быть выровнены. Для этого может быть использована автофлуоресценция полистирольных шариков в синем лазерном канале. Фокальная плоскость оптических ловушек перемещается вверх или вниз по оси Z до тех пор, пока изображение бусин не достигнет своего наибольшего диаметра. В этом положении можно измерить флуоресцентный сигнал от молекулы, привязанной между шариками.
  11. Чтобы использовать функцию кимографа, укажите положение x-y оси кимографа, чтобы оно позволяло обнаруживать трос между бусинами.
  12. На протяжении всего измерения состав буфера может быть легко изменен путем перемещения шариков в различные каналы или путем изменения буфера, подаваемого в систему микрофлюидики.

4. Анализ данных

  1. Предварительная обработка необработанных данных
    1. Используя простой сценарий, уменьшите выборку необработанных данных достаточно, чтобы (i) обеспечить более быструю последующую обработку данных, но (ii) по-прежнему содержать всю критическую информацию (рисунок 4A). Обычно для этой цели подходит 100-5000 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частота сбора данных в экспериментах с оптическим пинцетом часто выше, чем это необходимо для анализа - в представленных экспериментах частота сбора данных по умолчанию установлена на уровне 78 125 Гц. Поскольку пространство для хранения ограничено, это удобно и экономит время, чтобы уменьшить частоту дискретизации данных. Здесь необработанные данные были понижены в 30 раз.
    2. Затем используйте фильтр сигнала для уменьшения шума высокочастотного измерения от сигнала (рисунок 4A). Отрегулируйте степень фильтра и параметры частоты среза соответственно, чтобы оптимизировать вывод данных различных экспериментов (рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среди сигнальных фильтров фильтр Баттерворта51 является одним из наиболее широко используемых. В дополнительных данных предусмотрен специально написанный скрипт python, позволяющий предварительно обрабатывать необработанные данные. Параметры понижения дискретизации и фильтрации сигналов (частота среза, степень фильтра) должны быть оптимизированы для различных экспериментов.
  2. Для анализа данных force-ramp выполните следующие действия.
    1. Пометьте шаги либо вручную, найдя соответствующие точки на графике траектории силы, либо с помощью специально написанных сценариев. Разворачивающиеся шаги характеризуются внезапным падением силы в сочетании с увеличением расстояния по кривой сила-расстояние (FD).
    2. После того, как разворачивающиеся события отмечены, подойдите к различным областям кривой FD с помощью соответствующих моделей (рисунок 4D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для региона, предшествующего первому этапу разворачивания, трос можно считать "двухцепочечным" и обычно подходит с использованием расширяемой червеобразной модели цепи (WLC)47,52,53. Частями после первого разворачивающегося события считается комбинация двухцепочечных нуклеотидов (ручек) и одноцепочечных нуклеотидов (развернутая молекула РНК). Таким образом, подгонка данных является более сложной - обычно используется комбинация из 2 моделей WLC или моделей WLC и свободно сращенной цепи (FJC)36,39,52. Расширяемая модель WLC имеет два основных параметра подгонки: длина контура (LC) и длина сохраняемости (LP). Длина контура соответствует длине полностью растянутой молекулы, а длина стойкости определяет изгибающие свойства интересующей молекулы. Модель может быть описана с помощью следующего уравнения (1). WLC может использоваться для моделирования поведения как сложенных, так и развернутых областей, хотя для каждой из них должна использоваться отдельная модель с различными параметрами.
      (1) Equation 1
      где x — разгибание, LC — длина контура, F — сила, LP — длина стойкости, kB — постоянная Больцмана, T — термодинамическая температура, а S — модуль растяжения.
      Вторая модель, называемая свободно-сочлененной цепью (FJC), обычно используется для описания поведения развернутых одноцепочечных областей. Он использует аналогичные параметры полимеров, но рассматривает каждую единицу «цепи» как жесткий стержень, здесь соответствующий нуклеотидам развернутой одноцепочечной области. Следующее уравнение (2) описывает эту модель:
      (2) Equation 2
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наша лаборатория недавно разработала алгоритм, который позволяет пакетную обработку необработанных данных о силовой рампе под названием «Практический анализ оптического пинцета TOol (POTATO)54». Алгоритм понижает и фильтрует данные, затем определяет возможные этапы развертывания и, наконец, выполняет подгонку данных. POTATO встроен в удобный графический интерфейс пользователя (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Обрабатывайте данные с постоянной силой следующим образом:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие инструкции могут быть аналогичным образом применены к данным с постоянным положением.
    1. Для данных о постоянной силе постройте график расстояния с течением времени (рисунок 5). Гистограмма, показывающая частоту (количество) различных конформаций над относительным изменением положения, является полезным способом характеристики различных доминирующих и второстепенных состояний (рисунок 7).
    2. Подойдите к гистограмме, используя (множественные) функции Гаусса для оценки общего процента отдельных конформеров при заданной силе (рисунок 7C). Гауссовское соответствие, среднее положение и стандартное отклонение описывают связанные с силой отношения между различными популяциями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительных данных приведен специально написанный скрипт python, позволяющий проводить предварительную обработку и базовую бимодальную гауссовскую подгонку данных с постоянной силой. Параметры (частота среза, степень фильтра, ожидаемые средние значения, значения стандартного отклонения и амплитуды) необходимо оптимизировать для различных экспериментов.
    3. Затем используйте модель Скрытого Маркова для дальнейшего анализа состояний, которые могут обнаружить дополнительные складчатые промежуточные продукты (конформеры)55. Для получения дополнительной информации о модели постоянной силы и Скрытого Маркова можно обратиться к 55,56,57,58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом разделе основное внимание уделяется измерениям взаимодействий РНК-белок/лиганд флуоресцентным оптическим пинцетом. Описание общих экспериментов с оптическим пинцетом РНК и соответствующих репрезентативных результатов см. в разделе32. Для более подробного обсуждения взаимодействий РНК/ДНК-белок см. также 1,2,26,59,60.

