Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Optisk pincett för att studera RNA-proteininteraktioner i översättningsreglering

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62589
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Detta protokoll presenterar ett komplett experimentellt arbetsflöde för att studera RNA-proteininteraktioner med optisk pincett. Flera möjliga experimentella inställningar beskrivs inklusive kombinationen av optisk pincett med konfokal mikroskopi.

Abstract

RNA antar olika strukturella veck, som är väsentliga för dess funktioner och därmed kan påverka olika processer i cellen. Dessutom kan strukturen och funktionen hos ett RNA moduleras av olika transverkande faktorer, såsom proteiner, metaboliter eller andra RNAs. Frameshifting RNA-molekyler, till exempel, är reglerande RNAs belägna i kodningsregioner, som direkt översätter ribosomer till en alternativ öppen läsram och därmed fungerar som genbrytare. De kan också anta olika veck efter bindning till proteiner eller andra transfaktorer. För att dissekera RNA-bindande proteiners roll i översättning och hur de modulerar RNA-struktur och stabilitet är det viktigt att studera samspelet och mekaniska egenskaper hos dessa RNA-proteinkomplex samtidigt. Detta arbete illustrerar hur man använder enmolekyl-fluorescenskopplade optiska pincett för att utforska det konformationella och termodynamiska landskapet av RNA-proteinkomplex med hög upplösning. Som ett exempel, interaktionen mellan SARS-CoV-2 programmerade ribosomal frameshifting element med den transverkande faktorn kort isoform av zink-finger antiviralt protein utarbetas. Dessutom övervakades fluorescensmärkta ribosomer med hjälp av den konfokala enheten, vilket i slutändan skulle möjliggöra studier av översättningsförlängning. Fluorescenskopplad OT-analys kan tillämpas i stor utsträckning för att utforska olika RNA-proteinkomplex eller transverkande faktorer som reglerar översättning och kan underlätta studier av RNA-baserad genreglering.

Introduction

Överföring av genetisk information från DNA till proteiner genom mRNAs är en komplex biokemisk process, som regleras exakt på alla nivåer genom makromolekylära interaktioner inuti celler. För translationell reglering ger RNA-proteininteraktioner en kritisk roll för att snabbt reagera på olika stimuli och signaler1,2. Vissa RNA-proteininteraktioner påverkar mRNA-stabiliteten och ändrar därmed tiden då ett RNA är translationellt aktivt. Andra RNA-proteininteraktioner är associerade med recodingmekanismer såsom stop-codon readthrough, bypassing eller programmerad ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Nyligen har ett antal RNA-bindande proteiner (RBPs) visat sig interagera med stimulerande mRNA-element och översättningsmaskineriet för att diktera när och hur mycket omkodning som kommer att ske i cellen7,8,9,10,11. För att dissekera RNA-bindande proteiners roll i översättning och hur de modulerar RNA-struktur och stabilitet är det därför avgörande att studera interaktionsprinciperna och mekaniska egenskaperna hos dessa RNA-proteinkomplex i detalj.

Årtionden av arbete har lagt grunden för att studera översättningsprocessen i flera steg och flera komponenter, som bygger på invecklad kommunikation mellan översättningsmaskineriets RNA- och proteinkomponenter för att uppnå hastighet och noggrannhet12,13,14. Ett viktigt nästa steg för att förstå komplexa regulatoriska händelser är att bestämma krafter, tidsskalor och strukturella bestämningsfaktorer under översättning med hög precision12,15,16,17. Studien av RNA-konformationsdynamik och särskilt hur transverkande hjälpfaktorer verkar på RNA-strukturen under översättningen har belysts ytterligare av framväxten av enmolekylverktyg, inklusive optiska pincett eller nolllägesvågledare16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Optisk pincett (OT) representerar en mycket exakt enmolekylsteknik, som har tillämpats för att studera många typer av RNA-beroende dynamiska processer inklusive transkription och översättning26,27,28,29,30,31,32. Användningen av optiska pincett har gjort det möjligt att undersöka molekylära interaktioner, nukleinsyrastrukturer och termodynamiska egenskaper, kinetik och energier av dessa processer i detalj16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pincettanalys är baserad på entrapment av mikroskopiska objekt med en fokuserad laserstråle. I ett typiskt OT-experiment är molekylen av intresse bunden mellan två genomskinliga (vanligtvis polystyren) pärlor (figur 1A)27. Dessa pärlor fångas sedan av optiska fällor, som beter sig som fjädrar. Således kan kraften som appliceras på molekylen beräknas baserat på pärlans förskjutning från mitten av den fokuserade laserstrålen (trap center). Nyligen har optiska pincett kombinerats med konfokal mikroskopi (figur 1B), vilket möjliggör fluorescens- eller Fret-mätningar (Förster resonance energy transfer)40,41,42. Detta öppnar ett helt nytt fält av möjliga experiment som möjliggör samtidig mätning och därmed exakt korrelation av kraftspektroskopi och fluorescensdata.

Här demonstrerar vi experiment med optisk pincett i kombination med konfokal mikroskopi för att studera protein-RNA-interaktioner som reglerar translationell frameshifting. Mellan målet och kondensorn möjliggör en flödescell med fem kanaler kontinuerlig provtillämpning med laminärt flöde. Genom de mikrofluidiska kanalerna kan olika komponenter injiceras direkt, vilket minskar den praktiska tiden samt möjliggör mycket liten provförbrukning under hela experimentet.

