Summary
このプロトコルは、光ピンセットを用いたRNAとタンパク質の相互作用を研究するための完全な実験的ワークフローを提示する。光ピンセットと共焦点顕微鏡の組み合わせを含むいくつかの可能な実験セットアップが概説されている。
Abstract
RNAは、その機能に不可欠な多様な構造フォールドを採用しており、細胞内の多様なプロセスに影響を与える可能性があります。また、RNAの構造と機能は、タンパク質、代謝物、または他のRNAなどの様々な トランス作用因子によって変調することができます。例えば、フレームシフトRNA分子は、リボソームを別のオープンリーディングフレームに直接翻訳し、遺伝子スイッチとして機能するコード領域に位置する調節RNAです。彼らはまた、タンパク質または他の トランスファクターに結合した後に異なる折り目を採用することができます。翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNAの構造と安定性を調節する方法を解剖するには、これらのRNA-タンパク質複合体の相互作用と機械的特徴を同時に研究することが重要です。この研究は、単分子蛍光結合光ピンセットを採用して、RNA-タンパク質複合体の立体構造および熱力学的景観を高解像度で探索する方法を示しています。一例として、SARS-CoV-2プログラムリボソームフレームシフトエレメントと、ジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質の 経作用因子短いアイソフォームとの相互作用が詳述される。さらに、蛍光標識リボソームを共焦点単位でモニタリングし、最終的に翻訳伸びの研究を可能にした。蛍光結合OTアッセイは、多様なRNAタンパク質複合体または翻訳を調節する トランス作用因子を探索するために広く適用することができ、RNAベースの遺伝子調節の研究を容易にする可能性があります。
Introduction
mRNAを介したDNAからタンパク質への遺伝情報の伝達は、細胞内の高分子相互作用を通じてあらゆるレベルで正確に調節される複雑な生化学的プロセスです。翻訳調節では、RNAとタンパク質の相互作用は、様々な刺激およびシグナルに迅速に反応する重要な役割を与える1,2。RNAとタンパク質の相互作用の中には、mRNAの安定性に影響を与え、RNAが翻訳的に活性である時間を変化させるものがあります。他のRNA-タンパク質相互作用は、ストップコドンの読み取り、バイパス、またはプログラムリボソームフレームシフト(PRF)3,4,5,6,7などの再コードメカニズムに関連しています。最近では、多くのRNA結合タンパク質(RRP)が、細胞内でいつ、どのくらいのリコードが起こるかを決定するために、刺激性mRNA要素および翻訳機械と相互作用することが実証されています7,8,9,10,11。したがって、翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNA構造および安定性を調節する方法を解剖するためには、RNA-タンパク質複合体の相互作用原理と機械的特性を詳細に研究することが極めて重要です。
数十年にわたる作業は、速度と精度を達成するために翻訳機械のRNAとタンパク質成分の間の複雑なコミュニケーションに依存する翻訳のマルチステップおよびマルチコンポーネントプロセスを研究するための基礎を築いてきました12,13,14。複雑な規制事象を理解するうえで重要な次のステップは、翻訳中の力、タイムスケール、構造決定要因を高精度で決定することです12,15,16,17。RNAの立体構造ダイナミクス、特に翻訳中のRNA構造に対するトランス作用補助因子の作用の研究は、光ピンセットやゼロモードの導波ガイドを含む単分子ツールの出現によってさらに明るやかされています16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
光ピンセット(OT)は、転写を含む多くの種類のRNA依存性動的プロセスを研究するために適用された非常に正確な単分子技術を表し、翻訳26,28,28,29,30,31,32。光ピンセットの使用により、分子相互作用、核酸構造、熱力学的特性、運動論、およびこれらのプロセスのエネルギーの詳細な調査が可能になりました17,22,33,34,35,36,37,38,39 .光ピンセットアッセイは、焦点を合わせるレーザービームを有する微視的な物体の封じ込めに基づいている。典型的なOT実験では、目的の分子は2つの透明(通常はポリスチレン)ビーズ(図1A)27の間につながれである。これらのビーズは、その後、スプリングのように動作する光学トラップによってキャッチされます。したがって、分子に適用される力は、焦点を合わせるレーザー光(トラップ中心)の中心からのビードの変位に基づいて計算することができる。近年、光ピンセットを共焦点顕微鏡(図1B)と組み合わせて、蛍光またはフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)測定40,41,42を可能にしました。これにより、同時測定が可能な実験の全く新しい分野が開き、力分光法と蛍光データの正確な相関が可能になります。
ここでは、光ピンセットと共焦点顕微鏡を組み合わせて、並進フレームシフトを調節するタンパク質とRNAの相互作用を研究する実験を行う。目的と凝縮器の間に、5つのチャネルを持つフローセルは、層流を用いた連続的なサンプル塗布を可能にする。マイクロ流体チャネルを介して、様々な成分を直接注入することができ、実験全体を通してサンプル消費をほとんど行わず、実践的な時間を短縮します。
まず、OT実験の設計を支援する基本的なガイドラインを提案し、様々なセットアップの落とし穴と同様に利点を議論する。次に、サンプルの調製と実験ワークフローについて説明し、データ分析のためのプロトコルを提供する。例を示すために、代替読み取りフレーム43からのウイルスRNAの翻訳を変化させるジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質(ZAP)のトランス作用因子を用いてSARS-CoV-2フレームシフトRNA元素(図2A)を研究するRNAストレッチ実験から得られた結果を概説する。さらに、このOT共焦点アッセイでは蛍光標識リボソームを採用できることが実証されており、翻訳機械の加工性と速度を監視するのに役立ちます。ここで提示される方法は、翻訳のさまざまな側面を研究するために、異なるバッファー、リガンド、または他の細胞成分の効果を迅速にテストするために使用することができます。最後に、一般的な実験的な落とし穴と、それらのトラブルシューティング方法について説明します。以下に、実験計画の重要なポイントを概説します。
設計の構築
原則として、OT適合性RNA構築物を作成するための2つの一般的なアプローチがあります。最初のアプローチは、相補的なDNAハンドルとハイブリダイズされる長いRNA分子を採用し、したがって、真ん中に一本鎖RNA配列を横切る2つのRNA/DNAハイブリッド領域からなる構築物を生み出す(図2B)。このアプローチは、ほとんどのOT RNA実験で33,44,45に採用されています。
2 番目のアプローチでは、dsDNA ハンドルの短い (約 20 nt) のオーバーハング数 15,17 を利用します。これらのオーバーハングは、RNA分子とハイブリダイズされます。設計は複雑ですが、dsDNAハンドルを使用すると、DNA/RNAハイブリッドシステムの制限を克服できます。原則として、非常に長いハンドル(>10kb)でも実装できるため、共焦点測定に便利です。さらに、RNA分子をDNAハンドルに連結してテザー安定性を高めることができる。
エンドラベリング戦略
構築物は強い分子相互作用によってビーズにつながれなければならない。ハンドルの共有結合にはbeads46へのアプローチがありますが、ストレプトアビジン-ビオチンおよびジゴキシゲニン抗体などの強いが非共有的な相互作用は、OT実験15,33,35,45で一般的に使用されています。記載されたプロトコルにおいて、構築物はビオチンまたはジゴキシゲニンで標識され、ビーズは、それぞれ、ジゴキシゲニンに対するストレプトアビジンまたは抗体でコーティングされる(図1A)。このアプローチは、最大約60pN(テザー当たり)47の力を加えるのに適しています。さらに、異なる5'および3'ラベル付け戦略を使用することで、ビーズ17の間に形成されるテザーの方向を決定することができる。
蛍光測定用タンパク質標識
共焦点イメージングでは、蛍光標識にはいくつかの一般的に使用されるアプローチがあります。例えば、フルオロフォアは、タンパク質に自在に見られるアミノ酸残基に共有結合したり、反応性有機基を介して部位特異的突然変異誘発によって導入されたりする。チオールまたはアミン反応性染料は、システイン残基およびリジン残基の標識にそれぞれ使用できる。標識48,49の特異性を高めるための可逆的な保護方法はいくつかありますが、ネイティブタンパク質は通常、複数の残基で標識されます。蛍光素の小さなサイズは利点を与えるかもしれませんが、非特異的標識はタンパク質活性を妨げる可能性があり、したがってシグナル強度は49変わることがあります。また、標識効率に応じて信号強度が異なる実験によって異なる場合がある。したがって、実験の前にアクティビティチェックを実行する必要があります。
目的のタンパク質に His タグやストレップ タグなどの N または C 端子タグが含まれている場合、これらのタグの特定の標識は別の一般的なアプローチを表します。さらに、タグ標的標識は、フルオロフォアがタンパク質活性を妨害する可能性を低減し、溶解度49を高めることができる。しかし、タグ特異的標識は通常、モノフルオロフォア標識タンパク質を生み出し、検出が困難である可能性があります。特異的標識の別の方法は、抗体を採用することによって達成することができる。
マイクロ流体セットアップ
OTとマイクロ流体システムの組み合わせにより、異なる実験条件間の迅速な移行が可能になります。さらに、現在のシステムはフローセル内の層流を維持することを利用し、流れ方向に対して垂直方向の他のチャネルからの液体の混合を妨げる。そのため、層流は実験計画に特に有利である。現在、最大5チャンネルのフローセルが一般的に使用されています(図3)。
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Protocol
1. サンプル準備
- 対象の配列を、ハンドル配列として機能するラムダDNAフラグメントを含むベクターにクローン化します(図2)43,50。
- まず、PCRを介して後続 のインビトロ 転写用のDNAテンプレートを生成する(図2B;反応1)。このPCRステップでは、T7プロモーターがセンスDNA分子32、33、43、50の5'末端に添加される。 表1に従ってPCR反応を設定する。サーモサイクラーで適切なサイクルで50 μLアリコートでPCRを実行します。
- 2つの別々のPCR反応でハンドルを準備します(表1、 図2B、反応2および3)。まず、PCRで5'ハンドルを生成します。次に、3'ハンドルを生成し、同時に5'ジゴキシゲニン標識プライマー32、33、43、50を使用してジゴキシゲニンでそれをラベル付けします。
- PCR後、シリカスピンカラムを用いてDNAを精製する。
- T7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応を行う(表2)32、33、43、50。RNAの長さに応じて、37°Cで2〜4時間反応をインキュベートします。次に、DNase Iを反応に加え、37°Cで30分間インキュベートし、DNAテンプレートを消化します。シリカスピンカラムを使用してRNAを精製します。
- 5'ハンドルの標識反応(表3)の間に、T4 DNAポリメラーゼ38,50によってハンドルの3'端部にビオチン-16-dUTPを加える。室温で1〜2時間反応を行う。その後、シリカスピンカラムを用いてDNAを精製する。
メモ:5'ハンドルは3'の端にラベル付けする必要があるため(図2B)、PCR中にラベル付けを行うことはできません。 - 上記の成分を混合する - 5'ハンドル(ビオチンで標識3')、3'ハンドル(5'ジゴキシゲニンで標識)、およびRNA - アニール緩衝液中の1:1:1モル比(80%ホルムアミド、400mM NaCl、40mM HEPES、pH 7.5、0.5 mEDTA、pH)を得る/4つのDNAハイブリッド(DNA)を得る。焼鈍混合物を85°Cまで10分間加熱し、4°Cまでゆっくりと冷まします。
- アニールサンプルを3M酢酸ナトリウム(pH5)の1/10容量と混合し、3量の氷冷エタノールを混合し、-80°Cで1時間または-20°Cで一晩でインキュベートします。
- サンプルを4°Cで30分間15,000× g で遠心します。 上清を捨て、真空下でペレット(通常は目に見えない)を乾燥させます。
- 最後に、再懸濁し、ペレットをRNaseフリー水の50μLで、アリコートを作ります。アリコートは使用するまで-80°Cで保管してください。短期保存のために、サンプルはまた-20°Cで貯えることができる。
2. 計器のセットアップ
メモ:次のプロトコルは、LUMICKS社の商用光ピンセット計器C-Trap用に最適化されています。したがって、他の光ピンセット機器を使用する場合、提示されたステップの調整が必要になる場合があります。使用しない場合、機械のマイクロ流体システムは漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム溶液)に保たれ、使用前に洗浄する必要があります。
- 漂白剤を捨て、RNaseフリーの水を1mLで注射器に充填します。
- 0.5 Mナトリウムチオ硫酸ナトリウムの50 μLを少なくとも1mLのRNaseフリー水に加え、システム(1バー、0.5mL以上)を十分に洗浄して、システム内の残りの漂白剤を除去します。
- チオ硫酸ナトリウム溶液を注射器から捨てます。注射器を新鮮なものに交換し、RNaseフリー水の少なくとも0.5 mLでシステムを洗浄してください。
注:マイクロ流体システムは、システム内の気泡を避けるために乾燥して実行することはありませんので、注意してください。 - 2滴の浸漬油(1.33の屈折率)または約70μLの水を目的の上に置きます。
- フローセルを保持フレーム内の位置に配置します。
- 流動セルの上に2滴の浸漬油(1.51の屈折率)を入れます。
- ピンセットマシンでレーザーデバイスの電源を入れます。実行したら、ソフトウェアインターフェイスのトラップレーザーを100%でオンにします。
- 診断カメラ(Zファインダー)を使用して、マイクロスクリューを回して、屈折リングが最大である第2反射と第3反射(インタフェース)の間のチャンバーの中央にZ軸を調整します。
注:目的が測定チャンバーに近づき、目的の焦点面が2つのフェーズ間の界面を横切るたびに、Zファインダーモードで反射を認識することができます。可能な4つのインターフェースがあります:(i)水/浸漬油および底ガラス(ii)チャンバー内の底部ガラスおよび緩衝液(iii)チャンバー内の(iii)緩衝液、上部ガラス(iv)上部ガラスおよび凝縮器用浸漬油。 - コンデンサの位置を調整し(トラップレーザーを約50%)、コンデンサが測定室の上に浸漬油に触れるようにします。
- コンデンサーでゆっくりと下に移動してフォーカスを調整し、月モード(診断カメラ)で約10個の光バンドが表示されるようにします。
3. サンプル測定
- インキュベート抗ジゴキシゲニンコーティングビーズ(AD)サンプル構成体(3 μLの0.1%(w/v)ADビーズ懸濁液+4 μLサンプル)と、RNase阻害剤1 μLおよび8μLのアッセイバッファー(300 mM KCl、 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7.6, 0.05% Tween 20, 5 mM DTT) RTで 10-20 分間.インキュベーション後、サンプルを500 μLのアッセイバッファーで希釈します。
注:酸化的損傷を防ぐために、特に蛍光測定時に酸素捕捉剤をバッファーに追加することをお勧めします。ここでグルコース(8.3mg/mL)、グルコースオキシダーゼ(40 U/mL)およびカタラーゼ(185 U/mL)を含む脱酸素剤系が使用された。 - 0.8 μLの 1%(w/v)ストレプトアビジンコーティング(SA)ビーズを1 mLのアッセイバッファーと混合します。
- 注射器から水を捨て、それぞれの懸濁液/溶液で注射器を充填します。約1バーで少なくとも2分間洗ってから、ビーズを捕まえ始めます。
メモ:実験用のセットアップによっては、異なるチャンネル配置が使用される場合があります(図3)。典型的には、1つの流路はRNA分子を運ぶ抗ジゴキシゲニンビーズで満たされる。第2のチャネルは、ストレプトアビジンコーティングビーズで満たされています。バッファチャネルは、テザーを形成するために使用されます。第4のチャネルは、RNA結合タンパク質をロードするために使用することができる(図3C)、または代わりに、RBPを直接バッファチャネルに加えることができる(図3B)。 - ビーズをキャプチャするには、光トラップを互いに離して動かします。まず AD チャネルに移動し、トラップ 1 で AD ビーズをキャッチします。次に、ステージを SA チャネルに移動し、トラップ 2 で単一の SA ビーズをキャッチします。
注:すでに捕まえられたビードを失うことを避けるために、または同じトラップによって複数のビーズを捕まえるのを防ぐために、バッファとビードチャネルのインターフェイスにとどまるようにしてください。 - 適切なサイズのビーズがキャプチャされたら、バッファーチャネルに移動し、層流を停止します。次に、トラップの剛性をチェックするために力のキャリブレーションを行います。それぞれの剛性の値は、X/Y 軸で 10 ~ 15% 以上異なってはなりません。
注:ビードサイズに応じて、レーザーパワーまたはレーザー分割をトラップ間で調整します。ビードテンプレートが一致する限り、すべてのビードペアに対してフォースキャリブレーションを行う必要はありません(類似度スコア>0.9)。しかし、定期的に行うか、または少なくともアッセイ条件が変化するたびに行われるべきである。 - ビーズを互いに近くに移動し、数秒間待ってから離れて戻し、テザーが形成されるまで繰り返すことによって、テザーの釣りを開始します。テザー形成は、2つのビーズを互いに引き離した場合に測定力の増加をもたらす。
注: 複数のテザーの形成を避けるために、ビーズを近くに移動しすぎないようにしてください。2つのビーズの間にテザーを挟んだ後、過延伸高原を見つけることによってテザーの品質を確認することができます。単一のテザーの場合、高原は50〜60 pNの間でなければなりません。 - テザーを取得した後、測定を開始します。研究した現象に応じて、異なる測定設定を選択する必要があります(図1B-D)。
注: 通常、実験の開始時に、テザーの品質を確認し、動作を調査するフォースランプ実験が行われます。その後、状態遷移をさらに研究するために、一定力または定位置実験を開始してもよい。RNAサンプルで十分な数の測定が行われ、その挙動を決定すると、標識された因子をシステムに追加して共焦点測定を行うことができます。 - 蛍光測定を行う場合は、光ピンセット装置の共焦点レーザーと光子カウンターユニットをオンにします。
- ソフトウェアインターフェースで希望波長の励起レーザーをオンにし、蛍光色素に応じてレーザーのパワーを5%以上に設定します。
注:測定を行わないうち、励起レーザーの電力設定を0%に下げて、サンプルへの過度の光害を避けてください。 - ソフトウェアのイメージ機能を使用してサンプルのイメージングを開始します。
注意:画像を十分に焦点を合わせるには、共焦点顕微鏡と光学トラップの焦点面を整列させる必要があります。この目的のために、青色レーザーチャネルにおけるポリスチレンビーズの自己蛍光を採用することができる。オプティカル トラップの焦点面は、ビーズの画像が最も高い直径に達するまで Z 軸で上下に移動します。この位置では、ビーズ間につながれた分子からの蛍光シグナルを測定することができる。 - キモグラフ機能を使用するには、ビーズ間のテザーを検出できるように、キモグラフ軸のx-y位置を指定します。
- 測定全体を通して、緩衝組成物はビーズを異なるチャネルに移動するか、マイクロ流体システムで供給されるバッファを変えることによって容易に変えることができる。
4. データ分析
- 生データの前処理
- 単純なスクリプトを使用して、(i) 後続のデータ処理を高速化するのに十分な量の未加工データをダウンサンプルしますが、(ii) すべての重要な情報を含んでいます (図 4A)。通常、100-5000 Hzはこの目的に適しています。
注:光ピンセット実験のデータ収集頻度は、多くの場合、分析に必要なよりも高いです - 提示された実験では、データ収集周波数はデフォルトで78 125 Hzに設定されています。記憶領域が限られているため、データのサンプリングレートを低減するのに便利で時間を節約できます。ここでは、生データを30倍にダウンサンプリングしました。 - 次に、信号フィルタを用いて、信号からの高周波測定ノイズを低減する(図4A)。フィルターの度合いとカットオフ周波数のパラメータを調整して、異なる実験のデータ出力を最適化します(図5)。
注意:信号フィルタの中で、バターワースfilter51 は最も広く使用されているの一つです。生データの事前処理を可能にするカスタム記述の Python スクリプトが補足データに提供されます。ダウンサンプリングと信号フィルタリングパラメータ(カットオフ周波数、フィルタ度)は、さまざまな実験に合わせて最適化する必要があります。
- 単純なスクリプトを使用して、(i) 後続のデータ処理を高速化するのに十分な量の未加工データをダウンサンプルしますが、(ii) すべての重要な情報を含んでいます (図 4A)。通常、100-5000 Hzはこの目的に適しています。
- フォース ランプ データ解析では、次の手順を実行します。
- フォース軌道プロット上の対応する点を見つけるか、カスタム記述スクリプトを使用して、手動でステップをマークします。展開ステップは、力距離(FD)曲線の距離の増加と組み合わせた急激な力の低下によって特徴付けられる。
- 展開イベントがマークされたら、適切なモデルを使用して FD カーブの異なる領域にフィットします(図 4D)。
注: 最初の展開手順の前の領域では、テザーは「二本鎖」とみなされ、一般的に拡張可能なワームのようなチェーン モデル(WLC)47,52,53 を使用してフィットします。最初の展開イベントの後の部分は、二本鎖ヌクレオチド(ハンドル)と一本鎖ヌクレオチド(展開されたRNA分子)の組み合わせと考えられています。したがって、データフィッティングはより複雑です - 通常、2つのWLCモデルまたはWLCと自由結合チェーン(FJC)モデルの組み合わせが採用されています36,39,52。拡張可能 WLC モデルには、輪郭の長さ(LC)と持続性の長さ(LP)の 2 つのメイン フィット パラメータがあります。輪郭の長さは、完全に伸びた分子の長さに対応し、持続長は対象の分子の曲げ特性を定義する。モデルは、以下の式(1)で記述することができる。WLC は、折り畳まれた領域と展開された領域の両方の動作をモデル化するために使用できますが、これらごとに異なるパラメータを持つ別々のモデルを採用する必要があります。
(1)
ここで、Xは伸長、LC は輪郭の長さ、Fは力、LP は持続長、kB はボルツマン定数、Tは熱力学温度、Sはストレッチ係数です。
自由関節チェーン(FJC)と呼ばれる2番目のモデルは、一般的に展開された単一の立ち往生領域の挙動を記述するために使用されます。ポリマーの同様のパラメータを使用するが、ここで展開された単一鎖領域のヌクレオチドに対応する「鎖」の各単位を剛性ロッドとして扱う。次の式 (2) は、このモデルを説明します。
(2)
注:私たちの研究室は最近、「実用的な光ピンセット分析TOol(POTATO)54」と呼ばれる生の力ランプデータのバッチ処理を可能にするアルゴリズムを開発しました。アルゴリズムは、データをダウンサンプリングしてフィルタリングし、展開可能なステップを特定し、最終的にデータフィッティングを実行します。ポテトはユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)(https://github.com/REMI-HIRI/POTATO)で造られる。
- 定数強制データは、次のように処理します。
注: 次の手順は、定数位置データに対して類似的に適用できます。- 一定力データの場合、時間の経過に対する距離をプロットします(図5)。位置の相対的な変化に対する異なる立体の頻度(カウント)を示すヒストグラムは、さまざまな支配的およびマイナーな状態を特徴付ける便利な方法です(図7)。
- (複数の)ガウス関数を使用してヒストグラムを適合させ、特定の力で個々の適合者の全体的な割合を推定します(図7C)。ガウスは、適合、平均位置、標準偏差は、異なる集団間の力関連関係を概説します。
注: 事前処理と定数力データの基本的な二重モーダルガウスフィッティングを可能にするカスタム記述されたPythonスクリプトは、補足データに提供されています。パラメータ(カットオフ周波数、フィルタ度、期待値、標準偏差値、振幅)は、さまざまな実験に合わせて最適化する必要があります。 - 次に、隠しマルコフモデルを使用して状態をさらに分析し、追加の折りたたみ中間体(適合者)55を明らかにする可能性があります。定数力および隠されたマルコフモデルの詳細については、1つは55、56、57、58を参照することができます。
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Representative Results
このセクションでは、主に蛍光光ピンセットによるRNA-タンパク質/リガンド相互作用の測定に焦点を当てています。一般的なRNA光学ピンセット実験および対応する代表的な結果の説明については、32を参照してください。RNA/DNA-タンパク質相互作用の詳細については、1,26,59,60も参照してください。
原則として、RNA上のRBPまたは他の 任意の作用因子の結合は、分子の立体構造を安定化、不安定化、または変化させる可能性がある。以下に、各効果に対する機械的観測の描写を示す。しかし、所定のRNA-タンパク質複合体に対して実際に観察された効果は、これらの以下のシナリオに限定されない。
安定化
RNA構造は、タンパク質または他のリガンド45、61、62、63、64によって特異的に認識され結合することができる。結合の形成は、エネルギーの放出を伴う。したがって、与えられたRNA構造を展開するために余分なエネルギー的な障壁を克服する必要があります。その結果、平均展開力の増加が50,65に観察される可能性があります。外部の薬剤(タンパク質、小分子、その他のトランス作用因子)の結合によるRNA構造の安定化は、構造45の折りたたみ動力学の変化をもたらすこともある。そのために、さらなる測定は、平衡における力シフトと同様にフォールディング中間体間のあまり頻繁な移行が観察される、定力モードで行うことができる。
不安定
一部のタンパク質は、特定のRNA構造ではなく、特定の配列モチーフを認識します。結合部位は、極めて特異的なモチーフから、GCまたはAUリッチストレッチスなどのより一般的なパターンまで異なる可能性があります60,66。それにもかかわらず、タンパク質が展開された一本鎖RNAの立体構造に優先的に結合する場合、折り畳まれた状態と展開状態の間の平衡は、展開された状態36,43,67に向かってシフトすることができる。図 6 および図 7 では、このような動作の例を示します。
構造変更
場合によっては、RBP(または他のリガンド)は、RBPが以前に支配的な立体構造を不安定化させ、平衡を代替RNA構造44,68,69に向けてシフトするような方法で、上記の両方のメカニズムを組み合わせるかもしれません。代替状態への切り替えは、観測された立体構造の集団周波数の変化と、個々の折りたたみ状態の発生または消失をもたらす可能性があります。これらの変化は、最初に力ランプ実験で観察することができ、一定の力(または一定位置)実験によってさらに調査することができます。
RNAの折り畳み/展開に対するトランス作用因子の効果
ここで、SARS-CoV-2の−1プログラム型リボソームフレームシフト要素に対応するRNA配列を検討した。このRNA元素は、H型擬似ノット70,71を形成すると予測される。この例では、力距離の軌道では、RNAが展開し、2つの連続したステップで折り返します(図6A)。これらの2つのステップは、疑似結び目形成の前提条件である2つのステムループに対応している可能性が高い。この場合、RNAが完全に折り畳んだり、偽ノットと競合する代替構造を形成しなかったため、偽結は観察されなかった。トランス作用因子ZAPを添加すると、再折り返しイベントの突然消失と巨大ヒステリシスが観察された(図6B)43。これは、タンパク質がRNAの一本鎖状態に結合し、二次構造の形成を妨げることを示唆している。さらに、定力実験は、フォースランプ実験の結果を確認します。したがって、RNAは10pN前後で完全に折り畳まれている間(図7A)、タンパク質の存在は下の力に向かってリフォールディングをシフトし、10pNではRNAが依然として大部分が展開状態を占めている(図7B)。
OT測定と共焦点顕微鏡
次に、異なるフルオロフォアおよび標識リボソームの非特異的な結合に対する例示的な結果が示される(図8)。最初の例では、SYTOXグリーン色素を使用して、テザーDNA/RNAハイブリッドを標識しました。増加力に伴い、色素結合がより豊富になり、より高い蛍光シグナルをもたらす。力が高すぎるとテザーが壊れ、蛍光信号が失われます(図8A)。細菌性リボソーム(図8B)を用いた実験では、リジン残基の非特異的標識を、赤色蛍光色素に共役したN-ヒドロキシスクハニミド(NHS)を用いて採用した。標識タンパク質/錯体の活性を低下させるリスクがあるが、各リボソームが(平均して)複数のフルオロフォアによって標識されるほど、大きな利点は、より強いシグナルを達成する。RNA構築物には、細菌リボソームによって認識されるリボソーム結合部位(RBS)が含まれ、研究したRNA配列の5'近接に配置された。リボソームの結合時に、蛍光シグナルがテザー上で観察される。蛍光データは画像解析ツール72を用いてさらに解析することができ、その結果を力データと組み合わせることができ、折りたたみ遷移の研究が可能となる。
図1:OT実験と可能な測定アプローチの概略(A) 中間にSARS-CoV-2フレームシフトRNAを用いた光ピンセット実験を説明する回路図。RNAはssDNAハンドルにハイブリダイズされ、ビーズに固定化されます。これらは、焦点を合わせるレーザービームでRNAに引っ張力を発揮するために使用されます。RNAが展開されるまで、力は徐々に増加します(底)。 (B) 共焦点顕微鏡の模式図光と光ピンセットを組み合わせてRNAへの標識因子の結合を監視する。 (C) 定力データの例は、時間の経過に伴う一定値で力を固定することによって得ることができ、これは正確に適合者のドウェル時間を測定することを可能にする。 (D) フォースランプ測定から得られた力距離(FD)曲線の例。展開ステップは、FD プロファイルで突然の破裂として観察されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:OTサンプル合成の一般的なスキーム。(A) 研究に用いたSARS-CoV-2フレームシフトRNAのサンプル配列および予測二次構造。 (B) 2つのハンドル領域に隣接する目的の配列(SoI)を含むベクターは、3つのPCR反応におけるDNA/RNA構築物の生成のための鋳型として機能する。プライマーは、対応するPCRの結合部位に従ってスキームで描写され、番号が付けられております。PCR 1は 、インビトロ 転写テンプレートを生成し、続いて、長いRNA分子(水色)を生成する in vitro 転写(IVT)反応に使用されます。PCR 2は、ビオチンで標識された後の3'である5'ハンドルを生成します。二ゴキシゲニンに前方プライマーを用いたPCR3は、3'ジゴキシゲニン標識ハンドルを生成する。最後に、2つのハンドルとRNAをアニールして、光学ピンセット測定に適したDNA/RNAハイブリッド構築物を与えます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:異なるマイクロ流体チャネルの設定の図。(A) 5-マイクロ流体チャネルを有するフローセルのスキーム。 (B)と(C)は、(A)の赤破面積のズームインです。(B) ADビーズと SA ビーズをチャネル 1 と 3 にそれぞれ設定したシンプルな 3 チャネルの設定。因子はチャンネル2にあります。このセットアップは、高い親和性を有する安定したタンパク質に適しており、したがって低濃度は低い蛍光バックグラウンドを確保することが好ましい。サイドのビーズチャンネルは、固定テザーの向きと必要に応じて新しいビーズの迅速な採用を可能にします。(C) チャンネル 4 のファクタを使用した 4 チャンネルの設定。このような配置は、最小限のサンプル消費に特に有利である。測定は、チャンネル4で直接行うことができる。あるいは、バックグラウンド蛍光信号を回避するために、複合体をチャネル4に形成し、次いで測定をチャネル3で行うことができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: フォースランプ実験のデータ解析ワークフロー(A) データ分析ワークフローのフローチャート。生データファイルは、最初にダウンサンプリングされ、フィルタリングされ、ステップがマークされ、個々の状態が対応するモデルに適合されます。 (B) 生データにはかなりのノイズが含まれており、展開/リフォールディングイベントの識別を妨げる。また、ほとんどの実験では、データ収集の頻度が必要以上に高くなっています。 (C) そのため、データプロファイルを滑らかにするためにダウンサンプリングと信号ろ過が採用されます。 (D) 処理された曲線は、分子がまだ折り畳まれた状態(展開イベントの前)、WLC と FJC モデルの組み合わせ、または分子が展開状態にある場合(展開イベントの後)の 2 番目の WLC モデルの場合に、最終的に WLC モデルを使用してフィットします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:データ出力に対するカットオフ周波数の影響 生データ出力には信号ノイズ(上)が負担される場合がありますが、データ分析に適切な信号ろ過パラメータを選択することが重要です。適切なろ過は、フォールディング中間体(カットオフ周波数0.1、中間)の識別に役立ちますが、オーバー濾過(カットオフ周波数<0.001、底)は分解能の損失をもたらす可能性があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ZAPの不在と存在下におけるFD軌道の例。(A) ZAPが存在しない場合の SARS-CoV-2 RNAの展開(ピンク)およびリフォールディング(青色)の痕跡。サンプルは小さいヒステリシスだけによって容易に再折を示す。(B)トランスファクタZAP(400 nM)の存在下でのRNAの展開(ピンク)およびリフォールディング(青色)の痕跡。このサンプルは巨大なヒステリシスを示し、タンパク質が一本鎖RNAに結合し、そのリフォールディングを防ぐことを示唆している。(C) ZAP が存在しないか存在する場合の展開(ピンク)およびリフォールディング(青)ステップの数を示す棒グラフ。展開ステップの分布は ZAP の存在によってほとんど影響を受けませんが、ZAP を使用するリフォールディング ステップの数は明らかに減少しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ZAPが存在しない場合の定数力データの例。(A) 10(最大)から13(下)の間の力で得られた定数力データは、完全に折り畳まれた状態から完全に展開された状態へのシフトを示す、 SARS-CoV-2フレームシフトRNA要素の状態を示す。各グラフには、位置対時間(左)とヒストグラムプロット(右)が含まれています。 (B) ZAP(400nM)の存在下で得られる定数力データ。タンパク質結合時に、リフォールディングが損なわれる。10pNでは、RNA単独とは対照的に、ZAP RNAの存在下では、大部分が展開状態に存在する。したがって、平衡力の下方力へのシフトが示される。 (C) 位置データのヒストグラムは、各状態の相対的な存在量を得るためにガウス関数にデータを適合させることによって分析することができます(各状態の曲線下の領域から導出されます)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:OTを共焦点顕微鏡と組み合わせる。(A) SYTOXグリーンラベルテザーの例(左)。増加力での信号強度の増加に注意してください。黒い矢印はテザー破損イベントを示し、信号の損失につながります。それに結合した染料を有するテザーの描写(バインディング)および染料なしの破損後(信号なし)(右)。 (B) mRNA上のリボソームの特異的結合のキモグラフ例(左)。結合イベントは、2つのビーズ間のテザリングRNA上の蛍光シグナルとして観察することができる。(シグナルなし)と蛍光標識リボソームが結合した(結合)を伴うテザーの描写(右)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 在庫集中 | 最終濃度 | 容積 | |
| 反応量 | - | - | 500 μL |
| 10×バッファー | 10× | 1× | 50 μL |
| dNTP ミックス | 10mM | 0.2 mM | 10 μL |
| 高忠実度DNAポリメラーゼ | 1.25 U/μL | 0.025 U/μL | 10 μL |
| プライマー 1 | 10 μM | 0.4 μM | 20 μL |
| プライマー2 | 10 μM | 0.4 μM | 20 μL |
| テンプレート | 100 ng/μL | 1 ng/μL | 5 μL |
| 水 | - | - | 385 μL |
表1:光学ピンセット構築物を生成するPCRのためのピペット化スキーム。
| 在庫集中 | 最終濃度 | 容積 | |
| 反応量 | - | - | 300 μL |
| 5×バッファー | 5× | 1× | 60 μL |
| rNTP ミックス | 25mM | 5 mM | 60 μL |
| RNase阻害剤 | 40 U/μL | 0.7 U/μL | 5 μL |
| パイロホスファターゼ | 100 U/mL | 1.7 mU/μL | 4 μL |
| DTT | 100mM | 3.3 mM | 10 μL |
| T7 RNAポリメラーゼ | 50 U/μL | 3.3 U/μL | 20 μL |
| テンプレート | 120 ng/μL | 2 ng/μL | 5 μL |
| 水 | - | - | 136 μL |
表2:インビトロ転写のためのピペット法。
| 在庫集中 | 最終濃度 | 容積 | |
| 反応量 | - | - | 100 μL |
| 10×バッファー (NEB 2.1) | 10× | 1× | 10 μL |
| BSA | 1 μg/ml | 100 ng/μL | 1 μL |
| ビオチン-16-dUTP | 1 mM | 50 μM | 5 μL |
| T4 DNAポリメラーゼ | 30 U/μL | 1.5 U/μL | 5 μL |
| DNA 5'ハンドル(20-60 μg) | 300 ng/μL | 237 ng/μL | 79 μL |
表3:3'末端ビオチン標識のためのピペット化スキーム。
| 在庫集中 | 最終濃度 | 最終金額 | 容積 | |
| 反応量 | - | - | - | 300 μL |
| アニーリングバッファー | 1.25× | 1× | - | 240 μL |
| RNase阻害剤 | 40 U/μL | 0.5 U/μL | - | 5 μL |
| 5' ビオチン化DNAハンドル | 300 ng/μL | 10 ng/μL | 3 μg | 10 μL |
| 3'DNAハンドル | 300 ng/μL | 10 ng/μL | 3 μg | 10 μL |
| RNA | 150 ng/μL | 10 ng/μL | 3 μg | 20 μL |
| 水 | - | - | - | 5 μL |
表4:光ピンセット構築物のアニーリングのためのピペット化スキーム。
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Discussion
ここでは、蛍光結合型光ピンセットを用いて、RNA分子と様々なリガンドの相互作用と動的挙動を研究する方法を示す。以下に、本技術の重要なステップと限界について説明します。
プロトコルの重要なステップ
他の多くの方法と同様に、サンプルの品質は信頼性の高いデータを得るために極めて重要です。したがって、可能な限り最高の品質のサンプルを得るために、サンプル調製のための手順を最適化するために時間を費やす価値があります。最適化ステップには、適切なプライマー設計、アニーリング温度、RNAおよびタンパク質精製ステップが含まれます。
RNaseフリー条件を維持するためには、実験全体を通して、フィルター処理されたチップとソリューションの使用が重要です。また、マイクロ流体システムは、使用しない場合に漂白剤に保たれます。測定を開始する前に、システムから漂白剤を除去するために、チオ硫酸ナトリウムとRNaseフリー水でシステムを適切に洗浄することが重要です。
実験全体を通して同じサイズのビーズを使用する場合、毎回力のキャリブレーションを行う必要はありません。しかし、実験の再現性のために、力の較正チェックは定期的に行われるべきである。
メソッドの変更とトラブルシューティング
蛍光色素の安定性と光の漂白
蛍光測定時の合併症は、光漂白です。翻訳を監視する時間枠はシステムによって数秒から分まで延長することができるので、測定中の光の切り落としも考慮し、可能な限り最小限に抑える必要があります73。1つの選択肢は、最近導入された量子ドット49,74,75のような光漂白を起こしにくい、より安定した蛍光体を採用することです。さらに、カタラーゼと結合したグルコースオキシダーゼなどの「脱酸素剤」系を用いて酸素分子を除去することで更なる安定性が達成される。グルコースオキシダーゼは、過酸化水素に変えて環境から酸素を除去し、カタラーゼによって分解します。代替酸素清掃システムも76,77を採用することができます。
マイクロ流体
適切な測定には、連続した層流を維持することが不可欠です。最も重要なことは、システムが乾いて実行されるべきではありません。残念ながら、RRPやその他の目的の トランス作用因子は、多くの場合、実験のために少量でのみ利用可能であるため、連続的な流れを維持することは困難でコストがかかる可能性があります。サンプルの塗布中に気泡がシステムに導入された場合、通常、手動圧力またはエタノール洗浄で除去できます。
メソッドの制限事項
OTと共焦点顕微鏡の組み合わせもいくつかの制限をもたらします。まず、共焦点部の焦点面は、蛍光信号の適切な記録を可能にするために、トラップセンターに適切に整列されなければならない。さらに、共焦点測定のために、各部位で少なくとも2kbのハンドルは通常17が必要である。長いハンドルを使用することは原則として可能であるが、ハンドルのエネルギー寄与とデータ分析の精度の持続性の長さの変化を考慮する必要があります78。もう一つの重要なポイントは、蛍光体の半減期を増加させるために使用される酸素スカベンジャーは、また、溶液76のpHの比較的迅速な変化につながる。これらの変化は、緩衝化合物の濃度を増加させることによって部分的に補償することができる。しかし、測定中は、実験を通じて一貫した条件を確保するために、サンプルを定期的に(30〜60分ごとに)補充する必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
原稿を批判的に見直してくれたアヌジャ・キベ教授とレドモンド・スミス教授に感謝します。私たちは、専門家の技術支援のためにタチアナ・コッホに感謝します。私たちは、実験的なビデオを記録する助けのためにクリスティナペカルコワに感謝します.当研究室での研究は、ヘルムホルツ協会と欧州研究評議会(ERC)グラント・Nr・948636(NC)からの資金提供によって支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| E. coli HB101 | lab collection | N/A | cloning of the vectors |
| Chemicals and enzymes | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 31424 | Buffers |
| Biotin-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinylation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Buffers |
| Catalase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford Labs | D11000 | Buffers |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4527 | in vitro transcription |
| dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Buffers |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 11814320001 | Buffers |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | Oxygen scavanger system |
| Glucose-oxidase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
| HEPES | Carl Roth | HN78.3 | Buffers |
| Magnesium chloride | Carl Roth | 2189.1 | Buffers |
| Phusion DNA polymerase | NEB | M0530L | Gibson assembly, cloning |
| Potassium chloride | Merck | 529552-1KG | Buffers |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
| Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic | NEB | M0296L | in vitro transcription |
| RNase Inhibitor | Molox | 1000379515 | Buffers |
| rNTPS | life technologies | R0481 | in vitro transcription |
| Sodium thiosulophate | Sigma-Aldrich | S6672-500G | Bleach deactivation |
| Sytox Green | Lumicks | N/A | confocal measurements |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | Biotinylation |
| T5 exonuclease | NEB | M0363S | Gibson assembly, cloning |
| T7 RNA polymerase | Produced in-house | N/A | in vitro transcription |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0267S | PCR |
| Taq ligase | Biozym | L6060L | Gibson assembly, cloning |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
| Kits | |||
| Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) | Nanotemper | MO-L011 | Used for ribosome labeling |
| Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | Ribosomes used for the labeling |
| Oligonucleotides | |||
| 5' handle T7 forward | Microsynth | custom order | 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
| 3’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
| 5' handle forward | Microsynth | custom order | 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2 |
| 5’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2 |
| 3’ handle forward | Microsynth | custom order | 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
| 3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin | Microsynth | custom order | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
| DNA vectors | |||
| pMZ_OT | produced in-house | N/A | further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
| Software and Algorithms | |||
| Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
| Bluelake | Lumicks | N/A | |
| Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
| InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
| Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
| POTATO | https://github.com/lpekarek/POTATO.git | N/A | |
| RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
| Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
| Other | |||
| Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
| Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Syringes | VWR | TERUMO SS+03L1 | |
| Devices | |||
| C-trap | Lumicks | N/A | optical tweezers coupled with confocal microscopy |
References
- Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
- Firth, A. E., Brierley, I.
- Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
- Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
- Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
- Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
- Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
- Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
- Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
- Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
- Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D.
- Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
- Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H.
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
- Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
- Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
- Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
- Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
- Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
- Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D.
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
- Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
- Blanchard, S. C.
- Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
- McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
- Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C.
- Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
- Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
- Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
- Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
- Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
- McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
- de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
- Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
- McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
- Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
- Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
- Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
- Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
- Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
- Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
- Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
- Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
- Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
- Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
- Butterworth, S.
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
- Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
- Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
- Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
- Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
- Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S.
- Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T.
- Jankowsky, E., Harris, M. E.
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
- Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
- Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
- Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
- Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
- Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
- Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
- Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M.
- Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
- Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).
