Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Optiske pincet til at studere RNA-Protein interaktioner i oversættelse forordning

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62589
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Denne protokol præsenterer en komplet eksperimentel arbejdsgang til undersøgelse af RNA-proteininteraktioner ved hjælp af optiske pincet. Flere mulige eksperimentelle opsætninger er skitseret, herunder kombinationen af optiske pincet med konfokal mikroskopi.

Abstract

RNA vedtager forskellige strukturelle folder, som er afgørende for dets funktioner og dermed kan påvirke forskellige processer i cellen. Derudover kan strukturen og funktionen af et RNA moduleres af forskellige transvirkende faktorer, såsom proteiner, metabolitter eller andre RNA'er. Frameshifting RNA molekyler, for eksempel, er regulatoriske RNA'er placeret i kodning regioner, som direkte oversætte ribosomer i en alternativ åben læseramme, og dermed fungere som gen switche. De kan også vedtage forskellige folder efter binding til proteiner eller andre transfaktorer. For at dissekere RNA-bindende proteiners rolle i oversættelsen, og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det afgørende at studere samspillet og de mekaniske træk ved disse RNA-proteinkomplekser samtidigt. Dette arbejde illustrerer, hvordan man anvender enkelt-molekyle-fluorescens-koblet optisk pincet til at udforske det kropslige og termodynamiske landskab af RNA-protein komplekser ved en høj opløsning. Som et eksempel er samspillet mellem sars-CoV-2 programmeret ribosomale frameshifting element med trans-virkende faktor kort isoform af zink-finger antivirale protein uddybes. Derudover blev fluorescensmærkede ribosomer overvåget ved hjælp af den konfokale enhed, hvilket i sidste ende ville gøre det muligt at studere oversættelsesforlængelse. Fluorescens koblet OT assay kan anvendes bredt til at udforske forskellige RNA-protein komplekser eller trans-virkende faktorer, der regulerer oversættelse og kunne lette undersøgelser af RNA-baserede genregulering.

Introduction

Overførsel af genetisk information fra DNA til proteiner gennem mRNAs er en kompleks biokemisk proces, som er præcist reguleret på alle niveauer gennem makromolekylære interaktioner inde i celler. For translationel regulering giver RNA-proteininteraktioner en afgørende rolle for hurtigt at reagere på forskellige stimuli og signaler1,2. Nogle RNA-proteininteraktioner påvirker mRNA-stabiliteten og ændrer dermed det tidspunkt, hvor et RNA er translationelt aktivt. Andre RNA-protein interaktioner er forbundet med reoding mekanismer såsom stop-codon gennemlæsning, omgåelse, eller programmeret ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. For nylig har en række RNA-bindende proteiner (RBPs) vist sig at interagere med stimulerende mRNA-elementer og oversættelsesmaskineriet for at diktere, hvornår og hvor meget omkodning der vil forekomme i cellen7,8,9,10,11. For at dissekere RNA-bindende proteiners rolle i oversættelsen, og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det afgørende at studere interaktionsprincipperne og de mekaniske egenskaber af disse RNA-proteinkomplekser i detaljer.

Årtiers arbejde har lagt grunden til at studere multi-trins og multi-komponent proces oversættelse, som er afhængig af indviklet kommunikation mellem RNA og protein komponenter i oversættelsen maskiner til at opnå hastighed og nøjagtighed12,13,14. Et afgørende næste skridt i forståelsen af komplekse lovgivningsmæssige begivenheder er at bestemme de kræfter, tidshorisonter og strukturelle determinanter under oversættelse med høj præcision12,15,16,17. Undersøgelsen af RNA-kropsbygningsdynamikken og især hvordan transvirkende hjælpefaktorer virker på RNA-strukturen under oversættelsen, er blevet yderligere belyst af fremkomsten af enkeltmolekyleværktøjer, herunder optiske pincet eller nultilstandsbølgeguider16,17,18,19,20,21,22,23,24 25,26.

Optisk pincet (OT) repræsenterer en meget præcis enkeltmolekyle teknik, som er blevet anvendt til at studere mange former for RNA-afhængige dynamiske processer, herunder transskription, og oversættelse26,27,28,29,30,31,32. Brugen af optiske pincet har gjort det muligt sondering af molekylære interaktioner, nukleinsyre strukturer, og termodynamiske egenskaber, kinetika, og energiske af disse processer i detaljer16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pincet assay er baseret på fastklemning af mikroskopiske objekter med en fokuseret laserstråle. I et typisk OT-eksperiment bindes interessemolekylet mellem to gennemsigtige (normalt polystyren) perler (figur 1A)27. Disse perler fanges derefter af optiske fælder, der opfører sig som fjedre. Således kan den kraft, der påføres molekylet, beregnes baseret på perlens forskydning fra midten af den fokuserede laserstråle (trap center). For nylig er optiske pincet blevet kombineret med konfokal mikroskopi (Figur 1B), hvilket muliggør fluorescens eller Förster resonans energioverførsel (FRET) målinger40,41,42. Dette åbner et helt nyt felt af mulige eksperimenter, der muliggør samtidig måling og dermed præcis korrelation mellem kraftspektroskopi og fluorescensdata.

Her demonstrerer vi eksperimenter ved hjælp af de optiske pincet kombineret med konfokal mikroskopi til at studere protein-RNA interaktioner, der regulerer translationel frameshifting. Mellem målet og kondensatoren muliggør en flowcelle med fem kanaler kontinuerlig prøveudbringning med laminarflow. Gennem de mikrofluidiske kanaler kan forskellige komponenter injiceres direkte, hvilket reducerer hands-on-tiden samt tillader meget lidt prøveforbrug i hele eksperimentet.

For det første foreslås en grundlæggende retningslinje for at hjælpe med udformningen af OT-eksperimenter, og fordele samt faldgruber ved forskellige opsætninger diskuteres. Dernæst beskrives forberedelsen af prøver og eksperimentelle arbejdsgange, og der leveres en protokol til dataanalysen. For at repræsentere et eksempel skitserer vi resultaterne fra RNA-strækforsøg for at studere SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet (figur 2A) med den transvirkende faktor den korte isoform af zinkfinger antiviralt protein (ZAP), som ændrer oversættelsen af det virale RNA fra en alternativ læseramme43. Derudover påvises det, at fluorescensmærkede ribosomer kan anvendes i denne OT-konfokale analyse, hvilket ville være nyttigt at overvåge oversættelsesmaskinernes processivitet og hastighed. Den metode, der præsenteres her, kan bruges til hurtigt at teste effekten af forskellige buffere, ligands eller andre cellulære komponenter for at studere forskellige aspekter af oversættelse. Endelig diskuteres almindelige eksperimentelle faldgruber, og hvordan man foretager fejlfinding af dem. Nedenfor er nogle afgørende punkter i eksperimentelt design skitseret.

Konstruktion design
I princippet er der to fælles tilgange til at skabe en OT-kompatibel RNA-konstruktion. Den første tilgang anvender et langt RNA-molekyle, der er hybridiseret med komplementære DNA-håndtag, hvilket giver en konstruktion bestående af to RNA / DNA hybrid regioner flankerer en enkeltstrenget RNA-sekvens i midten (Figur 2B). Denne tilgang anvendes i de fleste OT RNA eksperimenter33,44,45.

Den anden tilgang udnytter dsDNA håndtag med korte (ca. 20 nt) udhæng15,17. Disse udhæng hybridiseres derefter med RNA-molekylet. Selvom brugen af dsDNA-håndtag er mere kompliceret i design, overvinder det nogle af begrænsningerne i DNA/RNA-hybridsystemet. I princippet kan selv meget lange håndtag (>10kb) implementeres, hvilket er mere bekvemt for konfokale målinger. Derudover kan RNA-molekylet nedtones til DNA-håndtag for at øge tetherstabiliteten.

Strategi for slutmærkning
Konstruktionen skal bindes til perler via en stærk molekylær interaktion. Mens der er tilgange til rådighed for kovalent limning af håndtag til perler46, stærke, men ikke-kovalente interaktioner såsom streptavidin-biotin og digoxigenin-antistof er almindeligt anvendt i OT eksperimenter15,33,35,45. I den beskrevne protokol er konstruktionen mærket med henholdsvis biotin eller digoxigenin, og perlerne er belagt med henholdsvis streptavidin eller antistoffer mod digoxigenin (figur 1A). Denne fremgangsmåde vil være egnet til at anvende kræfter op til ca. 60 pN (pr. tether)47. Desuden gør brugen af forskellige 5' og 3'-mærkningsstrategier det muligt at bestemme retningen af tether dannet mellem perlerne17.

Proteinmærkning til fluorescensmålinger
For confocal billeddannelse, der er flere almindeligt anvendte tilgange til fluorescens mærkning. For eksempel kan fluorophorer være kovalent fastgjort til aminosyrerester, der findes indbygget i proteiner eller introduceres af stedrettet mutagenese gennem en reaktiv organisk gruppe. Thiol eller amine-reaktive farvestoffer kan bruges til mærkning af henholdsvis cystein- og lysinrester. Der er flere reversible beskyttelsesmetoder til at øge specificiteten af mærkning48,49, men indfødte proteiner vil typisk blive mærket ved flere rester. Selv om fluorophorens lille størrelse kan give en fordel, kan ikke-specifik mærkning forstyrre proteinaktiviteten, og signalintensiteten kan derfor variere49. Afhængigt af mærkningseffektivitetssignalintensiteten kan der også være forskel på forskellige eksperimenter. Derfor bør der udføres en aktivitetskontrol forud for eksperimentet.

Hvis proteinet af interesse indeholder en N- eller C-terminal tag, såsom en His-tag eller STREP-tag, specifikke mærkning af disse tags repræsenterer en anden populær tilgang. Desuden reducerer tag-målrettet mærkning risikoen for, at fluorophoren forstyrrer proteinaktiviteten, og kan forbedre opløseligheden49. Men tag-specifikke mærkning normalt giver mono-fluorophore mærket proteiner, som kan være udfordrende at opdage. En anden måde at specifik mærkning kan opnås ved at anvende antistoffer.

Opsætning af mikrofluidics
Kombinationen af OT med et mikrofluidics system giver mulighed for en hurtig overgang mellem forskellige eksperimentelle forhold. Desuden udnytter de nuværende systemer at opretholde laminarstrømmen inde i strømningscellen, hvilket udelukker blanding af væsker fra andre kanaler i vinkelret retning i forhold til strømningsretningen. Derfor er laminar flow særligt fordelagtigt for det eksperimentelle design. I øjeblikket er flowceller med op til 5 kanaler almindeligt anvendt (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøveforberedelse

  1. Klon sekvensen af interesse i vektoren, der indeholder Lambda DNA-fragmenter, der tjener som håndtag sekvenser (Figur 2)43,50.
  2. Først generere en DNA-skabelon til efterfølgende in vitro transskription via PCR (Figur 2B; reaktion 1). På dette PCR-trin tilsættes T7-promotoren i 5' slutningen af forstand-DNA-molekylet32,33,43,50. Indstil PCR-reaktionen i henhold til tabel 1. Kør PCR i 50 μL aliquots med passende cyklusser i termocyklussen.
  3. Bebered håndtagene med to separate PCR-reaktioner (tabel 1, figur 2B, reaktion 2 og 3). Først skal du generere 5 'håndtaget ved PCR. Derefter generere 3 'håndtag og samtidig mærke det med digoxigenin ved hjælp af en 5 'digoxigenin-mærket primer32,33,43,50.
  4. Efter PCR rense DNA'et ved hjælp af silica spin kolonner.
  5. Udfør in vitro transskriptionsreaktionen ved hjælp af T7 RNA polymerase (tabel 2)32,33,43,50. Inkuberes reaktionen ved 37 °C i 2-4 timer afhængigt af RNA'ets længde. Derefter tilsættes DNase I til reaktionen og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter for at fordøje DNA-skabelonen. Rense RNA ved hjælp af silica spin kolonner.
  6. Under mærkningsreaktionen på 5' håndtaget (tabel 3) tilsættes biotin-16-dUTP i 3' ende af håndtaget ved T4 DNA polymerase38,50. Udfør reaktionen ved stuetemperatur i 1-2 timer. Derefter renses DNA'et ved hjælp af silica spin kolonner.
    BEMÆRK: Da 5'-håndtaget skal mærkes i 3' ende (figur 2B), kan mærkningen ikke udføres under PCR'en.
  7. Bland de ovennævnte komponenter - 5' håndtag (3' mærket med biotin), 3' håndtag (5' mærket med digoxigenin) og RNA - i et 1:1:1 molarforhold i udglødningsbuffer (80% formamid, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8), for at opnå den ønskede RNA /DNA hybrid (tabel 4). Udglødningsblandingen opvarmes op til 85 °C i 10 min og afkøles derefter langsomt til 4 °C.
  8. Den udglødede prøve blandes med 1/10 volumen på 3 M natriumacetat (pH 5), 3 bind iskold ethanol og inkuberes ved -80 °C i mindst 1 time eller ved -20 °C natten over.
  9. Centrifuge prøverne ved 15.000 × g i 30 min ved 4 °C. Kassér supernatanten og tør pellet (normalt ikke synlig) under vakuum.
  10. Endelig, resuspend, pellet i 50 μL af RNase-fri vand og gøre aliquots. Opbevar aliquots ved -80 °C, indtil de anvendes. Til kortvarig opbevaring kan prøverne også opbevares ved -20 °C.

2. Opsætning af instrument

BEMÆRK: Følgende protokol er optimeret til det kommercielle optiske pincetinstrument C-Trap fra LUMICKS-virksomheden. Derfor kan justeringer af de præsenterede trin være nødvendige, mens du bruger andre optiske pincetinstrumenter. Hvis det ikke anvendes, holdes maskinens mikrofluidicsystem i blegemiddel (natriumhypochloropløsning) og skal vaskes før brug.

  1. Kassér blegemidlet og fyld sprøjterne med 1 mL RNasefrit vand.
  2. Der tilsættes 50 μL på 0,5 M natrium thiosulfat til mindst 1 mL af det RNasefrie vand, og systemet (1 bar, mindst 0,5 mL) fjernes for at fjerne det resterende blegemiddel i systemet.
  3. Kassér natrium thiosulfatopløsningen fra sprøjterne. Udskift sprøjter med friske, og vask systemet med mindst 0,5 mL RNasefrit vand.
    BEMÆRK: Pas på, at mikrofluidics-systemet aldrig løber tør for at undgå luftbobler i systemet.
  4. Sæt 2 dråber nedsænkningsolie (brydningsindeks på 1,33) eller ca. 70 μL vand oven i målet.
  5. Placer flowcellen inde i holderammen i sin position.
  6. Sæt 2 dråber nedsænkningsolie (brydningsindeks på 1,51) oven på flowcellen.
  7. Tænd laserenheden i pincetmaskinen. Når den kører, skal du tænde fældefangstlaseren i softwaregrænsefladen ved 100%.
  8. Ved hjælp af diagnostiske kameraer (Z-finder), justere Z-aksen til midten af kammeret mellem den anden og den tredje refleksioner (grænseflader), hvor brydning ringe er de største, ved at dreje mikro skruen.
    BEMÆRK: Hver gang målet flyttes tættere på målekammeret, og målets fokusplan krydser grænsefladen mellem to faser, kan en refleksion genkendes i Z-finder-tilstand. Der er 4 grænseflader mulige: (i) vand /nedsænkning olie og bund glas (ii) bund glas og buffer inde i kammeret (iii) buffer inde i kammeret og top glas (iv) top glas og nedsænkning olie til kondensator.
  9. Juster kondensatorpositionen (sæt diffuseringslaser til ca. 50 %), så kondensatoren rører nedsænkningsolien oven på målekammeret.
  10. Juster fokus ved at bevæge sig langsomt ned/op med kondensatoren, så ca. 10 lysbånd vises i månetilstand (diagnostiske kameraer).