För det första föreslås en grundläggande riktlinje för att hjälpa utformningen av OT-experiment och fördelar samt fallgropar för olika inställningar diskuteras. Därefter beskrivs förberedelsen av prover och experimentella arbetsflöden och ett protokoll för dataanalysen tillhandahålls. För att representera ett exempel beskriver vi resultaten från RNA stretching experiment för att studera SARS-CoV-2 frameshifting RNA element (Figur 2A) med den transverkande faktorn den korta isoformen zink-finger antiviralt protein (ZAP), som ändrar översättningen av virala RNA från en alternativ läsram43. Dessutom visas det att fluorescensmärkta ribosomer kan användas i denna OT-konfokala analys, vilket skulle vara användbart för att övervaka översättningsmaskineriets processivitet och hastighet. Metoden som presenteras här kan användas för att snabbt testa effekten av olika buffertar, ligands eller andra cellulära komponenter för att studera olika aspekter av översättning. Slutligen diskuteras vanliga experimentella fallgropar och hur man felsöker dem. Nedan beskrivs några viktiga punkter i experimentell design.

Konstruera design
I princip finns det två vanliga metoder för att skapa en OT-kompatibel RNA-konstruktion. Det första tillvägagångssättet använder en lång RNA-molekyl som hybridiseras med kompletterande DNA-handtag, vilket ger en konstruktion bestående av två RNA/DNA-hybridregioner som flankerar en enkelsträngad RNA-sekvens i mitten (figur 2B). Detta tillvägagångssätt används i de flesta OT RNA-experiment33,44,45.

Den andra metoden drar nytta av dsDNA-handtag med korta (cirka 20 nt) överhäng15,17. Dessa överhäng hybridiseras sedan med RNA-molekylen. Även om det är mer komplicerat i design, övervinner användningen av dsDNA-handtag några av begränsningarna i DNA / RNA-hybridsystemet. I princip kan även mycket långa handtag (>10kb) genomföras, vilket är bekvämare för konfokala mätningar. Dessutom kan RNA-molekylen ligeras till DNA-handtag för att öka tjuderstabiliteten.

Strategi för slutmärkning
Konstruktionen måste bindas till pärlor via en stark molekylär interaktion. Även om det finns metoder för kovalent bindning av handtag till pärlor46, används starka men icke-kovalenta interaktioner såsom streptavidin-biotin och digoxigenin-antikropp ofta i OT-experiment15,33,35,45. I det beskrivna protokollet är konstruktionen märkt med biotin eller digoxigenin, och pärlorna är belagda med streptavidin eller antikroppar mot digoxigenin (figur 1A). Detta tillvägagångssätt skulle vara lämpligt för att tillämpa krafter upp till cirka 60 pN (per tjuder)47. Dessutom gör användningen av olika 5' och 3' märkningsstrategier det möjligt att bestämma orienteringen av tjudret som bildas mellan pärlorna17.

Proteinmärkning för fluorescensmätningar
För den konfokala avbildningen finns det flera vanliga metoder för fluorescensmärkning. Till exempel kan fluoroforer kovalent fästas vid aminosyrarester som finns infödda i proteiner eller introduceras av platsstyrd mutagenes genom en reaktiv organisk grupp. Tiool- eller aminreaktiva färgämnen kan användas för märkning av cystein- respektive lysinrester. Det finns flera reversibla skyddsmetoder för att öka specificiteten hos märkning48,49, men inhemska proteiner skulle vanligtvis märkas vid flera rester. Även om fluoroforens lilla storlek kan ge en fördel, kan icke-specifik märkning störa proteinaktiviteten och därmed kan signalintensiteten variera49. Beroende på märkningens effektivitet kan signalintensiteten också skilja sig mellan olika experiment. Därför bör en aktivitetskontroll utföras före experimentet.

Om proteinet av intresse innehåller en N- eller C-terminaltagg, till exempel en His-tag eller strep-tag, representerar specifik märkning av dessa taggar en annan populär metod. Dessutom minskar taggriktad märkning risken för att fluoroforen stör proteinaktiviteten och kan öka lösligheten49. Taggspecifik märkning ger dock vanligtvis monofluoformärkta proteiner, vilket kan vara utmanande att upptäcka. Ett annat sätt att specifik märkning kan uppnås genom att använda antikroppar.

Konfiguration av mikrofluidik
Kombinationen av OT med ett mikrofluidiksystem möjliggör en snabb övergång mellan olika experimentella tillstånd. Dessutom drar strömsystem nytta av att upprätthålla det laminära flödet inuti flödescellen, vilket utesluter blandning av vätskor från andra kanaler i vinkelrät riktning i förhållande till flödesriktningen. Därför är laminärt flöde särskilt fördelaktigt för den experimentella designen. För närvarande används ofta flödesceller med upp till 5 kanaler (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Provberedning

  1. Klona intressesekvensen i vektorn som innehåller Lambda DNA-fragment, som fungerar som handtagssekvenser (figur 2)43,50.
  2. Generera först en DNA-mall för efterföljande in vitro-transkription via PCR (figur 2B; reaktion 1). I detta PCR-steg läggs T7-promotorn till i 5' slutet av avkännings-DNA-molekylen32,33,43,50. Ställ in PCR-reaktionen enligt tabell 1. Kör PCR i 50 μL alikvoter med lämpliga cykler i termocykeln.
  3. Förbered handtagen genom två separata PCR-reaktioner (tabell 1, figur 2B; reaktion 2 och 3). Generera först 5' handtaget med PCR. Generera sedan 3' handtaget och samtidigt märka det med digoxigenin med hjälp av en 5 ' digoxigenin-märkt primer32,33,43,50.
  4. Efter PCR, rena DNA med hjälp av kiseldioxid spinn kolonner.
  5. Utför in vitro-transkriptionsreaktionen med T7 RNA-polymeras (tabell 2)32,33,43,50. Inkubera reaktionen vid 37 °C i 2-4 timmar beroende på längden på RNA. Lägg sedan till DNase I till reaktionen och inkubera vid 37 °C i 30 minuter för att smälta DNA-mallen. Rena RNA med hjälp av kiselspinnkolonner.
  6. Tillsätt biotin-16-dUTP i 3'-änden av handtaget med T4 DNA-polymeras38,50 under märkningsreaktionen hos 5'-handtaget (tabell 3). Utför reaktionen vid rumstemperatur i 1-2 h. Därefter renar du DNA med hjälp av kiselspinnkolonner.
    OBS: Eftersom 5'-handtaget måste märkas i dess 3' ände (bild 2B) kan märkningen inte utföras under PCR.
  7. Blanda de komponenter som nämns ovan - 5' handtag (3' märkt med biotin), 3' handtag (5' märkt med digoxigenin) och RNA - i ett 1:1:1 molarförhållande i glödgningsbuffert (80% formamid, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8). Värm glödgningsblandningen upp till 85 °C i 10 minuter och svalna sedan långsamt till 4 °C.
  8. Blanda glödggasprovet med 1/10 volym 3 M natriumacetat (pH 5), 3 volymer iskall etanol och inkubera vid -80 °C i minst 1 timme eller vid -20 °C över natten.
  9. Centrifugera proverna vid 15 000 × g i 30 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och torka pelleten (vanligtvis inte synlig) under vakuum.
  10. Slutligen återanvänds pelleten i 50 μL RNase-fritt vatten och gör alikvoter. Förvara alikvoterna vid -80 °C tills de används. För korttidslagring kan proverna också lagras vid -20 °C.

2. Instrumentinställning

OBS: Följande protokoll är optimerat för det kommersiella optiska pincettinstrumentet C-Trap från LUMICKS-företaget. Därför kan justeringar av de presenterade stegen vara nödvändiga vid användning av andra optiska pincettinstrument. Om maskinen inte används hålls maskinens mikrofluidiksystem i blekmedel (natriumhypokloritlösning) och måste tvättas före användning.

  1. Kassera blekmedlet och fyll sprutorna med 1 ml RNasefritt vatten.
  2. Tillsätt 50 μL 0,5 M natriumtiosulfat till minst 1 ml RNase-fritt vatten och tvätta systemet noggrant (1 bar, minst 0,5 ml) för att eliminera det återstående blekmedlet i systemet.
  3. Kassera natriumtiosulfatlösningen från sprutorna. Byt ut sprutorna mot färska och tvätta systemet med minst 0,5 ml RNasefritt vatten.
    OBS: Var försiktig så att mikrofluidiksystemet aldrig torkar för att undvika luftbubblor i systemet.
  4. Lägg 2 droppar nedsänkningsolja (brytningsindex på 1,33) eller cirka 70 μL vatten ovanpå målet.
  5. Placera flödescellen inuti hållkarmen i dess läge.
  6. Lägg 2 droppar nedsänkningsolja (brytningsindex på 1,51) ovanpå flödescellen.
  7. Slå på laserenheten i pincettmaskinen. När den är igång slår du på svällningslasern i programvarugränssnittet till 100%.
  8. Med hjälp av diagnostiska kameror (Z-finder) justerar du Z-axeln till mitten av kammaren mellan den andra och den tredje reflektionen (gränssnitt) där refraktionsringarna är störst genom att vrida mikroskruven.
    OBS: Varje gång målet flyttas närmare mätkammaren och målets brännplan korsar gränssnittet mellan två faser, kan en reflektion kännas igen i Z-finder-läget. Det finns 4 gränssnitt: i) vatten/nedsänkningsolja och bottenglas (ii) bottenglas och buffert inuti kammaren (iii) buffert inuti kammaren och toppglas (iv) toppglas och nedsänkningsolja för kondensor.
  9. Justera kondensorläget (ställ in svällningslasern till cirka 50%) så att kondensorn vidrör nedsänkningsoljan ovanpå mätkammaren.
  10. Justera fokus genom att röra dig långsamt nedåt/uppåt med kondensorn, så att ca 10 ljusband visas i månläget (diagnostiska kameror).

3. Provmätning

  1. Inkubera anti-digoxigeninbelagda pärlor (AD) med provkonstruktionerna (3 μL av 0,1% (w/v) AD-pärla suspension + 4 μL prov) och med 1 μL RNase-hämmare och 8 μL av analysbufferten (300 mM KCl, 5 m MGMCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM HEPES, pH 7,6, 20 Efter inkubationen späd provet i 500 μL analysbuffert.
    OBS: Det rekommenderas att tillsätta syresopätare, särskilt vid fluorescensmätningar till bufferten för att förhindra oxidativ skada. Här användes syre scavenger system som innehåller glukos (8,3 mg/mL), glukosoxidas (40 U/ml) och katalas (185 U/mL).
  2. Blanda 0,8 μL 1 % (w/v) streptavidinbelagda (SA) pärlor med 1 ml analysbuffert.
  3. Kassera vatten från sprutorna och fyll sprutorna med respektive suspensioner/lösningar. Tvätta i minst 2 min vid ca 1 bar och börja sedan fånga pärlor.
    OBS: Beroende på den experimentella uppsättningen kan olika kanalarrangemang användas (figur 3). Vanligtvis fylls en flödeskanal med anti-digoxigeninpärlor som bär RNA-molekylen. En andra kanal är fylld med de streptavidinbelagda pärlorna. Buffertkanalen används för att bilda tjudern. En fjärde kanal kan användas för att ladda RNA-bindningsproteinet (figur 3C), eller alternativt kan RBP tillsättas direkt i buffertkanalen (figur 3B).
  4. För att fånga pärlorna, flytta de optiska fällorna från varandra. Flytta först till AD-kanalen och fånga en AD-pärla i fälla 1. Flytta sedan scenen till SA-kanalen och fånga en enda SA-pärla genom fälla 2.
    OBS: Försök att stanna vid gränssnittet för buffert- och pärlkanalerna för att undvika att förlora den redan fångade pärlan, eller för att förhindra att fånga flera pärlor med samma fälla.
  5. När pärlor av rätt storlek fångas, flytta till buffertkanalen och stoppa det laminära flödet. Utför sedan kraftkalibrering för att kontrollera fällans styvhet. Respektive styvhetsvärden bör inte skilja sig åt i x/y-axeln med mer än 10-15%.
    OBS: Justera lasereffekten eller lasern uppdelad mellan fällorna efter pärlstorlek. Kraftkalibrering behöver inte göras för varje pärlpar så länge pärlmallarna matchar (likhetspoäng > 0,9). Det bör dock utföras regelbundet, eller åtminstone varje gång analysvillkoren ändras.
  6. Börja fiska efter en tjuder genom att flytta pärlorna nära varandra, vänta i några sekunder och sedan flytta dem tillbaka isär, upprepa tills en tjuder bildas. En tjuderbildning resulterar i en ökning av uppmätt kraft när de drar de två pärlorna bort från varandra.
    OBS: För att undvika bildandet av flera tjudrar bör pärlorna inte flyttas för nära. När du fångar en tjuder mellan de två pärlorna kan tjuderkvaliteten kontrolleras genom att hitta den översträckta platån. Platån ska vara mellan 50 och 60 pN för ett enda tjuder.
  7. När du skaffar ett tjuder startar du mätningen. Beroende på vilket fenomen som studeras bör olika mätinställningar väljas (figur 1B-D).
    OBS: Vanligtvis i början av experimentet utförs ett kraftrampsexperiment för att kontrollera tjuderkvaliteten och undersöka beteendet. Efteråt kan man också starta experimenten med konstant kraft eller konstant position för att studera tillståndsövergångarna ytterligare. När tillräckligt många mätningar har utförts på ett RNA-prov för att bestämma dess beteende kan märkta faktorer läggas till i systemet för att utföra konfokala mätningar.
  8. För att utföra fluorescensmätningar, slå på konfokala lasrar och fotonräknarenheten i det optiska pincettinstrumentet.
  9. Slå på excitationslasern för önskad våglängd i programvarugränssnittet och ställ in laserns effekt på 5 % eller högre, beroende på fluoroforen.
    OBS: Även om du inte mäter lägre effektinställning för excitationslasern till 0% för att undvika överdriven fotodamage till provet.
  10. Börja avbilda exemplet med hjälp av programvarans bildfunktioner.
    OBS: För att få välfokuserade bilder måste fokalplanet för det konfokala mikroskopet och optiska fällor justeras. För detta ändamål kan autofluorescens av polystyrenpärlor i den blå laserkanalen användas. Brännplanet för optiska fällor flyttas upp eller ner i z-axeln tills bilden av pärlor når sin högsta diameter. I denna position kan fluorescenssignalen från molekylen som är fastbunden mellan pärlorna mätas.
  11. Om du vill använda kymografifunktionen anger du kymografiaxelns x-y-position så att den gör det möjligt att upptäcka tjudret mellan pärlorna.
  12. Under hela mätningen kan buffertsammansättningen enkelt ändras genom att antingen flytta pärlorna till olika kanaler eller genom att ändra bufferten som levereras i mikrofluidiksystemet.

4. Dataanalys

  1. Förbehandling av rådata
    1. Genom att använda ett enkelt skript kan du minska rådata tillräckligt för att (i) möjliggöra snabbare efterföljande databehandling men (ii) innehåller fortfarande all kritisk information (figur 4A). Vanligtvis är 100-5000 Hz lämplig för detta ändamål.
      OBS: Datainsamlingsfrekvensen i optiska pincettexperiment är ofta högre än vad som är nödvändigt för analysen - i de presenterade experimenten är datainsamlingsfrekvensen inställd på 78 125 Hz som standard. Eftersom lagringsutrymmet är begränsat är det bekvämt och tidsbesparande att minska samplingshastigheten för data. Här minskades rådata med en faktor 30.
    2. Använd sedan ett signalfilter för att minska högfrekvent mätbrus från signalen (figur 4A). Justera filtergrads- och brytfrekvensparametrarna i enlighet därmed för att optimera datautgången för olika experiment (figur 5).
      OBS: Bland signalfilter är Butterworth filter51 ett av de mest använda. Ett specialskrivet python-skript som möjliggör förbehandling av rådata tillhandahålls i tilläggsdata. Downsampling och signalfiltreringsparametrar (brytfrekvens, filtergrad) måste optimeras för olika experiment.
  2. För analys av kraftrampdata använder du följande steg.
    1. Markera stegen antingen manuellt genom att hitta motsvarande punkter på kraftbanans plot eller med hjälp av specialskrivna skript. Utfällda steg kännetecknas av en plötslig kraftminskning i kombination med en ökning av avståndet i kraftavståndskurvan (FD).
    2. När utfällningshändelserna har markerats får du plats med olika regioner i FD-kurvan med hjälp av lämpliga modeller (figur 4D).
      OBS: För regionen före det första utfällbara steget kan tjudern betraktas som "dubbelsträngad" och är vanligtvis lämplig med en utökningsbar Worm-liknande kedjemodell (WLC)47,52,53. Delarna efter den första utfällningshändelsen anses vara en kombination av dubbelsträngade nukleotider (handtag) och enkelsträngade nukleotider (utfälld RNA-molekyl). Därför är datapassning mer komplex - vanligtvis används en kombination av 2 WLC-modeller eller WLC- och Fritt jointed chain (FJC) modeller36,39,52. Den utökningsbara WLC-modellen har två huvudpassningsparametrar konturlängden (LC) och persistenslängden (LP). Konturlängden motsvarar längden på den fullt sträckta molekylen och persistenslängden definierar böjningsegenskaperna hos molekylen av intresse. Modellen kan beskrivas med följande ekvation (1). WLC kan användas för att modellera beteendet hos både vikta och utfällda regioner, även om för var och en av dessa måste en separat modell med olika parametrar användas.
      (1) Equation 1
      där x är förlängning, LC är konturlängd, F är kraft, LP är persistenslängd, kB är Boltzmann konstant, T är termodynamisk temperatur och S är stretch modulus.
      Den andra modellen som kallas fritt ledkedja (FJC) används ofta för att beskriva beteendet hos utfällda enskilda strandade regioner. Den använder liknande parametrar för polymererna men behandlar varje enhet i "kedjan" som en styv stång, här motsvarande nukleotiderna i den utfällda enda strandade regionen. Följande ekvation (2) beskriver den här modellen:
      (2) Equation 2
      OBS: Vårt labb har nyligen utvecklat en algoritm som tillåter batchbehandling av rå kraftrampdata som kallas "Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54." Algoritmen nedsamplar och filtrerar data, sedan identifierar den möjliga utveckningssteg och utför slutligen datapassning. POTATO är inbyggt i ett användarvänligt grafiskt användargränssnitt (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Bearbeta data med konstant kraft enligt följande:
    OBS: Följande instruktioner kan analogt tillämpas på konstantpositionsdata.
    1. För konstantstyrkasdata, rita avståndet över tid (bild 5). Ett histogram som visar frekvensen (antalet) av olika konformationer över den relativa positionsförändringen är ett användbart sätt att karakterisera olika dominerande och mindre tillstånd (figur 7).
    2. Montera histogrammet med (flera) gaussiska funktioner för att uppskatta den totala procentandelen enskilda konformatörer vid en given kraft (figur 7C). Gaussian passar, genomsnittlig position, och standardavvikelsen beskriver det kraftrelaterade förhållandet mellan olika populationer.
      OBS: Ett specialskrivet python-skript som möjliggör förbehandling och grundläggande bimodal Gaussian-montering av konstantstyrkadata tillhandahålls i kompletterande data. Parametrar (brytfrekvens, filtergrad, förväntade medel, standardavvikelsevärden och amplituder) måste optimeras för olika experiment.
    3. Använd sedan Hidden Markov-modellen för att ytterligare analysera tillstånden, vilket kan avslöja ytterligare vikbara intermediärer (konformatörer)55. För mer information på konstant-styrka och Dold Markov modellerar, kan en se till55.56.57.58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I detta avsnitt ges fokus främst på mätningar av RNA-protein/ligand interaktioner av fluorescens optisk pincett. För en beskrivning av allmänna RNA optiska pincettexperiment och motsvarande representativa resultat, se32. För mer detaljerad diskussion av RNA/DNA-proteininteraktionerna, se också1,2,26,59,60.

I princip stabiliseras, destabiliserar eller kan ändra molekylens konformation av en RBP eller någon annan transverkande intressefaktor på RNA. Nedan visas en skildring av de mekaniska observerbara för varje effekt. Den faktiska effekten som observerats för ett givet RNA-proteinkomplex är dock inte begränsad till dessa nedan nämnda scenarier.

Stabilisering
RNA-strukturen kan specifikt kännas igen och bindas av proteinet eller andra ligands45,61,62,63,64. Bildandet av obligationerna åtföljs av en frisättning av energi. Därför måste en extra energisk barriär övervinnas för att veckla ut den givna RNA-strukturen. Som ett resultat kan en ökning av den genomsnittliga utveckningskraften observeras50,65. Stabiliseringen av RNA-strukturen genom bindning av ett externt medel (protein, liten molekyl, andra transverkande faktorer) kan också resultera i en förändring av strukturens vikkinetik45. För detta kan ytterligare mätningar utföras i konstant kraftläge, där mindre frekventa övergångar mellan de vikbara intermediärerna samt kraftförskjutning i jämvikten kan observeras.

Destabilisering
Vissa proteiner känner igen vissa sekvensmotiv snarare än specifika RNA-strukturer. Bindningsplatserna kan variera från ett mycket specifikt motiv till ett mer allmänt mönster som GC- eller AU-rika sträckor60,66. Men om proteinet företrädesvis binder till den utfällda enkelsträngade RNA-konformationen kan jämvikten mellan det vikta och utfällda tillståndet flyttas mot det utfällda tillståndet36,43,67. I figur 6 och figur 7 visas exempel på sådant beteende.

Strukturförändring
I vissa fall kan RBPs (eller andra ligands) kombinera båda mekanismerna som nämns ovan på ett sådant sätt att RBP destabiliserar den tidigare dominerande konformationen och flyttar jämvikten mot en alternativ RNA-struktur44,68,69. Övergången till ett alternativt tillstånd kan leda till en förändring av de observerade konformationspopulationsfrekvenserna samt förekomsten eller försvinnandet av enskilda vikningstillstånd. Dessa förändringar kan först observeras i kraftrampexperiment och kan undersökas ytterligare genom experiment med konstant kraft (eller konstant position).

Effekten av den transverkande faktorn på RNA-vikning/utfällning
Här studerades en RNA-sekvens som motsvarar -1 programmerade ribosomal frameshifting element av SARS-CoV-2. Detta RNA-element förutspås bilda ett pseudoknot70,71 av H-typ. I exemplet force-distance trajectories utvecklas och omvecklas RNA i två på varandra följande steg (figur 6A). Dessa två steg motsvarar sannolikt de två stamslingor som är förutsättningen för pseudoknot-bildandet. I detta fall observerades inte pseudoknot heller eftersom RNA inte helt vik eller bildade en alternativ struktur som konkurrerar med pseudoknot. Vid tillägg av den transverkande faktorn ZAP observerades ett plötsligt försvinnande av omveckningshändelserna och en enorm hysteres (figur 6B)43. Detta tyder på att proteinet binder till RNA: s enkelsträngade tillstånd, vilket hindrar bildandet av sekundära strukturer. Dessutom bekräftar experiment med konstant kraft resultaten av kraftrampexperiment. Följaktligen, medan RNA är helt vikt vid cirka 10 pN (figur 7A), flyttar närvaron av proteinet omveckningen mot lägre krafter, och vid 10 pN upptar RNA fortfarande mestadels det utfällda tillståndet (figur 7B).

OT-mätningar i kombination med konfokal mikroskopi
Därefter visas föredömliga resultat för den icke-specifika såväl som specifika bindningen av olika fluoroforer och märkta ribosomer (figur 8). I det första exemplet användes SYTOX Green färgämne för att märka den tjudrade DNA/RNA hybriden. Med ökande kraft är färgbindningen mer riklig vilket resulterar i högre fluorescenssignal. När kraften är för hög bryts tjudret och fluorescenssignalen går förlorad (figur 8A). För experimenten med bakteriella ribosomer (figur 8B) användes icke-specifik märkning av lysinresterna med N-hydroxysuccinimid (NHS) konjugerad till ett rött fluorescerande färgämne. Även om det finns en risk för att aktiviteten hos märkt protein/komplex minskar, är den stora fördelen starkare signal som uppnås eftersom varje ribosom (i genomsnitt) är märkt av flera fluoroforer. RNA-konstruktionen innehöll en ribosombindningsplats (RBS) som känns igen av bakteriella ribosomer, som placerades i 5' närhet till den studerade RNA-sekvensen. Vid bindning av ribosomerna observeras fluorescenssignalen på tjudret. Fluorescensdata kan analyseras ytterligare med hjälp av bildanalysverktyg72, och resultaten kan kombineras med kraftdata, vilket möjliggör studier av vikbara övergångar.

Figure 1
Bild 1: Schemat för OT-experimentet och möjliga mätmetoder. (A) Schematisk illustrerar de optiska pincettexperimenten med SARS-CoV-2 frameshifting RNA i mitten. RNA hybridiseras till ssDNA-handtag och immobiliseras på pärlor. Dessa används för att utöva dragkraft på RNA med en fokuserad laserstråle. Kraften ökas gradvis tills RNA utvecklas (botten). B) Schematisk konfokal mikroskopi i kombination med optisk pincett för att övervaka bindning av märkt faktor till RNA. C) Exempel på konstant kraftdata kan erhållas genom att fixera kraften vid ett konstant värde över tiden, vilket gör det möjligt att exakt mäta konformernas uppehållstid. D) Exempel på force-distance (FD) som erhålls från en kraftrampmätning. Det utfällande steget observeras som en plötslig bristning i FD-profilen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Ett allmänt schema för OT-provsyntes. (A) Exempelsekvens och förväntad sekundär struktur för det studerade SARS-CoV-2 frameshifting RNA som används i studien. (B) En vektor som innehåller intressesekvensen (SoI) flankerad av två handtagsområden fungerar som mall för generering av DNA/RNA-konstruktionen i 3 PCR-reaktioner. Primers avbildas och numreras i schemat enligt deras bindningsplatser i motsvarande PCR. PCR 1 ger in vitro-transkriptionsmallen, som därefter används för in vitro-transkriptionsreaktionen (IVT) för att generera den långa RNA-molekylen (ljusblå). PCR 2 ger 5' handtag, som senare är 3 ' märkt med biotin. PCR 3 med hjälp av den främre primern konjugerad till digoxigenin producerar det 3' digoxigenin-märkta handtaget. Slutligen är de två handtagen och RNA glödgade för att ge en DNA/ RNA hybridkonstruktion lämplig för optisk pincettmätningar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Illustration av olika mikrofluidiska kanalinställningar. A) Ett system för flödescellen med 5 mikrofluidiska kanaler. (B) och (C) är inzoomningarna för det rödstreckade området (A). (B) En enkel 3-kanals inställning med AD-pärlor och SA-pärlor i kanalerna 1 respektive 3. Faktorn finns i kanal 2. Denna inställning är lämplig för stabila proteiner med hög affinitet, så låg koncentration föredras för att säkerställa låg fluorescerande bakgrund. Pärlkanalerna på sidan tillåter fast tjuderorientering och snabb rekrytering av nya pärlor om det behövs. (C) 4-kanalsinställning med faktor i kanal 4. Ett sådant arrangemang är särskilt fördelaktigt för minimal provförbrukning. Mätningen kan utföras direkt i kanal 4. Alternativt, för att undvika bakgrund fluorescenssignal, kan komplexet bildas i kanal 4 och sedan kan mätningen utföras i kanal 3. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Bild 4: Arbetsflöde för dataanalys för kraftrampsexperiment. (A) Flödesschema för arbetsflödet för dataanalys. Rådatafilerna nedsamplades först och filtreras, sedan markeras stegen och de enskilda tillstånden monteras på motsvarande modell. B) Rådata innehåller en betydande mängd buller som hindrar identifieringen av händelser som utvecklas/omvecklas. I de flesta experiment är frekvensen av datainsamling också högre än nödvändigt. (C) Därför används nedsampling och signalfiltrering för att jämna ut dataprofilen. (D) De bearbetade kurvorna monteras slutligen med WLC-modellen när molekylen fortfarande är i vikt tillstånd (före utfällningshändelsen), en kombination av WLC med FJC-modeller eller en andra WLC-modell när molekylen är i utfällt tillstånd (efter utfällningshändelsen). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Effekten av brytfrekvens på datautgången. Även om rådatautgången kan belastas med signalbrus (överst), är det viktigt att välja rätt signalfiltreringsparametrar för dataanalys. Även om korrekt filtrering skulle hjälpa till att identifiera vikbara intermediärer (cut-off frekvens 0.1, mitten), över filtrering (cut-off frekvens <0.001, botten) kan resultera i förlust av upplösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Exempel FD-banor i ZAP:s frånvaro och närvaro. A) Utfälla (rosa) och omvecka (blå) spår av SARS-CoV-2 RNA i avsaknad av ZAP. Provet visar lätt omveckning med endast liten hysteres. B) Utfälla (rosa) och omvecka (blå) spår av RNA i närvaro av transfaktor ZAP (400 nM). Provet visar enorm hysteres, vilket tyder på att proteinet binder till det enkelsträngade RNA och förhindrar dess omveckning. C) Ett stapeldiagram som visar antalet utfällbara (rosa) och omveckande (blå) steg i ZAP:s frånvaro eller närvaro. Även om fördelningen av utfällningssteg fortfarande nästan inte påverkas av förekomsten av ZAP, finns det en tydlig minskning av antalet omveckningssteg med ZAP. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Exempel på konstanta kraftdata i ZAP:s frånvaro och närvaro. (A) Konstantstyrkadata som erhållits vid krafter mellan 10 (upp) till 13 (nedre) pN som visar skiftet från helt vikt tillstånd till helt utfällt tillstånd för SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet. Varje diagram innehåller positionen kontra tiden (vänster) och ett histogramdiagram (höger). B) Uppgifter om konstant kraft som erhållits i närvaro av ZAP (400 nM). Vid proteinbindning försämras omveckningen. På 10 pN, i kontrast till RNA bara, i närvaroen av ZAP RNA finns mestadels i det utfällda statligt. Därför indikeras en förskjutning av jämviktskraften mot lägre krafter. (C) Histogrammet av positionsdata kan analyseras genom att anpassa data till gaussiska funktioner för att ge det relativa överflödet av varje stat (härlett från området under kurvan för varje stat). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: OT i kombination med konfokal mikroskopi. (A) Ett exempel på kymografi av SYTOX Green märkt tjuder (vänster). Observera ökningen av signalintensiteten vid ökande krafter. Den svarta pilen markerar tjuderbrottshändelsen, vilket leder till förlust av signal. Avbildning av tjudret med färg som är bundet till det (Bindning) och efter brott utan färgämne (Ingen signal) (höger). (B) Exempel på kymografi för specifik bindning av ribosomen på mRNA (vänster). Bindningshändelsen kan observeras som en fluorescenssignal på det tjudrade RNA mellan de två pärlorna. Avbildning av tjuder utan (ingen signal) och med fluorescensmärkta ribosomer bundna (bindning) (höger). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Lagerkoncentration Slutlig koncentration Volym
Reaktionsvolym - - 500 μL
10× buffert 10× 1× 50 μL
dNTP-blandning 10 mM 0,2 mM 10 μL
DNA-polymeras med hög återgivning 1.25 U/μL 0.025 U/μL 10 μL
Primer 1 10 μM 0.4 μM 20 μL
Primer 2 10 μM 0.4 μM 20 μL
Mall 100 ng/μL 1 ng/μL 5 μL
Vatten - - 385 μL

Tabell 1: Pipetteringsschema för PCR för att generera de optiska pincettkonstruktionerna.