В принципе, связывание RBP или любого другого трансдействующего фактора, представляющего интерес, на РНК стабилизирует, дестабилизирует или может изменить конформацию молекулы. Ниже приведено описание механических наблюдаемых объектов для каждого эффекта. Однако фактический эффект, наблюдаемый для данного РНК-белкового комплекса, не ограничивается этими нижеупомянутыми сценариями.

Стабилизация
Структура РНК может быть специфически распознана и связана белком или другими лигандами45,61,62,63,64. Формирование связей сопровождается высвобождением энергии. Поэтому необходимо преодолеть дополнительный энергетический барьер, чтобы развернуть данную структуру РНК. В результате может наблюдаться увеличение средней силы разворачивания50,65. Стабилизация структуры РНК путем связывания внешнего агента (белка, малой молекулы, других трансдействующих факторов) также может привести к изменению кинетики складчатости структуры45. Для этого дальнейшие измерения могут быть выполнены в режиме постоянной силы, где могут наблюдаться менее частые переходы между складчатыми промежуточными продуктами, а также сдвиг силы в равновесии.

Дестабилизация
Некоторые белки распознают определенные мотивы последовательности, а не конкретные структуры РНК. Сайты связывания могут варьироваться от очень специфического мотива до более общего шаблона, такого как GC или AU rich stretches60,66. Тем не менее, если белок преимущественно связывается с развернутой одноцепочечной конформацией РНК, равновесие между свернутым и развернутым состоянием может быть смещено в сторону развернутого состояния36,43,67. На рисунках 6 и 7 показаны примеры такого поведения.

Изменение структуры
В некоторых случаях RBP (или другие лиганды) могут сочетать оба механизма, упомянутые выше, таким образом, что RBP дестабилизирует ранее доминирующую конформацию и смещает равновесие в сторону альтернативной структуры РНК44,68,69. Переход в альтернативное состояние может привести к изменению наблюдаемых конформационных частот популяции, а также к возникновению или исчезновению отдельных складчатых состояний. Эти изменения могут быть впервые замечены в экспериментах по наращиванию силы и могут быть дополнительно исследованы экспериментами с постоянной силой (или постоянным положением).

Влияние трансдействующего фактора на сворачивание/развертывание РНК
Здесь была изучена последовательность РНК, соответствующая запрограммированному -1 рибосомному элементу сдвига кадров SARS-CoV-2. Предполагается, что этот элемент РНК образует псевдоузломник Н-типа70,71. В примере траекторий сила-расстояние РНК разворачивается и переворачивается в два последовательных шага (рисунок 6А). Эти два шага, вероятно, соответствуют двум стволовым петлям, которые являются предпосылкой для образования псевдоузла. При этом псевдоузл не наблюдался либо потому, что РНК не полностью складывалась, либо образовывала альтернативную структуру, конкурирующую с псевдоузлом. При добавлении трансдействующего фактора ZAP наблюдалось внезапное исчезновение событий переворачивания и огромный гистерезис (рисунок 6B)43. Это говорит о том, что белок связывается с одноцепочечным состоянием РНК, препятствуя образованию вторичных структур. Кроме того, эксперименты с постоянной силой подтверждают результаты экспериментов с силовой рампой. Соответственно, в то время как РНК полностью свернута при температуре около 10 пН (рисунок 7А), присутствие белка смещает переворачивание в сторону более низких сил, и при 10 пН РНК по-прежнему в основном занимает развернутое состояние (рисунок 7B).

Измерения ОТ в сочетании с конфокальной микроскопией
Далее показаны примерные результаты для неспецифического, а также специфического связывания различных флуорофоров и меченых рибосом (рисунок 8). В первом примере краситель SYTOX Green использовался для маркировки привязанного гибрида ДНК/РНК. С увеличением силы связывание красителя становится более обильным, что приводит к более высокому сигналу флуоресценции. Как только сила становится слишком высокой, трос разрывается, и флуоресцентный сигнал теряется (рисунок 8A). Для экспериментов с бактериальными рибосомами (рисунок 8B) неспецифическую маркировку остатков лизина использовали с использованием N-гидроксисукцинимида (NHS), конъюгированного с красным флуоресцентным красителем. Хотя существует риск снижения активности меченого белка / комплекса, большим преимуществом является более сильный сигнал, поскольку каждая рибосома (в среднем) помечена несколькими флуорофорами. Конструкция РНК содержала сайт связывания рибосом (RBS), распознаваемый бактериальными рибосомами, который был помещен в 5' близость изученной последовательности РНК. При связывании рибосом на тросе наблюдается флуоресцентный сигнал. Данные флуоресценции могут быть дополнительно проанализированы с использованием инструментов анализа изображений72, а результаты могут быть объединены с данными о силе, что позволяет изучать складные переходы.

Figure 1
Рисунок 1: Схема эксперимента ОТ и возможные подходы к измерению. (A) Схема, иллюстрирующая эксперименты с оптическим пинцетом с РНК SARS-CoV-2 в середине. РНК гибридизуется с ручками ssDNA и иммобилизуется на шариках. Они используются для оказания силы притяжения на РНК с помощью сфокусированного лазерного луча. Сила постепенно увеличивается до тех пор, пока РНК не развернется (дно). (B) Схема конфокальной микроскопии в сочетании с оптическим пинцетом для мониторинга связывания меченого фактора с РНК. (C) Пример данных о постоянной силе может быть получен путем фиксации силы при постоянном значении с течением времени, что позволяет точно измерить время стоянки конформеров. D) Пример кривой сила-расстояние (FD), полученный в результате измерения силы-рампы. Шаг разворачивания наблюдается как внезапный разрыв профиля FD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Общая схема синтеза образцов ОТ. (A) Пример последовательности и предсказанная вторичная структура изученной РНК SARS-CoV-2, смещающей кадр, используемой в исследовании. (B) Вектор, содержащий интересующую последовательность (SoI), окруженную двумя областями ручки, служит шаблоном для генерации конструкции ДНК/РНК в 3 реакциях ПЦР. Грунтовки изображены и пронумерованы на схеме по местам их связывания в соответствующей ПЦР. ПЦР 1 дает шаблон транскрипции in vitro , который впоследствии используется для реакции транскрипции in vitro (IVT) для генерации длинной молекулы РНК (светло-голубой). PCR 2 дает 5-футовую ручку, которая позже на 3 фута маркируется биотином. PCR 3 с использованием передней праймера, конъюгированной с дигоксигенином, производит 3'-дигоксигенин-меченую ручку. Наконец, две ручки и РНК отжигаются, чтобы получить гибридную конструкцию ДНК / РНК, подходящую для измерений оптического пинцета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Иллюстрация различных настроек каналов микрофлюидики. (А) Схема проточной ячейки с 5-микрофлюидными каналами. (B) и (C) — это увеличение красной пунктирной области (A). (B) Простая 3-канальная установка с бусинами AD и SA в каналах 1 и 3 соответственно. Фактор найден в канале 2. Эта установка подходит для стабильных белков с высоким сродством, поэтому низкая концентрация предпочтительна для обеспечения низкого флуоресцентного фона. Шариковые каналы сбоку обеспечивают фиксированную ориентацию троса и быстрый набор новых бусин при необходимости. (C) 4-канальная настройка с фактором в канале 4. Такая компоновка особенно выгодна для минимального расхода пробы. Измерение может быть выполнено непосредственно в канале 4. Альтернативно, чтобы избежать фонового флуоресцентного сигнала, комплекс может быть сформирован в канале 4, а затем измерение может быть выполнено в канале 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Рабочий процесс анализа данных для экспериментов с силовой рампой. (A) Блок-схема рабочего процесса анализа данных. Файлы необработанных данных сначала понижаются и фильтруются, затем помечаются шаги, а отдельные состояния подстраиваются под соответствующую модель. (B) Необработанные данные содержат значительное количество шума, который препятствует выявлению событий разворачивания/повторного складывания. Также в большинстве экспериментов частота сбора данных выше, чем необходимо. (C) Поэтому для сглаживания профиля данных используется понижение разрешения и фильтрация сигналов. (D) Обработанные кривые окончательно устанавливаются с использованием модели WLC, когда молекула все еще находится в свернутом состоянии (до разворачивающегося события), комбинации WLC с моделями FJC или второй модели WLC, когда молекула находится в развернутом состоянии (после разворачивающегося события). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Влияние частоты среза на вывод данных. Хотя выход необработанных данных может быть обременен шумом сигнала (сверху), крайне важно выбрать правильные параметры фильтрации сигнала для анализа данных. Хотя надлежащая фильтрация поможет в выявлении складных промежуточных продуктов (частота среза 0,1, средняя), чрезмерная фильтрация (частота среза <0,001, нижняя) может привести к потере разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Пример траекторий FD при отсутствии и наличии ZAP. (A) Разворачивающиеся (розовые) и переворачивающиеся (синие) следы РНК SARS-CoV-2 в отсутствие ZAP. Образец показывает легкое сворачивание с небольшим гистерезисом. (B) Разворачивающиеся (розовые) и переворачивающиеся (синие) следы РНК в присутствии транс-фактора ZAP (400 нМ). Образец показывает огромный гистерезис, предполагая, что белок связывается с одноцепочечной РНК и предотвращает ее повторное сворачивание. (C) Линейчатая диаграмма, показывающая количество шагов разворачивания (розовый) и переворачивания (синий) при отсутствии или присутствии ZAP. В то время как распределение разворачивающихся шагов остается почти незатронутым присутствием ZAP, наблюдается явное снижение числа шагов повторного складывания с ПОМОЩЬЮ ZAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Пример данных о постоянной силе при отсутствии и наличии ZAP. (A) Данные о постоянной силе, полученные при силах в диапазоне от 10 (до) до 13 (снизу) пН, показывающие переход от полностью сложенного состояния к полностью развернутому состоянию элемента РНК SARS-CoV-2. Каждый график включает в себя позицию и время (слева) и график гистограммы (справа). (B) Данные о постоянной силе, полученные в присутствии ZAP (400 нМ). При связывании с белками происходит нарушение сворачивания. При 10 пН, в отличие от одной только РНК, в присутствии ЗАП РНК в основном существует в развернутом состоянии. Поэтому указывается сдвиг равновесной силы в сторону более низких сил. (C) Гистограмма данных о положении может быть проанализирована путем подгонки данных к функциям Гаусса, чтобы получить относительное изобилие каждого состояния (полученное из области под кривой для каждого состояния). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: ОТ в сочетании с конфокальной микроскопией. (A) Пример кимографа страховочного троса С маркировкой SYTOX Green (слева). Обратите внимание на увеличение интенсивности сигнала при увеличении сил. Черная стрелка отмечает событие поломки троса, которое приводит к потере сигнала. Изображение троса со связанным к нему красителем (Binding) и после поломки без красителя (No signal) (справа). (B) Пример кимографа специфического связывания рибосомы на мРНК (слева). Событие связывания можно наблюдать в виде флуоресцентного сигнала на привязанной РНК между двумя шариками. Изображение троса без (Без сигнала) и с флуоресцентными мечеными рибосомами, связанными (Связывание) (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Концентрация запасов Конечная концентрация Том
Реакционный объем - - 500 мкл
10× буфер 10× 1× 50 мкл
dNTP микс 10 мМ 0,2 мМ 10 мкл
Высокоточная ДНК-полимераза 1,25 ЕД/мкл 0,025 ЕД/мкл 10 мкл
Грунтовка 1 10 мкМ 0,4 мкМ 20 мкл
Грунтовка 2 10 мкМ 0,4 мкМ 20 мкл
Шаблон 100 нг/мкл 1 нг/мкл 5 мкл
Вода - - 385 мкл

Таблица 1: Схема пипетирования для ПЦР для генерации конструкций оптического пинцета.

Концентрация запасов Конечная концентрация Том
Реакционный объем - - 300 мкл
5× буфер 5× 1× 60 мкл
rNTP микс 25 мМ 5 мМ 60 мкл
Ингибитор РНКАЗЫ 40 ЕД/мкл 0,7 ЕД/мкл 5 мкл
Пирофосфатаза 100 Ед/мл 1,7 мЕд/мкл 4 мкл
Диднавиация 100 мМ 3,3 мМ 10 мкл
Т7 РНК-полимераза 50 ЕД/мкл 3,3 ЕД/мкл 20 мкл
Шаблон 120 нг/мкл 2 нг/мкл 5 мкл
Вода - - 136 мкл

Таблица 2: Схема пипетирования для транскрипции in vitro.

Концентрация запасов Конечная концентрация Том
Реакционный объем - - 100 мкл
10× буфер (NEB 2.1) 10× 1× 10 мкл
БСА 1 мкг/мл 100 нг/мкл 1 мкл
Биотин-16-dUTP 1 мМ 50 мкМ 5 мкл
Т4 ДНК-полимераза 30 ЕД/мкл 1,5 ЕД/мкл 5 мкл
ДНК 5' ручка (20-60 мкг) 300 нг/мкл 237 нг/мкл 79 мкл

Таблица 3: Схема пипетки для 3' торцевой маркировки биотина.

Концентрация запасов Конечная концентрация Окончательная сумма Том
Реакционный объем - - - 300 мкл
Буфер отжига 1.25× 1× - 240 мкл
Ингибиторы РНКАЗЫ 40 ЕД/мкл 0,5 ЕД/мкл - 5 мкл
5' биотинилированная ДНК ручка 300 нг/мкл 10 нг/мкл 3 мкг 10 мкл
3' РУЧКА ДНК 300 нг/мкл 10 нг/мкл 3 мкг 10 мкл
РНК 150 нг/мкл 10 нг/мкл 3 мкг 20 мкл
Вода - - - 5 мкл

Таблица 4: Схема пипетки для отжига конструкции оптического пинцета.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы демонстрируем использование флуоресцентно-связанных оптических пинцетов для изучения взаимодействий и динамического поведения молекул РНК с различными лигандами. Ниже обсуждаются критические шаги и ограничения данной методики.

Критические шаги в протоколе
Что касается многих других методов, качество выборки имеет решающее значение для получения достоверных данных. Поэтому для получения образцов максимально возможного качества стоит потратить время на оптимизацию процедуры пробоподготовки. Этапы оптимизации включают в себя правильную конструкцию праймера, температуры отжига, этапы очистки РНК и белка.

На протяжении всего эксперимента использование отфильтрованных наконечников и растворов имеет решающее значение для поддержания условий, свободных от РНКазы. Кроме того, система микрофлюидики хранится в отбеливателе, когда она не используется. Перед началом измерений важно правильно промыть систему тиосульфатом натрия и водой без РНКазы, чтобы удалить отбеливатель из системы.

В случае, если на протяжении всего эксперимента используются бусины одинакового размера, не требуется каждый раз выполнять калибровку силы. Тем не менее, проверки калибровки силы должны проводиться регулярно для воспроизводимости экспериментов.

Модификации и устранение неполадок метода
Стабильность флуорофоров и фотоотбеливание
Осложнением при флуоресцентных измерениях является фотоотбеливание. Поскольку временные рамки для мониторинга трансляции могут быть увеличены с секунд до минут в зависимости от системы, фотоотбеливание во время измерений также следует учитывать и максимально минимизировать73. Одним из вариантов является использование более стабильных флуорофоров, которые менее склонны к фотоотбеливанию, таких как недавно введенные квантовые точки49,74,75. Дальнейшая стабильность также достигается путем удаления молекул кислорода с использованием системы «поглотителя кислорода», такой как глюкозооксидаза в сочетании с каталазой. Глюкозооксидаза удаляет кислород из окружающей среды, превращая его в перекись водорода, которая затем разлагается каталазой. Также могут быть использованы альтернативные системы очистки кислорода76,77.

Микрофлюидика
Поддержание непрерывного ламинарного потока имеет важное значение для правильных измерений. Самое главное, что система никогда не должна пересыхать. К сожалению, ОДП или другие представляющие интерес трансдействующие факторы часто доступны только в небольших объемах для экспериментов, поэтому поддержание непрерывного потока может быть сложным и дорогостоящим. Если пузырьки воздуха вводятся в систему во время применения образца, для их удаления обычно достаточно ручного давления или промывки этанола.

Ограничения метода
Сочетание ОТ с конфокальной микроскопией также приносит некоторые ограничения. Во-первых, фокальная плоскость конфокального блока должна быть правильно выровнена с центрами ловушек, чтобы обеспечить надлежащую запись флуоресцентного сигнала. Кроме того, для конфокальных измерений обычно требуются дескрипторы размером не менее 2 КБ на каждом участке17. Хотя в принципе использование более длинных ручек возможно, следует учитывать энергетический вклад ручек и изменение длины стойкости для точности анализа данных78. Другим важным моментом являются поглотители кислорода, которые используются для увеличения периода полураспада флуорофоров, также приводят к относительно быстрым изменениям рН растворов76. Эти изменения могут быть частично компенсированы увеличением концентрации буферного соединения; однако во время измерений образцы должны регулярно пополняться (каждые 30-60 мин) для обеспечения стабильных условий в ходе эксперимента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Ануджу Кибе и профессора Редмонда Смита за критическое рецензирование рукописи. Благодарим Татьяну Кох за экспертную техническую помощь. Благодарим Кристину Пекаркову за помощь в записи экспериментальных видео. Работа в нашей лаборатории поддерживается Ассоциацией Гельмгольца и финансированием гранта Европейского исследовательского совета (ERC) Nr. 948636 (NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

Биохимия выпуск 180
Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N.… More

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter