Summary
경화 중 치과용 시멘트의 수축은 베이스 플레이트를 대체합니다. 이 프로토콜은 베이스 플레이트를 시멘트로 만들 공간을 남기는 치과용 시멘트의 초기 기초를 만들어 문제를 최소화합니다. 몇 주 후, 베이스 플레이트는 새 시멘트를 거의 사용하지 않고 이 비계의 위치에 접합될 수 있으므로 수축을 줄일 수 있습니다.
Abstract
신경 과학자들은 미니어처 현미경 (미니 스코프)을 사용하여 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 관찰합니다. 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 미니스코프 팀은 연구원들이 미니스코프를 직접 만들 수 있는 개방형 리소스를 제공합니다. V3 UCLA 미니스코프는 현재 사용 중인 가장 인기 있는 오픈 소스 미니스코프 중 하나입니다. 표재성 피질에 이식 된 대물 렌즈 (1 렌즈 시스템)를 통해 유전자 변형 뉴런에서 방출되는 형광 과도 현상의 이미징을 허용하거나 심부 뇌에 이식 된 릴레이 렌즈와 중계 된 이미지를 관찰하기 위해 미니 스코프에 미리 고정 된 대물 렌즈의 조합을 통해 깊은 뇌 영역에서 이미징 할 수 있습니다 (2 렌즈 시스템). 최적의 조건(뉴런이 형광 지표를 발현하고 릴레이 렌즈가 적절하게 이식된 경우)에서도 시멘트 경화 시 베이스 플레이트와 두개골에 부착된 시멘트 사이의 치과용 시멘트의 부피 변화로 인해 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 거리가 변경되어 정렬 불량이 발생하여 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 베이스 플레이트는 미니스코프를 두개골에 장착하고 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 작동 거리를 고정하는 데 도움이 되는 플레이트입니다. 따라서 베이스 플레이트 주변의 치과용 시멘트 부피의 변화는 렌즈 사이의 거리를 변경합니다. 본 프로토콜은 치과용 시멘트의 부피 변화로 인한 오정렬 문제를 최소화하는 것을 목표로 한다. 이 프로토콜은 릴레이 렌즈 이식 중에 치과 용 시멘트의 초기 기초를 구축하여 정렬 불량을 줄입니다. 이식 후 회복 시간은 치과용 시멘트의 기초가 베이스 플레이트를 완전히 경화시키기에 충분하므로 가능한 한 적은 새 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트를 이 비계에 접합할 수 있습니다. 이 기사에서는 미니스코프에 고정된 대물 렌즈로 신경 활동의 이미징을 가능하게 하기 위해 마우스의 베이스플레이팅 전략을 설명합니다.
Introduction
형광 활동 리포터는 민감하고 큰 동적 범위 1,2,3을 갖기 때문에 신경 활동의 이미징에 이상적입니다. 따라서 형광 현미경을 사용하여 신경 세포 활동 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15를 직접 관찰하는 실험이 증가하고 있습니다. ,16. 최초의 소형화된 단광자 형광 현미경(미니스코프)은 2011년 Mark Schnitzer et al.5에 의해 설계되었습니다. 이 미니스코프를 통해 연구자들은 자유롭게 행동하는 동물5(즉, 동물에 대한 물리적 구속, 머리 고정, 진정 또는 마취 없이)에서 소뇌 세포의 형광 역학을 모니터링할 수 있습니다. 현재이 기술은 피질 6,8,15,16과 같은 표면 뇌 영역을 모니터링하는 데 적용될 수 있습니다. 등쪽 해마 8,11,13,14 및 선조체 6,17과 같은 피질 하 영역; 복부 해마 14, 편도체10,18 및 시상 하부 8,12와 같은 심뇌 영역.
최근 몇 년 동안 여러 오픈 소스 미니 스코프가 개발되었습니다.4,5,6,7,11,13,17,19. 미니스코프는 연구원들이 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 미니스코프 팀에서 제공하는 단계별 지침을 따르는 경우 경제적으로 조립할 수 있습니다.4,7,11,13. 신경 활동의 광학 모니터링은 광 투과의 한계에 의해 제한되기 때문에7 관심 있는 뉴런 집단과 함께 중계 GRIN 렌즈(또는 릴레이 렌즈)에서 중계되는 시야를 확대하기 위해 미니스코프 하단에 대물 기울기 굴절률(GRIN) 렌즈(또는 대물 렌즈)를 미리 고정해야 하는 미니스코프가 설계되었습니다.6,7,8,10,16,17. 이 릴레이 렌즈는 표적 뇌 영역의 형광 활동이 릴레이 렌즈의 표면으로 릴레이되도록 표적 뇌 영역에 이식됩니다.6,7,8,10,16,17. 빛의 전체 정현파 주기의 약 1/4이 대물 GRIN 렌즈(~ 0.25피치)를 통해 이동합니다(그림 1A1), 확대된 형광 이미지를 생성합니다.6,7. 대물 렌즈가 항상 미니스코프 하단에 고정되는 것은 아니며 릴레이 렌즈의 이식이 필요하지 않습니다.6,7,11,13,15. 구체적으로, 두 가지 구성이 있습니다 : 하나는 미니 스코프에 고정 대물 렌즈가 있고 하나는 뇌에 이식 된 릴레이 렌즈입니다.8,10,12,14,16 (그림 1B1) 그리고 다른 하나는 탈착식 대물 렌즈가 있습니다.6,7,11,13,15 (그림 1B2). 고정 대물렌즈와 이식된 릴레이 렌즈 조합을 기반으로 한 설계에서 뇌의 형광 신호는 릴레이 렌즈의 상단 표면(그림 1A1)7,8,10,12,14,16. 이어서, 대물 렌즈는 릴레이 렌즈의 상부 표면으로부터 시야를 확대하고 전송할 수 있습니다 (그림 1A2). 반면에 탈착식 대물 GRIN 렌즈 디자인은 더 유연하여 릴레이 렌즈를 뇌에 미리 이식하는 것이 필수가 아닙니다(그림 1B2)6,7,11,13,15. 탈착식 대물 렌즈 디자인을 기반으로 한 미니스코프를 사용할 때 연구원은 여전히 대상 뇌 영역에 렌즈를 이식해야 하지만 대물 렌즈를 이식할 수 있습니다.6,7,11,13,15 또는 뇌의 릴레이 렌즈6,7. 이식을위한 대물 렌즈 또는 릴레이 렌즈의 선택은 연구원이 사용해야하는 미니 스코프 구성을 결정합니다. 예를 들어, V3 UCLA 미니스코프는 탈착식 대물 GRIN 렌즈 디자인을 기반으로 합니다. 연구원은 관심 있는 뇌 영역에 대물 렌즈를 직접 이식하고 "빈" 미니스코프를 대물 렌즈에 장착하도록 선택할 수 있습니다.6,7,11,13,15 (일렌즈 시스템; 그림 1B2) 또는 뇌에 릴레이 렌즈를 이식하고 대물 렌즈가 미리 고정 된 미니 스코프를 장착합니다.6,7 (2 렌즈 시스템; 그림 1B1). 그런 다음 미니스코프는 형광 카메라로 작동하여 유전적으로 암호화된 칼슘 지표에 의해 생성된 신경 형광의 라이브 스트림 이미지를 캡처합니다.1,2,3. 미니스코프를 컴퓨터에 연결한 후 이러한 형광 이미지를 컴퓨터로 전송하여 비디오 클립으로 저장할 수 있습니다. 연구원은 일부 분석 패키지로 형광의 상대적 변화를 분석하여 신경 활동을 연구할 수 있습니다.20,21 또는 향후 분석을 위해 코드를 작성하십시오.
V3 UCLA 미니스코프는 사용자가 1렌즈 또는 2렌즈 시스템으로 뉴런 활동을 이미지화할지 여부를 결정할 수 있는 유연성을 제공합니다7. 기록 시스템의 선택은 대상 뇌 영역의 깊이와 크기를 기반으로합니다. 간단히 말해서, 단일 렌즈 시스템은 제조업체가 특정 크기의 대물 렌즈만 생산하기 때문에 표면적(약 2.5mm 깊이) 비교적 큰(약 1.8 x 1.8mm2보다 큼) 영역만 이미징할 수 있습니다. 대조적으로, 2 렌즈 시스템은 모든 표적 뇌 영역에 적용될 수 있습니다. 그러나 베이스 플레이트를 접착하기 위한 치과용 시멘트는 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 거리가 변경되어 정렬 불량을 일으켜 이미지 품질이 저하되는 경향이 있습니다. 2렌즈 시스템을 사용하는 경우 최적의 이미징 품질을 달성하기 위해 두 개의 작동 거리를 정밀하게 타겟팅해야 합니다(그림 1A). 이 두 가지 중요한 작동 거리는 릴레이 렌즈의 뉴런과 하단 표면 사이, 릴레이 렌즈의 상단 표면과 대물 렌즈의 하단 표면 사이입니다(그림 1A1). 작동 거리 밖에서 렌즈가 잘못 정렬되거나 잘못 배치되면 이미징 오류가 발생합니다(그림 1C2). 반면, 단일 렌즈 시스템은 단 하나의 정확한 작동 거리만 필요합니다. 그러나 대물 렌즈 크기는 심뇌 영역 모니터링에 대한 적용을 제한합니다 (미니 스코프에 맞는 대물 렌즈는 약 1.8 ~ 2.0mm 6,11,13,15). 따라서, 대물 렌즈의 이식은 마우스 11,13에서 피질 6,15 및 등쪽 각막 암모니스 1 (CA1)과 같은 표면 및 비교적 큰 뇌 영역의 관찰을 위해 제한된다. 또한, 피질의 넓은 영역은 등쪽 CA111,13을 표적으로 삼기 위해 흡인되어야합니다. 심부 뇌 영역의 이미징을 방지하는 단일 렌즈 구성의 한계로 인해 상용 미니스코프 시스템은 결합된 대물 렌즈/릴레이 렌즈(2개 렌즈) 설계만 제공합니다. 반면에 V3 UCLA 미니 스코프는 대물 렌즈가 탈착식 6,11,13,15이기 때문에 1 렌즈 또는 2 렌즈 시스템으로 수정할 수 있습니다. 즉, V3 UCLA 미니 스코프 사용자는 탈착식 렌즈를 뇌에 이식 (단일 렌즈 시스템 생성), 표면 뇌 관찰 (깊이 2.5mm 미만)과 관련된 실험을 수행 할 때 또는 미니 스코프에 미리 고정하고 뇌에 릴레이 렌즈를 이식하여 (2 렌즈 시스템 생성) 활용할 수 있습니다. 심뇌 관찰과 관련된 실험을 수행 할 때. 2 렌즈 시스템은 뇌를 표면적으로 관찰하는 데에도 적용 할 수 있지만 연구원은 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 정확한 작동 거리를 알아야합니다. 단일 렌즈 시스템의 주요 장점은 두 렌즈 시스템에서 최적의 이미징 품질을 달성하기 위해 정확하게 타겟팅해야 하는 두 개의 작동 거리가 있기 때문에 두 렌즈 시스템보다 작동 거리를 놓칠 가능성이 적다는 것입니다(그림 1A). 따라서 피상적 인 뇌 관찰을 위해 단일 렌즈 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 실험에 심뇌 영역의 이미징이 필요한 경우 연구원은 두 렌즈의 정렬 불량을 피하는 방법을 배워야합니다.
실험용 미니스코프의 2렌즈 구성을 위한 기본 프로토콜에는 렌즈 이식 및 베이스플레이팅 8,10,16,17이 포함됩니다. 베이스플레이팅은 미니스코프를 동물의 머리 위에 장착하고 뉴런의 형광 신호를 비디오테이프로 녹화할 수 있도록 하는 베이스 플레이트를 동물의 머리에 붙이는 것입니다(그림 1B). 이 절차에는 치과용 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트를 두개골에 붙이는 것이 포함되지만(그림 1C), 치과용 시멘트의 수축은 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈(8,17) 사이의 거리에 허용할 수 없는 변화를 일으킬 수 있습니다. 두 렌즈 사이의 이동 거리가 너무 크면 셀에 초점을 맞출 수 없습니다.
미니스코프를 사용한 심부 뇌 칼슘 영상 실험에 대한 자세한 프로토콜이 이미 발표되었습니다.8,10,16,17. 이러한 프로토콜의 작성자는 Inscopix 시스템을 사용했습니다.8,10,16 또는 다른 주문을 받아서 만들어진 디자인17 바이러스 선택, 수술 및 베이스 플레이트 부착에 대한 실험 절차를 설명했습니다. 그러나 프로토콜은 V3 UCLA Miniscope 시스템, NINscope와 같은 다른 오픈 소스 시스템에 정확하게 적용될 수 없습니다.6, 및 핀치스코프19. 베이스 플레이트를 두개골에 접합하는 데 사용되는 치과 용 시멘트의 유형으로 인해 UCLA Miniscope를 사용하여 두 렌즈 구성으로 기록하는 동안 두 렌즈의 정렬 불량이 발생할 수 있습니다.8,17 (그림 1C). 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈 사이의 거리가 베이스도금 절차 동안 치과용 시멘트의 바람직하지 않은 수축으로 인해 이동하기 쉽기 때문에 본 프로토콜이 필요합니다. 베이스 도금 중에 미니스코프와 릴레이 렌즈 상단 사이의 거리를 조정하여 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈 사이의 최적 작동 거리를 찾아야 하며, 그런 다음 베이스 플레이트를 이 이상적인 위치에 접착해야 합니다. 대물 렌즈와 이식된 릴레이 렌즈 사이의 정확한 거리가 설정되면 셀룰러 해상도(그림 1B; in vivo 녹음). 릴레이 렌즈의 최적 작동 거리 범위가 작기 때문에(50 - 350 μm)4,8경화 중 과도한 시멘트 수축으로 인해 대물 렌즈와 이식된 릴레이 렌즈를 적절한 범위 내로 유지하기 어려울 수 있습니다. 이 보고서의 전반적인 목표는 수축 문제를 줄이기위한 프로토콜을 제공하는 것입니다.8,17 이는 베이스도금 절차 중에 발생하고 2렌즈 구성에서 형광 신호의 미니스코프 기록 성공률을 높이기 위한 것입니다. 성공적인 미니스코프 기록은 자유롭게 행동하는 동물에서 개별 뉴런의 형광에서 눈에 띄는 상대적 변화를 실시간으로 기록하는 것으로 정의됩니다. 치과용 시멘트 브랜드마다 수축률이 다르지만 연구원은 이전에 테스트한 브랜드를 선택할 수 있습니다.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. 그러나 의료 재료에 대한 수입 규정으로 인해 일부 국가/지역에서 모든 브랜드를 쉽게 구할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서 우리는 사용 가능한 치과용 시멘트의 수축률을 테스트하는 방법을 개발했으며, 중요하게는 수축 문제를 최소화하는 대체 프로토콜을 제공합니다. 현재의 베이스도금 프로토콜에 비해 장점은 실험실에서 쉽게 얻을 수 있는 도구 및 시멘트를 사용한 칼슘 이미징의 성공률이 증가한다는 것입니다. UCLA 미니스코프가 예제로 사용되지만 프로토콜은 다른 미니스코프에도 적용할 수 있습니다. 이 보고서에서는 최적화된 베이스플레이팅 절차에 대해 설명하고 UCLA 미니스코프 2렌즈 시스템(그림 2A). UCLA 미니 스코프를 사용한 2 렌즈 구성에 대한 성공적인 이식 예 (n = 3 마우스)와 이식 실패 사례 (n = 2 마우스)가 성공과 실패의 이유에 대한 논의와 함께 제시됩니다.
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Protocol
이 연구에서 수행 된 모든 절차는 국립 대만 대학 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 : NTU-109-EL-00029 및 NTU-108-EL-00158)의 승인을 받았습니다.
1. 치과용 시멘트의 체적 변화 평가
참고: 치과용 시멘트의 부피 변화는 경화 과정에서 발생합니다. 이식 및 베이스 도금 전에 치과용 시멘트의 부피 변화를 테스트합니다. 연구원은 모든 브랜드의 치과용 시멘트를 테스트하고 부피 변화가 가장 적은 브랜드를 사용하여 베이스 플레이트를 시멘트로 만들 수 있습니다. 그림 3에 예가 나와 있습니다.
- 각 치과 용 시멘트 분말 0.5g의 무게를 달아 적절한 용액 (1mL)과 혼합하십시오.
알림: 치과 용 시멘트 지침에서 권장되는 분말 / 액체 비율은 고체 형태를 얻기 위해 0.5g의 분말 대 0.25mL의 용액입니다. 이 테스트 프로토콜은 피펫 팁의 부피 변화를 측정하기 위해 혼합물을 액체 형태로 흡인할 수 있도록 비율을 0.5g/mL로 희석합니다. - 0.1-10μL 피펫 팁을 사용하여 2.5μL의 치과용 시멘트 혼합물을 제거한 다음 피펫 팁을 광경화 접착제로 밀봉합니다.
- 팁을 랙에 놓고 치과 용 시멘트 혼합물의 최상위 수준을 표시하고 40 분 후에 치과 용 시멘트 혼합물의 수준을 측정합니다 (보충 비디오 S1).
- 팁에서 치과용 시멘트 경화 중 레벨 변화를 모니터링하는 것 외에도 남은 건조 치열 시멘트 밀도를 측정합니다. 밀도를 계산하려면 치과용 시멘트의 무게를 측정하고 아르키메데스의 원리로 부피를 측정합니다.
- 간단히 말해서, 남은 마른 치과 용 시멘트를 물이 채워진 컵에 넣고 넘쳐나는 물의 무게를 잰다.
- 아래에 설명 된 모든 프로토콜에 대해 수축이 가장 적은 치과 용 시멘트를 사용하십시오.
2. 마취, 외과적 이식, 바이러스 주입, 더미 베이스플레이팅
- 마취
참고: 본 보고서는 UCLA 미니스코프의 수술 및 베이스도금 절차를 최적화하는 것을 목표로 합니다. 따라서, 표적 뇌 영역을 감염시키기위한 최적의 바이러스 역가가 알려져 있다고 가정되었다. 최적의 바이러스 역가를 찾는 방법은 Resendez 등의 1-5 단계에서 찾을 수 있습니다.8. 바이러스 희석이 최적화되면 외과적 이식을 시작할 수 있습니다.- 마우스를 유도 용기에 넣고 산소를 공급합니다(0.2L/min의 기류 속도에서 100%). 마우스에 5-10 분 동안 산소를 미리 공급하십시오.
- 마우스가 균형을 잃기 시작하고 결국 마취될 때까지 100% 산소(기류 속도: 0.2L/min)와 혼합된 5% 이소플루란을 투여합니다.
- 유도실에서 마우스를 꺼내 아트로핀(0.04mg/kg, 피하 주사)을 주사하여 진통제로 타액과 부프레노르핀(0.03mg/kg, 피하 주사)이 축적되는 것을 방지합니다.
- 마우스의 머리를 면도하십시오.
- 마스크, 멸균 가운 및 장갑을 착용하십시오. 수술을 위해 멸균 공간과 멸균 수술기구를 준비하십시오. 입체 장치에서 마우스의 머리를 안정화시킵니다 (이 단계 동안 3-2.5 % 이소 플루 란으로 마취를 유지하십시오). 진통제 및 마취 절차 후 이어 바가 머리를 단단히 안정 시키는지 확인하십시오. 열 지원을 제공하십시오.
- 머리가 똑바로 놓여 있는지 확인하고 면도 한 머리를 베타 딘으로 멸균 한 다음 머리에 국소 진통제 인 자일로 카인 (10 %)을 뿌립니다.
- 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 바르십시오.
알림: 안구 손상을 예방하기 위해 모든 마취 동안 눈 보호를 위해 안과 연고를 사용하십시오. - 뒷발을 꼬집어 동물의 깊은 통증 반사를 테스트하십시오. 동물이 발 철수 반사를 보이지 않으면 수술 절차를 진행하십시오.
- 두개골의 중간 시상면을 따라 작은 절개를하십시오 (브레그마 앞쪽 약 2mm에서 시작하여 브레그마 뒤쪽 약 6mm로 끝남). 그런 다음 두개골의 결합 조직을 청소하고 세 개의 스테인리스 스틸 나사를 왼쪽 정면 및 정수리 뼈에 고정합니다.
- 이 시점에서 이소 플루 란을 1-2 %로 줄입니다. 전체 수술 과정에서 호흡 속도를 모니터링하십시오. 호흡 속도가 너무 느리면 (동물에 따라 약 1 / s) 이소 플루 란의 농도를 줄이십시오.
- 팁 직경이 0.7mm인 버 드릴을 사용하여 수술용 현미경 또는 실체 현미경으로 릴레이 렌즈 이식을 위한 개두술을 실행합니다. 마이크로 드릴을 사용하여 버 드릴 비트를 잡고 의도 한 원 영역의 윤곽을 그립니다 (종골의 전체 두께는 관통 할 필요가 없습니다).
참고 : 현재 프로토콜에 사용 된 릴레이 렌즈는 직경 1.0mm, 길이 ~ 9.0mm, 피치 1, 작동 거리 범위는 ~ 100μm-300μm입니다. 따라서 개두술의 직경은 1.2mm였습니다.- 경막이 노출 될 때까지 윤곽선을 부드럽게 깊게합니다.
- 3mL 주사기에 3mL의 멸균 식염수를 준비하고 얼음 양동이에서 식힌다. 주사기에서 0.1mL의 식염수로 노출 된 부위를 자주 헹구어 해당 부위를 식히고 열 손상과 출혈을 예방하십시오.
- 27G 바늘로 경막을 가볍게 골라 떼어냅니다.
- 끝에서 27mm 떨어진 1G 무딘 바늘에 표시를하고 렌즈 이식을위한 창을 만들기 위해 뇌의 피질을 조심스럽게 흡인하는 데 사용합니다 8,11,13,17 (그림 2B1). 필요한 경우 사포로 27G 주사 바늘 끝을 갈아서 뭉툭한 바늘을 만듭니다. 그런 다음 바늘을 주사기에 연결하고 주사기를 튜브에 연결하고 튜브를 흡입 소스에 연결하여 진공을 만듭니다.
알림: 릴레이 렌즈는 뭉툭하며 깊은 뇌 영역에 배치될 때 뇌 조직을 압박합니다. 따라서, 피질의 흡인은 릴레이 렌즈 이식으로 인한 조직 손상을 감소시킨다. 피질은 생쥐에서 두께가 약 1mm이지만 실체 현미경으로 시각화하기가 어렵습니다. 이 마크는 실체 현미경만으로 바늘의 깊이를 더 정확하게 결정할 수있는 랜드 마크를 만듭니다. 또한 저항에 따라 피질 영역에 도달했는지 또는 통과했는지 여부를 결정할 수 있습니다. 피질의 윗부분은 상대적으로 부드럽고 피질 하 영역은 밀도가 느껴집니다. 따라서 텍스처가 더 조밀하게 느껴지기 시작하면 흡인을 중지하십시오(그림 2B3). - 3mL 주사기에 3mL의 멸균 식염수를 준비하고 얼음 양동이에서 식힌다. 출혈을 멈추고 뇌부종의 가능성을 줄이기 위해 식염수로 해당 부위를 헹굽니다.
- 아데노 관련 바이러스(AAV) 주사
참고 : AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE가 본 실험에 사용되었습니다. jGCaMP7s는 녹색 형광을 방출하는 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표입니다3. 본 연구에서는 야생형 마우스를 대상으로 사용했기 때문에 녹색 형광 칼슘 지표 유전자로 뉴런을 형질감염시키고 발현을 활성화하기 위해 바이러스 벡터가 필요했습니다. 녹색 형광 칼슘 지표를 발현하는 형질 전환 마우스를 대상으로 사용하는 연구원은 프로토콜 2.2를 건너 뛸 수 있습니다.- 20G 정맥 주사(i.v.) 카테터의 내부 바늘을 정위 팔에 장착하고 적절한 좌표(릴레이 렌즈 이식 중에 사용되는 것과 동일한 좌표)에서 뇌를 천자(~100 - 200μm/min)합니다(그림 2B3).
- 미세 주입 바늘을 복부 CA1에 100-200 μm / min의 속도로 내리고 200 nL의 바이러스 벡터를 표적 영역 (-3.16 mm AP, 3.25 mm ML 및 -3.50 mm DV로 주입 (~ 25 nL / 분)합니다.
- 바이러스가 확산되고 역류를 최소화하기 위해 10분 동안 기다리십시오.
- 미세 주입 바늘을 빼냅니다(~100-200μm/분).
- 릴레이 렌즈 이식
- 릴레이 렌즈를 75% 알코올10,16으로 소독한 다음 발열원이 없는 식염수로 헹굽니다. 이식 될 때까지 차가운 발열원이없는 식염수에 렌즈를 담그십시오.
참고: 차가운 렌즈는 뇌에 삽입할 때 뇌부종을 최소화합니다. - 톱니가 열수축 튜브로 덮인 마이크로 불독 클램프(그림 2B3)를 사용하여 릴레이 렌즈를 잡습니다.
알림: 불독 클램프는 렌즈를 손상시키지 않고 단단히 고정할 수 있습니다. 튜브로 덮인 불독 클램프를 만드는 방법에 대해서는 Resendez et al.8 을 참조하십시오. - 릴레이 렌즈를 대상 영역(브레그마에서 -3.16mm AP, 3.50mm ML 및 -3.50mm DV) 위에 천천히 배치하고(~100 - 200μm/분) 치과용 시멘트로 안정화합니다.
- 릴레이 렌즈를 75% 알코올10,16으로 소독한 다음 발열원이 없는 식염수로 헹굽니다. 이식 될 때까지 차가운 발열원이없는 식염수에 렌즈를 담그십시오.
- 더미 베이스 도금
참고: 이식 수술 중 "더미 베이스 플레이팅"의 목적은 몇 주 후 실제 베이스 도금 절차 중에 적용해야 하는 치과용 시멘트의 양을 줄이기 위해 치과용 시멘트 베이스를 만드는 것입니다. 이러한 방식으로, 치과용 시멘트의 부피 변화의 위험이 최소화된다.- 대물 렌즈를 미니스코프 바닥에 고정하고 베이스 플레이트를 미니스코프에 조립합니다(이 단계에서는 고정된 대물 렌즈, 베이스 플레이트 및 미니스코프의 어셈블리가 아직 마우스의 두개골 위에 놓이지 않았습니다).
- 베이스 플레이트 외부에 10cm의 파라핀 필름을 감습니다(그림 4A).
- 재사용 가능한 접착 점토를 사용하여 정위 암 프로브로 미니스코프를 잡습니다.
- 대물 렌즈를 릴레이 렌즈 위에 맞춰 렌즈 사이에 가능한 한 적은 공간을 둡니다(그림 4B).
- 치과용 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트의 위치를 고정합니다(시멘트가 파라핀 필름에만 닿도록).
- 치과 용 시멘트가 마르면 필름을 제거하십시오.
- 조립판과 미니스코프를 제거합니다. 치과용 시멘트 베이스는 속이 비어 있습니다(그림 4B).
- 릴레이 렌즈를 일상적인 활동과 마우스에 의해 긁히지 않도록 보호하려면 릴레이 렌즈가 덮일 때까지 일부 몰딩 실리콘 고무로 릴레이 렌즈를 밀봉하고 실리콘 고무를 얇은 치과용 시멘트 층으로 덮습니다(그림 4B).
- 입체 기구에서 마우스를 분리하고 마우스를 회복실에 넣습니다.
- 감염을 예방하기 위해 진통제 및 세프 타지 딤 (25mg / kg, 피하 주사)에 카프로 펜 (5mg / kg, 피하 주사) 또는 멜 록시 캄 (1mg / kg, 피하 주사)을 주사하십시오.
참고: 항생제 사용은 무균 기술의 대안이 아닙니다. 수술 전후 항생제 (즉, ceftazidime)는 장기 수술 또는 만성 임플란트 배치와 같은 특정 상황에서 표시 될 수 있습니다. - 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 관찰하십시오.
- 하우스 마우스에 개별적으로 멜록시캄(1mg/kg, 피하 주사, q24h)을 일주일 동안 주사하여 수술 후 통증을 완화합니다. 수술 후 매일 동물을 확인하여 정상적으로 먹고, 마시고, 배변하고 있는지 확인하십시오.
- 3 주 이상 후에 기본 도금을 수행하십시오.
3. 베이스 도금
참고: 일반적으로 기본 도금 절차(그림 5)는 회복 및 바이러스 배양 시간으로 인해 초기 절차 후 2-3주 이내에 수행할 수 없습니다. 베이스플레이팅을 위한 유도 절차는 2.1.1 내지 2.1.8단계에서 설명한 것과 유사하다. 그러나, 기초 도금은 침습적 인 절차가 아니며, 동물은 가벼운 진정 작용 만 필요합니다. 따라서 동물이 정위 프레임에서 움직일 수없는 한 0.8-1.2 % 이소 플루 란으로 충분합니다. 또한, 비교적 가벼운 이소플루란 마취는 또한 모니터링동안 뉴런의 형광 과도 상태의 발현을 촉진하는 것을 도울 수 있다 8 (보충 비디오 S2).
- 뼈 rongeur로 치과 용 시멘트 지붕의 얇은 층을 조심스럽게 자르고 실리콘 고무를 제거하십시오. 릴레이 렌즈 표면을 75% 알코올로 청소합니다.
- 조립판 옆에 고정 나사를 고정하여 미니스코프 바닥에 고정합니다(그림 5A1).
알림: 베이스 플레이트는 조여진 베이스 플레이트와 가볍게 고정된 베이스 플레이트의 차이로 인해 거리가 일정하지 않을 수 있으므로 미니스코프 하단 아래에 단단히 조여야 합니다. - 초점 슬라이드를 주 하우징에서 약 2.7 - 3mm 떨어진 곳으로 조정합니다(그림 5A2).
참고: 베이스 도금 절차 중에 길이를 추가로 조정할 수 있지만 미니스코프 길이와 이식된 릴레이 렌즈와 사전 고정된 대물 렌즈 사이의 최적 길이를 동시에 조정하는 것은 매우 혼란스럽기 때문에 약 2.7mm로 고정하십시오. - 미니스코프를 데이터 수집 보드에 연결하고 컴퓨터의 USB 3.0(또는 버전 이상) 포트에 연결합니다.
- UCLA 팀에서 개발한 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다.
- 노출을 255로, 게인을 64x로, 여기 LED를 5%로 조정합니다. 이러한 설정은 초기 베이스 도금에 권장됩니다. 구체적인 설정은 뇌 영역과 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표의 발현 수준에 따라 달라집니다.
- 연결 버튼을 클릭하여 미니스코프를 데이터 수집 소프트웨어에 연결하고 라이브 스트림을 시청합니다.
- 미니스코프 대물 렌즈를 릴레이 렌즈에 손으로 정렬하고 형광 신호 검색을 시작합니다(그림 5B1).
참고: 처음에는 형광 신호를 수동으로 검색하면 조정이 용이합니다. AAV 시스템이 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약을 발현하기 위해 사용되었기 때문에, 프로모터 유형 및 AAV 혈청형 모두 형질감염23,24의 효율에 영향을 미쳤다. 연구자들은 향후 실험을 진행하기 전에 형광의 변화를 보여주는 개별 뉴런을 찾아 칼슘 지표의 발현을 확인해야 합니다. - 미니 스코프를 막는 곳에 치과 용 시멘트를 뚫습니다 (선택 사항).
- 데이터 수집 소프트웨어의 라이브 스트림을 시청하고 릴레이 렌즈의 여백을 랜드마크로 사용하십시오(보충 비디오 S2). 릴레이 렌즈의 여백은 모니터에서 달과 같은 회색 원으로 나타납니다(그림 5B1, 흰색 화살표).
- 릴레이 렌즈가 발견되면 형광 신호가 발견 될 때까지 미니 스코프의 다양한 각도와 거리를 조심스럽게 조정하십시오.
참고: 뉴런의 이미지는 배경보다 흰색입니다. 정확한 뉴런 모양은 뉴런이 릴레이 렌즈의 초점면에 완벽하게 놓여 있음을 나타냅니다. 둥근 뉴런은 초점면 근처에 있었음을 시사합니다. 신경 모양은 뇌 전체에 걸쳐 다르며 여기서는 복부 CA1이 예로 표시됩니다. - 개별 뉴런이 시간의 함수로 형광 변화를 나타내지 않으면 실리콘 고무로 베이스를 다시 밀봉합니다. 형광은 잠복기가 바이러스23,24의 특성에 의존하기 때문에 관찰되지 않습니다. 추가 일주일 후에 3.1-3.12단계를 수행합니다. (선택 사항입니다).
- 미니스코프를 최적의 위치에 놓고 재사용 가능한 접착 점토가 있는 스테레오택시 암을 미니스코프 쪽으로 이동합니다(그림 5B2). 미니스코프를 재사용 가능한 접착 점토로 입체 팔에 부착하십시오.
- x, y 및 z 암을 약간 조정하여 최상의 보기를 검색합니다(보조 비디오 S2). 그런 다음 z축에서 이어바, 톱니 바 또는 재사용 가능한 접착 점토를 돌려 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 표면 사이의 각도를 조정합니다. 바이러스 발현 및 수정체 이식은 적어도 하나의 세포가 형광 과도 현상을 나타낼 때 성공적이다 (도 6A; 보충 비디오 S2) 베이스 도금 중 (CA1과 같은 뇌 영역에 따라 다름).
주: 모니터에 흰색 셀만 표시되고 과도 상태는 표시되지 않으면 다른 원인이 있는 것입니다(그림 6B, C, 보충 비디오 S4, S5, 결과 섹션 및 문제 해결 섹션 참조). - 베이스 플레이트(그림 5B2)를 치과용 시멘트로 시멘트로 만듭니다.
- 접합 중에 관심 영역을 모니터링하여 최적의 위치가 변경되지 않는지 확인하십시오.
- 베이스 플레이트를 치과용 시멘트 베이스에 단단히 접착하면서 가능한 한 적은 양의 시멘트를 사용합니다(그림 5B2). 베이스 플레이트 주위에 두 번째 및 세 번째 시멘트 층을 바르되 GRIN 렌즈에 영향을 미치지 않도록 주의하십시오.
알림: 베이스 플레이트에 시멘트를 적용하는 것은 더미 도금 절차 중에 베이스 플레이트의 베이스가 형성되었기 때문에 이 단계에서 더 쉽습니다. - 시멘트가 경화 될 때베이스 플레이트에서 미니 스코프를 조심스럽게 분리하십시오. 그런 다음 보호 캡을 조입니다.
- 동물을 회복 케이지로 옮깁니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 관찰하십시오.
- 하우스 마우스 개별적으로. 매일 정상적으로 먹고, 마시고, 배변하고 있는지 확인하십시오. 마우스가 완전히 회복 될 때까지 5 일 동안 기다린 다음 칼슘 이미징을 확인하십시오.
알림: 베이스 플레이트를 고정하는 치과용 시멘트는 소량뿐입니다. 따라서 베이스 도금 절차 이후 베이스 플레이트가 상당히 이동한 경우 드릴로 치과용 시멘트를 제거하고 베이스 도금 절차를 다시 수행하십시오. - 모든 실험이 완료되면 케타민 (87 mg / kg) / 자일 라진 (13 mg / kg) 혼합물의 복강 내 주사에 의하여)하고 동물을 마취시키고25 동물을 관류합니다.
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Representative Results
치과용 시멘트 부피 변화 평가
경화 과정에서 치과용 시멘트의 부피가 변하기 때문에 GRIN 렌즈의 작동 거리가 약 50-350μm인경우 이미징 품질에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다4,8. 따라서이 경우 Tempron과 Tokuso라는 두 개의 시판 치과 용 시멘트가 이식 및베이스 도금 절차 전에 테스트되었습니다 (그림 5). 비디오를 먼저 평가하여 시멘트가 수축되었는지 확인한 다음 완전히 건조되었을 때 시멘트의 부피를 비교했습니다. 치과용 시멘트의 초기 혼합물의 동일한 농도와 부피를 피펫 팁에 로딩하고 비디오테이프로 녹화하였다(보충 비디오 S1). 비디오 S1은 건조 과정에서 두 시멘트가 모두 수축되었음을 보여주었습니다. Tokuso는 Tempron보다 더 나은 성능을 보였습니다 (즉, 수축 후에도 Tempron보다 더 큰 부피를 가짐) : 그림 3B; 템프론의 평균 부피 : 0.93 ± 0.07 mL; 도쿠소의 평균 부피: 1.18 ± 0.07 mL; t-검정: p = 0.048, t(6) = 2.46, 덜 축소되었음을 시사합니다. 시멘트의 밀도도 완전 건조 후 4회 시험하였다. 도쿠소는 템프론보다 평균 밀도가 낮았고(템프론의 평균 밀도: 1.07 ± 0.12 g/mL; 도쿠소의 평균 밀도: 0.93 ± 0.08 g/mL; t-검정: p = 0.38, t(6) = -0.94), 이는 수축률이 더 낮았음을 의미합니다. 따라서, Tokuso는 다음의 이식 및 베이스도금 단계에 사용되었다. 위의 실험을 설명하는 목적은 브랜드를 추천하는 것이 아니라 실험자에게 경화시 상당한 부피 변화를 겪지 않는 치과 용 시멘트를 찾도록 상기시키는 것입니다.
이미지 이동 측정
우리는 고정 된 물체에 더미 기초 도금 및 원래 기초 도금 절차를 시뮬레이션하여 더미 기저 도금 절차가베이스 플레이트 위치에서 원래 절차보다 더 작은 이동을 초래하는지 조사했습니다. 광경화 접착제를 사용하여 베이스 플레이트에서 1cm 튀어나온 베이스 플레이트 중앙에 23G 2.5cm 주사기 바늘을 고정했습니다(그림 3C). 그런 다음 정위 도구의 팔로 바늘을 잡고 베이스플레이팅을 시뮬레이션했습니다. 실험실 동물을 사용하는 대신 스티커가 정위 도구의 테이블에 부착되었습니다. 주사기 바늘이 스티커를 뚫어 원래 위치를 나타냅니다. 그런 다음 바늘을 0.5mm 높이고 시뮬레이션 수술을 시작했습니다. 일회성 베이스도금 절차8를 모방한 수술에서는 스티커 위 1cm인 베이스 플레이트를 덮을 때까지 치과용 시멘트를 도포했습니다. 그런 다음 시멘트가 경화될 때까지 2시간 동안 기다렸다가 바늘을 부드럽게 밀어 스티커를 다시 뚫었습니다. 광경화 접착제가 바늘을 완전히 안정화시키지 못했기 때문에 바늘을 더 깊이 밀어 넣어 치과용 시멘트가 건조된 후 베이스 플레이트의 위치를 나타내는 또 다른 구멍을 만들 수 있었습니다. 바늘의 위치 이동을 정량화하기 위해 초기 구멍과 두 번째 구멍 사이의 거리를 측정했습니다. 결과는 두개골 위 1cm의베이스 플레이트가 1.76 ± 0.14 mm 위치 이동을 초래했지만 더미 베이스 플레이팅은 0.75 ± 0.17 mm의 이동만을 초래했음을 입증했습니다 (그림 3D, 1 회 베이스 도금 대 더미 베이스 플레이팅의 평균 이동 거리; t- 검정 : p < 0.01, t (8) = 6.03).
또한 치과용 시멘트의 높이가 이동에 영향을 미치는지 궁금했습니다. 따라서 일회성 기본 도금 절차를 사용하여 더 짧은 높이 (그림 3E, 0.5cm 위)를 추가로 테스트했습니다. 두개골 위 0.5cm에 고정된 베이스 플레이트는 두개골 위 1cm 베이스 플레이트보다 훨씬 적게 이동했습니다(그림 3F, 평균 이동 거리: 0.43 ± 0.11 대 1.76 ± 0.14mm, t-검정: p < 0.01, t(8) = 9.73). 데이터에 따르면 두개골 위의 바닥판 높이와 바닥판이 이동한 거리는 양의 상관관계가 있었습니다. 더미 베이스플레이팅 절차 다음에는 최소한의 치과용 시멘트만 사용하는 두 번째 베이스플레이팅 단계가 따르기 때문에 이 데이터는 더미 베이스플레이팅이 베이스플레이팅 절차의 정밀도를 개선하는 데 도움이 된다는 가설도 뒷받침합니다.
2렌즈 미니스코프 시스템을 사용한 이미징
바이러스 주입, 더미 베이스플레이팅 및 베이스플레이팅(그림 2, 그림 4, 그림 5)에 대한 외과적 프로토콜을 따라 베이스도금 절차 중 및 베이스도금 절차 후 마우스가 자유롭게 움직이는 동안 3마리의 마우스(n = 3/5)에서 개별 뉴런의 형광 과도 현상을 관찰했습니다(그림 6A, 보충 비디오 S3) 베이스도금 절차 중 및 베이스도금 절차 후에 대물렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 작동 거리가 동일하게 유지됨을 확인했습니다(그림 6A1 그림 6A3과 비교하여 치과용 시멘트가 완전히 건조된 후 위치의 약간의 이동만 발생했습니다. 여기에서는 마우스 한 마리의 베이스플레이팅(보충 비디오 S2, 마우스 #5)과 마우스가 자유롭게 움직이는 동안의 후속 칼슘 이미징(보충 비디오 S3, 마우스 #3, #4, #5, 원시 데이터)에 대한 비디오를 제공합니다. V3 용 데이터 수집 소프트웨어에는 배경 빼기 기능이 포함되어 있지 않으며 오프라인 처리를 통해 비디오의 대비를 향상시킬 수 있습니다. 보충 비디오 S2의 경우 형광 신호에 대한 수동 검색을 수행한 다음 미세 조정을 위해 미니스코프를 입체 암에 부착했습니다. 프로빙 동안 일부 형광 과도 현상이 관찰되었다(보충 비디오 S2; 그림 6A). 과도 현상은 회색 또는 흰색 반점의 밝기가 부드럽게 이동하는 것이며 깜박이는 빛과 유사한 발사 패턴이 아닙니다. 도 6A도 1 내지 도 6A는 과도 상태의 이미지들을 도시한다. 자유롭게 행동하는 마우스의 비디오는 베이스 도금 절차 동안 관심 영역과 비교하여 허용 가능한 공간 이동을 보여주었습니다(보충 비디오 S3). 이 단계에서는 릴레이 렌즈의 바닥과 활성 뉴런 사이의 거리를 조정할 수 없었기 때문에 세포의 여백을 크게 향상시킬 수 없었습니다. 특히, 균일 한 배경을 제외하고는 아무것도 부재하는 것을 포함하여 기본 도금 절차 중에 일부 문제가 자주 발생할 수 있습니다 (그림 6B; 보충 비디오 S4) 또는 형광 과도 현상이 없는 백혈구 마진의 가시성(그림 6C; 보충 비디오 S5). 부정적인 결과의 두 가지 예도 제공됩니다 (n = 2/5) (그림 6B, C, 보충 비디오 S4, S5). 실패의 잠재적 원인은 토론 섹션에서 검토합니다. 이 두 마우스에 대한 수술 절차는 경로를 비우기 위해 직경 1mm 바늘을 사용하지 않고 수행되었습니다. 따라서, 릴레이 렌즈가 직접 이식되었다. 우리는 마우스 #2에서 릴레이 렌즈가 뉴런을 압축하고 일부 뉴런을 아래로 끌어내려 뉴런이 손상되었을 수 있다고 제안합니다. 따라서, 형광 과도 현상은 발견되지 않았다.
그림 1: 미니스코프의 메커니즘과 일반적으로 이미징 실패를 일으키는 결함 . (A) 릴레이 렌즈와 대물 렌즈의 만화 다이어그램은 2 렌즈 시스템에서 형광 세포를 시각화하는 데 필요한 메커니즘을 보여줍니다. 각 렌즈의 신호파는 형광 세포를 시각화하기 위한 작동 거리를 찾는 데 관련된 메커니즘의 중요성과 메커니즘을 강조합니다. (대답 1) 릴레이 GRIN 렌즈는 작동 거리 내에서 대상 뉴런 위에 배치됩니다. 릴레이 렌즈의 피치가 0.5*N(여기서 N은 정수)이기 때문에 렌즈는 빛을 중계하여 대상 뉴런을 시각화할 수 있으며 원래의 형광 신호를 릴레이 렌즈의 상단으로 가져옵니다. 그런 다음 빛의 전체 정현파 주기의 약 1/4이 대물 GRIN 렌즈(~ 0.25피치)를 통과하여 확대된 이미지를 생성합니다. (대답 2) 대물 렌즈는 이미지를 미니스코프의 상단(다이어그램의 녹색 판)에 있는 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS) 센서로 전송합니다. (B) (B1) 2 렌즈 시스템과 (B2) 1 렌즈 시스템 간의 GRIN 렌즈 이식 절차의 차이점을 보여주는 만화 다이어그램. 일반적으로 가장 큰 차이점은 단일 렌즈 시스템이 대물 렌즈를 직접 사용하여 뇌 표면을 이미지화한다는 것입니다. 결과적으로 대물 렌즈를 표적 뉴런 위에 이식해야 합니다. (C) 대조적으로, 2 렌즈 시스템에서는 추가 릴레이 렌즈가 뇌에 이식되고 대물 렌즈가 미니 스코프에 미리 고정됩니다. (씨1) UCLA 미니스코프 V3 버전의 베이스 플레이트 모양으로 인해 치과용 시멘트가 완전히 건조된 후 고르지 않은 이동이 발생할 수 있습니다. (씨2) 이러한 이동으로 인해 릴레이 렌즈와 대물 렌즈 사이의 작동 거리에서 정렬 불량 또는 편차가 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 2렌즈 미니스코프 시스템의 성공률을 높이기 위해 수정된 프로토콜 및 세부 수술 프로토콜. (대답 1) 2 렌즈 시스템에 대한 수정 된 수술 프로토콜. 바이러스 주입 및 릴레이 GRIN 렌즈 이식의 위치가 표시됩니다. 더미 베이스플레이팅을 사용하면 작동 거리가 관심 뉴런을 정확하게 포함할 수 있으며 (A2) 베이스플레이팅 절차와 관련된 위치 이동이 줄어듭니다. 따라서, (A3) 자유롭게 행동하는 마우스에서 형광 세포를 이미징할 확률이 증가된다. (b) 바이러스 주입 및 중계 GRIN 렌즈 배치를 위한 단계의 만화 이미지. (나1) 먼저 피질 흡인 깊이 평가를 돕기 위해 끝에서 약 1mm (마우스 실험의 경우)의 펜으로 흡인 바늘을 표시하십시오. 그런 다음 뇌에서 결합 조직과 피질 (마우스에서 약 1mm 깊이)을 흡인합니다. (나2) 복부 해마를 대상 영역으로 사용하여 릴레이 렌즈를 이식합니다. 특히, 거친 뇌량은 피질 영역의 흡인을 멈추는 랜드 마크입니다. 뇌량의 섬유질 질감은 흡인 중에 실체 현미경으로 볼 수 있습니다. (나3) 둘째, 20G 카테터(직경 약 1mm, 직경은 릴레이 렌즈와 유사)의 내부 바늘로 관심 지점을 뚫어 바이러스 주입 전에 경로를 제거합니다. 실체 현미경에서 바늘로 만든 움푹 들어간 곳 (그림의 점선 원)이 보여야합니다. 미세 주입 바늘과 릴레이 렌즈를 덴트 (또는 덴트 중심에서 250μm 떨어진 곳)에서 내립니다. 마지막으로 릴레이 GRIN 렌즈를 놓습니다(본 연구에서는 직경 1mm의 릴레이 렌즈를 사용했습니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 경화된 치과용 시멘트의 부피 변화 측정 . (A) 두 브랜드의 경화 치과 용 시멘트의 예. 검은 색 화살표는 분말과 용액을 혼합 한 후의 원래 수준을 나타냅니다. 흰색 화살표는 경화 10분, 20분, 40분 후의 수준을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 광경화 접착제로 밀봉 된 팁의 바닥을 가리 킵니다. (B) 완전히 건조 된 후 남아있는 치과 용 시멘트의 평균 부피. 막대와 오차 막대는 SEM± 수단입니다. *는 스튜던트 t-검정에 의해 결정된 유의성(P < 0.05)을 나타냅니다. (c) 베이스 플레이트의 위치 이동을 측정하기 위해 사용되는 방법을 설명하는 그림 및 사진. 바늘을 베이스 플레이트에 접착하고 원래의 베이스도금 절차(원스텝 베이스플레이팅)와 더미 베이스플레이팅 절차를 시뮬레이션하는 데 사용했습니다. 빨간색과 검은색 화살표는 치과용 시멘트가 경화되기 전과 후의 바늘 위치를 나타냅니다. (D) 바늘 끝의 평균 거리 변화 (E) 두개골 높이 이상의베이스 플레이트와 위치 이동 사이의 관계를 측정하는 데 사용 된 방법의 그림. (F) 바늘 끝의 평균 거리 변화. 막대와 오차 막대는 SEM± 수단입니다. **는 스튜던트 t-검정에 의해 결정된 유의성(P < 0.01)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 상세한 더미 베이스도금 절차(릴레이 렌즈 이식 직후 실행). (A1) 대물 렌즈, 베이스 플레이트 및 파라핀 필름 조립을 미니스코프로 만든 3단계 만화. (대답 2) 어셈블리의 사진 버전. (나1) 더미 베이스 도금 절차를 보여주는 만화. 먼저, 조립 된 미니 스코프가 릴레이 렌즈와 정렬됩니다. 대물 렌즈는 가능한 한 릴레이 렌즈에 가깝습니다. 둘째, 치과용 시멘트를 베이스 플레이트를 둘러싼 파라필름에 첨가하고 두개골에 도포하여 향후 베이스플레이팅을 위한 암형 몰드를 만듭니다. 그런 다음 베이스 플레이트를 제거하고 성형 실리콘 고무(분홍색)를 추가하고 치과용 시멘트를 얹어 암 금형과 릴레이 렌즈를 보호합니다. 그런 다음 동물은 마취에서 회복 할 수 있습니다. 최소 3 주 후,베이스 도금 절차가 수행됩니다. (나2) (B1)의 사진 버전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 베이스도금 절차 단계. (대답 1) 베이스 플레이트를 부착하고 (A2) 초점 슬라이더를 2.7-3mm로 수동으로 조정합니다. 2.7-3mm(그림에 표시된 위치)의 설정은 형광 세포를 수동으로 검색하기 전에 시작하기에 가장 좋은 위치인 것 같습니다. (나1) 첫 번째 만화 다이어그램은 형광 세포의 시각화를 위해 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 길이의 중요성을 보여줍니다 (형광 세포는 일반적으로 0.5mm에서 2mm 사이의 거리에서 관찰됩니다). 형광 세포가 나오기 전에 연구원은 릴레이 렌즈의 여백(상단 그림의 화살표)을 확인해야 합니다. 손으로 빠르게 조정하는 것이 더 쉽기 때문에 먼저 렌즈를 최적의 보기 위치로 수동으로 조정하는 것이 도움이 됩니다. (나2) 재사용 가능한 접착 점토를 정위 암 프로브에 놓은 다음 재사용 가능한 접착 점토로 팔에 부착하여 미니스코프를 안정화합니다. 이 단계에서 관심 영역이 이동했을 수 있지만 스테레오 택스 암과 재사용 가능한 접착 점토를 약간 조정하여 쉽게 고칠 수 있습니다. 최적의 관심 영역을 확인하고 찾은 후 소량의 치과 용 시멘트 (빨간색으로 표시)를 추가하십시오. 베이스 플레이트를 가능한 한 적은 치과 용 시멘트로 붙입니다. 치과용 시멘트가 건조된 후 미니스코프와 베이스 플레이트를 분리합니다. 베이스 플레이트가 충분히 안정적이지 않으면 치과용 시멘트를 추가하십시오. (C)이 다이어그램은 성공을 달성하기위한 모든 단계의 중요성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 베이스도금 절차 중 성공 및 실패의 예. (A) 베이스도금 절차 중 성공적인 이미징의 예. 릴레이 렌즈는 복부 해마를 겨냥했습니다. 동물이 이소플루란으로 마취되었을 때 형광 과도 현상이 발견되었습니다(보충 비디오 S2 참조). (대답 2) 더 나은 가시성을 위해 대비가 증가했습니다. 빨간색 점선은 혈관을 나타냅니다. (대답 3) 형광 과도 현상은 베이스플레이팅 후 5일 후에 마우스가 홈케이지에서 자유롭게 행동할 때 나타납니다(보충 비디오 S3 참조, 마우스 #3 및 #4의 이미지도 보충 비디오 S3에 제공됨). 약간의 위치 이동 만 발생했습니다. (나1) 실패의 예입니다. 베이스 도금 중에 모양이 세포와 같지 않은 균일한 흰색/회색 영역만 발견되었습니다(보충 비디오 S4 참조). (나2) 릴레이 렌즈는 대상 영역을 놓쳤고 감염된 세포가 없는 영역 위에 위치했습니다. (씨1) 실패의 또 다른 예입니다. 이 마우스에서는 많은 둥근 세포가 관찰되었지만 기저 도금 동안 형광 과도 현상이 관찰되지 않았습니다 (배양 3 주 후 마우스가 마취 / 진정되는 동안). 또한, 염기 도금 절차를 다시 수행 할 때 (배양 5 주째) 또는 동물이 자유롭게 행동 할 때에도 형광 과도 현상이 발생하지 않았습니다. 이미지는 배양 5주차에 기저도금 동안 얻어졌다(보충 비디오 S5 참조). (C2 및 C3) 릴레이 렌즈는 복부 해마의 피라미드 층을 놓쳤습니다. 파란색 점은 DAPI로 염색 된 핵입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 문제 | 가능한 원인 | 용액 | ||
| 베이스 도금시 이미징이 좋았지 만 다음날 완전히 초점이 맞지 않았습니다. | 피험자의 두개골과 베이스 플레이트 사이의 치과용 시멘트 경화 시 부피 변화 | 본 보고서에 제안된 대로 렌즈 이식 절차 후 "더미 베이스플레이팅"을 진행합니다. 체적 변화가 적은 치과용 시멘트를 선택하십시오. | ||
| 베이스 도금 중에 셀과 같은 모양이없는 균일 한 흰색 / 회색 영역이 있습니다 (보충 비디오 S4 참조). | A. 릴레이 렌즈가 목표 영역을 놓쳤습니다. B. 형광 표시기의 잘못된 표현 C. 형광 표시기가 실제로 표현되는 미니스코프 아래에 대물 렌즈를 설치하는 것을 잊었습니다. | A. 수술을 할 때는 더미 렌즈를 사용하십시오. 이식 연습 후 더미 렌즈의 좌표를 확인하십시오. B. 칼슘 이미징 실험을위한 최적의 바이러스 역가를 찾으십시오 (Resendez et al. 2016 참조). 어떤 이유로 사전 테스트를 수행 할 수없는 경우 초보자는 먼저 더 높은 역가를 시도하는 것이 좋습니다. (자세한 내용은 디스쿠션 섹션 참조) C. 대물 GRIN 렌즈에 나사를 조입니다(~ 0.25피치. 예: 에드먼드 옵틱스; 재고 #64-519) 미니스코프 하단에 있습니다. | ||
| 많은 세포를 관찰하지만 베이스도금 중 형광 역학은 관찰하지 않습니다. | A. 건강하지 않은 뉴런 또는 죽은 뉴런 B. 희소 정제 유형의 뉴런 C. 심부 마취 상태 | A. 모든 수술 절차에 주의하십시오. 릴레이 렌즈의 직경과 유사한 새 주사 바늘을 사용하여 먼저 주입/이식 경로를 절단하여 렌즈 이식으로 압력을 해제합니다. 천천히 바이러스를 주입하고 천천히 렌즈를 이식하십시오. B. 뉴런의 활동을 모니터링하기 위해 더 오랜 시간 동안 기다리거나 꼬리를 약간 꼬집어 마우스를 자극하십시오. C. 기본 도금은 침습적 절차가 아니며 동물은 진정제 만 필요합니다. 따라서 동물이 정위 프레임에서 움직일 수없는 한 1.2 ~ 0.8 % 이소 플루 란을 유지하는 것으로 충분합니다. | ||
표 1: 문제 해결 차트.
보충 비디오 S1: 치과용 시멘트 부피 테스트. 부피의 차이는 치과용 시멘트 준비 초기의 부피와 시멘트 건조 후의 부피의 차이를 측정하였다. 두 가지 브랜드의 치과 용 시멘트 (예 : Tempron 및 Tokuso Curefast)가 테스트되었습니다. 치과용 시멘트가 건조된 후의 부피를 시험하기 위해, 각 치과용 시멘트 분말 0.5g을 칭량하고 적절한 용액(1mL)과 혼합하였다. 이어서, 0.1-10 μL 피펫 팁에 2.5 μL의 치과용 시멘트 혼합물을 로딩하고 광경화 접착제로 밀봉하였다. 그런 다음 팁을 랙에 놓고 치과 용 시멘트 혼합물의 표면을 표시하고 40 분 동안 비디오 녹화했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S2: 베이스도금 절차의 데모. 대물 렌즈의 표면과 릴레이 렌즈 사이의 각도는 z축에서 이어 바, 톱니 바 또는 재사용 가능한 접착 점토를 돌려 조정했습니다. 릴레이 렌즈의 여백은 모니터에 달과 같은 회색 원으로 나타났습니다. 성공적인 바이러스 발현 및 렌즈 이식은 베이스도금 중에 적어도 하나의 형광 역학(화살표)을 나타내야 합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S3 : 자유롭게 행동하는 마우스에서 형광 역학의 시연. 마우스 #3, #4 및 #5의 형광 과도 현상. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S4: 오류의 예입니다. 기본 도금 절차 중에 균일 한 배경이 나타났습니다. 밝기의 변화는 개별 세포의 형광 과도 상태 때문이 아닙니다. 검색 절차로 인해 발생했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S5: 다른 실패 예제 데모. 염기 도금 절차 중에 형광 과도 현상이 부족했지만 일부 둥근 셀 마진은 여전히 볼 수 있었습니다. 밝기의 변화는 개별 세포의 형광 과도 현상으로 인한 것이 아닙니다. 검색 절차로 인해 발생했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 보고서는 2 렌즈 UCLA 미니 스코프 시스템을 사용하는 연구자를위한 상세한 실험 프로토콜을 설명합니다. 당사 프로토콜에서 설계된 도구는 생체 내 칼슘 이미징을 시도하려는 모든 실험실에 비교적 저렴합니다. 바이러스 주입, 렌즈 이식, 더미 베이스 도금 및 베이스 플레이팅과 같은 일부 프로토콜은 칼슘 이미징의 성공률을 향상시키기 위해 미니스코프 시스템의 다른 버전에도 사용할 수 있습니다. 바이러스 주입과 관련된 일반적인 문제 및 미니스코프 버전에 관계없이 수정해야 하는 렌즈 이식 외에도 UCLA 베이스 플레이트의 구조로 인해 위치 이동이 발생하여 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 간의 작동 거리가 일치하지 않을 수 있습니다(그림 1C). 두 렌즈의 위치 이동을 최소화하기 위해 수정된 실험 프로토콜이 개발되었습니다(그림 2, 그림 4, 그림 5). 성공적인 칼슘 이미징은 성공적인 바이러스 발현, 렌즈 이식 및 기저 도금 절차의 조합을 통해 달성 할 수 있습니다 (그림 5C). 2렌즈 시스템을 사용하여 심뇌 영역을 관찰하려면 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈의 상대 위치도 정확해야 하기 때문에 베이스도금 절차에서 높은 수준의 정확도가 필요합니다. 이 보고서는 기본 문제를 해결하는 프로토콜을 제시할 뿐만 아니라 바이러스 주입 및 렌즈 이식에 대한 몇 가지 팁에 대해서도 논의합니다. 아래에서는 먼저 베이스플레이팅 절차에 대해 논의한 다음 바이러스 주사 및 렌즈 이식 절차에 대해 설명하고 몇 가지 실패 예를 설명합니다(그림 6).
베이스도금
UCLA 미니스코프의 V3 버전은 현재 가장 일반적으로 사용되는 디자인이며 온라인으로 주문할 수 있습니다. 이 버전의베이스 플레이트는 벽이없는 두 개의 모서리로 구성되어 있지만 (그림 1C1) 치과 용 시멘트가 완전히 건조 된 후 모양이 고르지 않은 이동 (그림 1C1, C2)을 유발할 수 있습니다. 당사 프로토콜(그림 4)의 더미 베이스플레이팅 절차는 파라핀 필름을 사용하여 실제 베이스플레이팅 중에 치과용 시멘트에 사용할 수 있는 공간을 줄이기 때문에 정렬 불량 및 베이스 플레이트 이동 문제를 최소화합니다(그림 5B). 나머지 공간은 실제 베이스도금 절차 중에 최적의 이미징 위치를 찾기에 여전히 충분합니다. 따라서 연구원은 가능한 한 적은 치과용 시멘트로 베이스 플레이트를 접착할 수 있습니다(그림 5B2). 또한 더미 베이스 도금 절차는 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 완벽한 거리가 필요하지 않기 때문에 비교적 적은 시간(약 15-20분)이 소요됩니다. 그러나 더미 베이스플레이팅은 성공적인 칼슘 이미징을 위한 핵심 요소 중 하나일 뿐입니다. 예를 들어, 형광 신호를 모니터링하는 동안 뉴런이 작업 평면에서 약간 벗어나면 흐릿하게 나타날 수 있습니다 (릴레이 렌즈의 작동 거리에 따라 다름, 종종 약 100 ~ 300 μm). 작동 거리를 향상시키는 능력은 뉴런의 작동 거리가 릴레이 렌즈 주입 절차에 의해 미리 결정되기 때문에 제한적입니다. 더미 베이스도금 절차 없이 실험을 수행했으며 관심 영역은 항상 (마우스 4마리 중 4마리에서) 1회 베이스도금 후 누락되었습니다. 따라서 이러한 솔루션은 수축 문제를 줄이기 위해 고안되었습니다. 일부 광경화 치과용 시멘트는 매우 빨리 경화되기 때문에 경화 중 수축 문제를 피할 수 있습니다. 이러한 시멘트는 연구원이 베이스 도금 절차 중에 거리를 조정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 칼슘 지표를 여기시키고 치과 용 시멘트를 경화시키는 파장의 범위는 다르지만 기본 도금 절차 중 광 퇴색을 방지해야합니다. 광퇴색을 방지하기 위해, 광원에 의해 생성 된 파장의 범위는 칼슘 지시약과 광 경화 치과 용 시멘트 사이의 교차 반응을 피하기 위해 상당히 좁아야합니다. 따라서, 광 경화 치과 용 시멘트의 사용은 기초 도금 절차에 권장되지 않습니다. 또한 일부 특정 브랜드의 치과 용 시멘트는 다른 연구팀이베이스 플레이트를 접착하는 데 자주 사용됩니다 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . 이러한 시멘트의 저수축 특성은 문제를 해결할 수 있지만 구매(수입)의 어려움으로 인해 이러한 브랜드를 테스트할 기회가 없었습니다. 의료용 제품은 국가/지역에 따라 수입 규정의 적용을 받을 수 있습니다. 연구자가 문헌 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22에 언급 된 시멘트에 접근하는 데 어려움이있는 경우 당사의 프로토콜은 치과 용 시멘트 수축 문제를 해결할 것입니다.
수축 문제 외에도 많은 실험 과정에서 미니스코프 자체와베이스 플레이트 (특히베이스 플레이트의 자석)에서 구조적 마모가 발생할 수 있습니다. 마모로 인한 작은 간격은 두 렌즈 사이의 거리의 안정성을 감소시킵니다. 다시 말하지만, 전체 광학 경로에 대한 정확도는 미니스코프를 사용하여 자유롭게 행동하는 마우스에서 과도 칼슘을 이미징하는 데 중요합니다.
바이러스 주입/수정체 이식 문제 해결
바이러스를 뇌 영역에 주입하기 전에 정위 팔에 새 바늘을 장착하고 적절한 좌표로 뇌를 천천히 뚫는 것이 좋습니다. 새 바늘은 매우 날카롭기 때문에 이 구멍은 실제 미세 주사 바늘 및 릴레이 렌즈의 경로를 지우는 (또는 경로를 절단) 준비하는 준비 단계 역할을 하며 미세 주사 바늘 또는 릴레이 렌즈의 압축으로 인해 발생할 수 있는 조직 손상을 최소화합니다. 날카로운 바늘은 무딘 릴레이 렌즈의 경로를 자릅니다. 따라서 바늘 끝은 릴레이 렌즈와 동일한 좌표로 낮추어야합니다. 20G I.V. 카테터의 내부 바늘은 릴레이 렌즈의 직경과 유사한 직경 1mm이기 때문에 선택되었습니다. 릴레이 렌즈의 직경에 따라 다른 바늘 게이지를 사용할 수 있습니다.
본 연구는 바이러스 벡터의 특성과 역가에 초점을 맞추지 않았지만 이러한 요인은 성공적인 칼슘 이미징에 여전히 중요합니다(그림 5C). 바이러스 벡터의 발현 품질을 사전 테스트 할 필요가 있습니다. Resendez 등의 프로토콜의 단계 1 내지 5는 칼슘 이미징 실험8을 위한 최적의 바이러스 역가의 식별을 위한 상세한 방법을 제공한다. 어떤 이유로 사전 테스트를 수행 할 수없는 경우 초보자는 먼저 비교적 높은 역가를 시도하는 것이 좋습니다. 높은 바이러스 역가를 사용하는 단점 중 하나는 세포 독성8. 죽은 뉴런은자가 형광을 일으키고 미니 스코프(8) 아래에서 밝은 흰색 점으로 보입니다. 그러나 이러한 죽은 뉴런은 초보자가 기본 도금 절차를 찾고 연습하기에 좋은 랜드 마크입니다. 반면에, 저역가 바이러스의 주입은 세포를 죽일 위험이 낮지만, 세포가 염기도금 절차 중에 형광 과도 현상을 나타내지 않으면 형광이 배경에 의해 가려질 수 있습니다. 릴레이 렌즈 이식으로 인해 표적 뉴런이 누락되거나 바이러스 벡터의 발현이 좋지 않아 누락 될 수 있기 때문에 실패 원인을 정확히 찾아내는 것은 어렵습니다. 원인을 결정하는 것은 조직 학적 확인 없이는 매우 혼란 스럽습니다. 따라서 바이러스 벡터를 사전 테스트할 수 없는 경우 상대적으로 높은 역가의 바이러스를 사용하는 것이 좋습니다.
Resendez et al. 미세 주입 바늘 250 μm 측면 및 복부를 렌즈 배치에 삽입 할 것을 권장합니다. 우리의 관찰은 릴레이 렌즈와 같은 깊이에 바이러스를 주입하면 좋은 칼슘 신호를 발현 할 수 있음을 보여주었습니다. 우리는 감염 및 확산 가능성으로 인해 릴레이 렌즈의 좌표와 동일한 깊이로 바이러스를 주입하는 것이 조직 손상을 줄이고 감염된 뉴런과 릴레이 렌즈 사이의 거리의 정확도를 높이는 데 최적이라고 제안합니다. Resendez 등은 또한 표적 세포와 릴레이 렌즈8 사이의 좁은 작동 거리를 감안할 때 동일한 수술 중에 바이러스 주사 및 렌즈 이식을 수행 할 것을 권장합니다. 그러나 일부 연구자들은 바이러스 주입 단계와 렌즈 이식 단계가18,26 주 간격으로 2 주 (또는 그 이상) 수행되는 프로토콜을 따릅니다. 단계 사이의 시간을 길게하면 개별 수술 시간이 줄어 듭니다. 그러나 이 프로토콜에서는 이 두 단계가 하나의 수술로 병합되었는데, 이는 단일 수술 프로토콜에서 외과의가 미세 주사 바늘과 릴레이 렌즈를 대상 영역으로 낮출 때 렌즈 사이의 위치를 모니터링할 수 있어 표적화 실패 가능성을 줄이기 때문입니다(그림 2B3).
두 마리의 마우스(마우스 #1 및 #2)의 경우, 렌즈에 대한 경로를 생성하기 위해 바늘을 사용하는 것도 생략되었고, 마우스 #2에서는 둥근 세포와 같은 회색 반점이 관찰되었습니다(그림 6C). 그러나, 형광 동역학(보충 비디오 S5)은 관찰되지 않았다. 이 예의 뇌 슬라이스 (그림 6C2, C3)를 조사한 결과, 릴레이 렌즈가 내려가는 동안 일부 세포를 끌어 내렸다고 가정했습니다. 이 끌린 뉴런은 건강에 좋지 않았기 때문에 염기 도금 절차 또는 실험 중에 활동이 발견되지 않았습니다.
베이스도금 절차 동안 완전히 균질한 회색 신호와 가시적인 세포형 이미지가 없는 마우스 한 마리가 있었습니다(그림 6B1). 마우스를 희생 한 후 뇌 조각이 관찰되었습니다. 렌즈가 곡선 피라미드 층의 내측에 있음을 알 수있었습니다. 목표 영역(그림 6B2)이 완전히 누락되었습니다. 이러한 실패한 시도는 우리가 수술 프로토콜을 수정하고 궁극적으로 세 마리의 마우스로 성공하도록 이끈 중요한 경험이었습니다(보충 비디오 S3).
미세 주입 바늘
뇌량은 등쪽 해마를 덮는 단단한 섬유질 관입니다. 강성 때문에 끝이 평평한 미세 주입 바늘에 의한 침투에 저항합니다. 따라서 경 사진 팁이있는 미세 주입 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 유형의 바늘은 조직 손상을 줄일 뿐만 아니라 주변 섬유에 의한 막힘으로 인해 대상 부위에 바이러스를 주입하지 못할 가능성을 줄입니다. 위에서 언급한 문제를 문제 해결 차트에 요약했습니다(표 1).
기간
전체 절차의 시간 프레임은 그림 2A에 요약되어 있으며 단위는 일수입니다. 구체적으로, 수술 부분 (바이러스 주입, 릴레이 렌즈 이식, 더미베이스 도금)은 초보자의 경우 3 시간, 충분히 훈련 된 연구원의 경우 1.5 시간이 소요될 수 있습니다. 마우스는 몸집이 작고 신진 대사가 빠르며 큰 종보다 장기간 마취로 인한 건강 문제에 더 취약합니다27. 연구원은 수술에 소요되는 시간을 3시간 미만으로 유지하는 것을 목표로 해야 합니다. 실제 염기 도금은 칼슘 지시약 발현의 3 내지 6 주 후에 수행 될 수있다. 이 절차는 1 시간이 걸릴 수 있습니다. 후속 종단 칼슘 활성 관찰은 1 개월 이상 지속될 수 있습니다.
결론
UCLA 미니스코프는 오픈 소스 생체 내 칼슘 이미징 장치입니다. 기성품의 사전 설치된 베이스플레이트 또는 렌즈 모듈 없이 실험을 수행하는 개인은 베이스도금 절차 중에 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 최적 거리를 정확하게 달성할 수 있어야 합니다. 2 렌즈 UCLA 미니 스코프 시스템 사용의 어려움 증가는 치과 용 시멘트의 부피 변화에 있습니다. 우리는 원래 프로토콜을 최적화하고 위에서 언급 한 문제로 인한 결함을 최소화하여 2 렌즈 UCLA Miniscope 시스템으로 칼슘 이미징의 성공률을 높였습니다.
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Disclosures
이것은 업계에서 지원하는 연구가 아닙니다. 저자는 재정적 이해 상충이 없다고보고합니다.
Acknowledgments
이 작업은 대만 과학 기술부 (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