Lagerkoncentration Slutlig koncentration Volym
Reaktionsvolym - - 300 μL
5× buffert 5× 1× 60 μL
rNTP-blandning 25 mM 5 mM 60 μL
RNase-hämmare 40 U/μL 0.7 U/μL 5 μL
Pyrophosphatase 100 U/ml 1,7 mU/μL 4 μL
DTT 100 mM 3,3 mM 10 μL
T7 RNA polymeras 50 U/μL 3.3 U/μL 20 μL
Mall 120 ng/μL 2 ng/μL 5 μL
Vatten - - 136 μL

Tabell 2: Pipetteringsschema för transkription in vitro .

Lagerkoncentration Slutlig koncentration Volym
Reaktionsvolym - - 100 μL
10×buffert (NEB 2.1) 10× 1× 10 μL
BSA 1 μg/ml 100 ng/μL 1 μL
Biotin-16-dUTP 1 mM 50 μM 5 μL
T4 DNA-polymeras 30 U/μL 1.5 U/μL 5 μL
DNA 5'-handtag (20-60 μg) 300 ng/μL 237 ng/μL 79 μL

Tabell 3: Pipetteringsschema för 3' end biotinmärkning.

Lagerkoncentration Slutlig koncentration Slutligt belopp Volym
Reaktionsvolym - - - 300 μL
Glödgning buffert 1.25× 1× - 240 μL
RNase-hämmare 40 U/μL 0.5 U/μL - 5 μL
5' biotinylerat DNA-handtag 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
3' DNA-handtag 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
RNA 150 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 20 μL
Vatten - - - 5 μL

Tabell 4: Pipetteringsschema för glödgning av den optiska pincettkonstruktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här visar vi användningen av fluorescenskopplade optiska pincett för att studera interaktioner och dynamiskt beteende hos RNA-molekyler med olika ligands. Nedan diskuteras kritiska steg och begränsningar av den nuvarande tekniken.

Kritiska steg i protokollet
Liksom för många andra metoder är provets kvalitet avgörande för att få tillförlitliga data. För att få prover av högsta möjliga kvalitet är det därför värt att spendera tid för att optimera proceduren för provberedning. Optimeringsstegen inkluderar korrekt primerdesign, glödgningstemperaturer, RNA och proteinreningssteg.

Under hela experimentet är användning av filtrerade spetsar och lösningar avgörande för att upprätthålla RNase-fria förhållanden. Dessutom hålls mikrofluidiksystemet i blekmedel när det inte används. Innan mätningarna påbörjas är det viktigt att tvätta systemet ordentligt med natriumtiosulfat och RNase-fritt vatten för att avlägsna blekmedlet från systemet.

Om samma storlek pärlor används under hela experimentet, är det inte nödvändigt att utföra kraftkalibrering varje gång. Kraftkalibreringskontroller bör dock göras regelbundet för att experimenten ska kunna reproduceras.

Ändringar och felsökning av metoden
Fluoroforstabilitet och fotobleaching
En komplikation under fluorescensmätningar är fotobleaching. Eftersom tidsramen för att övervaka översättningen kan förlängas från sekunder till minuter beroende på system, bör fotobleaching under mätningarna också övervägas och minimeras så mycket som möjligt73. Ett alternativ är att använda mer stabila fluoroforer, som är mindre benägna att fotoblechera, såsom nyligen introducerade kvantprickar49,74,75. Ytterligare stabilitet uppnås också genom att ta bort syremolekyler med hjälp av ett "syre scavenger" -system, såsom glukosoxidas i kombination med katalas. Glukosoxidas tar bort syre från miljön genom att omvandla det till väteperoxid, som sedan sönderdelas av katalas. Alternativa syrerensningssystem kan också användas76,77.

Mikrofluidik
Att upprätthålla ett kontinuerligt laminärt flöde är avgörande för korrekta mätningar. Viktigast av allt bör systemet aldrig ta slut. Tyvärr är RSP:er eller andra transverkande faktorer av intresse ofta endast tillgängliga i små volymer för experimenten, därför kan det vara utmanande och kostnadskrävande att upprätthålla kontinuerligt flöde. Om luftbubblor förs in i systemet under provtillämpningen är manuell tryck- eller etanoltvätt vanligtvis tillräcklig för att de ska kunna avlägsnas.

Metodens begränsningar
Kombinationen av OT med konfokal mikroskopi ger också vissa begränsningar. För det första måste konfokalenhetens fokalplan justeras korrekt med svällningscentra för att möjliggöra korrekt registrering av fluorescenssignal. För konfokala mätningar behövs dessutom vanligtvis handtag på minst 2 kb på varje plats17. Även om det i princip är möjligt att använda längre handtag bör man överväga handtagens energibidrag och förändringen i persistenslängden för noggrannheten i dataanalys78. En annan viktig punkt är syresopätarna, som används för att öka fluoroforernas halveringstid, leder också till relativt snabba förändringar i pH-värdet på lösningarna76. Dessa förändringar kan delvis kompenseras genom att koncentrationen av buffringsmassan ökar. Under mätningarna bör dock proverna fyllas på regelbundet (var 30:e–60:e minut) för att säkerställa konsekventa förhållanden genom försöket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Anuja Kibe och jun. Prof. Redmond Smyth för att de kritiskt granskar manuskriptet. Vi tackar Tatyana Koch för teknisk experthjälp. Vi tackar Kristyna Pekarkova för hjälpen med att spela in experimentella videor. Arbetet i vårt laboratorium stöds av Helmholtz Association och finansiering från Europeiska forskningsrådets (ERC) anslag nr. 948636 (till NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

Biokemi nummer 180
Optisk pincett för att studera RNA-proteininteraktioner i översättningsreglering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N.… More

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter