Pinces optiques pour étudier les interactions ARN-protéine dans la régulation de la traduction

Résumé

Ce protocole présente un flux de travail expérimental complet pour l’étude des interactions ARN-protéine à l’aide de pinces optiques. Plusieurs configurations expérimentales possibles sont décrites, y compris la combinaison de pinces optiques avec la microscopie confocale.

Résumé

L’ARN adopte divers plis structurels, qui sont essentiels à ses fonctions et peuvent donc avoir un impact sur divers processus dans la cellule. En outre, la structure et la fonction d’un ARN peuvent être modulées par divers facteurs trans-agissants, tels que des protéines, des métabolites ou d’autres ARN. Les molécules d’ARN à décalage de trame, par exemple, sont des ARN régulateurs situés dans des régions codantes, qui dirigent la traduction des ribosomes en un cadre de lecture ouvert alternatif, et agissent ainsi comme des commutateurs de gènes. Ils peuvent également adopter différents plis après s’être liés à des protéines ou à d’autres facteurs trans. Pour disséquer le rôle des protéines de liaison à l’ARN dans la traduction et la façon dont elles modulent la structure et la stabilité de l’ARN, il est crucial d’étudier simultanément l’interaction et les caractéristiques mécaniques de ces complexes ARN-protéine. Ce travail illustre comment utiliser des pinces optiques couplées à une seule molécule et à fluorescence pour explorer le paysage conformationnel et thermodynamique des complexes ARN-protéine à haute résolution. À titre d’exemple, l’interaction de l’élément de décalage de trame ribosomique programmé par le SARS-CoV-2 avec l’isoforme courte du facteur trans-agissant de la protéine antivirale zinc-doigt est élaborée. De plus, les ribosomes marqués par fluorescence ont été surveillés à l’aide de l’unité confocale, ce qui permettrait finalement d’étudier l’allongement de la traduction. Le test OT couplé à la fluorescence peut être largement appliqué pour explorer divers complexes ARN-protéine ou facteurs trans-agissant régulant la traduction et pourrait faciliter les études de la régulation des gènes basée sur l’ARN.

Introduction

Le transfert de l’information génétique de l’ADN aux protéines à travers les ARNm est un processus biochimique complexe, qui est régulé avec précision à tous les niveaux par des interactions macromoléculaires à l’intérieur des cellules. Pour la régulation translationnelle, les interactions ARN-protéine confèrent un rôle essentiel pour réagir rapidement à divers stimuli et ^signaux1,2. Certaines interactions ARN-protéine affectent la stabilité de l’ARNm et modifient ainsi le temps pendant lequel un ARN est actif sur le plan translationnel. D’autres interactions ARN-protéine sont associées à des mécanismes de rec....

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Clonez la séquence d’intérêt dans le vecteur contenant les fragments d’ADN Lambda, qui servent de séquences de poignée (Figure 2)^43,50.
2. Générez d’abord un modèle d’ADN pour une transcription in vitro ultérieure par PCR (Figure 2B; réaction 1). À cette étape de PCR, le promoteur T7 est ajouté à l’extrémité 5' de la molécule d’ADN sensorielle32,33,43,50.

Résultats

Dans cette section, l’accent est principalement mis sur les mesures des interactions ARN-protéine/ligand par les pinces optiques à fluorescence. Pour une description des expériences générales de pinces optiques à ARN et des résultats représentatifs correspondants, voir ³². Pour une discussion plus détaillée des interactions ARN/ADN-protéine, voir également 1,2,26,59,60.<.......

Discussion

Ici, nous démontrons l’utilisation de pinces optiques couplées à la fluorescence pour étudier les interactions et le comportement dynamique des molécules d’ARN avec divers ligands. Ci-dessous, les étapes critiques et les limites de la technique actuelle sont discutées.

Étapes critiques du protocole
Comme pour beaucoup d’autres méthodes, la qualité de l’échantillon est essentielle pour obtenir des données fiables. Par conséquent, pour obtenir des échantillons de la plus haut.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souches bactériennes
E. coli HB101	collection de laboratoire	/A	clonage des vecteurs
Produits chimiques et enzymes
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	31424	Tampons
Biotine-16-dUTP	Roche	11093070910	Biotinylation
BSA	Sigma-Aldrich	A4737	Tampons
Catalase	Lumicks	N/A	Système de cavanger
à oxygène Dithiothreitol (DTT)	Melford Labs	D11000	Tampons
DNAse I du pancréas bovin	Sigma-Aldrich	D4527	transcription in vitro
dNTPs	Th.Geyer	11786181	PCR
EDTA	Tampons Sigma-Aldrich	E9884
Formamide	Tampons	11814320001	Sigma-Aldrich
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	Système de cavage d’oxygène
Glucose-oxydase	Lumicks	N/A	Système de cavage d’oxygène
HEPES	Carl Roth	HN78.3	Tampons
Chlorure de magnésium	Carl Roth	2189.1	Tampons
Phusion ADN polymérase	NEB	M0530L	Gibson assemblage, clonage
Chlorure de potassium	Merck	529552-1KG	Tampons
PrimeSTAR GXL ADN POLYMÉRASE	Takara Bio Clontech	R050A
PCR Pyrophosphotase, thermostabile, inorganique	NEB	M0296L	transcription in vitro
Inhibiteur de la RNase	Molox	1000379515	Buffers
rNTPS	life technologies	R0481	transcription in vitro
Thiosulophate de sodium	Sigma-Aldrich	S6672-500G	Désactivation de l’eau de Javel
Sytox Green	Lumicks	N/A	mesures confocales
T4 ADN polymérase	NEB	M0203S	Biotinylation
T5 exonucléase	NEB	M0363S	Gibson assemblage, clonage
ARN polymérase T7	Produit en interne	N/A	Transcription in vitro
Taq ADN polymérase	NEB	M0267S	PCR
Taq ligase	Biozym	L6060L	Gibson assemblage, clonage
TWEEN 20 BioXtra	Sigma-Aldrich	P7949	Tampons
Kits
Kit de marquage des protéines monolithiques RED-NHS 2e génération (réactif aux amines)	Nanotemper	MO-L011	Utilisé pour le marquage des ribosomes
Purefrex 2.0	GeneFrontier	PF201-0.25-EX	Ribosomes utilisés pour le marquage
Oligonucleotides
5' poignée T7 commande	personnalisée		Microsynth avant5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', utilisé pour générer un modèle de transcription in vitro OT en PCR 1
3' poignée Microsynth inverse		ordre personnalisé	5' -  ; GTCAAAGTGCGCCCCCCTTATCC - 3', utilisé pour générer un modèle de transcription OT in vitro en PCR 1
Poignée de 5' en commande	personnalisée	Microsynth	5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , utilisé pour générer une poignée de 5' en PCR 2
Poignée de 5' Microsynth inverse		personnalisé	5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', utilisé pour générer une poignée de 5' en PCR 2
Poignée 3' avant	Microsynth	commande personnalisée	5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', utilisé pour générer poignée 3' en PCR 3
3' poignée inversée 5' étiqueté avec de la digoxigénine	Microsynth	ordre personnalisé	5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', utilisé pour générer la poignée 3' dans les
vecteurs PCR 3<>ADN
pMZ_OT	produit en interne	N/A	description plus détaillée dans « Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035 ; doi :
https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035Software and Algorithms
Atom	https://atom.io/packages/ide-python	N/A
Bluelake	Lumicks	N/A
Graphpad	https://www.graphpad.com/	N/A
InkScape 0.92.3	https://inkscape.org/	N/A
Matlab	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	N/A
POTATO		N/A
RNAstructure	https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html	N/A
Spyder	https://www.spyder-ide.org/	N/A
Other
Particules de polystyrène enrobées de streptavidine, 1,5-1,9 & micro ; m, 5 ml, 1,0 % p/v	Spherotech	SVP-15-5
Particules de polystyrène enrobées d’anti-digoxigénine, 2.0-2.4 & micro ; m, 2 ml, 0,1 % p/v	Spherotech	DIGP-20-2
Seringues	VWR	TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap	Lumicks	N/A	; Pince à épiler couplée à la microscopie confocale

N avant ordre https://github.com/lpekarek/POTATO.git