このプロトコルは、光ピンセットを用いたRNAとタンパク質の相互作用を研究するための完全な実験的ワークフローを提示する。光ピンセットと共焦点顕微鏡の組み合わせを含むいくつかの可能な実験セットアップが概説されている。
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この記事について
サマリー
要約
RNAは、その機能に不可欠な多様な構造フォールドを採用しており、細胞内の多様なプロセスに影響を与える可能性があります。また、RNAの構造と機能は、タンパク質、代謝物、または他のRNAなどの様々な トランス作用因子によって変調することができます。例えば、フレームシフトRNA分子は、リボソームを別のオープンリーディングフレームに直接翻訳し、遺伝子スイッチとして機能するコード領域に位置する調節RNAです。彼らはまた、タンパク質または他の トランスファクターに結合した後に異なる折り目を採用することができます。翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNAの構造と安定性を調節する方法を解剖するには、これらのRNA-タンパク質複合体の相互作用と機械的特徴を同時に研究することが重要です。この研究は、単分子蛍光結合光ピンセットを採用して、RNA-タンパク質複合体の立体構造および熱力学的景観を高解像度で探索する方法を示しています。一例として、SARS-CoV-2プログラムリボソームフレームシフトエレメントと、ジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質の 経作用因子短いアイソフォームとの相互作用が詳述される。さらに、蛍光標識リボソームを共焦点単位でモニタリングし、最終的に翻訳伸びの研究を可能にした。蛍光結合OTアッセイは、多様なRNAタンパク質複合体または翻訳を調節する トランス作用因子を探索するために広く適用することができ、RNAベースの遺伝子調節の研究を容易にする可能性があります。
概要
mRNAを介したDNAからタンパク質への遺伝情報の伝達は、細胞内の高分子相互作用を通じてあらゆるレベルで正確に調節される複雑な生化学的プロセスです。翻訳調節では、RNAとタンパク質の相互作用は、様々な刺激およびシグナルに迅速に反応する重要な役割を与える1,2。RNAとタンパク質の相互作用の中には、mRNAの安定性に影響を与え、RNAが翻訳的に活性である時間を変化させるものがあります。他のRNA-タンパク質相互作用は、ストップコドンの読み取り、バイパス、またはプログラムリボソームフレームシフト(PRF)3,4,5,6,7などの再コードメカニズムに関連しています。最近では、多くのRNA結合タンパク質(RRP)が、細胞内でいつ、どのくらいのリコードが起こるかを決定するために、刺激性mRNA要素および翻訳機械と相互作用することが実証されています7,8,9,10,1....
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プロトコル
1. サンプル準備
- 対象の配列を、ハンドル配列として機能するラムダDNAフラグメントを含むベクターにクローン化します(図2)43,50。
- まず、PCRを介して後続 のインビトロ 転写用のDNAテンプレートを生成する(図2B;反応1)。このPCRステップでは、T7プロモーターがセンスDNA分子32、33、43、50の5'末端に添加される。 表1に従ってPCR反応を設定する。サーモサイクラーで適切なサイクルで50 μLアリコートでPCRを実行します。
- 2つの別々のPCR反応でハンドルを準備します(表1、 図2B、反応2および3)。まず、PCRで5'ハンドルを生成します。次に、3'ハンドルを生成し、同時に5'ジゴキ....
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結果
このセクションでは、主に蛍光光ピンセットによるRNA-タンパク質/リガンド相互作用の測定に焦点を当てています。一般的なRNA光学ピンセット実験および対応する代表的な結果の説明については、32を参照してください。RNA/DNA-タンパク質相互作用の詳細については、1,26,59,60も参照してください。
原則として、RNA上のRBPまたは他の 任意の作用因子の結合は、分子の立体構造を安定化、不安定化、または変化させる可能性がある。以下に、各効果に対する機械的観測の描写を示す。しかし、所定のRNA-タンパク質複合体に対して実際に観察された効果は、これらの以下のシナリオに限定されない。
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ディスカッション
ここでは、蛍光結合型光ピンセットを用いて、RNA分子と様々なリガンドの相互作用と動的挙動を研究する方法を示す。以下に、本技術の重要なステップと限界について説明します。
プロトコルの重要なステップ
他の多くの方法と同様に、サンプルの品質は信頼性の高いデータを得るために極めて重要です。したがって、可能な限り最高の品質のサンプルを得るために、サンプル調製のための手順を最適化するために時間を費やす価値があります。最適化ステップには、適切なプライマー設計、アニーリング温度、RNAおよびタンパク質精製ステップが含まれます。
RNaseフリー条件を維持するためには、実験全体を通して、フィルター処理されたチップとソリューションの使用が重要です。また、マイクロ流体システムは、使用しない場合に漂白剤に保たれます。測定を開始する前に、システムから漂白剤を除去するために、チオ硫酸ナトリウムとRNaseフリー水でシステムを適切に洗浄することが重要です。
実験.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
原稿を批判的に見直してくれたアヌジャ・キベ教授とレドモンド・スミス教授に感謝します。私たちは、専門家の技術支援のためにタチアナ・コッホに感謝します。私たちは、実験的なビデオを記録する助けのためにクリスティナペカルコワに感謝します.当研究室での研究は、ヘルムホルツ協会と欧州研究評議会(ERC)グラント・Nr・948636(NC)からの資金提供によって支援されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Bacterial Strains | |||
| E. coli HB101 | lab collection | N/A | cloning of the vectors |
| Chemicals and enzymes | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 31424 | Buffers |
| Biotin-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinylation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | バッファー |
| カタラーゼ | Lumicks | N/A | 酸素スカバンジャーシステム |
| ジチオスレイトール (DTT) | Melford Labs | D11000 | バッファー |
| DNAse I ウシ膵臓由来 | Sigma-Aldrich | D4527 | in vitro 転写 |
| dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| バッファー ホルムアミド | Sigma-Aldrich | 11814320001 | バッファー |
| グルコース | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | 酸素スカバンジャーシステム |
| グルコースオキシダーゼ | Lumicks | N/A | 酸素スカバンジャーシステム |
| HEPES | カールロス | HN78.3 | バッファー |
| 塩化マグネシウム | カールロス | 2189.1 | バッファー |
| Phusion DNA ポリメラーゼ | NEB | M0530L | ギブソン アセンブリ、クローニング |
| 塩化カリウム | メルク | 529552-1KG | バッファー |
| PrimeSTAR GXL DNA ポリメラーゼ | タカラ バイオ クロンテック | R050A | PCR |
| ピロホスホターゼ、サーモスタビレ、無機 | NEB | M0296L | in vitro 転写 |
| RNase 阻害剤 | Molox | 1000379515 Buffer | |
| rNTPS | Life Technologies | R0481 | in vitro転写 |
| チオスロファ酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S6672-500G | 漂白剤の不活性化 |
| Sytox Green | Lumicks | N/A | 共焦点測定 |
| T4 DNA ポリメラーゼ | NEB | M0203S | ビオチン化 |
| T5 エキソヌクレアーゼ | NEB | M0363S | ギブソンアセンブリ、クローニング |
| T7 RNA ポリメラーゼ | 社内で生産 | N/A | in vitro 転写 |
| Taq DNA ポリメラーゼ | NEB | M0267S | PCR |
| Taq リガーゼ | Biozym | L6060L | ギブソンアセンブリ、クローニング |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | バッファー |
| Kits | |||
| モノリスタンパク質ラベリングキット RED-NHS 第2世代(アミン反応性) | ナノテンパー | MO-L011 | リボソームラベリングに使用 |
| Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | リボソーム ラベリング |
| Oligonucleotides | |||
| 5' handle T7 forward | Microsynth | カスタムオーダー | 5フィート- CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', PCR 1 |
| 3' ハンドル リバース | マイクロシンセ | カスタム オーダー | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', PCR 1 でOT in vitro転写テンプレートを生成するために使用 |
| 5' ハンドルフォワード | Microsynth | カスタムオーダー | 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , PCR で 5' ハンドルを生成するために使用 2 |
| 5' ハンドルリバース | マイクロシンセ | カスタムオーダー | 5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', PCR 2 で 5' ハンドルを生成するために使用 |
| 3 'ハンドルフォワード | Microsynth | カスタムオーダー5 | '-ATCCTGCAACCTGCTCTTCTCGCC AG - 3 '、PCRで3'ハンドルを生成するために使用されます |
| 3 'ハンドルリバース5 'ジゴキシゲニンで標識 | Microsynth | カスタムオーダー | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3' で標識、PCRで3'ハンドルを生成するために使用 3 |
| DNA vectorspMZ_OT | |||
| 社内で製造された | N/A | Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control」 Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035;土井: | |
| https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035Software and Algorithms | |||
| Atom | https://atom.io/packages/ide-python | 該当なし | |
| Bluelake | Lumicks | 該当なし | |
| グラフパッド | https://www.graphpad.com/ | 該当なし | |
| InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | 該当なし | |
| Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
| ポテト | N/A | ||
| RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
| Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
| その他 | |||
| ストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子、1.5-1.9 µm、5 ml、1.0% w/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
| 抗ジゴキシゲニン被覆ポリスチレン粒子、2.0-2.4 µm、2 ml、0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| シリンジ | VWR | テルモ SS+03L1 | |
| Devices | |||
| C-trap | Lumicks | N/A | 共焦点顕微鏡と組み合わせた光ピンセット |
参考文献
- Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096(2019).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G.
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再版と許可