3. Stikprøvemåling

  1. Inkuber anti-digoxigeninbelagte perler (AD) med prøvekonstruktionerne (3 μL på 0,1 % (w/v) AD perleaffjedring + 4 μL prøve) og med 1 μL RNase-hæmmere og 8 μL af analysebufferen (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Mellem 20, 5 mM DTT) ved RT i 10-20 min. Efter inkubationen fortyndes prøven i 500 μL analysebuffer.
    BEMÆRK: Det anbefales at tilsætte iltscavengers, især under fluorescensmålinger til bufferen for at forhindre oxidativ skade. Her blev der anvendt iltscavenger-system, der indeholder glukose (8,3 mg/mL), glukoseoxidase (40 U/mL) og katalase (185 U/mL).
  2. Bland 0,8 μL af 1% (w/v) strøptavidin-coatede (SA) perler med 1 mL assay buffer.
  3. Kassér vand fra sprøjterne, og fyld sprøjterne med respektive affjedringer/opløsninger. Vask i mindst 2 min på ca 1 bar, og derefter begynde at fange perler.
    BEMÆRK: Afhængigt af forsøgsopsætningen kan der anvendes forskellige kanalordninger (figur 3). Typisk, en flow kanal er fyldt med anti-digoxigenin perler bærer RNA molekyle. En anden kanal er fyldt med de streptavidin-belagt perler. Bufferkanalen bruges til at danne tethers. En fjerde kanal kan anvendes til at indlæse RNA-bindingsproteinet (Figur 3C), eller alternativt kan RBP tilsættes direkte i bufferkanalen (Figur 3B).
  4. For at fange perlerne skal du flytte de optiske fælder fra hinanden. Første træk til AD-kanalen og fange en AD-perle i fælde 1. Flyt derefter scenen til SA-kanalen og fange en enkelt SA perle ved fælde 2.
    BEMÆRK: Prøv at bo på grænsefladen af buffer og perle kanaler for at undgå at miste den allerede fanget perle, eller for at forhindre at fange flere perler af samme fælde.
  5. Når perlerne af den rigtige størrelse er fanget, flytte til bufferkanalen og stoppe laminar flow. Udfør derefter kraftkalibrering for at kontrollere fældestivhed. De respektive stivhedsværdier bør ikke afvige i x/y-aksen med mere end 10-15%.
    BEMÆRK: Juster lasereffekten eller laseren mellem fælderne efter perlestørrelsen. Force kalibrering behøver ikke at ske for hver perle par, så længe perle skabeloner match (lighed score > 0,9). Det skal dog udføres regelmæssigt, eller i det mindste hver gang analysebetingelserne ændres.
  6. Begynd at fiske efter en tøjre ved at flytte perlerne tæt på hinanden, venter i et par sekunder, og derefter flytte dem tilbage fra hinanden, gentag, indtil en tether er dannet. En tetherdannelse resulterer i en stigning i målt kraft ved at trække de to perler væk fra hinanden.
    BEMÆRK: For at undgå dannelse af flere tethers bør perlerne ikke flyttes for tæt. Ved at fange en tether mellem de to perler, kan tether kvalitet kontrolleres ved at finde overstretching plateau. Plateauet skal være mellem 50 og 60 pN for en enkelt tether.
  7. Når du har fået en tether, skal du starte målingen. Afhængigt af det undersøgte fænomen bør der vælges forskellige måleopsætninger (figur 1B-D).
    BEMÆRK: Normalt i begyndelsen af eksperimentet udføres et kraftrampeeksperiment for at kontrollere tøjrets kvalitet og sonde adfærden. Bagefter kan man også starte konstant-kraft eller konstant position eksperimenter for at studere staten overgange yderligere. Når der er udført et tilstrækkeligt antal målinger på en RNA-prøve til at bestemme dens funktionsmåde, kan mærkede faktorer føjes til systemet for at udføre konfokale målinger.
  8. Hvis du vil udføre fluorescensmålinger, skal du tænde for de konfokale lasere og fotontællerenheden i det optiske pincetinstrument.
  9. Tænd excitation laser af ønskede bølgelængde i software interface og indstille effekten af laseren til 5% eller højere, afhængigt af fluorophore.
    BEMÆRK: Uden at måle, at excitationslaserens effektindstilling ikke måles, til 0 % for at undgå for meget fotodamage til prøven.
  10. Start billedfilen ved hjælp af billedfunktioner i softwaren.
    BEMÆRK: For at få velfokuserede billeder skal det konfokale mikroskops brændplan og optiske fælder justeres. Til dette formål kan der anvendes autofluorescence af polystyrenperlerne i den blå laserkanal. Fokusplan af optiske fælder flyttes op eller ned i z-aksen, indtil billedet af perler når sin højeste diameter. På denne position kan fluorescenssignalet fra molekylet, der er bundet mellem perlerne, måles.
  11. For at bruge kymograffunktionen skal du angive kymografaksens x-y-position, så den gør det muligt at detektere tether mellem perlerne.
  12. Under hele målingen kan buffersammensætningen let ændres ved enten at flytte perlerne til forskellige kanaler eller ved at ændre den buffer, der leveres i mikrofluidics-systemet.

4. Dataanalyse

  1. Forudbehandling af rådata
    1. Ved at bruge et simpelt script, nedsallomple de rå data nok til (i) tillade hurtigere efterfølgende databehandling, men (ii) stadig indeholder alle de kritiske oplysninger (Figur 4A). Normalt er 100-5000 Hz egnet til dette formål.
      BEMÆRK: Dataindsamlingsfrekvensen i optiske pincetforsøg er ofte højere, end det er nødvendigt for analysen - i de præsenterede eksperimenter er dataindsamlingsfrekvensen som standard indstillet til 78 125 Hz. Da lagerpladsen er begrænset, er det praktisk og tidsbesparende at reducere prøveudtagningshastigheden af dataene. Her blev de rå data nedsampledt med en faktor på 30.
    2. Derefter skal du anvende et signalfilter for at reducere den højfrekvente målestøj fra signalet (Figur 4A). Juster filtergraden og cut-off-frekvensparametrene i overensstemmelse hermed for at optimere dataoutputtet for forskellige eksperimenter (figur 5).
      BEMÆRK: Blandt signalfiltre er Butterworth filter51 et af de mest anvendte. Et specialskrevet pythonscript, der gør det muligt at forbehandle rådata, findes i de supplerende data. Downsampling og signalfiltrering parametre (cut-off frekvens, filter grad) skal optimeres til forskellige eksperimenter.
  2. Brug følgende trin til analyse af dataanalyse af fremtramper.
    1. Markér trinnene enten manuelt ved at finde tilsvarende punkter på kraftforløbet eller ved hjælp af specialskrevne scripts. Udfoldende trin er karakteriseret ved et pludseligt fald i kraft kombineret med en stigning i afstanden i kraftafstandskurven (FD).
    2. Når udfoldende begivenheder er markeret, passer forskellige områder af FD-kurven ved hjælp af passende modeller (Figur 4D).
      BEMÆRK: For regionen før det første udfoldelsestrin kan tether betragtes som "dobbeltstrenget" og er almindeligt egnet ved hjælp af en udvidelig Worm-like-chain model (WLC)47,52,53. Delene efter den første udfoldelseshændelse betragtes som en kombination af dobbeltstrengede nukleotider (håndtag) og enkeltstrengede nukleotider (udfoldet RNA-molekyle). Derfor er datamontering mere kompleks - normalt anvendes en kombination af 2 WLC-modeller eller WLC- og Frit-jointed chain (FJC) modeller36,39,52. Den udvidelige WLC-model har to hovedgnageparametre, konturlængden (LC) og persistenslængden (LP). Konturlængde svarer til længden af det fuldt strakte molekyle, og persistenslængden definerer bøjningsegenskaberne for molekylet af interesse. Modellen kan beskrives med følgende ligning (1). WLC kan bruges til at modellere adfærden i både foldede såvel som udfoldede regioner, selvom der for hver af disse skal anvendes en separat model med forskellige parametre.
      (1) Equation 1
      hvor x er forlængelse, LC er kontur længde, F er kraft, LP er vedholdenhed længde, kB er Boltzmann konstant, T er termodynamisk temperatur, og S er stretch modulus.
      Den anden model kaldet Frit-jointed chain (FJC) er almindeligt anvendt til at beskrive adfærd udfoldede enkelt strandede regioner. Det bruger lignende parametre for polymererne, men behandler hver enhed i "kæden" som en stiv stang, her svarende til nukleosiderne i det udfoldede enkeltstrengede område. I følgende ligning (2) beskrives denne model:
      (2) Equation 2
      BEMÆRK: Vores laboratorium har for nylig udviklet en algoritme, der tillader batchbehandling af de rå kraft-rampe data kaldet "Praktisk optisk pincet Analyse TOol (POTATO)54." Algoritmen nedstempler og filtrerer dataene, så identificerer den mulige udfoldende trin og udfører endelig datamontering. POTATO er bygget i en brugervenlig grafisk brugergrænseflade (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Behandl data med konstant kraft på følgende måde:
    BEMÆRK: Følgende instruktioner kan analogt anvendes på data med konstant position.
    1. For data med konstant kraft afbildes afstanden over tid (figur 5). Et histogrammer, der viser hyppigheden (tæller) af forskellige konformationer i forhold til den relative holdningsændring, er en nyttig måde at karakterisere forskellige dominerende og mindre tilstande på (figur 7).
    2. Sæt histogrammet ved hjælp af (flere) gaussiske funktioner til at estimere den samlede procentdel af individuelle konforme ved en given kraft (Figur 7C). Gaussian passer, middelposition, og standardafvigelsen skitserer det kraftrelaterede forhold mellem forskellige populationer.
      BEMÆRK: Et specialskrevet pythonscript, der tillader forbehandling og grundlæggende bimodal gaussisk montering af konstantkraftdata, leveres i de supplerende data. Parametre (cut-off frekvens, filtergrad, forventede midler, standardafvigelsesværdier og amplituder) skal optimeres til forskellige eksperimenter.
    3. Dernæst anvende Hidden Markov model til yderligere at analysere de stater, som kan afdække yderligere folde mellemprodukter (conformers)55. For yderligere oplysninger om konstant-kraft og Hidden Markov model, kan man henvise til55,56,57,58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette afsnit fokuseres der hovedsageligt på målinger af RNA-protein/ligandinteraktioner foretaget af fluorescens optiske pincet. For en beskrivelse af generelle RNA optiske pincet eksperimenter og tilsvarende repræsentative resultater, se32. For mere detaljeret diskussion af RNA / DNA-protein interaktioner, også se1,2,26,59,60.

I princippet stabiliserer bindingen af en RBP eller enhver anden transvirkende interessefaktor på RNA, destabiliserer eller kan ændre molekylets kropsbygning. Nedenfor vises en skildring af de mekaniske observerbare for hver effekt. Den faktiske effekt, der er observeret for et givet RNA-proteinkompleks, er imidlertid ikke begrænset til disse nedenstående scenarier.

Stabilisering
RNA-strukturen kan specifikt genkendes og bindes af proteinet eller andre ligands45,61,62,63,64. Dannelsen af obligationerne ledsages af en frigivelse af energi. Derfor skal en ekstra energisk barriere overvindes for at udfolde den givne RNA-struktur. Som følge heraf kan der observeres en forøgelse af den gennemsnitlige udfoldning kraft50,65. Stabiliseringen af RNA-strukturen ved binding af et eksternt middel (protein, lille molekyle, andre transvirkende faktorer) kan også resultere i en ændring af strukturens folde kinetik45. Til det formål kan yderligere målinger udføres i konstant krafttilstand, hvor mindre hyppige overgange mellem folde-mellemprodukterne samt kraftforskydning i ligevægten kan observeres.

Destabilisering
Nogle proteiner genkender visse sekvensmotiver i stedet for specifikke RNA-strukturer. Bindingsstederne kan variere fra et meget specifikt motiv til et mere generelt mønster som GC eller AU rich strækninger60,66. Ikke desto mindre, hvis proteinet fortrinsvis binder sig til den udfoldede enkeltstrengede RNA-kropsbygning, kan ligevægten mellem den foldede og udfoldede tilstand flyttes mod den udfoldede tilstand36,43,67. I figur 6 og figur 7 er eksempler på en sådan adfærd afbildet.

Strukturændring
I nogle tilfælde kan RBPs (eller andre ligands) kombinere begge ovennævnte mekanismer på en sådan måde, at RBP destabiliserer den tidligere dominerende kropsbygning og flytter ligevægten i retning af en alternativ RNA-struktur44,68,69. Overgangen til en alternativ tilstand kan resultere i en ændring i de observerede kropsbygningspopulationsfrekvenser samt forekomsten eller forsvinden af individuelle foldetilstande. Disse ændringer kan først observeres i force-ramp eksperimenter og kan undersøges yderligere af konstant-kraft (eller konstant-position) eksperimenter.

Effekten af transvirkende faktor på RNA foldning/udfoldning
Her blev en RNA-sekvens svarende til -1-programmeret ribosomale frameshifting element af SARS-CoV-2 undersøgt. Dette RNA-element forventes at danne en H-type pseudoknot70,71. I eksemplet kraft-afstand baner, RNA udfolder sig og foldes i to på hinanden følgende trin (Figur 6A). Disse to trin svarer sandsynligvis til de to stilkløkker, der er forudsætningen for pseudoknotdannelsen. I dette tilfælde blev pseudoknot ikke observeret, enten fordi RNA ikke fuldt ud fold eller dannede en alternativ struktur, der konkurrerede med pseudoknot. Ved tilføjelsen af den transvirkende faktor ZAP blev der observeret en pludselig forsvinden af refolding-begivenhederne og en enorm hysterese (figur 6B)43. Dette tyder på, at proteinet binder sig til RNA's enkeltstrengede tilstand, der hindrer dannelsen af sekundære strukturer. Desuden bekræfter konstantkraftforsøg resultaterne af force-ramp eksperimenter. Mens RNA er fuldt foldet ved ca. 10 pN (figur 7A), skifter proteinets tilstedeværelse derfor genfoldningen mod lavere kræfter, og ved 10 pN besætter RNA stadig for det meste den udfoldede tilstand (Figur 7B).

OT målinger kombineret med konfokal mikroskopi
Dernæst vises eksemplariske resultater for ikke-specifikke såvel som specifikke bindinger af forskellige fluorophorer og mærkede ribosomer (figur 8). I det første eksempel blev SYTOX Green dye brugt til at mærke den tøjrede DNA/RNA hybrid. Med stigende kraft er farvebindingen mere rigelig, hvilket resulterer i højere fluorescenssignal. Når kraften er for høj, går tetheret i stykker, og fluorescenssignalet går tabt (Figur 8A). Til forsøg med bakterielle ribosomer (figur 8B) blev der anvendt ikke-specifik mærkning af lysinrester ved hjælp af N-hydroxysuccinimid (NHS), der var konjugeret til et rødt fluorescerende farvestof. Selv om der er risiko for at reducere aktiviteten af mærket protein / kompleks, den store fordel er stærkere signal opnået som hver ribosom er (i gennemsnit) mærket af flere fluorophores. RNA-konstruktionen indeholdt et ribosombindingssted (RBS), der blev anerkendt af bakterielle ribosomer, som blev placeret i 5's nærhed af den undersøgte RNA-sekvens. Ved binding af ribosomer observeres fluorescenssignalet på tether. Fluorescensdata kan analyseres yderligere ved hjælp af billedanalyseværktøjer72, og resultaterne kan kombineres med kraftdataene, hvilket gør det muligt at studere foldeovergange.

Figure 1
Figur 1: Skematisk for OT-eksperimentet og mulige målemetoder. (A) Skematisk illustrerer de optiske pincet eksperimenter med SARS-CoV-2 frameshifting RNA i midten. RNA er hybridiseret til ssDNA håndtag og immobiliseret på perler. Disse bruges til at udøve trækkekraft på RNA med en fokuseret laserstråle. Kraften øges gradvist, indtil RNA udfoldes (nederst). (B) Skematisk af konfokal mikroskopi kombineret med optiske pincet til at overvåge bindingen af mærket faktor til RNA. (C) Eksempel konstant kraft data kan opnås ved at fastsætte kraften til en konstant værdi over tid, hvilket gør det muligt præcist at måle opholdstid af conformers. (D) Eksempel på FD-kurve (Force-distance) opnået ved en kraftrampemåling. Det udfoldende trin observeres som et pludseligt brud i FD-profilen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: En generel ordning med OT-prøvesyntese. (A) Eksempelsekvens og forudsagt sekundær struktur af den undersøgte SARS-CoV-2 frameshifting RNA ansat i undersøgelsen. (B) En vektor, der indeholder den interessesekvens (SoI), der er flankeret af to håndtagsområder, fungerer som skabelon for generering af DNA/RNA-konstruktionen i 3 PCR-reaktioner. Primere er afbildet og nummereret i ordningen i henhold til deres bindende websteder i den tilsvarende PCR. PCR 1 giver in vitro transskription skabelon, som efterfølgende bruges til in vitro transskription (IVT) reaktion til at generere den lange RNA molekyle (lyseblå). PCR 2 giver 5' håndtaget, som senere er 3' mærket med biotin. PCR 3 ved hjælp af den fremadgående primer konjugeret til digoxigenin producerer 3 'digoxigenin-mærket håndtag. Endelig er de to håndtag og RNA udglødet for at give en DNA / RNA hybrid konstruktion egnet til optiske pincet målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Illustration af forskellige mikrofluidics kanal opsætninger. (A) En ordning af flowcellen med 5- mikrofluidics kanaler. (B) og (C) er zoom-ins af det rødstiplede område af (A). (B) En simpel 3-kanals opsætning med AD perler og SA perler i kanal 1 og 3, henholdsvis. Faktor findes i kanal 2. Denne opsætning er velegnet til stabile proteiner med høj affinitet, og derfor foretrækkes lav koncentration for at sikre lav fluorescerende baggrund. Perlekanalerne på siden tillader fast tetherorientering og hurtig rekruttering af nye perler, hvis det er nødvendigt. (C) 4-kanals opsætning med Faktor i kanal 4. En sådan ordning er særlig fordelagtig for et minimalt prøveforbrug. Målingen kan udføres direkte i kanal 4. Alternativt kan komplekset dannes i kanal 4 for at undgå baggrundslyscenssignal, og derefter kan målingen udføres i kanal 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Arbejdsgang for dataanalyse for force-ramp eksperimenter. (A) Rutediagram over dataanalysearbejdsgangen. De rå datafiler er først nedsampled og filtreret, derefter trin er markeret, og de enkelte stater er monteret på den tilsvarende model. B) De rå data indeholder en betydelig mængde støj, som hindrer identifikationen af hændelser, der udfolder sig/foldes tilbage. Også i de fleste af forsøgene er hyppigheden af dataindsamling højere end nødvendigt. (C) Der anvendes derfor nedsampling og signalfiltrering til at udjævne dataprofilen. (D) De forarbejdede kurver monteres endelig ved hjælp af WLC-modellen, når molekylet stadig er i foldet tilstand (før udfoldelseshændelsen), en kombination af WLC med FJC-modeller eller en anden WLC-model, når molekylet er i udfoldet tilstand (efter udfoldelseshændelsen). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Effekten af skæringsfrekvens på dataoutput. Mens den rå data output kan være belastet med signalstøj (øverst), er det afgørende at vælge ordentlig signalfiltrering parametre for dataanalyse. Selv om korrekt filtrering ville hjælpe med at identificere folde mellemprodukter (cut-off frekvens 0.1, midten), over filtrering (cut-off frekvens <0.001, bund) kan resultere i tab af opløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Eksempel FD baner i mangel og tilstedeværelse af ZAP. (A) Udfoldelse (pink) og refolding (blå) spor af SARS-CoV-2 RNA i mangel af ZAP. Prøven viser let at folde med kun lille hysterese. (B) Udfoldelse (pink) og refolding (blå) spor af RNA i nærværelse af transfaktor ZAP (400 nM). Prøven viser stor hysterese, hvilket tyder på, at proteinet binder sig til den enkeltstrengede RNA og forhindrer dets refolding. (C) Et søjlediagram, der viser antallet af udfoldende (pink) og refolding (blå) trin i fraværet eller tilstedeværelsen af ZAP. Mens fordelingen af udfoldende trin forbliver næsten upåvirket af tilstedeværelsen af ZAP, er der et klart fald i antallet af refolding trin med ZAP. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Eksempel konstant kraft data i mangel og tilstedeværelse af ZAP. (A) Konstantkraftsdata, der er opnået ved kræfter, der spænder mellem 10 (op) til 13 (nederst) pN, der viser skiftet fra fuldt foldet tilstand til fuldt udfoldet tilstand af SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet. Hver graf indeholder positionen vs. klokkeslæt (venstre) og et histogramplot (højre). (B) Konstant kraft data indhentet i overværelse af ZAP (400 nM). Ved proteinbinding forringes genfoldningen. På 10 pN, i modsætning til RNA alene, i overværelse af ZAP RNA for det meste eksisterer i udfoldet tilstand. Derfor er et skift i ligevægtskraften mod lavere kræfter angivet. (C) Histogrammet af positionsdata kan analyseres ved at montere dataene på gaussiske funktioner for at give den relative overflod af hver stat (afledt af området under kurven for hver stat). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: OT kombineret med konfokal mikroskopi. (A) Et eksempel kymograf af SYTOX Green mærket tether (venstre). Bemærk stigningen i signalintensiteten ved at øge kræfterne. Den sorte pil markerer binde bindefejl begivenhed, hvilket fører til tab af signal. Skildring af tether med farvestof bundet til det (Binding) og efter brud uden farvestof (Intet signal) (højre). (B) Eksempel kymograf af specifik binding af ribosom på mRNA (venstre). Bindingshændelsen kan observeres som et fluorescenssignal på det tøjrede RNA mellem de to perler. Skildring af tøjre uden (Intet signal) og med fluorescens-mærket ribosomer bundet (Binding) (højre). Klik her for at se en større version af dette tal.

Aktiekoncentration Endelig koncentration Lydstyrke
Reaktionsvolumen - - 500 μL
10× buffer 10× 1× 50 μL
dNTP mix 10 mM 0,2 mM 10 μL
High fidelity DNA polymerase 1,25 U/μL 0,025 U/μL 10 μL
Primer 1 10 μM 0,4 μM 20 μL
Primer 2 10 μM 0,4 μM 20 μL
Skabelon 100 ng/μL 1 ng/μL 5 μL
Vand - - 385 μL

Tabel 1: Pipetterordning for PCR til generering af de optiske pincetkonstruktioner.

Aktiekoncentration Endelig koncentration Lydstyrke
Reaktionsvolumen - - 300 μL
5× buffer 5× 1× 60 μL
rNTP mix 25 mM 5 mM 60 μL
RNase-hæmmer 40 U/μL 0,7 U/μL 5 μL
Pyrophosphatase 100 U/mL 1,7 mU/μL 4 μL
DTT 100 mM 3,3 mM 10 μL
T7 RNA polymerase 50 U/μL 3.3 U/μL 20 μL
Skabelon 120 ng/μL 2 ng/μL 5 μL
Vand - - 136 μL

Tabel 2: Pipetterordning for in vitro transskription.

Aktiekoncentration Endelig koncentration Lydstyrke
Reaktionsvolumen - - 100 μL
10× buffer (NEB 2.1) 10× 1× 10 μL
BSA 1 μg/ml 100 ng/μL 1 μL
Biotin-16-dUTP 1 mM 50 μM 5 μL
T4 DNA polymerase 30 U/μL 1,5 U/μL 5 μL
DNA 5' håndtag (20-60 μg) 300 ng/μL 237 ng/μL 79 μL

Tabel 3: Pipetterordning for 3' endebiotinmærkning.

Aktiekoncentration Endelig koncentration Endeligt beløb Lydstyrke
Reaktionsvolumen - - - 300 μL
Udglødning af buffer 1.25× 1× - 240 μL
RNase-hæmmere 40 U/μL 0,5 U/μL - 5 μL
5' biotinyleret DNA-håndtag 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
3' DNA-håndtag 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
RNA 150 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 20 μL
Vand - - - 5 μL

Tabel 4: Pipetterordning til udglødning af den optiske pincetkonstruktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrerer vi brugen af fluorescens-koblede optiske pincet til at studere interaktioner og dynamisk adfærd af RNA-molekyler med forskellige ligands. Nedenfor diskuteres kritiske trin og begrænsninger af den nuværende teknik.

Kritiske trin i protokollen
Som for mange andre metoder, kvaliteten af prøven er afgørende for at opnå pålidelige data. For at opnå de højest mulige kvalitetsprøver er det derfor værd at bruge tid på at optimere proceduren for prøveforberedelse. Optimeringstrinnene omfatter korrekt primerdesign, udglødningstemperaturer, RNA og proteinrensningstrin.

Gennem hele eksperimentet er brug af filtrerede spidser og løsninger afgørende for at opretholde RNase-fri betingelser. Derudover holdes mikrofluidics-systemet i blegemiddel, når det ikke er i brug. Før du starter målinger, er det vigtigt at vaske systemet ordentligt med natrium thiosulat og RNase-fri vand for at fjerne blegemidlet fra systemet.

I tilfælde af at der anvendes perler af samme størrelse i hele eksperimentet, er det ikke nødvendigt at udføre kraftkalibrering hver gang. Ikke desto mindre bør der regelmæssigt foretages kontrol af kraftkalibrering for reproducerbarheden af forsøg.

Ændringer og fejlfinding af metoden
Fluorophore stabilitet og fotobleaching
En komplikation under fluorescensmålinger er fotobleaching. Da tidsrammen til overvågning af oversættelse kan forlænges fra sekunder til minutter afhængigt af systemet, bør fotografering under målingerne også overvejes og minimeres så meget som muligt73. En mulighed er at anvende mere stabile fluorophores, som er mindre tilbøjelige til fotobleaching, såsom nyligt indførte quantum dots49,74,75. Yderligere stabilitet opnås også ved at fjerne iltmolekyler ved hjælp af et "iltscavenger" system, såsom glukoseoxidase kombineret med katalase. Glukoseoxidase fjerner ilt fra miljøet ved at omdanne det til hydrogenperoxid, som derefter nedbrydes af katalase. Alternative iltscavenging systemer kan også anvendes76,77.

Mikrofluidics
Vedligeholdelse af et kontinuerligt laminar flow er afgørende for korrekte målinger. Vigtigst af alt bør systemet aldrig løbe tør. Desværre er RBPs eller andre transvirkende interessefaktorer ofte kun tilgængelige i små mængder for forsøgene, og derfor kan det være udfordrende og omkostningskrævende at opretholde kontinuerlig strømning. Hvis der indføres luftbobler i systemet under prøveudbringningen, er manuel tryk- eller ethanolvask normalt tilstrækkelig til, at de kan fjernes.

Begrænsninger af metoden
Kombination af OT med konfokal mikroskopi bringer også nogle begrænsninger. For det første skal den konfokale enheds brændplan justeres korrekt med fældecentre for at muliggøre korrekt registrering af fluorescenssignal. Desuden er der normalt behov for håndtag på mindst 2 kb på hvert sted til konfokale målinger17. Selv om det i princippet er muligt at anvende længere håndtag, bør man overveje håndtagenes energibidrag og ændringen i den vedvarende længde for nøjagtigheden af dataanalyse78. Et andet afgørende punkt er iltscavengers, som bruges til at øge levetiden af fluorophores, også føre til relativt hurtige ændringer i pH af løsningerne76. Disse ændringer kan delvis kompenseres ved at øge koncentrationen af bufferforbindelsen; Under målingerne bør prøverne dog genopfyldes regelmæssigt (hvert 30.-60. minut) for at sikre ensartede forhold gennem forsøget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Anuja Kibe og Jun. Prof. Redmond Smyth for kritisk gennemgang af manuskriptet. Vi takker Tatyana Koch for teknisk ekspertbistand. Vi takker Kristyna Pekarkova for hjælpen til at optage eksperimentelle videoer. Arbejdet i vores laboratorium er støttet af Helmholtz Association og finansiering fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) Grant Nr. 948636 (til NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

Biokemi udgave 180
Optiske pincet til at studere RNA-Protein interaktioner i oversættelse forordning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N.… More

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter