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Biochemistry

Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62589
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Este protocolo presenta un flujo de trabajo experimental completo para estudiar las interacciones ARN-proteína utilizando pinzas ópticas. Se describen varias configuraciones experimentales posibles, incluida la combinación de pinzas ópticas con microscopía confocal.

Abstract

El ARN adopta diversos pliegues estructurales, que son esenciales para sus funciones y, por lo tanto, pueden afectar diversos procesos en la célula. Además, la estructura y función de un ARN puede ser modulada por diversos factores de acción trans, como proteínas, metabolitos u otros ARN. Las moléculas de ARN que cambian el marco, por ejemplo, son ARN reguladores ubicados en regiones codificantes, que dirigen la traducción de ribosomas en un marco de lectura abierto alternativo y, por lo tanto, actúan como interruptores genéticos. También pueden adoptar diferentes pliegues después de unirse a proteínas u otros factores trans. Para diseccionar el papel de las proteínas de unión al ARN en la traducción y cómo modulan la estructura y la estabilidad del ARN, es crucial estudiar la interacción y las características mecánicas de estos complejos ARN-proteína simultáneamente. Este trabajo ilustra cómo emplear pinzas ópticas acopladas a fluorescencia de una sola molécula para explorar el panorama conformacional y termodinámico de los complejos ARN-proteína a una alta resolución. A modo de ejemplo, se elabora la interacción del elemento de desplazamiento de marco ribosómico programado por sarS-CoV-2 con la isoforma corta del factor de acción trans de la proteína antiviral zinc-dedo. Además, los ribosomas marcados con fluorescencia se monitorizaron utilizando la unidad confocal, lo que en última instancia permitiría el estudio del alargamiento de la traducción. El ensayo OT acoplado a fluorescencia se puede aplicar ampliamente para explorar diversos complejos de ARN-proteína o factores de acción trans que regulan la traducción y podría facilitar los estudios de regulación génica basada en ARN.

Introduction

La transferencia de información genética del ADN a las proteínas a través de los ARNm es un proceso bioquímico complejo, que se regula con precisión en todos los niveles a través de interacciones macromoleculares dentro de las células. Para la regulación traslacional, las interacciones ARN-proteína confieren un papel crítico para reaccionar rápidamente a diversos estímulos y señales1,2. Algunas interacciones ARN-proteína afectan la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, alteran el tiempo que un ARN está activo traslacionalmente. Otras interacciones ARN-proteína se asocian con mecanismos de recodificación como la lectura stop-codón, la derivación o el frameshifting ribosómico programado (PRF)3,4,5,6,7. Recientemente, se ha demostrado que una serie de proteínas de unión al ARN (RBPs) interactúan con elementos estimulantes de ARNm y la maquinaria de traducción para dictar cuándo y cuánta recodificación ocurrirá en la célula7,8,9,10,11. Por lo tanto, para diseccionar el papel de las proteínas de unión al ARN en la traducción y cómo modulan la estructura y la estabilidad del ARN, es fundamental estudiar en detalle los principios de interacción y las propiedades mecánicas de estos complejos ARN-proteína.

Décadas de trabajo han sentado las bases para estudiar el proceso de traducción de múltiples pasos y múltiples componentes, que se basa en la intrincada comunicación entre los componentes de ARN y proteína de la maquinaria de traducción para lograr velocidad y precisión12,13,14. Un siguiente paso crucial en la comprensión de eventos regulatorios complejos es determinar las fuerzas, escalas de tiempo y determinantes estructurales durante la traducción con alta precisión12,15,16,17. El estudio de la dinámica conformacional del ARN y especialmente cómo actúan los factores auxiliares de acción transactuante sobre la estructura del ARN durante la traducción se han iluminado aún más con la aparición de herramientas de una sola molécula, incluidas las pinzas ópticas o las guías de onda de modo cero16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Las pinzas ópticas (OT) representan una técnica de molécula única de alta precisión, que se ha aplicado para estudiar muchos tipos de procesos dinámicos dependientes del ARN, incluida la transcripción y la traducción26,27,28,29,30,31,32. El uso de pinzas ópticas ha permitido sondear las interacciones moleculares, las estructuras de ácidos nucleicos y las propiedades termodinámicas, cinéticas y energéticas de estos procesos en detalle16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . El ensayo de pinzas ópticas se basa en el atrapamiento de objetos microscópicos con un rayo láser enfocado. En un experimento típico de OT, la molécula de interés está atada entre dos perlas transparentes (generalmente poliestireno) (Figura 1A)27. Estas cuentas son atrapadas por trampas ópticas, que se comportan como resortes. Por lo tanto, la fuerza aplicada sobre la molécula se puede calcular en función del desplazamiento de la perla desde el centro del rayo láser enfocado (centro de trampa). Recientemente, las pinzas ópticas se han combinado con microscopía confocal (Figura 1B), lo que permite mediciones de fluorescencia o transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET)40,41,42. Esto abre un nuevo campo de posibles experimentos que permiten la medición simultánea y, por lo tanto, la correlación precisa de la espectroscopia de fuerza y los datos de fluorescencia.

Aquí, demostramos experimentos utilizando las pinzas ópticas combinadas con microscopía confocal para estudiar las interacciones proteína-ARN que regulan el desplazamiento de marco traslacional. Entre el objetivo y el condensador, una celda de flujo con cinco canales permite la aplicación continua de muestras con flujo laminar. A través de los canales microfluídicos, se pueden inyectar varios componentes directamente, lo que disminuye el tiempo de práctica y permite un consumo de muestras muy pequeño durante todo el experimento.

Primero, se propone una guía básica para ayudar al diseño de experimentos de OT y se discuten las ventajas y las trampas de varias configuraciones. A continuación, se describe la preparación de muestras y flujos de trabajo experimentales, y se proporciona un protocolo para el análisis de datos. Para poner un ejemplo, esbozamos los resultados obtenidos de los experimentos de estiramiento de ARN para estudiar el elemento arn de desplazamiento de marco SARS-CoV-2 (Figura 2A) con el factor de transacción la isoforma corta de la proteína antiviral del dedo de zinc (ZAP), que altera la traducción del ARN viral a partir de un marco de lectura alternativo43. Además, está demostrado que los ribosomas marcados con fluorescencia se pueden emplear en este ensayo confocal OT, lo que sería útil para controlar la procesividad y la velocidad de la maquinaria de traducción. El método presentado aquí se puede utilizar para probar rápidamente el efecto de diferentes tampones, ligandos u otros componentes celulares para estudiar varios aspectos de la traducción. Finalmente, se discuten las trampas experimentales comunes y cómo solucionarlas. A continuación, se describen algunos puntos cruciales en el diseño experimental.

Diseño de construcción
En principio, hay dos enfoques comunes para crear una construcción de ARN compatible con OT. El primer enfoque emplea una molécula larga de ARN que se hibrida con mangos de ADN complementarios, lo que produce una construcción que consiste en dos regiones híbridas de ARN / ADN que flanquean una secuencia de ARN de cadena simple en el medio (Figura 2B). Este enfoque se emplea en la mayoría de los experimentos de ARN OT33,44,45.

El segundo enfoque aprovecha los mangos dsDNA con voladizos cortos (alrededor de 20 nt)15,17. Estos voladizos se hibridan con la molécula de ARN. Aunque es más complicado en el diseño, el uso de mangos dsDNA supera algunas de las limitaciones del sistema híbrido ADN/ARN. En principio, incluso se pueden implementar mangos muy largos (>10kb), lo que es más conveniente para mediciones confocales. Además, la molécula de ARN se puede ligar a los mangos de ADN para aumentar la estabilidad de la correa.

Estrategia de etiquetado final
La construcción debe estar atada a cuentas a través de una fuerte interacción molecular. Si bien existen enfoques disponibles para la unión covalente de mangos a perlas46, las interacciones fuertes pero no covalentes como la estreptavidina-biotina y el anticuerpo digoxigenina se utilizan comúnmente en experimentos de OT15,33,35,45. En el protocolo descrito, el constructo está marcado con biotina o digoxigenina, y las perlas están recubiertas con estreptavidina o anticuerpos contra digoxigenina, respectivamente (Figura 1A). Este enfoque sería adecuado para aplicar fuerzas de hasta aproximadamente 60 pN (por correa)47. Además, el uso de diferentes estrategias de etiquetado de 5' y 3' permite determinar la orientación de la correa formada entre las cuentas17.

Etiquetado de proteínas para mediciones de fluorescencia
Para las imágenes confocales, hay varios enfoques comúnmente utilizados para el etiquetado de fluorescencia. Por ejemplo, los fluoróforos pueden unirse covalentemente a residuos de aminoácidos que se encuentran de forma nativa en las proteínas o se introducen por mutagénesis dirigida al sitio a través de un grupo orgánico reactivo. Los colorantes reactivos al tiol o amina se pueden utilizar para el etiquetado de residuos de cisteína y lisina, respectivamente. Existen varios métodos de protección reversibles para aumentar la especificidad del etiquetado48,49, sin embargo, las proteínas nativas normalmente se etiquetarían en múltiples residuos. Aunque el pequeño tamaño del fluoróforo puede conferir una ventaja, el etiquetado no específico puede interferir con la actividad de la proteína y, por lo tanto, la intensidad de la señal puede variar49. Además, dependiendo de la eficiencia del etiquetado, la intensidad de la señal puede diferir entre diferentes experimentos. Por lo tanto, se debe realizar una verificación de actividad antes del experimento.

En caso de que la proteína de interés contenga una etiqueta N- o C-terminal, como una etiqueta His o una etiqueta estreptocócica, el etiquetado específico de estas etiquetas representa otro enfoque popular. Además, el etiquetado dirigido a etiquetas reduce la posibilidad de que el fluoróforo interfiera con la actividad de las proteínas y puede mejorar la solubilidad49. Sin embargo, el etiquetado específico de la etiqueta generalmente produce proteínas marcadas con monofluoróforos, que podrían ser difíciles de detectar. Otra forma de etiquetado específico se puede lograr mediante el empleo de anticuerpos.

Configuración de microfluidos
La combinación de OT con un sistema de microfluídica permite una transición rápida entre diferentes condiciones experimentales. Además, los sistemas actuales aprovechan el mantenimiento del flujo laminar dentro de la celda de flujo, lo que impide la mezcla de líquidos de otros canales en la dirección perpendicular en relación con la dirección del flujo. Por lo tanto, el flujo laminar es particularmente ventajoso para el diseño experimental. Actualmente, las celdas de flujo con hasta 5 canales se emplean comúnmente (Figura 3).

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Protocol

1. Preparación de la muestra

  1. Clonar la secuencia de interés en el vector que contiene los fragmentos de ADN Lambda, que sirven como secuencias de mango (Figura 2)43,50.
  2. Primero generar una plantilla de ADN para la posterior transcripción in vitro mediante PCR (Figura 2B; reacción 1). En este paso de PCR, el promotor T7 se añade en el extremo 5' de la molécula de ADN sensorial32,33,43,50. Establezca la reacción de PCR de acuerdo con la Tabla 1. Ejecutar la PCR en alícuotas de 50 μL con ciclos apropiados en el termociclador.
  3. Preparar los mangos mediante dos reacciones de PCR separadas (Tabla 1, Figura 2B; reacción 2 y 3). Primero, generar el mango de 5' por PCR. Luego, genere el mango de 3' y etiquételo simultáneamente con digoxigenina utilizando un cebador etiquetado con digoxigenina de 5'32,33,43,50.
  4. Después de la PCR, purificar el ADN usando columnas de espín de sílice.
  5. Realizar la reacción de transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa T7 (Tabla 2)32,33,43,50. Incubar la reacción a 37 °C durante 2-4 h dependiendo de la longitud del ARN. A continuación, agregue la DNasa I a la reacción e incube a 37 ° C durante 30 minutos para digerir la plantilla de ADN. Purificar el ARN usando columnas de espín de sílice.
  6. Durante la reacción de etiquetado del mango de 5' (Tabla 3), añadir biotina-16-dUTP en el extremo 3' del mango por ADN polimerasa T438,50. Realice la reacción a temperatura ambiente durante 1-2 h. Después, purifica el ADN usando columnas de espín de sílice.
    NOTA: Dado que el mango de 5' debe estar etiquetado en su extremo de 3' (Figura 2B), el etiquetado no se puede realizar durante la PCR.
  7. Mezcle los componentes mencionados anteriormente: mango de 5' (3' marcado con biotina), mango de 3' (5' marcado con digoxigenina) y ARN - en una proporción molar de 1:1:1 en tampón de recocido (80% formamida, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, pH 8), para obtener el híbrido ARN/ADN deseado (Tabla 4). Calentar la mezcla de recocido hasta 85 °C durante 10 min y luego enfriar lentamente hasta 4 °C.
  8. Mezclar la muestra recocida con 1/10 de volumen de 3 M de acetato de sodio (pH 5), 3 volúmenes de etanol helado e incubar a -80 °C durante al menos 1 h o a -20 °C durante la noche.
  9. Centrifugar las muestras a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y seque el gránulo (generalmente no visible) al vacío.
  10. Por último, resuspend, el pellet en 50 μL de agua libre de RNasa y hacer alícuotas. Conservar las alícuotas a -80 °C hasta que se utilicen. Para el almacenamiento a corto plazo, las muestras también se pueden almacenar a -20 °C.

2. Configuración del instrumento

NOTA: El siguiente protocolo está optimizado para el instrumento de pinzas ópticas comerciales C-Trap de la empresa LUMICKS. Por lo tanto, los ajustes a los pasos presentados pueden ser necesarios mientras se utilizan otros instrumentos de pinzas ópticas. Si no se utiliza, el sistema de microfluídica de la máquina se mantiene en lejía (solución de hipoclorito de sodio) y debe lavarse antes de su uso.

  1. Deseche la lejía y llene las jeringas con 1 ml de agua libre de RNasa.
  2. Agregue 50 μL de tiosulfato de sodio de 0,5 M a al menos 1 ml de agua libre de RNasa y lave bien el sistema (1 bar, al menos 0,5 ml) para eliminar la lejía restante en el sistema.
  3. Deseche la solución de tiosulfato de sodio de las jeringas. Reemplace las jeringas por otras frescas y lave el sistema con al menos 0,5 ml de agua libre de RNasa.
    NOTA: Tenga cuidado de que el sistema de microfluídica nunca se seque para evitar burbujas de aire en el sistema.
  4. Coloque 2 gotas de aceite de inmersión (índice de refracción de 1.33) o aproximadamente 70 μL de agua sobre el objetivo.
  5. Coloque la celda de flujo dentro del marco de sujeción en su posición.
  6. Coloque 2 gotas de aceite de inmersión (índice de refracción de 1.51) sobre la celda de flujo.
  7. Encienda el dispositivo láser en la máquina de pinzas. Una vez que se esté ejecutando, encienda el láser de captura en la interfaz del software al 100%.
  8. Utilizando cámaras de diagnóstico (Z-finder), ajuste el eje Z al centro de la cámara entre la segunda y la tercera reflexión (interfaces) donde los anillos de refracción son los más grandes, girando el micro tornillo.
    NOTA: Cada vez que el objetivo se acerca a la cámara de medición y el plano focal del objetivo cruza la interfaz entre dos fases, se puede reconocer una reflexión en el modo Z-finder. Hay 4 interfaces posibles: (i) agua / aceite de inmersión y vidrio inferior (ii) vidrio inferior y tampón dentro de la cámara (iii) tampón dentro de la cámara y vidrio superior (iv) vidrio superior y aceite de inmersión para condensador.
  9. Ajuste la posición del condensador (ajuste el láser de captura a aproximadamente el 50%) para que el condensador toque el aceite de inmersión en la parte superior de la cámara de medición.
  10. Ajuste el enfoque moviéndose lentamente hacia abajo / hacia arriba con el condensador, de modo que se muestren aproximadamente 10 bandas de luz en el modo lunar (cámaras de diagnóstico).

3. Medición de la muestra

  1. Incubar perlas recubiertas de anti-digoxigenina (AD) con los constructos de la muestra (3 μL de suspensión de perlas AD al 0,1% (p/v) + 4 μL de muestra) y con 1 μL de inhibidores de la RNasa y 8 μL del tampón del ensayo (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM TDT) en RT durante 10-20 min. Después de la incubación, diluya la muestra en 500 μL de tampón de ensayo.
    NOTA: Se recomienda agregar eliminadores de oxígeno, particularmente durante las mediciones de fluorescencia al tampón para prevenir el daño oxidativo. Aquí se utilizó un sistema eliminador de oxígeno que contenía glucosa (8,3 mg/mL), glucosa oxidasa (40 U/mL) y catalasa (185 U/mL).
  2. Mezcle 0,8 μL de perlas recubiertas de estreptavidina (SA) al 1% (p/v) con 1 ml de tampón de ensayo.
  3. Deseche el agua de las jeringas y llene las jeringas con las respectivas suspensiones/soluciones. Lave durante al menos 2 minutos a aproximadamente 1 barra y luego comience a atrapar cuentas.
    NOTA: Dependiendo de la configuración experimental, se pueden utilizar diferentes arreglos de canales (Figura 3). Por lo general, un canal de flujo está lleno de perlas de anti-digoxigenina que transportan la molécula de ARN. Un segundo canal está lleno de las cuentas recubiertas de estreptavidina. El canal de búfer se utiliza para formar las ataduras. Se puede emplear un cuarto canal para cargar la proteína de unión al ARN (Figura 3C), o alternativamente se puede agregar RBP directamente en el canal tampón (Figura 3B).
  4. Para capturar las cuentas, mueva las trampas ópticas separadas entre sí. Primero muévase al canal AD y atrape una cuenta AD en la trampa 1. A continuación, mueva el escenario al canal SA y atrape una sola cuenta SA mediante la trampa 2.
    NOTA: Intente permanecer en la interfaz del búfer y los canales de cuentas para evitar perder la cuenta ya capturada, o para evitar atrapar varias cuentas por la misma trampa.
  5. Una vez que se capturen las cuentas del tamaño correcto, muévase al canal de amortiguación y detenga el flujo laminar. A continuación, realice la calibración de fuerza para verificar la rigidez de la trampa. Los valores de rigidez respectivos no deben diferir en el eje x/y en más del 10-15%.
    NOTA: Ajuste la potencia del láser o la división del láser entre las trampas de acuerdo con el tamaño de la perla. La calibración de la fuerza no tiene que hacerse para cada par de cuentas, siempre y cuando las plantillas de cuentas coincidan (puntuación de similitud > 0,9). Sin embargo, debe realizarse regularmente, o al menos cada vez que se cambian las condiciones del ensayo.
  6. Comience a pescar una correa moviendo las cuentas cerca una de la otra, esperando unos segundos, y luego volviéndolas a separar, repita hasta que se forme una correa. Una formación de atadura resulta en un aumento de la fuerza medida al alejar las dos cuentas una de la otra.
    NOTA: Para evitar la formación de múltiples ataduras, las cuentas no deben moverse demasiado cerca. Al atrapar una correa entre las dos cuentas, la calidad de la correa se puede verificar encontrando la meseta de estiramiento excesivo. La meseta debe estar entre 50 y 60 pN para una sola correa.
  7. Al obtener una correa, inicie la medición. Dependiendo del fenómeno estudiado, se deben elegir diferentes configuraciones de medición (Figura 1B-D).
    NOTA: Por lo general, al comienzo del experimento, se realiza un experimento de rampa de fuerza para verificar la calidad de la correa y sondear el comportamiento. Después, también se pueden comenzar los experimentos de fuerza constante o posición constante para estudiar más a fondo las transiciones de estado. Una vez que se ha realizado un número suficiente de mediciones en una muestra de ARN para determinar su comportamiento, se pueden agregar factores marcados al sistema para realizar mediciones confocales.
  8. Para realizar mediciones de fluorescencia, encienda los láseres confocales y la unidad de contador de fotones en el instrumento de pinzas ópticas.
  9. Encienda el láser de excitación de la longitud de onda deseada en la interfaz del software y ajuste la potencia del láser al 5% o más, dependiendo del fluoróforo.
    NOTA: Si bien no se mide, reduzca la configuración de potencia del láser de excitación al 0% para evitar el fotodaño excesivo a la muestra.
  10. Comience a crear imágenes de la muestra mediante las funciones de imagen del software.
    NOTA: Para obtener imágenes bien enfocadas, el plano focal del microscopio confocal y las trampas ópticas deben estar alineados. Para este propósito, se puede emplear la autofluorescencia de las perlas de poliestireno en el canal láser azul. El plano focal de las trampas ópticas se mueve hacia arriba o hacia abajo en el eje z hasta que la imagen de las cuentas alcanza su diámetro más alto. En esta posición, se puede medir la señal de fluorescencia de la molécula atada entre las perlas.
  11. Para utilizar la función kymograph, especifique la posición x-y del eje kymograph para que permita la detección de la correa entre las cuentas.
  12. A lo largo de la medición, la composición del tampón se puede cambiar fácilmente moviendo las perlas a diferentes canales o cambiando el búfer suministrado en el sistema de microfluídica.

4. Análisis de datos

  1. Preprocesamiento de datos sin procesar
    1. Mediante el uso de un script simple, reduzca la muestra de los datos sin procesar lo suficiente como para (i) permitir un procesamiento de datos posterior más rápido, pero (ii) aún contener toda la información crítica (Figura 4A). Por lo general, 100-5000 Hz es adecuado para este propósito.
      NOTA: La frecuencia de recopilación de datos en los experimentos con pinzas ópticas es a menudo más alta de lo necesario para el análisis: en los experimentos presentados, la frecuencia de recopilación de datos se establece en 78 125 Hz de forma predeterminada. Dado que el espacio de almacenamiento es limitado, es conveniente y ahorra tiempo reducir la frecuencia de muestreo de los datos. Aquí, los datos brutos se redujeron en un factor de 30.
    2. A continuación, emplee un filtro de señal para reducir el ruido de medición de alta frecuencia de la señal (Figura 4A). Ajuste el grado de filtro y los parámetros de frecuencia de corte en consecuencia para optimizar la salida de datos de diferentes experimentos (Figura 5).
      NOTA: Entre los filtros de señal, el filtro Butterworth51 es uno de los más utilizados. En los datos complementarios se proporciona un script python escrito a medida que permite el procesamiento previo de datos sin procesar. Los parámetros de reducción de muestreo y filtrado de señales (frecuencia de corte, grado de filtro) deben optimizarse para diferentes experimentos.
  2. Para el análisis de datos de rampa de fuerza, siga estos pasos.
    1. Marque los pasos manualmente buscando los puntos correspondientes en el gráfico de trayectoria de fuerza o utilizando scripts escritos a medida. Los pasos de despliegue se caracterizan por una caída repentina de la fuerza combinada con un aumento de la distancia en la curva fuerza-distancia (FD).
    2. Una vez que se marcan los eventos de despliegue, ajuste las diferentes regiones de la curva FD utilizando los modelos apropiados (Figura 4D).
      NOTA: Para la región antes del primer paso de despliegue, la correa puede considerarse "de doble cadena" y se ajusta comúnmente utilizando un modelo extensible de cadena similar a un gusano (WLC)47,52,53. Las partes después del primer evento de despliegue se consideran una combinación de nucleótidos de doble cadena (mangos) y nucleótidos de cadena simple (molécula de ARN desplegada). Por lo tanto, el ajuste de datos es más complejo: generalmente se emplea una combinación de 2 modelos WLC o WLC y modelos de cadena de unión libre (FJC)36,39,52. El modelo WLC extensible tiene dos parámetros de ajuste principales: la longitud del contorno (LC) y la longitud de persistencia (LP). La longitud del contorno corresponde a la longitud de la molécula completamente estirada y la longitud de persistencia define las propiedades de flexión de la molécula de interés. El modelo se puede describir con la siguiente ecuación (1). WLC se puede utilizar para modelar el comportamiento de las regiones plegadas y desplegadas, aunque para cada una de ellas se debe emplear un modelo separado con diferentes parámetros.
      (1) Equation 1
      donde x es extensión, LC es longitud de contorno, F es fuerza, LP es longitud de persistencia, kB es constante de Boltzmann, T es temperatura termodinámica y S es módulo de estiramiento.
      El segundo modelo llamado cadena de articulación libre (FJC) se usa comúnmente para describir el comportamiento de las regiones desplegadas de una sola cadena. Utiliza parámetros similares a los de los polímeros, pero trata cada unidad de la "cadena" como una varilla rígida, aquí correspondiente a los nucleótidos de la región monocatenaria desplegada. La siguiente ecuación (2) describe este modelo:
      (2) Equation 2
      NOTA: Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un algoritmo que permite el procesamiento por lotes de los datos brutos de rampa de fuerza llamado "Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54". El algoritmo reduce y filtra los datos, luego identifica los posibles pasos de despliegue y finalmente realiza el ajuste de datos. El POTATO está construido en una interfaz gráfica de usuario (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO) fácil de usar.
  3. Procese los datos de fuerza constante de la siguiente manera:
    NOTA: Las siguientes instrucciones se pueden aplicar analógicamente en datos de posición constante.
    1. Para los datos de fuerza constante, grafique la distancia a lo largo del tiempo (Figura 5). Un histograma que muestre la frecuencia (recuentos) de diferentes conformaciones sobre el cambio relativo de posición es una forma útil de caracterizar varios estados dominantes y menores (Figura 7).
    2. Ajuste el histograma utilizando (múltiples) funciones gaussianas para estimar el porcentaje total de conformadores individuales a una fuerza dada (Figura 7C). Los ajustes gaussianos, la posición media y la desviación estándar describen la relación relacionada con la fuerza entre las diferentes poblaciones.
      NOTA: En los datos complementarios se proporciona un script python escrito a medida que permite el preprocesamiento y el ajuste gaussiano bimodal básico de datos de fuerza constante. Los parámetros (frecuencia de corte, grado de filtro, medias esperadas, valores de desviación estándar y amplitudes) deben optimizarse para diferentes experimentos.
    3. A continuación, emplee el modelo de Markov oculto para analizar más a fondo los estados, que pueden descubrir intermedios plegables adicionales (conformadores)55. Para obtener más información sobre el modelo de Markov de fuerza constante y oculto, se puede consultar 55,56,57,58.

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Representative Results

En esta sección, se presta especial atención a las mediciones de las interacciones ARN-proteína/ligando por las pinzas ópticas de fluorescencia. Para una descripción de los experimentos generales de pinzas ópticas de ARN y los resultados representativos correspondientes, ver32. Para una discusión más detallada de las interacciones ARN/ADN-proteína, véase también1,2,26,59,60.

En principio, la unión de un RBP o cualquier otro factor de transacción de interés en el ARN estabiliza, desestabiliza o puede alterar la conformación de la molécula. A continuación, se muestra una representación de los observables mecánicos para cada efecto. Sin embargo, el efecto real observado para un complejo ARN-proteína dado no se limita a estos escenarios mencionados a continuación.

Estabilización
La estructura del ARN puede ser específicamente reconocida y unida por la proteína u otros ligandos45,61,62,63,64. La formación de los enlaces se acompaña de una liberación de energía. Por lo tanto, se debe superar una barrera energética adicional para desplegar la estructura de ARN dada. Como resultado, se podría observar un aumento en la fuerza de despliegue media50,65. La estabilización de la estructura del ARN mediante la unión de un agente externo (proteína, molécula pequeña, otros factores de acción trans) también puede dar lugar a un cambio de la cinética de plegamiento de la estructura45. Para eso, se pueden realizar mediciones adicionales en el modo de fuerza constante, donde se pueden observar transiciones menos frecuentes entre los intermedios de plegamiento, así como el cambio de fuerza en el equilibrio.

Desestabilización
Algunas proteínas reconocen ciertos motivos de secuencia en lugar de estructuras específicas de ARN. Los sitios de unión pueden variar desde un motivo altamente específico hasta un patrón más general como tramos ricos en GC o AU60,66. Sin embargo, si la proteína se une preferentemente a la conformación de ARN monocatenario desplegado, el equilibrio entre el estado plegado y desplegado puede desplazarse hacia el estado desplegado36,43,67. En la Figura 6 y la Figura 7 se muestran ejemplos de tal comportamiento.

Alteración de la estructura
En algunos casos, las RBP (u otros ligandos) podrían combinar ambos mecanismos mencionados anteriormente de tal manera que la RBP desestabilice la conformación previamente dominante y desplace el equilibrio hacia una estructura alternativa de ARN44,68,69. El cambio a un estado alternativo puede resultar en un cambio en las frecuencias de población conformacionales observadas, así como la aparición o desaparición de estados de plegamiento individuales. Estos cambios se pueden observar por primera vez en experimentos de rampa de fuerza y pueden investigarse más a fondo mediante los experimentos de fuerza constante (o posición constante).

Efecto del factor de acción trans en el plegamiento/despliegue del ARN
Aquí, se estudió una secuencia de ARN correspondiente al elemento de desplazamiento de marco ribosómico programado -1 del SARS-CoV-2. Se predice que este elemento de ARN formará un pseudoknot70,71 de tipo H. En las trayectorias de fuerza-distancia de ejemplo, el ARN se despliega y se repliega en dos pasos consecutivos (Figura 6A). Estos dos pasos probablemente corresponden a los dos bucles del tallo que son el requisito previo para la formación de pseudonudos. En este caso, el pseudo nudo tampoco se observó porque el ARN no se plegó completamente o formó una estructura alternativa que compitiera con el pseudonudo. Al agregar el factor transactuante ZAP, se observó una desaparición repentina de los eventos de repliegue y una enorme histéresis (Figura 6B)43. Esto sugiere que la proteína se une al estado monocatenario del ARN, impidiendo la formación de estructuras secundarias. Además, los experimentos de fuerza constante confirman los resultados de los experimentos de rampa de fuerza. En consecuencia, mientras que el ARN está completamente plegado a alrededor de 10 pN (Figura 7A), la presencia de la proteína desplaza el repliegue hacia fuerzas más bajas, y a 10 pN el ARN todavía ocupa principalmente el estado desplegado (Figura 7B).

Mediciones de OT junto con microscopía confocal
A continuación, se muestran resultados ejemplares para la unión inespecífica y específica de diferentes fluoróforos y ribosomas marcados (Figura 8). En el primer ejemplo, se utilizó el tinte verde SYTOX para etiquetar el híbrido ADN/ARN atado. Con el aumento de la fuerza, la unión del tinte es más abundante, lo que resulta en una mayor señal de fluorescencia. Una vez que la fuerza es demasiado alta, la correa se rompe y la señal de fluorescencia se pierde (Figura 8A). Para los experimentos con ribosomas bacterianos (Figura 8B), se empleó el etiquetado no específico de los residuos de lisina utilizando N-hidroxisuccinimida (NHS) conjugada a un colorante fluorescente rojo. Aunque existe el riesgo de disminuir la actividad de la proteína / complejo marcado, la gran ventaja es una señal más fuerte lograda ya que cada ribosoma está (en promedio) marcado por múltiples fluoróforos. El constructo de ARN contenía un sitio de unión al ribosoma (RBS) reconocido por los ribosomas bacterianos, que se colocó en la proximidad de 5' de la secuencia de ARN estudiada. Al unirse a los ribosomas, la señal de fluorescencia se observa en la correa. Los datos de fluorescencia se pueden analizar más a fondo utilizando herramientas de análisis de imágenes72, y los resultados se pueden combinar con los datos de fuerza, lo que permite el estudio de las transiciones de plegamiento.

Figure 1
Figura 1: Esquema del experimento OT y posibles enfoques de medición. (A) Esquema que ilustra los experimentos de pinzas ópticas con el ARN de desplazamiento de marco del SARS-CoV-2 en el medio. El ARN se hibrida en mangos de ssDNA y se inmoviliza en perlas. Estos se utilizan para ejercer fuerza de tracción sobre el ARN con un rayo láser enfocado. La fuerza aumenta gradualmente hasta que el ARN se despliega (abajo). (B) Esquema de microscopía confocal combinada con pinzas ópticas para monitorear la unión del factor marcado al ARN. (C) Se pueden obtener datos de fuerza constante de ejemplo fijando la fuerza en un valor constante a lo largo del tiempo, lo que permite medir con precisión el tiempo de permanencia de los conformadores. (D) Ejemplo de curva fuerza-distancia (FD) obtenida a partir de una medición fuerza-rampa. El paso de despliegue se observa como una ruptura repentina en el perfil FD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Un esquema general de síntesis de muestras ot. (A) Secuencia de ejemplo y estructura secundaria predicha del ARN de desplazamiento de marco del SARS-CoV-2 estudiado empleado en el estudio. (B) Un vector que contiene la secuencia de interés (SoI) flanqueada por dos regiones de mango sirve como plantilla para la generación de la construcción ADN/ARN en 3 reacciones de PCR. Los cebadores se representan y numeran en el esquema de acuerdo con sus sitios de unión en la PCR correspondiente. La PCR 1 produce la plantilla de transcripción in vitro , que posteriormente se utiliza para la reacción de transcripción in vitro (IVT) para generar la molécula larga de ARN (azul claro). La PCR 2 produce el mango de 5', que luego se etiqueta con biotina de 3'. La PCR 3 utilizando la imprimación delantera conjugada con digoxigenina produce el mango marcado con digoxigenina de 3'. Finalmente, los dos mangos y el ARN se recocen para dar una construcción híbrida de ADN / ARN adecuada para las mediciones de pinzas ópticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ilustración de diferentes configuraciones de canales de microfluídica. (A) Un esquema de la celda de flujo con 5- canales de microfluídica. (B) y (C) son los zoom-ins del área discontinua roja de (A). (B) Una configuración simple de 3 canales con cuentas AD y cuentas SA en los canales 1 y 3, respectivamente. El factor se encuentra en el canal 2. Esta configuración es adecuada para proteínas estables con alta afinidad, por lo que se prefiere una baja concentración para garantizar un fondo fluorescente bajo. Los canales de cuentas en el lateral permiten una orientación de amarre fija y un rápido reclutamiento de nuevas cuentas si es necesario. (C) Configuración de 4 canales con Factor en el canal 4. Tal disposición es particularmente ventajosa para un consumo mínimo de muestras. La medición se puede realizar directamente en el canal 4. Alternativamente, para evitar la señal de fluorescencia de fondo, el complejo se puede formar en el canal 4 y luego la medición se puede realizar en el canal 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Flujo de trabajo de análisis de datos para experimentos de rampa de fuerza. (A) Diagrama de flujo del flujo de trabajo de análisis de datos. Los archivos de datos sin procesar se muestrean y filtran primero, luego se marcan los pasos y los estados individuales se ajustan al modelo correspondiente. (B) Los datos brutos contienen una cantidad considerable de ruido, que obstruye la identificación de eventos de despliegue/repliegue. Además, en la mayoría de los experimentos, la frecuencia de recopilación de datos es más alta de lo necesario. (C) Por lo tanto, se emplea el downsampling y la filtración de señal para suavizar el perfil de datos. (D) Las curvas procesadas se ajustan finalmente utilizando el modelo WLC cuando la molécula todavía está en el estado plegado (antes del evento de despliegue), una combinación del WLC con modelos FJC o un segundo modelo WLC cuando la molécula está en un estado desplegado (después del evento de despliegue). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: El efecto de la frecuencia de corte en la salida de datos. Si bien la salida de datos sin procesar puede estar cargada con ruido de señal (arriba), es crucial elegir los parámetros de filtración de señal adecuados para el análisis de datos. Aunque la filtración adecuada ayudaría en la identificación de intermedios plegables (frecuencia de corte 0.1, media), la sobrefiltración (frecuencia de corte <0.001, inferior) puede resultar en pérdida de resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Ejemplo de trayectorias FD en ausencia y presencia de ZAP. (A) Desplegar (rosa) y replegar (azul) rastros del ARN del SARS-CoV-2 en ausencia de ZAP. La muestra muestra fácilmente repliegue con solo histéresis pequeña. (B) Despliegue (rosa) y repliegamiento (azul) de trazas del ARN en presencia de transfactor ZAP (400 nM). La muestra muestra una enorme histéresis, lo que sugiere que la proteína se une al ARN monocatenario y evita su repliegue. (C) Un gráfico de barras que muestra el número de pasos desplegados (rosa) y repliegamiento (azul) en ausencia o presencia de ZAP. Si bien la distribución de los pasos de despliegue sigue sin verse afectada por la presencia de ZAP, hay una clara caída en el número de pasos de repliegue con ZAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Ejemplo de datos de fuerza constante en ausencia y presencia de ZAP. (A) Datos de fuerza constante obtenidos a fuerzas que oscilan entre 10 (arriba) y 13 (abajo) pN que muestran el cambio del estado completamente plegado al estado completamente desplegado del elemento ARN de desplazamiento de marco SARS-CoV-2. Cada gráfico incluye la posición frente al tiempo (izquierda) y una gráfica de histograma (derecha). (B) Datos de fuerza constante obtenidos en presencia de ZAP (400 nM). Tras la unión a proteínas, el repliegue se ve afectado. A 10 pN, en contraste con el ARN solo, en presencia de ARN ZAP existe principalmente en el estado desplegado. Por lo tanto, se indica un cambio en la fuerza de equilibrio hacia fuerzas más bajas. (C) El histograma de los datos de posición se puede analizar ajustando los datos a las funciones gaussianas para obtener la abundancia relativa de cada estado (derivada del área bajo la curva para cada estado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: OT combinado con microscopía confocal. (A) Un ejemplo de kymograph de la correa etiquetada SYTOX Green (izquierda). Tenga en cuenta el aumento de la intensidad de la señal al aumentar las fuerzas. La flecha negra marca el evento de rotura de la correa, lo que conduce a la pérdida de señal. Representación de la correa con tinte unido a ella (Binding) y después de la rotura sin tinte (Sin señal) (derecha). (B) Ejemplo de kymograph de unión específica del ribosoma en el ARNm (izquierda). El evento de unión se puede observar como una señal de fluorescencia en el ARN atado entre las dos perlas. Representación de la correa sin (Sin señal) y con ribosomas marcados con fluorescencia unidos (Binding) (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concentración de existencias Concentración final Volumen
Volumen de reacción - - 500 μL
Búfer de 10× 10× 1× 50 μL
Mezcla dNTP 10 mM 0,2 mM 10 μL
ADN polimerasa de alta fidelidad 1,25 U/μL 0,025 U/μL 10 μL
Imprimación 1 10 μM 0,4 μM 20 μL
Imprimación 2 10 μM 0,4 μM 20 μL
Plantilla 100 ng/μL 1 ng/μL 5 μL
Agua - - 385 μL

Tabla 1: Esquema de pipeteo para que la PCR genere los constructos de pinzas ópticas.

Concentración de existencias Concentración final Volumen
Volumen de reacción - - 300 μL
5× búfer 5× 1× 60 μL
Mezcla rNTP 25 mM 5 mM 60 μL
Inhibidor de la RNasa 40 U/μL 0,7 U/μL 5 μL
Pirofosfatasa 100 U/ml 1,7 mU/μL 4 μL
TDT 100 metros 3,3 mM 10 μL
ARN polimerasa T7 50 U/μL 3,3 U/μL 20 μL
Plantilla 120 ng/μL 2 ng/μL 5 μL
Agua - - 136 μL

Tabla 2: Esquema de pipeteo para la transcripción in vitro.

Concentración de existencias Concentración final Volumen
Volumen de reacción - - 100 μL
Búfer de 10× (NEB 2.1) 10× 1× 10 μL
BSA 1 μg/ml 100 ng/μL 1 μL
Biotina-16-dUTP 1 mM 50 μM 5 μL
ADN polimerasa T4 30 U/μL 1,5 U/μL 5 μL
Mango de ADN 5' (20-60 μg) 300 ng/μL 237 ng/μL 79 μL

Tabla 3: Esquema de pipeteo para el etiquetado de biotina de 3' final.

Concentración de existencias Concentración final Importe final Volumen
Volumen de reacción - - - 300 μL
Búfer de recocido 1,25× 1× - 240 μL
Inhibidores de la RNasa 40 U/μL 0,5 U/μL - 5 μL
Mango de ADN biotinilado de 5' 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
Mango de ADN de 3' 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
ARN 150 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 20 μL
Agua - - - 5 μL

Tabla 4: Esquema de pipeteo para el recocido del constructo de pinzas ópticas.

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Discussion

Aquí, demostramos el uso de pinzas ópticas acopladas a fluorescencia para estudiar las interacciones y el comportamiento dinámico de las moléculas de ARN con varios ligandos. A continuación, se discuten los pasos críticos y las limitaciones de la presente técnica.

Pasos críticos en el protocolo
Como para muchos otros métodos, la calidad de la muestra es fundamental para obtener datos confiables. Por lo tanto, para obtener muestras de la más alta calidad posible, vale la pena dedicar tiempo a optimizar el procedimiento para la preparación de muestras. Los pasos de optimización incluyen el diseño adecuado de la imprimación, las temperaturas de recocido, el ARN y los pasos de purificación de proteínas.

A lo largo del experimento, el uso de puntas y soluciones filtradas es crucial para mantener las condiciones libres de RNasa. Además, el sistema de microfluídica se mantiene en lejía cuando no está en uso. Antes de comenzar las mediciones, es importante lavar el sistema adecuadamente con tiosulfato de sodio y agua libre de RNasa para eliminar la lejía del sistema.

En caso de que se utilicen cuentas del mismo tamaño durante todo el experimento, no es necesario realizar la calibración de la fuerza cada vez. Sin embargo, las comprobaciones de calibración de la fuerza deben realizarse regularmente para la reproducibilidad de los experimentos.

Modificaciones y solución de problemas del método
Estabilidad del fluoróforo y fotoblanqueo
Una complicación durante las mediciones de fluorescencia es el fotoblanqueo. Dado que el marco de tiempo para monitorear la traducción se puede extender de segundos a minutos dependiendo del sistema, también se debe considerar y minimizar el fotoblanqueo durante las mediciones73. Una opción es emplear fluoróforos más estables, que son menos propensos al fotoblanqueo, como los puntos cuánticos recientemente introducidos49,74,75. También se logra una mayor estabilidad mediante la eliminación de moléculas de oxígeno utilizando un sistema de "eliminador de oxígeno", como la glucosa oxidasa junto con la catalasa. La glucosa oxidasa elimina el oxígeno del medio ambiente convirtiéndolo en peróxido de hidrógeno, que luego se descompone por la catalasa. También se pueden emplear sistemas alternativos de eliminación de oxígeno76,77.

Microfluídica
Mantener un flujo laminar continuo es esencial para las mediciones adecuadas. Lo más importante es que el sistema nunca debe funcionar en seco. Desafortunadamente, las RBP u otros factores de interés de acción transactucional a menudo están disponibles solo en pequeños volúmenes para los experimentos, por lo tanto, mantener un flujo continuo puede ser un desafío y costoso. Si se introducen burbujas de aire en el sistema durante la aplicación de la muestra, la presión manual o el lavado de etanol suelen ser suficientes para su eliminación.

Limitaciones del método
La combinación de OT con microscopía confocal también trae algunas limitaciones. Primero, el plano focal de la unidad confocal debe alinearse correctamente con los centros de trampa para permitir el registro adecuado de la señal de fluorescencia. Además, para las mediciones confocales, generalmente se necesitan asas de al menos 2 kb en cada sitio17. Aunque en principio es posible utilizar mangos más largos, se debe considerar la contribución energética de los mangos y el cambio en la longitud de persistencia para la precisión del análisis de datos78. Otro punto crucial son los eliminadores de oxígeno, que se utilizan para aumentar la vida media de los fluoróforos, también conducen a cambios relativamente rápidos en el pH de las soluciones76. Estos cambios pueden compensarse parcialmente aumentando la concentración del compuesto amortiguador; sin embargo, durante las mediciones, las muestras deben reponerse regularmente (cada 30-60 minutos) para garantizar condiciones consistentes a través del experimento.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Anuja Kibe y al Prof. Redmond Smyth por revisar críticamente el manuscrito. Agradecemos a Tatyana Koch por la asistencia técnica experta. Agradecemos a Kristyna Pekarkova por la ayuda con la grabación de videos experimentales. El trabajo en nuestro laboratorio cuenta con el apoyo de la Asociación Helmholtz y la financiación de la subvención nr. 948636 (a NC) del Consejo Europeo de Investigación (ERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy

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Bioquímica Número 180
Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción
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Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N.… More

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).

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