Summary
Kürleme sırasında diş çimentosunun büzülmesi, taban plakasının yerini alır. Bu protokol, taban plakasını çimentolamak için yer bırakan diş çimentosunun ilk temelini oluşturarak sorunu en aza indirir. Haftalar sonra, taban plakası bu iskele üzerinde çok az yeni çimento kullanılarak yerinde çimentolanabilir, böylece büzülme azalır.
Abstract
Sinirbilimciler, serbestçe davranan hayvanlarda nöronal aktiviteyi gözlemlemek için minyatür mikroskoplar (miniskoplar) kullanırlar. Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) Miniscope ekibi, araştırmacıların miniskopları kendileri oluşturmaları için açık kaynaklar sağlar. V3 UCLA Miniscope, şu anda kullanımda olan en popüler açık kaynaklı miniskoplardan biridir. Genetiği değiştirilmiş nöronlardan yayılan floresan geçicilerinin, yüzeysel korteks üzerine implante edilmiş objektif bir lens (tek lensli bir sistem) aracılığıyla veya derin beyin bölgelerinde, derin beyne implante edilmiş bir röle lensi ve aktarılan görüntüyü gözlemlemek için miniskopta önceden sabitlenmiş objektif bir lensin (iki lensli bir sistem) bir kombinasyonu yoluyla görüntülenmesine izin verir. En uygun koşullar altında bile (nöronlar floresan göstergelerini ifade ettiğinde ve röle lensi düzgün bir şekilde implante edildiğinde), taban plakası arasındaki diş çimentosunun hacimsel bir değişimi ve çimento kürlemesi üzerine kafatasına tutturulması, objektif ve röle lensleri arasındaki değişen bir mesafe ile yanlış hizalamalara neden olabilir ve bu da düşük görüntü kalitesine neden olabilir. Taban plakası, miniskobun kafatasına monte edilmesine yardımcı olan ve objektif ile röle lensleri arasındaki çalışma mesafesini sabitleyen bir plakadır. Böylece, taban plakası etrafındaki diş çimentosunun hacmindeki değişiklikler, lensler arasındaki mesafeyi değiştirir. Mevcut protokol, diş çimentosundaki hacim değişikliklerinden kaynaklanan yanlış hizalama problemini en aza indirmeyi amaçlamaktadır. Protokol, röle lens implantasyonu sırasında diş çimentosunun ilk temelini oluşturarak yanlış hizalamayı azaltır. İmplantasyondan sonraki iyileşme süresi, diş çimentosunun temelinin taban plakasını tamamen kürlemesi için yeterlidir, bu nedenle taban plakası mümkün olduğunca az yeni çimento kullanılarak bu iskele üzerine çimentolanabilir. Bu makalede, miniskopa tutturulmuş objektif bir lens ile nöronal aktivitenin görüntülenmesini sağlamak için farelerde baz kaplama stratejilerini açıklayacağız.
Introduction
Floresan aktivite raporlayıcıları, nöronal aktivitenin görüntülenmesi için idealdir, çünkü hassastırlar ve geniş dinamik aralıklara sahiptirler 1,2,3. Bu nedenle, giderek artan sayıda deney, nöronal aktiviteyi doğrudan gözlemlemek için floresan mikroskobu kullanmaktadır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. İlk minyatür tek fotonlu floresan mikroskobu (miniskop) 2011 yılında Mark Schnitzer ve ark.5 tarafından tasarlanmıştır. Bu miniskop, araştırmacıların serbestçe davranan hayvanlarda serebellar hücrelerin floresan dinamiklerini izlemelerini sağlar5 (yani, hayvanlara herhangi bir fiziksel kısıtlama, kafa kısıtlaması, sedasyon veya anestezi olmadan). Şu anda, teknik korteks 6,8,15,16 gibi yüzeysel beyin bölgelerini izlemek için uygulanabilir; dorsal hipokampus 8,11,13,14 ve striatum 6,17 gibi subkortikal alanlar; ve ventral hipokampus 14, amigdala 10,18 vehipotalamus 8,12 gibi derin beyin bölgeleri.
Son yıllarda, birkaç açık kaynaklı miniskop geliştirilmiştir.4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskop, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) Miniskop ekibi tarafından sağlanan adım adım yönergeleri izlerlerse araştırmacılar tarafından ekonomik olarak monte edilebilir.4,7,11,13. Çünkü nöral aktivitenin optik izlenmesi ışık iletiminin sınırlamaları ile sınırlıdır.7 İlgilenilen nöronal popülasyona ve bu popülasyondan, bir röle GRIN merceğinden (veya röle lensinden) aktarılan görüş alanını büyütmek için miniskobun altına önceden sabitlenmiş objektif gradyan kırılma indisi (GRIN) lensinin (veya objektif lensin) kullanılmasını gerektiren bir miniskop tasarlanmıştır.6,7,8,10,16,17. Bu röle lensi, hedef beyin bölgesine implante edilir, böylece hedef beyin bölgesinin floresan aktivitesi röle lensinin yüzeyine aktarılır.6,7,8,10,16,17. Tam bir sinüzoidal ışık periyodunun yaklaşık 1 / 4'ü objektif GRIN merceğinden geçer (~ 0.25 adım) (Şekil 1A1), büyütülmüş floresan görüntü ile sonuçlanır6,7. Objektif lens her zaman miniskopun altına sabitlenmez ve röle lensinin implantasyonu gerekli değildir.6,7,11,13,15. Spesifik olarak, iki konfigürasyon vardır: biri miniskopta sabit bir objektif lens ve beyne implante edilmiş bir röle lensi ile8,10,12,14,16 (Şekil 1B1) ve sadece çıkarılabilir objektif lensli bir diğeri6,7,11,13,15 (Şekil 1B2). Sabit objektif ve implante edilmiş röle lensi kombinasyonuna dayanan tasarımda, beyinden gelen floresan sinyalleri röle lensinin üst yüzeyine getirilir (Şekil 1A1)7,8,10,12,14,16. Daha sonra, objektif lens, röle lensinin üst yüzeyinden görme alanını büyütebilir ve iletebilir (Şekil 1A2). Öte yandan, çıkarılabilir objektif GRIN lens tasarımı daha esnektir, bu da bir röle lensinin beyne önceden implante edilmesinin zorunlu olmadığı anlamına gelir (Şekil 1B2)6,7,11,13,15. Çıkarılabilir bir objektif lens tasarımına dayanan bir miniskop kullanırken, araştırmacıların hala hedef beyin bölgesine bir lens yerleştirmeleri gerekir, ancak objektif bir lens implante edebilirler.6,7,11,13,15 veya beyindeki bir röle lensi6,7. İmplantasyon için objektif veya röle lensi seçimi, araştırmacının kullanması gereken miniskop konfigürasyonunu belirler. Örneğin, V3 UCLA Miniscope, çıkarılabilir bir objektif GRIN lens tasarımına dayanmaktadır. Araştırmacılar, beynin ilgilendiği bölgeye objektif bir lensi doğrudan implante etmeyi ve "boş" miniskobu objektif lense monte etmeyi seçebilirler.6,7,11,13,15 (tek lensli bir sistem; Şekil 1B2) veya beyne bir röle lensi yerleştirmek ve objektif bir lensle önceden sabitlenmiş bir miniskop monte etmek için6,7 (iki lensli bir sistem; Şekil 1B1). Miniskop daha sonra genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi tarafından üretilen nöronal floresanın canlı akış görüntülerini yakalamak için bir floresan kamera olarak çalışır.1,2,3. Miniskop bir bilgisayara bağlandıktan sonra, bu floresan görüntüler bilgisayara aktarılabilir ve video klip olarak kaydedilebilir. Araştırmacılar, bazı analiz paketleriyle floresandaki göreceli değişiklikleri analiz ederek nöronal aktiviteyi inceleyebilirler.20,21 veya gelecekteki analizler için kodlarını yazın.
V3 UCLA Miniscope, kullanıcılara nöronal aktiviteyi bir veya iki lensli bir sistemle görüntüleyip görüntülemeyeceğine karar verme esnekliği sağlar7. Kayıt sisteminin seçimi, hedef beyin bölgesinin derinliğine ve boyutuna dayanır. Kısacası, tek lensli bir sistem yalnızca yüzeysel (yaklaşık 2,5 mm'den daha küçük) ve nispeten büyük (yaklaşık 1,8 x 1,8mm2'den daha büyük) bir alanı görüntüleyebilir, çünkü üreticiler yalnızca belirli bir boyutta objektif lens üretir. Buna karşılık, iki lensli bir sistem herhangi bir hedef beyin bölgesine uygulanabilir. Bununla birlikte, taban plakasını yapıştırmak için kullanılan diş çimentosu, objektif ve röle lensleri arasındaki değişen mesafe ile yanlış hizalamalara neden olma eğilimindedir ve bu da düşük görüntü kalitesine neden olur. İki lensli sistem kullanılıyorsa, optimum görüntüleme kalitesini elde etmek için iki çalışma mesafesinin tam olarak hedeflenmesi gerekir (Şekil 1A). Bu iki kritik çalışma mesafesi, röle lensinin nöronları ve alt yüzeyi arasında ve röle lensinin üst yüzeyi ile objektif lensin alt yüzeyi arasındadır (Şekil 1A1). Lensin çalışma mesafesinin dışına yanlış hizalanması veya yanlış yerleştirilmesi görüntüleme hatasına neden olur (Şekil 1C2). Buna karşılık, tek lensli sistem yalnızca bir hassas çalışma mesafesi gerektirir. Bununla birlikte, objektif lens boyutu, derin beyin bölgelerinin izlenmesi için uygulamasını sınırlar (miniskopa uyan objektif lens yaklaşık 1.8 ~ 2.0 mm 6,11,13,15'tir). Bu nedenle, objektif bir lensin implantasyonu, yüzeyin ve farelerde korteks6,15 ve dorsal cornu ammonis 1 (CA1) gibi nispeten büyük beyin bölgelerinin gözlemlenmesi için sınırlıdır11,13 . Ek olarak, dorsal CA1 11,13'ü hedeflemek için korteksin geniş bir alanı aspire edilmelidir. Derin beyin bölgelerinin görüntülenmesini engelleyen tek lensli konfigürasyonun sınırlaması nedeniyle, ticari miniskop sistemleri yalnızca birleşik bir objektif lens / röle lensi (iki lens) tasarımı sunar. Öte yandan, V3 UCLA miniskobu tek lensli veya iki lensli bir sisteme dönüştürülebilir, çünkü objektif lensi çıkarılabilir 6,11,13,15'tir. Başka bir deyişle, V3 UCLA miniskop kullanıcıları, çıkarılabilir lensi beyne implante ederek (tek lensli bir sistem oluşturarak), yüzeysel beyin gözlemlerini içeren deneyler yaparken (derinliği 2,5 mm'den az) veya miniskopu önceden sabitleyerek ve beyne bir röle lensi yerleştirerek (iki lensli bir sistem oluşturarak) yararlanabilirler. derin beyin gözlemlerini içeren deneyler yaparken. İki lensli sistem, beyni yüzeysel olarak gözlemlemek için de uygulanabilir, ancak araştırmacı objektif lens ve röle lensi arasındaki doğru çalışma mesafelerini bilmelidir. Tek lensli sistemin temel avantajı, iki lensli sistemde optimum görüntüleme kalitesi elde etmek için tam olarak hedeflenmesi gereken iki çalışma mesafesi olduğu göz önüne alındığında, çalışma mesafelerini kaçırma şansının iki lensli bir sisteme göre daha düşük olmasıdır (Şekil 1A). Bu nedenle, yüzeysel beyin gözlemleri için tek lensli bir sistem kullanmanızı öneririz. Bununla birlikte, deney derin beyin bölgesinde görüntüleme gerektiriyorsa, araştırmacı iki lensin yanlış hizalanmasını önlemeyi öğrenmelidir.
Deneyler için miniskopların iki lensli konfigürasyonu için temel protokol, lens implantasyonu ve taban kaplaması 8,10,16,17'yi içerir. Taban kaplaması, bir taban plakasının bir hayvanın kafasına yapıştırılmasıdır, böylece miniskop sonunda hayvanın üstüne monte edilebilir ve nöronların floresan sinyallerini videoya çekebilir (Şekil 1B). Bu prosedür, taban plakasını kafatasına yapıştırmak için diş çimentosu kullanmayı içerir (Şekil 1C), ancak diş çimentosunun büzülmesi, implante edilen röle lensi ile objektif lens 8,17 arasındaki mesafede kabul edilemez değişikliklere neden olabilir. İki lens arasındaki kaydırılmış mesafe çok büyükse, hücreler netlemeye getirilemez.
Miniskopları kullanarak derin beyin kalsiyum görüntüleme deneyleri için ayrıntılı protokoller zaten yayınlanmıştır.8,10,16,17. Bu protokollerin yazarları Inscopix sistemini kullanmışlardır.8,10,16 veya diğer özelleştirilmiş tasarımlar17 ve viral seleksiyon, cerrahi ve taban plakası bağlantısı için deneysel prosedürleri tanımlamıştır. Bununla birlikte, protokolleri V3 UCLA Miniscope sistemi, NINscope gibi diğer açık kaynaklı sistemlere tam olarak uygulanamaz.6ve Finchscope19. İki lensin yanlış hizalanması, taban plakasını kafatasına çimentolamak için kullanılan diş çimentosu türü nedeniyle UCLA Miniscope ile iki lensli bir konfigürasyonda kayıt sırasında ortaya çıkabilir.8,17 (Şekil 1C). İmplante edilmiş röle lensi ile objektif lens arasındaki mesafe, baz kaplama prosedürü sırasında diş çimentosunun istenmeyen büzülmesi nedeniyle kaymaya eğilimli olduğu için mevcut protokole ihtiyaç vardır. Taban kaplaması sırasında, implante edilmiş röle lensi ile objektif lens arasındaki optimum çalışma mesafesi, miniskop ile röle lensinin üst kısmı arasındaki mesafe ayarlanarak bulunmalı ve taban plakası daha sonra bu ideal konuma yapıştırılmalıdır. Objektif lens ile implante edilen röle lensi arasındaki doğru mesafe ayarlandıktan sonra, hücresel çözünürlükte uzunlamasına ölçümler elde edilebilir (Şekil 1B; in vivo kayıt). Bir röle lensinin optimum çalışma mesafesi aralığı küçük olduğundan (50 - 350 μm)4,8, kürleme sırasında aşırı çimento büzülmesi, objektif lensin ve implante edilmiş röle lensinin uygun aralıkta tutulmasını zorlaştırabilir. Bu raporun genel amacı, büzülme sorunlarını azaltmak için bir protokol sağlamaktır.8,17 baz kaplama işlemi sırasında meydana gelen ve iki lensli bir konfigürasyonda floresan sinyallerinin miniskop kayıtlarının başarı oranını artırmak. Başarılı miniskop kaydı, serbestçe davranan bir hayvanda bireysel nöronların floresansındaki gözle görülür göreceli değişikliklerin canlı akışının kaydedilmesi olarak tanımlanır. Farklı dental çimento markalarının farklı büzülme oranları olmasına rağmen, araştırmacılar daha önce test edilmiş bir marka seçebilirler.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Bununla birlikte, tıbbi malzemeler için ithalat düzenlemeleri nedeniyle bazı ülkelerde / bölgelerde her markanın elde edilmesi kolay değildir. Bu nedenle, mevcut diş çimentolarının büzülme oranlarını test etmek ve daha da önemlisi büzülme sorununu en aza indiren alternatif bir protokol sağlamak için yöntemler geliştirdik. Mevcut baz kaplama protokolüne göre avantajı, laboratuvarlarda kolayca elde edilebilen alet ve çimento ile kalsiyum görüntülemenin başarı oranındaki artıştır. UCLA miniskobu örnek olarak kullanılır, ancak protokol diğer miniskoplar için de geçerlidir. Bu raporda, optimize edilmiş bir taban kaplama prosedürünü açıklıyoruz ve ayrıca UCLA miniskop iki lensli sistemin (Şekil 2A). UCLA miniskobu ile iki lensli konfigürasyon için hem başarılı implantasyon örnekleri (n = 3 fare) hem de başarısız implantasyon örnekleri (n = 2 fare) başarı ve başarısızlıkların nedenlerine ilişkin tartışmalarla birlikte sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada yapılan tüm prosedürler Ulusal Tayvan Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay No.: NTU-109-EL-00029 ve NTU-108-EL-00158).
1. Diş çimentosunun hacim değişiminin değerlendirilmesi
NOT: Diş çimentosu hacmindeki değişiklikler, kürleme işlemi sırasında meydana gelir. İmplantasyon ve baz kaplamadan önce diş çimentosunun hacim değişikliklerini test edin. Araştırmacılar, herhangi bir diş çimentosu markasını test edebilir ve taban plakasını çimentolamak için en düşük hacim değişikliğine sahip markayı kullanabilirler. Bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir.
- Her bir diş çimento tozunun 0,5 g ağırlığını koyun ve uygun çözeltisiyle (1 mL) karıştırın.
NOT: Dental çimento talimatlarında önerilen toz/sıvı oranı, katı bir form elde etmek için çözeltinin 0,5 g toz ila 0,25 mL'sidir. Bu test protokolü, pipet uçlarındaki hacim değişimini ölçmek için karışımın sıvı halde aspire edilebilmesi için oranı 0,5 g/mL'ye kadar seyreltir. - Diş çimento karışımının 2,5 μL'sini çıkarmak için 0,1-10 μL pipet uçları kullanın ve ardından pipet ucunu hafif kürleyici bir yapıştırıcı ile kapatın.
- İpuçlarını bir rafa yerleştirin, diş çimento karışımının en üst seviyelerini işaretleyin ve 40 dakika sonra diş çimento karışımının seviyesini ölçün (Ek video S1).
- Uçlardaki diş çimentosu kürlemesi sırasındaki seviye değişikliklerini izlemenin yanı sıra, kalan kuru diş çimentosu yoğunluğunu da ölçün. Yoğunluğu hesaplamak için diş çimentosunun ağırlığını ölçün ve hacmi Arşimet prensibi ile ölçün.
- Kısacası, kalan kuru diş çimentosunu suyla dolu bir kaba koyun ve taşan suyu tartın.
- Aşağıda detaylandırılan tüm protokoller için diş çimentosunu en az büzülme ile kullanın.
2. Anestezi, cerrahi implantasyon, viral enjeksiyon ve kukla baz kaplama
- Anestezi
NOT: Bu rapor, UCLA miniskobu için cerrahi ve baz kaplama prosedürünü optimize etmeyi amaçlamaktadır; bu nedenle, hedef beyin bölgelerini enfekte etmek için en uygun viral titrenin bilindiği varsayılmaktadır. Optimal viral titreyi bulma yöntemleri, Resendez ve ark.'nın 1 ila 5. adımlarında bulunabilir.8. Viral seyreltme optimize edildikten sonra, cerrahi implantasyon başlatılabilir.- Fareyi bir indüksiyon kabına yerleştirin ve oksijen sağlayın (0,2 L/dak hava akış hızında %100). Fareyi 5 ila 10 dakika boyunca önceden oksijenlendirin.
- Fare dengesini kaybetmeye başlayana ve sonunda anestezi altına alınana kadar% 100 oksijenle (hava akış hızı: 0.2 L / dak) karıştırılmış% 5 izofluran uygulayın.
- Fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve tükürük ve buprenorfin (0.03 mg / kg; deri altı enjeksiyonu) birikimini önlemek için analjezik olarak atropin (0.04 mg / kg; deri altı enjeksiyon) enjekte edin.
- Farenin kafasını tıraş edin.
- Maske, steril önlük ve eldiven giyin. Ameliyat için steril bir alan ve steril cerrahi aletler hazırlayın. Stereotaksik aparat üzerinde farenin kafasını stabilize edin (bu adım sırasında% 3 ila% 2.5 izofluran ile anesteziyi koruyun). Analjezik ve anestezik prosedürlerden sonra, kulak çubuklarının kafayı güvenli bir şekilde stabilize ettiğinden emin olun. Termal destek sağlayın.
- Başın düz bir pozisyonda ayarlandığından emin olun, traş edilmiş kafayı betadin ile sterilize edin ve ardından kafaya lokal bir analjezik olan ksilokain (% 10) püskürtün.
- Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhem uygulayın.
NOT: Oküler yaralanmayı önlemek için tüm anestezik olaylar sırasında gözün korunması için oftalmik merhem kullanın. - Arka pençesini sıkıştırarak hayvanın derin ağrı refleksini test edin. Hayvan pençe çekilme refleksi göstermediğinde, cerrahi prosedürlere devam edin.
- Kafatasının orta sagital düzlemi boyunca küçük bir kesi yapın (bregmaya yaklaşık 2 mm önden başlar ve bregmaya yaklaşık 6 mm posterior biter). Ardından, kafatasındaki bağ dokusunu temizleyin ve sol ön ve interparietal kemiklere üç paslanmaz çelik vida takın.
- Bu noktada, izofluranı% 1-2'ye düşürün. Tüm cerrahi prosedür sırasında solunum hızını izleyin. Solunum hızı çok yavaşsa (hayvana bağlı olarak yaklaşık 1 / s), izofluran konsantrasyonunu azaltın.
- 0,7 mm uç çapına sahip bir çapak matkabı kullanarak röle lensi lens implantasyonu için cerrahi mikroskop veya stereomikroskop altında bir kraniyotomi uygulayın. Çapak matkap ucunu tutmak ve amaçlanan daire alanının bir taslağını çizmek için bir mikro matkap kullanın (kalvaryumun tam kalınlığına nüfuz edilmesi gerekmez).
NOT: Mevcut protokolde kullanılan röle lensinin çapı 1,0 mm, uzunluğu ~ 9,0 mm aralığı 1 ve çalışma mesafesi aralığı ~100 μm - 300 μm'dir; bu nedenle, kraniyotomi çapı 1.2 mm'dir.- Dura açığa çıkana kadar taslağı yavaşça derinleştirin.
- 3 mL'lik bir şırıngada 3 mL steril salin hazırlayın ve bir buz kovasında soğutun. Alanı soğutmak ve ısı hasarını ve kanamayı önlemek için maruz kalan bölgeyi sık sık şırıngadan 0.1 mL salin ile durulayın.
- Dura'yı 27G iğneyle hafifçe toplayın ve soyun.
- Uçtan 1 mm uzakta 27 G'lık künt bir iğne üzerine bir işaret koyun ve lens implantasyonuiçin bir pencere oluşturmak amacıyla beynin korteksini dikkatlice aspire etmek için kullanın 8,11,13,17 (Şekil 2B1). Gerekirse, 27 G'lik bir enjeksiyon iğnesinin ucunu zımpara kağıdı ile öğüterek künt bir iğne yapın. Ardından, iğneyi bir şırıngaya bağlayın, şırıngayı bir tüpe bağlayın ve bir vakum oluşturmak için tüpü bir emme kaynağına bağlayın.
NOT: Röle lensi künttür ve derin beyin bölgesine yerleştirildiğinde beyin dokusunu sıkıştırır. Böylece, korteksin aspirasyonu, röle lens implantasyonuna bağlı doku hasarını azaltır. Korteks farelerde yaklaşık 1 mm kalınlığındadır, ancak stereomikroskop altında görselleştirilmesi zordur. İşaret, iğnenin derinliğinin tek başına bir stereomikroskoptan daha hassas bir şekilde belirlenmesini sağlamak için bir dönüm noktası oluşturur. Ek olarak, direnç bağlı olarak korteks bölgesine ulaşılıp ulaşılmadığı veya geçilip geçilmediği belirlenebilir; korteksin üst kısmı nispeten yumuşak hissederken, subkortikal bölge yoğun hissediyor. Bu nedenle, doku daha yoğun hissetmeye başladığında, aspirasyonu durdurun (Şekil 2B3). - 3 mL'lik bir şırıngada 3 mL steril salin hazırlayın ve bir buz kovasında soğutun. Kanamayı durdurmak ve beyin ödemi olasılığını azaltmak için bölgeyi salin ile durulayın.
- Adeno ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonu
NOT: Bu deneyde AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE kullanılmıştır. jGCaMP7s, yeşil floresan3 yayan genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesidir. Bu çalışmada denek olarak vahşi tip bir fare kullanıldığından, nöronları yeşil-floresan kalsiyum gösterge geni ile transfekte etmek ve ifadeyi sağlamak için viral bir vektöre ihtiyaç vardı. Denekleri olarak yeşil-floresan kalsiyum göstergesini ifade eden transgenik fareler kullanan araştırmacılar, protokol 2.2'yi atlayabilirler.- 20 G intravenöz (i.v.) kateterin iç iğnesini stereotaksik kola monte edin ve beyni uygun koordinatlarda (röle lensi lens implantasyonu sırasında kullanılan koordinatlarla aynı) yavaşça delin (~ 100 - 200 μm / dak) (Şekil 2B3).
- Mikroenjeksiyon iğnesini ventral CA1'e 100-200 μm / dak hızında indirin ve viral vektörün 200 nL'sini hedef bölgeye (~ 25 nL / dak) (bregmadan -3.16 mm AP, 3.25 mm ML ve -3.50 mm DV) infüze edin.
- Virüsün yayılmasına izin vermek ve geri akışı en aza indirmek için 10 dakika bekleyin.
- Mikroenjeksiyon iğnesini geri çekin (~ 100-200 μm / dak).
- Röle lens implantasyonu
- Röle lensini %75 alkol10,16 ile dezenfekte edin ve ardından pirojensiz salin ile durulayın. İmplantasyona kadar lensi soğuk pirojensiz salin içinde bekletin.
NOT: Soğuk bir lens, beyne yerleştirildiğinde beyin ödemini en aza indirir. - Röle lensini, dişleri ısı büzülme borusuyla kaplanmış bir mikro bulldog kelepçesi (Şekil 2B3) kullanarak tutun.
NOT: Bulldog kelepçesi, lense zarar vermeden sıkıca tutabilir. Boru kaplı bulldog kelepçesini yapma yöntemi için Resendez ve ark.8'e bakınız. - Röle lensini yavaşça (~100 - 200 μm/dak) hedef bölgenin üzerine yerleştirin (bregmadan -3,16 mm AP, 3,50 mm ML ve -3,50 mm DV) ve diş çimentosu ile stabilize edin.
- Röle lensini %75 alkol10,16 ile dezenfekte edin ve ardından pirojensiz salin ile durulayın. İmplantasyona kadar lensi soğuk pirojensiz salin içinde bekletin.
- Kukla taban kaplaması
NOT: İmplantasyon ameliyatı sırasında "kukla baz kaplama" nın amacı, birkaç hafta sonra gerçek baz kaplama prosedürü sırasında uygulanması gereken diş çimentosu miktarını azaltmak için bir diş çimento tabanı oluşturmaktır. Bu şekilde, diş çimentosunun hacminde bir değişiklik riski en aza indirilir.- Objektif lensi miniskopun altına sabitleyin ve taban plakasını miniskobun üzerine monte edin (bu adımda, ankrajlı objektif lensin, taban plakasının ve miniskopun montajı henüz farenin kafatasının üzerine yerleştirilmemiştir).
- Taban plakasının dışına 10 cm parafin film sarın (Şekil 4A).
- Miniskopu stereotaksik kol probu ile yeniden kullanılabilir yapışkan kil kullanarak tutun.
- Objektif lensi röle lensinin üstüne, lensler arasında mümkün olduğunca az boşluk bırakacak şekilde hizalayın (Şekil 4B).
- Taban plakasının konumlandırılmasını sağlamak için diş çimentosu kullanın (çimento sadece parafin filmine dokunacak şekilde).
- Diş çimentosu kuruduğunda, filmi çıkarın.
- Taban plakasını ve miniskobu çıkarın. Diş çimento tabanı içi boştur (Şekil 4B).
- Röle lensini günlük aktivitelerden ve fare tarafından çizilmekten korumak için, röle lensini röle lensi kaplanana kadar bir miktar kalıplama silikon kauçuğu ile kapatın ve silikon kauçuğu ince bir diş çimentosu tabakası ile örtün (Şekil 4B).
- Fareyi stereotaksik aletlerden ayırın ve fareyi bir kurtarma odasına yerleştirin.
- Enfeksiyonu önlemek için analjezi için karprofen (5 mg / kg; deri altı enjeksiyon) veya meloksikam (1 mg / kg; deri altı enjeksiyon) ve seftazidim (25 mg / kg; deri altı enjeksiyon) enjekte edin.
NOT: Antibiyotik kullanımı aseptik bir tekniğe alternatif değildir. Perioperatif antibiyotikler (yani, seftazidim), uzun süreli ameliyatlar veya kronik implantların yerleştirilmesi gibi belirli durumlarda endike olabilir. - Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı izleyin.
- Ev farelerini ayrı ayrı ve ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için bir hafta boyunca meloksikam (1 mg / kg; deri altı enjeksiyon; q24h) enjekte edin. Normal şekilde yediğinden, içtiğinden ve dışkıladığından emin olmak için ameliyattan sonra her gün hayvanı kontrol edin.
- 3 veya daha fazla hafta sonra baz kaplama yapın.
3. Taban kaplaması
NOT: Genellikle, baz kaplama prosedürü (Şekil 5), iyileşme ve viral inkübasyon süresi nedeniyle ilk prosedürden sonraki 2-3 hafta içinde gerçekleştirilemez. Baz kaplama için indüksiyon prosedürleri, adım 2.1.1 ila 2.1.8'de açıklananlara benzer. Bununla birlikte, baz kaplama invaziv bir prosedür değildir ve hayvan sadece hafif sedasyon gerektirir. Bu nedenle, hayvan stereotaksik çerçeve üzerinde hareket edemediği sürece% 0.8-1.2 izofluran yeterlidir. Ek olarak, nispeten hafif izofluran anestezisi, izleme sırasında nöronların floresan geçicilerinin ekspresyonunu kolaylaştırmaya yardımcı olabilir8 (Ek video S2).
- Diş çimento çatısının ince tabakasını bir kemik rongeur ile dikkatlice kesin ve silikon kauçuğu çıkarın. Röle lensinin yüzeyini %75 alkolle temizleyin.
- Miniskopun altına sabitlemek için taban plakasının yanına ayarlanmış bir vida takın (Şekil 5A1).
NOT: Taban plakası, miniskobun alt kısmının altında güvenli bir şekilde sıkılmalıdır, çünkü sıkılmış ve hafifçe tutturulmuş bir taban plakası arasındaki fark tutarsız bir mesafeye neden olabilir. - Netleme kaydırağını ana muhafazadan yaklaşık 2,7 - 3 mm olacak şekilde ayarlayın (Şekil 5A2).
NOT: Taban kaplama prosedürü sırasında uzunluk daha da ayarlanabilse de, yaklaşık 2,7 mm'ye sabitleyin, çünkü aynı anda miniskop uzunluğunu ve implante edilmiş röle lensi ile önceden sabitlenmiş objektif lens arasındaki optimum uzunluğu ayarlamak çok kafa karıştırıcıdır. - Miniskopu veri toplama kartına bağlayın ve bilgisayardaki USB 3.0 (veya daha yüksek sürüm) bağlantı noktasına takın.
- UCLA ekibi tarafından geliştirilen veri toplama yazılımını çalıştırın.
- Pozlamayı 255'e, kazancı 64x'e ve uyarma LED'ini %5'e ayarlayın. Bu ayarlar ilk taban kaplaması için önerilir; spesifik ayarlar beyin bölgelerine ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin ekspresyon seviyelerine bağlı olarak değişecektir.
- Miniskopu veri toplama yazılımına bağlamak ve canlı yayını izlemek için Bağlan düğmesine tıklayın.
- Miniskop objektif lensini röle lensine elle hizalayın ve floresan sinyallerini aramaya başlayın (Şekil 5B1).
NOT: Başlangıçta, floresan sinyalini manuel olarak aramak ayarlamaları kolaylaştırır. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesini ifade etmek için bir AAV sistemi kullanıldığından, hem promotör tip hem de AAV serotipi transfeksiyonun etkinliğini etkilemiştir23,24. Araştırmacıların, gelecekteki deneylere devam etmeden önce floresandaki değişiklikleri gösteren bireysel nöronları bularak kalsiyum göstergesinin ekspresyonunu kontrol etmeleri gerekir. - Diş çimentosunu miniskobu bloke ettiği herhangi bir yere delin (isteğe bağlı).
- Veri toplama yazılımının canlı akışını izleyin ve röle lensinin kenar boşluğunu bir dönüm noktası olarak kullanın (Ek video S2). Röle lensinin kenar boşluğu, monitörde ay benzeri gri bir daire olarak görünür (Şekil 5B1; beyaz oklar).
- Röle lensi bulunduğunda, floresan sinyalleri bulunana kadar miniskopun çeşitli açılarını ve mesafelerini dikkatlice ayarlayın.
NOT: Nöronların görüntüleri arka plandan daha beyazdır. Kesin bir nöronal şekil, nöronların röle lensinin odak düzleminde mükemmel bir şekilde yattığını gösterir. Yuvarlak nöronlar, odak düzlemine yakın olduklarını göstermektedir. Nöronal şekil beyinde farklıdır, burada ventral CA1 örnek olarak gösterilmiştir. - Bireysel bir nöron, zamanın bir fonksiyonu olarak floresandaki değişiklikleri göstermiyorsa, tabanı silikon kauçukla yeniden kapatın. Kuluçka süresi de virüsün özelliğine bağlı olduğu için floresan gözlenmez23,24. 3.1-3.12 arasındaki adımları bir hafta daha sonra gerçekleştirin. (Bu isteğe bağlıdır).
- Miniskobu en uygun konumda tutun ve stereotaksik kolu yeniden kullanılabilir yapışkan kil ile miniskoba doğru hareket ettirin (Şekil 5B2). Miniskopu stereotaksik kola yeniden kullanılabilir yapışkan kil ile yapıştırın.
- En iyi görünümü aramak için x, y ve z kollarını hafifçe ayarlayın (Ek video S2). Ardından, z eksenindeki kulak çubuğunu, diş çubuğunu veya yeniden kullanılabilir yapışkan kili döndürerek objektif lensin yüzeyi ile röle lensi arasındaki açıyı ayarlayın. Viral ekspresyon ve lens implantasyonu, en az bir hücre floresan geçicileri gösterdiğinde başarılı olur (Şekil 6A; Ek video S2) baz kaplama sırasında (aynı zamanda CA1 gibi beynin alanına da bağlıdır).
NOT: Monitör yalnızca beyaz hücreler gösteriyor ancak geçici hücreler göstermiyorsa, başka bir neden daha vardır (bkz: Şekil 6B,C, Ek videolar S4,S5, Sonuçlar bölümü ve sorun giderme bölümü). - Taban plakasını (Şekil 5B2) diş çimentosu ile çimentolayın.
- Optimum pozisyonun değişmediğinden emin olmak için çimentolama sırasında ilgilenilen bölgeyi izleyin.
- Taban plakasını diş çimento tabanına sıkıca yapıştırırken mümkün olan en az miktarda çimento kullanın (Şekil 5B2). Taban plakasının etrafına ikinci ve üçüncü bir çimento tabakası uygulayın, ancak GRIN lensi etkilememeye dikkat edin.
NOT: Taban plakasına çimento uygulamak bu adımda daha kolaydır, çünkü taban plakasının tabanı kukla kaplama prosedürü sırasında oluşturulmuştur. - Çimento kürlendiğinde miniskobu taban plakasından dikkatlice ayırın. Ardından, koruyucu bir kapağa vidalayın.
- Hayvanı bir kurtarma kafesine taşıyın. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı izleyin.
- Ev fareleri ayrı ayrı. Her gün normal şekilde yediğinden, içtiğinden ve dışkıladığından emin olun. Farenin tamamen iyileşmesi için 5 gün bekleyin ve ardından kalsiyum görüntülemeyi kontrol edin.
NOT: Taban plakasını tutan az miktarda diş çimentosu vardır. Bu nedenle, taban kaplama prosedüründen bu yana taban plakası önemli ölçüde kaymışsa, diş çimentosunu bir matkapla çıkarın ve taban kaplama prosedürünü tekrar gerçekleştirin. - Anestezi uygulayın (bir ketamin (87 mg / kg) / ksilazin (13 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile) ve tüm deneyler yapıldığında25 hayvana perfüze edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dental çimento hacim değişiminin değerlendirilmesi
Kürleme işlemi sırasında diş çimentosunun hacmi değiştiğinden, GRIN lensin çalışma mesafesinin yaklaşık 50 ila 350 μm4,8 olduğu göz önüne alındığında, görüntüleme kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, bu olguda, implantasyon ve baz kaplama prosedüründen önce ticari olarak temin edilebilen iki diş çimentosu, Tempron ve Tokuso test edilmiştir (Şekil 5). Videolar önce çimentoların küçülüp küçülmediğini belirlemek için değerlendirildi ve daha sonra tamamen kuruduğunda çimento hacimleri karşılaştırıldı. Diş çimentolarının ilk karışımlarının aynı konsantrasyonu ve hacimleri pipet uçlarına yüklendi ve videoya çekildi (Ek video S1). Video S1, kurutma işlemi sırasında her iki çimentonun da küçüldüğünü gösterdi. Tokuso, Tempron'dan daha iyi performans gösterdi (yani, küçüldükten sonra bile Tempron'dan daha büyük bir hacme sahipti): Şekil 3B; Tempron'un ortalama hacmi: 0.93 ± 0.07 mL; Tokuso'nun ortalama hacmi: 1.18 ± 0.07 mL; t-testi: p = 0.048, t(6) = 2.46, bu da daha az küçüldüğünü düşündürmektedir. Çimentoların yoğunlukları da tam kuruduktan sonra 4 kez test edildi. Tokuso, Tempron'dan daha düşük bir ortalama yoğunluğa sahipti (ortalama Tempron yoğunluğu: 1.07 ± 0.12 g / mL; Tokuso'nun ortalama yoğunluğu: 0.93 ± 0.08 g / mL; t-testi: p = 0.38, t (6) = -0.94), daha düşük bir büzülme oranına sahip olduğunu ima eder. Bu nedenle, Tokuso aşağıdaki implantasyon ve bazlasyon adımları için kullanıldı. Yukarıdaki deneyi tanımlamanın amacı, herhangi bir markayı önermek değil, deneycilere kürleme sırasında önemli bir hacim değişikliğine uğramayan bir diş çimentosu bulmalarını hatırlatmaktır.
Görüntü kaydırma ölçümü
Kukla taban kaplama prosedürünün taban plakası konumunda orijinal prosedürden daha küçük bir kaymaya neden olup olmadığını araştırmak için sabit bir nesne üzerinde kukla taban kaplama ve orijinal taban kaplama prosedürlerini simüle ettik. Bir taban plakasının ortasındaki 23 G 2.5 cm'lik bir şırınga iğnesini, taban plakasından 1 cm yapışarak sabitlemek için bir ışık kürü yapıştırıcısı kullanılmıştır (Şekil 3C). Daha sonra, iğneleri stereotaksik bir enstrümanın koluyla tutarak taban kaplaması simüle edildi. Laboratuvar hayvanlarını kullanmak yerine, stereotaksik cihazın masasına bir çıkartma yapıştırıldı. Şırınga iğnesi etiketi deldi ve böylece orijinal konumu temsil etti. Daha sonra iğne 0,5 mm yükseltildi ve simülasyon ameliyatlarına başlandı. Bir kerelik baz kaplama prosedürü8'i taklit eden bir ameliyatta, diş çimentosu, etiketin 1 cm yukarısında bulunan taban plakasını kaplayana kadar uygulandı. Daha sonra, etiketi tekrar delmek için iğneyi hafifçe itmeden önce çimentonun sertleşmesi için 2 saatlik bir bekleme süresi vardı. Işık kürü yapıştırıcısı iğneyi tamamen stabilize etmediğinden, iğne, diş çimentosu kuruduktan sonra taban plakasının yerini temsil eden başka bir delik oluşturmak için daha derine itilebilir. İlk delik ile ikinci delik arasındaki mesafe, iğnenin konum kaymasını ölçmek için ölçüldü. Sonuçlar, kafatasının 1 cm yukarısındaki taban plakasının 1.76 ± 0.14 mm'lik bir yer kaymasına neden olduğunu, ancak kukla taban kaplamasının sadece 0.75 ± 0.17 mm'lik bir kayma ile sonuçlandığını göstermiştir (Şekil 3D; bir kerelik taban kaplamasının ortalama kayma mesafesi ve kukla taban kaplaması; t-testi: p < 0.01, t(8) = 6.03).
Ek olarak, diş çimentosunun yüksekliğinin değişimi etkileyip etkilemeyeceğini merak ediyorduk. Bu nedenle, bir kerelik baz kaplama prosedürünü kullanarak daha kısa bir yüksekliği (Şekil 3E; 0,5 cm yukarıda) daha fazla test ettik. Kafatasının 0,5 cm yukarısına sabitlenmiş taban plakası, kafatasının 1 cm yukarısındaki taban plakasından önemli ölçüde daha az kaymıştır (Şekil 3F; ortalama kayma mesafesi: 0,43 ± 0,11 vs 1,76 ± 0,14 mm; t-testi: p < 0,01, t(8) = 9,73). Veriler, taban plakasının kafatasının üzerindeki yüksekliğinin ve taban plakasının kaydırdığı mesafenin pozitif olarak ilişkili olduğunu göstermiştir. Kukla baz kaplama prosedürünü, sadece minimum miktarda diş çimentosu kullanan ikinci bir baz kaplama adımı izlediğinden, bu veriler aynı zamanda kukla baz kaplamanın baz kaplama prosedürünün hassasiyetini artırmaya yardımcı olduğu hipotezini de desteklemektedir.
İki lensli miniskop sistemi kullanarak görüntüleme
Viral infüzyon, kukla bazlasyon ve bazlasyon için cerrahi protokolleri izleyerek (Şekil 2, Şekil 4, Şekil 5), baz kaplama prosedürü sırasında ve fareler serbestçe hareket ederken baz kaplama prosedüründen sonra üç farede (n = 3/5) (Şekil 6A, Ek video S3) bireysel nöronların floresan geçicilerini gözlemledik ve objektif ve röle lensleri arasındaki çalışma mesafesinin aynı kaldığını doğruladık (Şekil 6A1 Şekil 6A3'e karşı, diş çimentosu tamamen kuruduktan sonra pozisyonda sadece hafif bir kayma meydana geldi. Burada, fareler serbestçe hareket ederken bir farenin taban kaplaması (Ek video S2; fare #5) ve ardından kalsiyum görüntüleme (Ek video S3; fare #3, #4, #5; ham veri) videoları sunuyoruz. V3 için veri toplama yazılımının arka plan çıkarma işlevleri içermediğini ve videonun kontrastının çevrimdışı işleme ile iyileştirilebileceğini lütfen unutmayın). Ek video S2 için, floresan sinyalleri için manuel bir arama yapıldı ve daha sonra miniskop ince ayarlamalar için stereotaksik kola tutturuldu. Sondalama sırasında bazı floresan geçicileri gözlenmiştir (Ek video S2; Şekil 6A). Geçici, gri veya beyaz noktalardaki parlaklıkta yumuşak bir kaymadır, yanıp sönen bir ışığa benzeyen bir ateşleme deseni değil; Şekil 6A 1 ila 6A2, geçicilerin görüntülerini göstermektedir. Serbestçe davranan farelerin videosu, taban kaplama prosedürü sırasında ilgi alanına kıyasla kabul edilebilir bir mekansal kayma gösterdi (Ek video S3). Hücrelerin kenar boşlukları bu aşamada önemli ölçüde iyileştirilemedi, çünkü röle lensinin tabanı ile aktif nöronlar arasındaki mesafeyi ayarlayamadık. Özellikle, taban kaplama prosedürü sırasında, tek tip bir arka plan dışında hiçbir şeyin bulunmaması da dahil olmak üzere bazı sorunlar sıklıkla ortaya çıkabilir (Şekil 6B; Ek video S4) veya floresan geçici madde olmadan beyaz hücre kenar boşluklarının görünürlüğü (Şekil 6C; Ek video S5). İki olumsuz sonuç örneği de verilmiştir (n = 2/5) (Şekil 6B, C, Ek videolar S4, S5). Başarısızlıkların olası nedenleri Tartışma bölümünde incelenmiştir. Bu iki fare için cerrahi prosedürler, yolu temizlemek için 1 mm çapında bir iğne kullanılmadan gerçekleştirildi; Böylece, röle lensi doğrudan implante edildi. Fare #2'de, röle lensinin nöronları sıkıştırmış ve bazı nöronları aşağı sürüklemiş olabileceğini ve bunun da hasarlı nöronlara neden olabileceğini öne sürüyoruz. Bu nedenle, floresan geçicileri bulunamadı.
Şekil 1: Miniskobun mekanizmaları ve genellikle görüntüleme başarısızlığına neden olan kusurlar . (A) İki lensli bir sistemde floresan hücrelerin görselleştirilmesi için gerekli mekanizmaları gösteren röle lensinin ve objektif lensin karikatür diyagramı. Her lensin sinyal dalgaları, floresan hücreleri görselleştirmek için bir çalışma mesafesi bulmanın önemini ve mekanizmasını vurgulamaktadır. (A1) Röle GRIN lensi, çalışma mesafesi içindeki hedef nöronların üzerine yerleştirilir. Röle lensinin perdesi 0,5*N olduğundan (burada N bir tamsayıdır), lens ışığı ileterek hedef nöronların görselleştirilmesini sağlar ve orijinal floresan sinyallerini röle lensinin en üstüne getirir. Daha sonra, tam bir sinüzoidal ışık periyodunun yaklaşık 1 / 4'ü objektif GRIN merceğinden (~ 0.25 adım) geçer ve büyütülmüş bir görüntü ile sonuçlanır. (A2) Objektif lens, görüntüleri miniskopun üst kısmında (diyagramdaki yeşil plaka) bulunan tamamlayıcı bir metal-oksit-yarı iletken (CMOS) sensöre iletir. (B) GRIN lens implantasyon prosedürlerinde (B1) iki lensli sistem ile (B2) tek lensli sistem arasındaki farkları gösteren karikatür diyagramı. Genel olarak, en büyük fark, tek lensli sistemin beynin yüzeyini görüntülemek için doğrudan objektif lensini kullanmasıdır; Sonuç olarak, objektif lensin hedef nöronların üzerine implante edilmesi gerekir. (C) Buna karşılık, iki lensli sistemde, karşılaştırıldığında, beyne ek bir röle lensi implante edilir ve objektif lens miniskop içine önceden sabitlenir. (C1) UCLA Miniscope'un V3 versiyonu için taban plakasının şekli, diş çimentosu tamamen kuruduktan sonra düzensiz bir kaymaya neden olabilir. (C2) Bu kayma, röle lensi ile objektif lens arasındaki çalışma mesafesinden yanlış hizalamalara veya sapmalara neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İki lensli miniskop sisteminin başarı oranını artırmak için modifiye protokoller ve ayrıntılı cerrahi protokoller. (A1) İki lensli sistem için modifiye cerrahi protokol. Viral enjeksiyonun yerleri ve röle GRIN lens implantasyonu gösterilmiştir. Kukla baz kaplama, çalışma mesafesinin ilgilenilen nöronları doğru bir şekilde kapsamasını sağlar ve (A2) baz kaplama prosedürü ile ilişkili konumsal kaymayı azaltır. Bu nedenle, (A3) serbestçe davranan farelerde floresan hücreleri görüntüleme olasılığı artar. (B) Viral enjeksiyon adımlarının karikatür görüntüsü ve GRIN lens yerleşimini iletin. (B1) İlk olarak, korteks aspirasyon derinliğinin değerlendirilmesine yardımcı olmak için aspirasyon iğnesini ucundan yaklaşık 1 mm'lik bir kalemle (fare deneyleri için) işaretleyin. Daha sonra, bağ dokusunu ve korteksi (farelerde yaklaşık 1 mm derinliğinde) beyinden aspire edin. (B2) Bir röle lensi implante etmek için ventral hipokampüsü hedef alan olarak kullanın; Özellikle, sert korpus kallozum, kortikal bölgenin aspirasyonunu durdurmak için dönüm noktasıdır. Korpus kallozumun fibröz dokusu aspirasyon sırasında stereomikroskop altında görülebilir. (B3) İkincisi, viral infüzyondan önce bir yolu temizlemek için ilgi noktasını 20 G'lik bir kateterin (yaklaşık 1 mm çapında; çap röle lenininkine benzer) bir iç iğnesiyle delin. Stereomikroskop altında, iğne tarafından oluşturulan bir göçük (resimdeki kesikli daire) görünür olmalıdır. Mikroenjeksiyon iğnesini ve röle lensini göçükte (veya göçüğün merkezinden sadece 250 μm uzakta) indirin. Son olarak, röle GRIN lensini yerleştirin (bu çalışmada, 1 mm çapında bir röle lensi kullandık). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kürlenmiş diş çimentosunun hacim değişiminin ölçümü . (A) İki markanın kürlenmiş diş çimentosu ile bir örnek. Siyah oklar, tozu ve çözeltiyi karıştırdıktan sonra orijinal seviyeleri gösterir. Beyaz oklar, 10, 20 ve 40 dakikalık kürlenmeden sonraki seviyeleri gösterir. Kırmızı oklar, ışık kürü tutkalı ile kapatılmış uçların diplerine işaret eder. (B) Kalan diş çimentolarının tamamen kuruduktan sonra ortalama hacimleri. Çubuklar ve hata çubukları, SEM'± araçlardır. * Öğrencinin t-testi tarafından belirlenen anlamlılığı (P < 0.05) belirtir. (C) Taban plakasının konum kaymasını ölçmek için kullanılan yöntemi açıklayan çizimler ve bir fotoğraf. Taban plakasından bir iğne yapıştırıldı ve orijinal taban kaplama prosedürünü (tek adımlı taban kaplama) ve kukla taban kaplama prosedürünü simüle etmek için kullanıldı. Kırmızı ve siyah oklar, diş çimentosu kürlenmeden önce ve sonra iğnenin yerlerini temsil eder. (D) İğnenin ucundaki ortalama mesafe değişiklikleri (E) Kafatası seviyesinin üzerindeki taban plakası ile konum kayması arasındaki ilişkiyi ölçmek için kullanılan yöntemin çizimleri. (F) İğnenin ucunun ortalama mesafe değişiklikleri. Çubuklar ve hata çubukları, SEM'± araçlardır. ** Öğrencinin t-testi tarafından belirlenen anlamlılığı (P < 0.01) belirtir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ayrıntılı kukla taban kaplama prosedürü (röle lensi implantasyonundan hemen sonra gerçekleştirilir). (A1) Miniskop üzerinde objektif lens, taban plakası ve parafin film montajının üç adımlı karikatürü. (A2) Montajın fotoğraf versiyonu. (B1) Kukla taban kaplama prosedürünü gösteren karikatür. İlk olarak, monte edilen miniskop röle lensi ile hizalanır. Konumlandırılan objektif lens, röle lensine mümkün olduğunca yakındır. İkincisi, taban plakasını çevreleyen parafilme diş çimentosu eklenir ve gelecekteki taban kaplaması için dişi bir kalıp yapmak üzere kafatasına uygulanır. Daha sonra, taban plakası çıkarılır ve kalıplama silikon kauçuğu (pembe) eklenir ve dişi kalıbı ve röle lensini korumak için diş çimentosu ile doldurulur. Hayvanın daha sonra anesteziden kurtulmasına izin verilir. En az 3 hafta sonra, baz kaplama prosedürü gerçekleştirilir. (B2) (B1)'in fotoğraf versiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Taban kaplama prosedürü için adımlar. (A1) Taban plakasını takın ve (A2) netleme kaydırıcısını manuel olarak 2,7 ila 3 mm olarak ayarlayın. 2,7 ila 3 mm'lik bir ayar (resimde gösterilen konumda), floresan hücreleri manuel olarak aramadan önce başlamak için en iyi yer gibi görünmektedir. (B1) İlk karikatür diyagramı, floresan hücrelerin görselleştirilmesi için objektif lens ile röle lensi arasındaki uzunluğun önemini göstermektedir (floresan hücreler genellikle 0,5 ila 2 mm arasında bir mesafede gözlenir). Floresan hücre ortaya çıkmadan önce, araştırmacı röle lensinin kenar boşluğunu görmelidir (üstteki resimdeki oklar). Öncelikle objektifi manuel olarak en uygun görüntüleme konumuna ayarlamak yararlıdır, çünkü elle hızlı ayarlamalar yapmak daha kolaydır. (B2) Yeniden kullanılabilir yapışkan kil stereotaksik kol probu üzerine yerleştirin ve ardından miniskobu yeniden kullanılabilir yapışkan kil ile kola yapıştırarak stabilize edin. Bu aşamada, ilgi alanı değişmiş olabilir, ancak bu, stereotaksik kolu ve yeniden kullanılabilir yapışkan kilini hafifçe ayarlayarak kolayca düzeltilebilir. En uygun ilgi alanını kontrol ettikten ve bulduktan sonra, az miktarda diş çimentosu ekleyin (kırmızı ile temsil edilir). Taban plakasını mümkün olduğunca az diş çimentosu ile yapıştırın. Diş çimentosu kuruduktan sonra miniskobu ve taban plakasını ayırın. Taban plakası yeterince stabil değilse, ek diş çimentosu ekleyin. (C) Bu diyagram, başarıya ulaşmak için her adımın önemini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Baseplating prosedürü sırasında başarı ve başarısızlık örnekleri. (A) Baseplating prosedürü sırasında başarılı görüntüleme örneği. Röle lensi ventral hipokampüsü hedef aldı. Floresan geçicileri, hayvan izofluran ile anestezi altındayken fark edildi (ayrıca bakınız Ek video S2). (A2) Daha iyi görünürlük için kontrast artırıldı. Kırmızı kesikli çizgiler kan damarlarını gösterir. (A3) Floresan, fare ana kafesinde serbestçe davrandığında taban kaplamasından beş gün sonra geçici olarak ortaya çıkar (ayrıca Ek video S3'e bakın; farelerin görüntüleri #3 ve #4 Ek video S3'te de verilmiştir). Pozisyonda sadece hafif bir kayma meydana geldi. (B1) Bir hata örneği. Baz kaplama sırasında, sadece hücre benzeri şekilli olmayan homojen beyaz / gri alanlar fark edildi (ayrıca bakınız Ek video S4). (B2) Röle lensi hedef alanı kaçırdı ve enfekte olmuş hücrelerin olmadığı bir bölgenin üzerinde bulunuyordu. (C1) Başka bir başarısızlık örneği. Bu farede, birçok yuvarlak hücre gözlenmesine rağmen, baz kaplama sırasında (üç haftalık inkübasyondan sonra ve fare anestezi / sedasyon yapılırken) floresan geçicileri gözlenmemiştir. Ayrıca, baz kaplama prosedürü tekrar yapıldığında (inkübasyonun beşinci haftasında) veya hayvan serbestçe davrandığında bile floresan geçici olarak kullanılmamıştır. Görüntü, inkübasyonun beşinci haftasında baz kaplama sırasında elde edildi (ayrıca bakınız Ek video S5). (C2 ve C3) Röle lensi, ventral hipokampusun piramidal tabakasını kaçırdı. Mavi noktalar DAPI ile boyanmış çekirdeklerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sorun | Olası neden | Çözüm | ||
| Baseplating yaparken iyi görüntüleme vardı ama ertesi gün tamamen odak dışında | Deneğin kafatası ile taban plakası arasındaki diş çimentosunun kürlenmesi üzerine hacim değişikliği | Bu raporda önerildiği gibi lens implantasyon prosedüründen sonra "kukla baz kaplama" işlemine devam edin. Daha az hacim değişimi olan bir diş çimentosu seçin. | ||
| Taban kaplaması sırasında hücre benzeri bir şekle sahip olmayan homojen beyaz/gri alanlara sahiptir (ayrıca ek video S4'e bakın) | A. Röle lensi hedef alanı kaçırdı B. Floresan göstergesinin kötü ifadesi C. Floresan göstergesinin gerçekte ifade edildiği miniskobun altına objektif bir lens takmayı unutun | C. Ameliyatları uygulamak için kukla lensler kullanın. İmplantasyon uygulamasından sonra kukla lensin koordinatlarını kontrol edin B. Kalsiyum görüntüleme deneyleri için optimal bir viral titre bulun (Resendez et al. 2016'ya atıfta bulunulur). Herhangi bir nedenle, ön test yapılamıyorsa, yeni başlayanların önce daha yüksek bir titre denemelerini öneririz. (Ayrıntılar için Disscusion bölümüne bakın) C. Objektif bir GRIN lense vidalayın (~ 0.25 pitch. örn: Edmund Optics; Stok #64-519) miniskopun alt kısmında. | ||
| Baz kaplama sırasında birçok hücreyi gözlemleyin, ancak floresan dinamiği yok | A. Sağlıksız nöronlar veya ölü nöronlar B. Seyrek fining tipi nöronlar C. Derin anestezi durumu | C. Her cerrahi işlem için dikkatli olun. Lens implantasyonu ile basıncı serbest bırakmak için önce infüzyon / implantasyon yolunu kesmek için röle lensinizin çapına benzer yeni bir şırınga iğnesi kullanın. Virüsü yavaşça aşılayın ve lensi yavaşça implante edin. B. Nöronların aktivitelerini izlemek için daha uzun süre bekleyin veya fareyi uyarmak için kuyruğu biraz sıkıştırın. C. Baseplating invaziv bir prosedür değildir ve hayvanın sadece sedasyona ihtiyacı vardır. Bu nedenle, hayvan stereotaksik çerçeve üzerinde hareket edemediği sürece% 1.2 ~% 0.8 izofluran korumak yeterlidir. | ||
Tablo 1: Sorun giderme grafiği.
Ek video S1: Diş çimento hacim testi. Hacim arasındaki fark, diş çimento preparatının başlangıcında ölçülmüş ve çimentodan sonraki hacim kurumuştur. İki marka diş çimentosu (örneğin, Tempron ve Tokuso Curefast) test edildi. Kuruduktan sonra diş çimentosunun hacmini test etmek için, her bir diş çimento tozunun 0.5 g'ı tartıldı ve uygun çözeltisi (1 mL) ile karıştırıldı. Daha sonra, 0.1-10 μL pipet uçları, 2.5 μL diş çimento karışımı ile yüklendi ve ışık kürlü yapıştırıcı ile kapatıldı. Daha sonra, uçlar bir rafa yerleştirildi, diş çimento karışımlarının yüzeyleri işaretlendi ve 40 dakika boyunca videoya çekildi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek video S2: Taban kaplama prosedürünün gösterileri. Objektif lensin yüzeyi ile röle lensi arasındaki açı, z ekseni üzerindeki kulak çubuğu, diş çubuğu veya yeniden kullanılabilir yapışkan kil döndürülerek ayarlandı. Röle lensinin kenar boşluğu, monitörde ay benzeri gri bir daire olarak görünüyordu. Başarılı viral ekspresyon ve lens implantasyonu, bazlasyon sırasında en az bir floresan dinamiği (ok) ortaya çıkarmalıdır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek video S3: Serbestçe davranan farelerde floresan dinamiklerinin gösterilmesi. Floresan geçici farelerden #3, #4 ve #5. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek video S4: Bir hata örneği. Taban kaplama prosedürü sırasında tek tip bir arka plan ortaya çıktı. Parlaklıktaki değişikliğin, tek tek hücrelerin floresan geçicilerinden kaynaklanmadığını lütfen unutmayın; arama prosedüründen kaynaklandı. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek video S5: Başka bir hata örneğinin gösterilmesi. Baz kaplama prosedürü sırasında floresan geçici eksikliği meydana geldi, ancak bazı yuvarlak hücre kenar boşlukları hala görülebiliyordu. Parlaklıktaki değişikliğin, tek tek hücrelerin floresan geçicilerinden kaynaklanmadığını lütfen unutmayın; arama prosedüründen kaynaklandı. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu rapor, iki lensli UCLA Miniskop sistemini kullanan araştırmacılar için ayrıntılı bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Protokolümüzde tasarlanan araçlar, in vivo kalsiyum görüntülemeyi denemek isteyen herhangi bir laboratuvar için nispeten uygundur. Viral enjeksiyon, lens implantasyonu, kukla baz kaplama ve baz kaplama gibi bazı protokoller, kalsiyum görüntülemenin başarı oranını artırmak için miniskop sisteminin diğer versiyonları için de kullanılabilir. Viral enjeksiyon ile ilgili genel problemler ve miniskop versiyonundan bağımsız olarak düzeltilmesi gereken lens implantasyonu dışında, UCLA taban plakasının yapısı, objektif ve röle lensleri arasında uyumsuz çalışma mesafelerine yol açabilecek konumsal bir kaymaya neden olabilir (Şekil 1C). İki lensin konumsal kaymasını en aza indirmek için modifiye edilmiş bir deneysel protokol geliştirilmiştir (Şekil 2, Şekil 4, Şekil 5). Başarılı kalsiyum görüntüleme, başarılı viral ekspresyon, lens implantasyonu ve bazlasyon prosedürlerinin bir kombinasyonu ile elde edilebilir (Şekil 5C). Derin beyin bölgelerini gözlemlemek için iki lensli bir sistem kullanmak, temel kaplama prosedürlerinde yüksek düzeyde doğruluk gerektirir, çünkü implante edilmiş röle lensinin ve objektif lensin göreceli konumlarının da doğru olması gerekir. Bu rapor sadece baz kaplama sorunlarını çözen bir protokol sunmakla kalmaz, aynı zamanda viral enjeksiyon ve lens implantasyonu için bazı ipuçlarını da tartışır. Aşağıda, önce baz kaplama prosedürlerini, ardından viral enjeksiyonu ve lens implantasyon prosedürlerini tartışıyoruz ve bazı başarısızlık örneklerini açıklıyoruz (Şekil 6).
Taban kaplaması
UCLA Miniscope'un V3 versiyonu şu anda en yaygın kullanılan tasarımdır ve çevrimiçi olarak sipariş edilebilir. Bu versiyonun taban plakası duvarsız iki kenardan oluşur (Şekil 1C1), ancak diş çimentosu tamamen kuruduktan sonra şekli düzensiz bir kaymaya (Şekil 1C1, C2) neden olabilir. Protokolümüzdeki kukla baz kaplama prosedürleri (Şekil 4), yanlış hizalama ve taban plakası kaydırma sorunlarını en aza indirir, çünkü gerçek baz kaplama sırasında diş çimentosu için mevcut alanı azaltmak için parafin film kullanır (Şekil 5B). Kalan alan, gerçek bazallama prosedürü sırasında optimal bir görüntüleme pozisyonu bulmak için hala yeterlidir. Bu nedenle, araştırmacı taban plakasını mümkün olduğunca az diş çimentosu ile yapıştırabilir (Şekil 5B2). Ek olarak, kukla taban kaplama prosedürü nispeten az zaman alır (yaklaşık 15 ila 20 dakika), çünkü objektif lens ile röle lensi arasında mükemmel bir mesafe gerektirmez. Bununla birlikte, kukla baz kaplama, başarılı kalsiyum görüntüleme için anahtar faktörlerden sadece biridir; Örneğin, floresan sinyallerinin izlenmesi sırasında, nöronlar çalışma düzleminin biraz dışındaysa bulanık görünebilir (röle lensinin çalışma mesafesine bağlı olarak; genellikle yaklaşık 100 ~ 300 μm). Çalışma mesafesini iyileştirme yeteneği sınırlıdır, çünkü nöronların çalışma mesafesi röle lens implantasyon prosedürü ile önceden belirlenir. Kukla baz kaplama prosedürü olmadan bir deney yapıldı ve ilgi alanı her zaman (dört fareden dördünde) bir kerelik baz kaplamadan sonra kaçırıldı. Bu nedenle, bu çözümler büzülme sorununu azaltmak için tasarlanmıştır. Bazı hafif kürlü diş çimentoları, kürleme sırasında büzülme problemini önleyebilir, çünkü çok hızlı bir şekilde iyileşirler; Bu çimentolar, araştırmacıların baz kaplama prosedürü sırasında mesafeyi ayarlamalarına yardımcı olabilir. Kalsiyum göstergelerini heyecanlandırmak ve diş çimentosunu kürlemek için dalga boylarının aralığı farklı olsa da, baz kaplama prosedürü sırasında fotobeyazlatmanın önlenmesi gerekir. Fotobeyazlatmayı önlemek için, kalsiyum göstergeleri ile ışık kürlü diş çimentosu arasındaki çapraz reaksiyonları önlemek için ışık kaynağı tarafından üretilen dalga boylarının aralığının oldukça dar olması gerekir. Bu nedenle, baz kaplama prosedürü için ışık kürlü diş çimentosu kullanılması önerilmez. Ek olarak, bazı özel dental çimento markaları, diğer araştırma ekipleri tarafından taban plakalarının yapıştırılmasında sıklıkla kullanılmaktadır 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . Bu çimentoların düşük büzülme özellikleri sorunu çözebilir, ancak satın almada (ithal etmedeki) zorluklar nedeniyle bu markaları test etme fırsatımız olmadı. Tıbbi sınıf ürünler, ülkeye/bölgeye bağlı olarak ithalat düzenlemelerine tabi olabilir. Araştırmacılar literatürde bahsedilen çimentolara erişmekte güçlük çekerler 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, protokolümüz dental çimento büzülmesi sorununu çözecektir.
Büzülme sorununa ek olarak, birçok deney sırasında miniskobun kendisinde ve taban plakasında (özellikle taban plakasındaki mıknatıslar) yapısal aşınma meydana gelebilir. Aşınmanın neden olduğu küçük boşluklar, iki lens arasındaki mesafenin dengesini azaltır. Yine, tüm optik yol üzerindeki doğruluk, bir miniskop kullanarak serbestçe davranan farelerde kalsiyum geçicilerinin görüntülenmesinin anahtarıdır.
Viral enjeksiyon/lens implantasyonu sorunlarını giderme
Virüsü beyin bölgesine aşılamadan önce, stereotaksik kola yeni bir iğne monte etmeniz ve beyni uygun koordinatlarda yavaşça delmeniz önerilir. Yeni iğne çok keskin olduğu için, bu delme işlemi gerçek mikroenjeksiyon iğnesi ve röle lensi için yolu temizlemek (veya bir yolu kesmek) için bir hazırlık adımı görevi görür ve mikroenjeksiyon iğnesinden veya röle merceğinden sıkıştırmanın neden olabileceği doku hasarını en aza indirir. Keskin iğne, künt röle lensi için bir yol keser; Bu nedenle, iğnenin ucu röle lensi ile aynı koordinatlara indirilmelidir. 20 G I.V. kateterinin iç iğnesi, röle lensimizin çapına benzer şekilde 1 mm'lik bir çapa sahip olduğu için seçildi. Röle lensinin çapına bağlı olarak farklı bir iğne ölçer kullanılabilir.
Bu çalışmada viral vektörlerin özellikleri ve titreleri üzerinde durulmamış olsa da, bu faktörler başarılı kalsiyum görüntüleme için hala kritik öneme sahiptir (Şekil 5C). Viral vektörün ekspresyon kalitesini önceden test etmek gerekir. Resendez ve ark.'nın protokolünün 1 ila 5. adımları, kalsiyum görüntüleme deneyleri için optimal bir viral titrenin tanımlanması için ayrıntılı yöntemler sağlar8. Herhangi bir nedenle ön test yapılamıyorsa, yeni başlayanların önce nispeten yüksek bir titre denemeleri önerilir. Yüksek viral titre kullanmanın dezavantajlarından biri issitotoksisite8. Ölü nöronlar otofloresana yol açar ve miniskop8'in altında parlak beyaz lekeler olarak görülebilir. Bununla birlikte, bu ölü nöronlar, yeni başlayanlar için baz kaplama prosedürünü bulmak ve uygulamak için iyi bir işarettir. Öte yandan, düşük titreli bir virüsün infüzyonu hücreleri öldürme riski daha düşük olmasına rağmen, hücreler baz kaplama prosedürü sırasında herhangi bir floresan geçici göstermiyorsa, floresan arka plan tarafından maskelenebilir. Başarısızlığın nedenlerini belirlemek zordur, çünkü röle lensi lens implantasyonu veya viral vektörün zayıf ekspresyonu nedeniyle hedef nöronlar kaçırılabilir. Nedeni belirlemek, histolojik doğrulama olmadan çok kafa karıştırıcıdır. Bu nedenle, viral vektörler önceden test edilemiyorsa nispeten yüksek titreli virüslerin kullanılması önerilir.
Resendez ve ark. mikroenjeksiyon iğnesinin lensin yerleştirilmesine 250 μm lateral ve ventral olarak yerleştirilmesini önermektedir. Gözlemlerimiz, virüsün röle lensiyle aynı derinlikte infüzyonunun da iyi kalsiyum sinyallerinin ekspresyonuna yol açabileceğini göstermiştir. Enfeksiyon ve yayılma olasılığı nedeniyle, virüsün röle lensinin koordinatı ile aynı derinlikte infüze edilmesinin, doku hasarını azaltmak ve enfekte olmuş nöronlar ile röle lensi arasındaki mesafenin doğruluğunu artırmak için en uygun olduğunu öneriyoruz. Resendez ve ark. ayrıca hedef hücreler ile röle lensi arasındaki dar çalışma mesafeleri aralığı göz önüne alındığında aynı ameliyat sırasında viral enjeksiyon ve lens implantasyonu yapılmasını önermektedir8. Bununla birlikte, bazı araştırmacılar viral infüzyon adımının ve lens implantasyon adımının18,26 hafta arayla iki (veya daha fazla) kez gerçekleştirildiği bir protokolü takip etmektedir. Adımlar arasındaki süreyi uzatmak, bireysel ameliyat süresini azaltır. Ancak bu protokolde bu iki adım tek bir ameliyatta birleştirildi, çünkü tek ameliyat protokolünde, cerrah mikroenjeksiyon iğnesi ile röle lensi arasındaki pozisyonu hedef bölgeye indirirken izleyebilir ve bu da başarısız hedefleme olasılığını azaltır (Şekil 2B3).
İki fare için (fareler #1 ve #2), lens için bir yol oluşturmak için bir iğnenin kullanılması da ihmal edildi ve fare #2'de yuvarlak hücre benzeri gri lekeler gözlendi (Şekil 6C). Bununla birlikte, floresan dinamikleri (Ek video S5) gözlenmemiştir. Bu örneğin beyin dilimini inceledikten sonra (Şekil 6C2, C3), röle lensinin indirilirken bazı hücreleri aşağı sürüklediğini varsaydık. Bu sürüklenen nöronlar sağlıksızdı, bu nedenle baz kaplama prosedürü sırasında veya deney sırasında hiçbir aktivite fark edilmedi.
Taban kaplama prosedürü sırasında tamamen homojen gri sinyale sahip ve görünür hücre benzeri görüntüler olmayan bir faremiz vardı (Şekil 6B1). Fareyi feda ettikten sonra beyin dilimleri gözlendi. Lensin kavisli piramidal tabakanın medial tarafında olduğu fark edildi; hedef alan (Şekil 6B2) tamamen kaçırılmıştır. Bu başarısız girişimler, ameliyat protokolümüzü değiştirmemize ve nihayetinde üç fareyle başarılı olmamıza yol açan kritik deneyimlerdi (Ek video S3).
Mikroenjeksiyon iğnesi
Korpus kallozum, dorsal hipokampüsü kaplayan sert fibröz bir yoldur. Sertliği nedeniyle, düz uçlu bir mikroenjeksiyon iğnesi ile penetrasyona karşı dirençlidir. Bu nedenle, eğimli uçlu bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanmanızı öneririz. Bu tip iğne sadece doku hasarını azaltmakla kalmaz, aynı zamanda yakındaki lifler tarafından tıkanma nedeniyle virüsün hedef bölgeye infüze edilememesi olasılığını da azaltır. Yukarıda belirtilen sorunları bir sorun giderme tablosunda özetledik (Tablo 1).
Zaman dilimi
Tüm prosedürün zaman dilimi, birimler olarak günlerle birlikte Şekil 2A'da özetlenmiştir. Ayrıntılı olarak, cerrahi kısım (viral enjeksiyon, röle lens implantasyonu, kukla baz kaplama) yeni başlayanlar için 3 saat veya yeterince eğitimli araştırmacılar için 1,5 saat sürebilir. Fareler küçük bir vücut boyutuna ve hızlı metabolizmaya sahiptir ve anestezi altında uzun sürelerin neden olduğu sağlık sorunlarına karşı daha büyük türlere göre daha hassastırlar27. Araştırmacılar ameliyatta geçirilen süreyi 3 saatin altında tutmayı hedeflemelidir. Gerçek baz kaplama, 3 ila 6 haftalık kalsiyum göstergesi ekspresyonundan sonra yapılabilir. Bu prosedür 1 saat sürebilir. Sonraki uzunlamasına kalsiyum aktivitesi gözlemi 1 aydan fazla devam edebilir.
Sonuç
UCLA Miniscope, açık kaynaklı bir in vivo kalsiyum görüntüleme cihazıdır. Hazır, önceden monte edilmiş bir taban plakası veya lens modülü olmadan, deney yapan kişilerin, taban kaplama prosedürü sırasında objektif lens ile röle lensi arasındaki optimum mesafeyi doğru bir şekilde elde edebilmeleri gerekir. İki lensli UCLA Miniskop sistemini kullanmanın artan zorluğu, diş çimentosunun hacim değişiminde yatmaktadır. Orijinal protokolleri optimize ettik ve yukarıda belirtilen sorunlardan kaynaklanan kusurları en aza indirdik, böylece iki lensli UCLA Miniskop sistemi ile kalsiyum görüntülemenin başarı oranını artırdık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu endüstri destekli bir çalışma değildir. Yazarlar finansal çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
