Summary
Krympingen av dental sement under herding forskyver grunnplaten. Denne protokollen minimerer problemet ved å skape et første fundament av tannsementen som gir plass til å sementere grunnplaten. Noen uker senere kan bunnplaten sementeres på plass på dette stillaset ved hjelp av lite ny sement, og dermed redusere krympingen.
Abstract
Nevrologer bruker miniatyrmikroskoper (miniskoper) for å observere nevronaktivitet hos dyr som oppfører seg fritt. University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet gir åpne ressurser for forskere å bygge miniskoper selv. V3 UCLA Miniscope er et av de mest populære open source-miniskopene som er i bruk. Det tillater avbildning av fluorescenstransienter som sendes ut fra genetisk modifiserte nevroner gjennom en objektiv linse implantert på overfladisk cortex (et linsesystem), eller i dype hjerneområder gjennom en kombinasjon av en relélinse implantert i den dype hjernen og en objektivlinse som er forankret i miniskopet for å observere det videresendte bildet (et to-linsesystem). Selv under optimale forhold (når nevroner uttrykker fluorescensindikatorer og relélinsen er riktig implantert), kan en volumendring av tannsementen mellom baseplaten og dens feste til skallen ved sementherding forårsake feiljustering med en endret avstand mellom objektiv- og relélinsene, noe som resulterer i dårlig bildekvalitet. En baseplate er en plate som hjelper til med å montere miniskopet på skallen og fikser arbeidsavstanden mellom objektivet og relélinsene. Dermed endrer endringer i volumet av dental sement rundt grunnplaten avstanden mellom linsene. Den nåværende protokollen tar sikte på å minimere feiljusteringsproblemet forårsaket av volumendringer i tannsementen. Protokollen reduserer feiljusteringen ved å bygge et første fundament av tannsement under relélinseimplantasjon. Rekonvalesenstiden etter implantasjon er tilstrekkelig til at fundamentet av tannsement kan herde bunnplaten helt, slik at grunnplaten kan sementeres på dette stillaset med så lite ny sement som mulig. I denne artikkelen beskriver vi strategier for baseplettering hos mus for å muliggjøre avbildning av nevronaktivitet med en objektiv linse forankret i miniskopet.
Introduction
Fluorescerende aktivitetsreportere er ideelle for avbildning av nevronaktiviteten fordi de er følsomme og har store dynamiske områder 1,2,3. Derfor bruker et økende antall eksperimenter fluorescensmikroskopi for direkte å observere nevronaktivitet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Det første miniatyriserte en-foton fluorescensmikroskopet (miniskop) ble designet i 2011 av Schnitzer et al.5. Dette miniskopet gjør det mulig for forskere å overvåke fluorescensdynamikken til cerebellarceller i fritt oppførende dyr5 (dvs. uten fysisk begrensning, hodestøtte, sedasjon eller anestesi til dyrene). For tiden kan teknikken brukes til å overvåke overfladiske hjerneområder som cortex 6,8,15,16; subkortikale områder som dorsal hippocampus 8,11,13,14 og striatum 6,17; og dype hjerneområder som ventral hippocampus 14, amygdala 10,18 og hypothalamus 8,12.
De siste årene har flere open source-miniskoper blitt utviklet4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskopet kan settes sammen økonomisk av forskere hvis de følger trinnvise retningslinjer gitt av University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet4,7,11,13. Fordi optisk overvåking av nevral aktivitet er begrenset av begrensningene i lysoverføring7 til og fra den nevrale populasjonen av interesse, ble et miniskop designet som krever at en objektiv gradientbrytningsindeks (GRIN) linse (eller objektivlinse) skal forankres nederst i miniskopet for å forstørre synsfeltet som videresendes fra et relé GRIN-objektiv (eller relélinse)6,7,8,10,16,17. Denne relélinsen er implantert i målhjerneområdet slik at fluorescensaktiviteten til målhjerneområdet blir videresendt på overflaten av relélinsen6,7,8,10,16,17. Omtrent 1/4 av en full sinusformet periode med lys beveger seg gjennom den objektive GRIN-linsen (~ 0,25 tonehøyde) (Figur 1A1), noe som resulterer i et forstørret fluorescensbilde6,7. Objektivlinsen er ikke alltid festet i bunnen av miniskopet, og implantasjonen av relélinsen er heller ikke nødvendig6,7,11,13,15. Spesielt er det to konfigurasjoner: en med en fast objektivlinse i miniskopet og en relélinse implantert i hjernen8,10,12,14,16 (Figur 1B1) og en annen med bare en flyttbar objektivlinse6,7,11,13,15 (Figur 1B2). I designet basert på kombinasjonen av fast mål og implantert relélinse, bringes fluorescenssignalene fra hjernen til den øverste overflaten av relélinsen (Figur 1A1)7,8,10,12,14,16. Deretter kan objektivlinsen forstørre og overføre synsfeltet fra den øverste overflaten av relélinsen (Figur 1A2). På den annen side er den flyttbare objektive GRIN-linsedesignen mer fleksibel, noe som betyr at preimplantasjon av en relélinse i hjernen ikke er obligatorisk (Figur 1B2)6,7,11,13,15. Når du bruker et miniskop basert på en flyttbar objektivlinsedesign, trenger forskere fortsatt å implantere en linse i målhjerneområdet, men de kan enten implantere en objektivlinse6,7,11,13,15 eller en relélinse i hjernen6,7. Valget av et mål eller en relélinse for implantasjon bestemmer miniskopkonfigurasjonen som forskeren må bruke. For eksempel er V3 UCLA Miniscope basert på en flyttbar objektiv GRIN-linsedesign. Forskere kan velge å enten implantere en objektiv linse direkte i hjerneområdet av interesse og montere det "tomme" miniskopet på objektivlinsen6,7,11,13,15 (et system med ett objektiv; Figur 1B2) eller å implantere en relélinse i hjernen og montere et miniskop som er forankret med en objektivlinse6,7 (et system med to linser; Figur 1B1). Miniskopet fungerer deretter som et fluorescenskamera for å fange livestream-bilder av nevronfluorescens produsert av en genetisk kodet kalsiumindikator1,2,3. Etter at miniskopet er koblet til en datamaskin, kan disse fluorescensbildene overføres til datamaskinen og lagres som videoklipp. Forskere kan studere nevronaktivitet ved å analysere de relative endringene i fluorescens med noen analysepakker20,21 eller skriv kodene deres for fremtidig analyse.
V3 UCLA Miniscope gir brukerne fleksibilitet til å bestemme om de skal avbilde nevronaktivitet med et ett- eller tolinsesystem7. Valget av opptakssystem er basert på dybden og størrelsen på målhjerneområdet. Kort sagt, et objektivsystem kan bare avbilde et område som er overfladisk (mindre enn ca. 2,5 mm dypt) og relativt stort (større enn ca. 1,8 x 1,8 mm2) fordi produsentene bare produserer en viss størrelse objektivlinse. I motsetning til dette kan et to-linsesystem brukes på et hvilket som helst målhjerneområde. Imidlertid har tannsementen for liming av grunnplaten en tendens til å forårsake feiljustering med en endret avstand mellom objektiv- og relélinsene, noe som resulterer i dårlig bildekvalitet. Hvis tolinsesystemet brukes, må to arbeidsavstander målrettes nøyaktig for å oppnå optimal bildekvalitet (figur 1A). Disse to kritiske arbeidsavstandene er mellom nevronene og bunnen av relélinsen, og mellom den øverste overflaten av relélinsen og den nederste overflaten av objektivlinsen (figur 1A1). Enhver feiljustering eller feilplassering av objektivet utenfor arbeidsavstanden resulterer i bildefeil (figur 1C2). I motsetning til dette krever systemet med ett objektiv bare én presis arbeidsavstand. Imidlertid begrenser objektiv linsestørrelse dens anvendelse for overvåking av dype hjernegrupper (objektivlinsen som passer til miniskopet er ca. 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Derfor er implantasjon av en objektiv linse begrenset for observasjon av overflaten og relativt store hjernegrupper, som cortex 6,15 og dorsal cornu ammonis 1 (CA1) hos mus11,13 . I tillegg må et stort område av cortex aspireres for å målrette dorsale CA111,13. På grunn av begrensningen i en-linsekonfigurasjonen som forhindrer avbildning av dype hjerneregioner, tilbyr kommersielle miniskopsystemer bare en kombinert objektivlinse / relélinse (to-linse) design. På den annen side kan V3 UCLA-miniskopet modifiseres til enten et objektiv- eller tolinsesystem fordi objektivlinsen er flyttbar 6,11,13,15. Med andre ord kan V3 UCLA-miniskopbrukere dra nytte av den flyttbare linsen ved å implantere den i hjernen (lage et linsesystem), når de utfører eksperimenter som involverer overfladiske hjerneobservasjoner (mindre enn 2,5 mm i dybden), eller ved å forankres det i miniskopet og implantere en relélinse i hjernen (lage et to-linsesystem), når du utfører eksperimenter som involverer dype hjerneobservasjoner. To-linsesystemet kan også brukes til overfladisk observasjon av hjernen, men forskeren må vite de nøyaktige arbeidsavstandene mellom objektivlinsen og relélinsen. Den største fordelen med ettlinsesystemet er at det er en redusert sjanse for å savne arbeidsavstandene enn med et tolinsesystem, gitt at det er to arbeidsavstander som må målrettes nøyaktig for å oppnå optimal bildekvalitet i tolinsesystemet (figur 1A). Derfor anbefaler vi å bruke et linsesystem for overfladiske hjerneobservasjoner. Men hvis eksperimentet krever avbildning i det dype hjerneområdet, må forskeren lære å unngå feiljustering av de to linsene.
Den grunnleggende protokollen for to-linsekonfigurasjon av miniskoper for eksperimenter inkluderer linseimplantasjon og baseplettering 8,10,16,17. Baseplating er liming av en baseplate på et dyrs hode slik at miniskopet til slutt kan monteres på toppen av dyret og videobånd fluorescenssignalene til nevroner (figur 1B). Denne prosedyren innebærer å bruke tannsement til å lime baseplaten på skallen (figur 1C), men krymping av tannsement kan forårsake uakseptable endringer i avstanden mellom den implanterte relélinsen og objektivlinsen 8,17. Hvis den forskjøvede avstanden mellom de to linsene er for stor, kan ikke cellene bringes i fokus.
Detaljerte protokoller for dype hjernekalsiumavbildningseksperimenter ved hjelp av miniskoper er allerede publisert8,10,16,17. Forfatterne av disse protokollene har brukt Inscopix-systemet8,10,16 eller andre tilpassede design17 og har beskrevet de eksperimentelle prosedyrene for virusseleksjon, kirurgi og baseplatefeste. Protokollene deres kan imidlertid ikke brukes nøyaktig på andre open source-systemer, for eksempel V3 UCLA Miniscope-systemet, NINscope6og Finchscope19. Feiljustering av de to linsene kan oppstå under opptaket i en to-linsekonfigurasjon med et UCLA-miniskop på grunn av typen tannsement som brukes til å sementere grunnplaten til skallen8,17 (Figur 1C). Den nåværende protokollen er nødvendig fordi avstanden mellom den implanterte relélinsen og objektivlinsen er tilbøyelig til å skifte på grunn av uønsket krymping av tannsement under basepletteringsprosedyren. Under baseplettering må den optimale arbeidsavstanden mellom den implanterte relélinsen og objektivlinsen finnes ved å justere avstanden mellom miniskopet og toppen av relélinsen, og baseplaten skal deretter limes på dette ideelle stedet. Etter at riktig avstand mellom objektivlinsen og den implanterte relélinsen er angitt, kan langsgående målinger oppnås ved cellulær oppløsning (Figur 1B; in vivo innspilling). Siden det optimale spekteret av arbeidsavstander for et reléobjektiv er lite (50 - 350 μm)4,8, kan overdreven sementkrymping under herding gjøre det vanskelig å holde objektivlinsen og den implanterte relélinsen innenfor riktig område. Det overordnede målet med denne rapporten er å gi en protokoll for å redusere krympeproblemene8,17 som oppstår under basepletteringsprosedyren og for å øke suksessraten for miniskopopptak av fluorescenssignaler i en tolinsekonfigurasjon. Vellykket miniskopopptak er definert som opptak av en livestream av merkbare relative endringer i fluorescensen til individuelle nevroner i et fritt oppførende dyr. Selv om forskjellige merker av dental sement har forskjellige krympehastigheter, kan forskere velge et merke som tidligere er testet6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Imidlertid er ikke alle merker enkle å få tak i i enkelte land/regioner på grunn av importforskriftene for medisinsk materiale. Derfor har vi utviklet metoder for å teste krympehastigheten til tilgjengelige tannsement og, viktigere, gi en alternativ protokoll som minimerer krympeproblemet. Fordelen i forhold til den nåværende basepletteringsprotokollen er en økning i suksessraten for kalsiumavbildning med verktøy og sement som lett kan oppnås i laboratorier. UCLA-miniskopet brukes som et eksempel, men protokollen gjelder også for andre miniskoper. I denne rapporten beskriver vi en optimalisert grunnpletteringsprosedyre og anbefaler også noen strategier for montering av UCLA-miniskopets tolinsesystem (Figur 2A). Både eksempler på vellykket implantasjon (n = 3 mus) og eksempler på mislykket implantasjon (n = 2 mus) for tolinsekonfigurasjonen med UCLA-miniskopet presenteres sammen med diskusjonene på grunn av suksessene og fiaskoene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av National Taiwan University Animal Care and Use Committee (godkjenningsnr.: NTU-109-EL-00029 og NTU-108-EL-00158).
1. Vurdering av volumendring av dental sement
MERK: Endringer i volumet av dental sement oppstår under herdeprosessen. Test volumendringene av dental sement før implantasjon og baseplating. Forskere kan teste ethvert merke av dental sement og bruke merket med lavest volumendring for å sementere grunnplaten. Et eksempel er vist i figur 3.
- Vei 0,5 g av hvert tannsementpulver og bland det med riktig løsning (1 ml).
MERK: Det anbefalte pulver / væskeforholdet i tannsementinstruksjonene er 0,5 g pulver til 0,25 ml av løsningen for å oppnå en fast form. Denne testprotokollen fortynner forholdet til 0,5 g/ml slik at blandingen kan aspireres i flytende form for å måle volumendringen i pipettespisser. - Bruk 0,1-10 μL pipettespisser for å fjerne 2,5 μL av tannsementblandingen, og forsegl deretter pipettespissen med et lett herdende lim.
- Plasser spissene på et stativ, merk de øverste nivåene av tannsementblandingen, og mål nivået på tannsementblandingen etter 40 min (tilleggsvideo S1).
- I tillegg til å overvåke nivåendringene under tannsementherdingen i spissene, måles den gjenværende tørre tannsementtettheten. For å beregne tettheten måler du vekten av tannsementen, og måler volumet med Archimedes 'prinsipp.
- Kort sagt, legg den gjenværende tørre tannsementen i en kopp fylt med vann, og vei vannet som renner over.
- Bruk tannsementen med minst krymping for alle protokollene som er beskrevet nedenfor.
2. Anestesi, kirurgisk implantasjon, viral injeksjon og dummy baseplating
- Anestesi
MERK: Denne rapporten tar sikte på å optimalisere kirurgi og baseplating prosedyre for UCLA miniscope; Derfor ble det antatt at den optimale virale titer for infisering av målhjernegruppene var kjent. Metodene for å finne den optimale virale titeren finnes i trinn 1 til 5 i Resendez et al.8. Når virusfortynningen er optimalisert, kan kirurgisk implantasjon initieres.- Plasser musen i en induksjonsbeholder og tilfør oksygen (100 % ved en luftstrømningshastighet på 0,2 l/min). Preoxygenate musen i 5 til 10 min.
- Administrer 5 % isofluran blandet med 100 % oksygen (luftstrømshastighet: 0,2 l/min) til musen begynner å miste balansen og til slutt blir bedøvet.
- Fjern musen fra induksjonskammeret og injiser atropin (0,04 mg/kg; subkutan injeksjon) for å forhindre akkumulering av spytt og buprenorfin (0,03 mg/kg; subkutan injeksjon) som smertestillende.
- Barber musens hode.
- Bruk maske, steril kjole og hansker. Forbered et sterilt rom og sterile kirurgiske instrumenter for kirurgi. Stabiliser musens hode (oppretthold anestesi med 3 til 2,5% isofluran i løpet av dette trinnet) på det stereotaktiske apparatet. Etter smertestillende og anestetiske prosedyrer, sørg for at ørestengene stabiliserer hodet sikkert. Gi termisk støtte.
- Sørg for at hodet er satt i en rett stilling, steriliser det barberte hodet med betadin, og spray deretter hodet med xylokainen (10%), et lokalt smertestillende middel.
- Påfør veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet.
MERK: Bruk oftalmisk salve for øyebeskyttelse under alle bedøvelseshendelser for å forhindre okulær skade. - Test dyrets dype smerterefleks ved å klemme bakpoten. Når dyret ikke viser poteuttaksrefleks, fortsett med kirurgiske prosedyrer.
- Lag et lite snitt langs midten av sagittalplanet av skallen (starter fra ca. 2 mm foran bregma og slutter ca. 6 mm bakover til bregma). Rengjør deretter bindevevet på skallen, og forankre tre rustfrie stålskruer på venstre frontale og interparietale bein.
- På dette tidspunktet reduseres isofluran til 1-2 %. Overvåk pustefrekvensen under hele den kirurgiske prosedyren. Hvis pustefrekvensen er for lav (ca. 1/s, avhengig av dyret), reduseres konsentrasjonen av isofluran.
- Utfør en kraniotomi for relélinseimplantasjonen under et kirurgisk mikroskop eller stereomikroskop ved å bruke et burrbor med en diameter på 0,7 mm. Bruk en mikrobor for å ta tak i borkronen og tegne et omriss av det tiltenkte sirkelområdet (hele tykkelsen på calvarium trenger ikke å penetreres).
MERK: Reléobjektivet som ble brukt i den nåværende protokollen hadde en diameter på 1,0 mm, en lengde ~ 9,0 mm en stigning på 1 og et arbeidsavstandsområde på ~ 100 μm - 300 μm; Derfor hadde kraniotomien en diameter på 1,2 mm.- Utdyp omrisset forsiktig til duraen er eksponert.
- Tilbered 3 ml sterilt saltvann i en 3 ml sprøyte og avkjøl den i en isbøtte. Skyll det eksponerte området ofte med 0,1 ml saltvann fra sprøyten for å avkjøle området og forhindre varmeskader og blødninger.
- Plukk og riv av duraen lett med en 27G kanyle.
- Sett en markering på en 27 G stump nål på 1 mm fra spissen og bruk den til å aspirere hjernens cortex forsiktig for å lage et vindu for linseimplantasjon 8,11,13,17 (figur 2B1). Hvis nødvendig, lag en stump nål ved å slipe ned spissen av en 27 G injeksjonskanyle med sandpapir. Deretter kobler du nålen til en sprøyte, kobler sprøyten til et rør og kobler røret til en sugekilde for å skape et vakuum.
MERK: Relélinsen er stump og vil komprimere hjernevevet når det plasseres i det dype hjerneområdet. Dermed reduserer aspirasjon av cortex vevskader på grunn av relélinseimplantasjon. Cortex er ca. 1 mm tykk hos mus, men er vanskelig å visualisere under et stereomikroskop. Merket skaper et landemerke for å tillate dybden av nålen å bli bestemt mer presist enn med et stereomikroskop alene. I tillegg kan man avgjøre om cortex-regionen er nådd eller passert avhengig av motstanden; Den øverste delen av cortex føles relativt myk, mens den subkortikale regionen føles tett. Derfor, når teksturen begynner å føles tettere, stopp aspirasjonen (figur 2B3). - Tilbered 3 ml sterilt saltvann i en 3 ml sprøyte og avkjøl den i en isbøtte. Skyll området med saltvann for å stoppe blødningen og redusere muligheten for hjerneødem.
- Adenoassosiert virus (AAV) injeksjon
MERK: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE ble brukt i dette eksperimentet. jGCaMP7s er en genetisk kodet kalsiumindikator som avgir grønn fluorescens3. Fordi den nåværende studien brukte en villtypemus som emne, var det nødvendig med en viral vektor for å transfektere nevronene med det grønnfluorescerende kalsiumindikatorgenet og muliggjøre uttrykket. Forskere som bruker transgene mus som uttrykker den grønne fluorescerende kalsiumindikatoren som deres, kan hoppe over protokoll 2.2.- Monter den indre nålen på et 20 G intravenøst (i.v.) kateter på den stereotaktiske armen og punkter langsomt (~ 100 - 200 μm / min) hjernen på passende koordinater (de samme koordinatene som ble brukt under relélinseimplantasjon) (figur 2B3).
- Senk mikroinjeksjonsnålen med en hastighet på 100-200 μm / min inn i den ventrale CA1 og infusjon (~ 25 nL / min) 200 nL av virusvektoren i målområdet (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML og -3,50 mm DV fra bregma).
- Vent i 10 minutter for å la viruset diffundere og for å minimere tilbakestrømningen.
- Trekk ut (~100-200 μm/min) mikroinjeksjonskanylen.
- Relé linse implantasjon
- Desinfiser relélinsen med 75% alkohol10,16 og skyll deretter med pyrogenfritt saltvann. Bløtlegg linsen i kaldt pyrogenfritt saltvann til implantasjon.
MERK: En kald linse minimerer hjerneødem når den plasseres i hjernen. - Hold relélinsen ved hjelp av en mikrobulldogklemme (figur 2B3) hvis tenner har blitt dekket med varmekrympeslange.
MERK: Bulldog-klemmen kan holde linsen fast uten å skade den. Se Resendez et al.8 for metoden for å lage den slangedekkede bulldogklemmen. - Plasser relélinsen sakte (~100 - 200 μm/min) på toppen av målområdet (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML og -3,50 mm DV fra bregma) og stabiliser den med tannsement.
- Desinfiser relélinsen med 75% alkohol10,16 og skyll deretter med pyrogenfritt saltvann. Bløtlegg linsen i kaldt pyrogenfritt saltvann til implantasjon.
- Dummy baseplating
MERK: Formålet med "dummy baseplating" under implantasjonsoperasjonen er å skape en dental sementbase for å redusere mengden dental sement som må påføres under den virkelige basepletteringsprosedyren flere uker senere. På denne måten minimeres risikoen for endring i volumet av dental sement.- Fest objektivlinsen på bunnen av miniskopet og monter grunnplaten på miniskopet (i dette trinnet er monteringen av den forankrede objektivlinsen, grunnplaten og miniskopet ennå ikke plassert over musens skalle).
- Fest 10 cm parafinfilm rundt utsiden av bunnplaten (figur 4A).
- Hold miniskopet med den stereotaktiske armsonden ved hjelp av gjenbrukbar selvklebende leire.
- Juster objektivlinsen på toppen av releobjektivet med så lite plass mellom linsene som mulig (figur 4B).
- Bruk dental sement for å sikre plasseringen av grunnplaten (slik at sementen bare berører parafinfilmen).
- Når dental sementen har tørket, fjern filmen.
- Fjern bunnplaten og miniskopet. Tannsementbasen er hul (figur 4B).
- For å beskytte relélinsen mot daglige aktiviteter og fra å bli riper av musen, forsegle relélinsen med litt støpende silikongummi til relélinsen er dekket, og dekk silikongummien med et tynt lag tannsement (figur 4B).
- Koble musen fra de stereotaktiske instrumentene og plasser musen i et restitusjonskammer.
- Injiser karprofen (5 mg/kg, subkutan injeksjon) eller meloksikam (1 mg/kg, subkutan injeksjon) mot analgesi og ceftazidim (25 mg/kg, subkutan injeksjon) for å forebygge infeksjon.
MERK: Bruk av antibiotika er ikke et alternativ til en aseptisk teknikk. Perioperative antibiotika (dvs. ceftazidim) kan være indisert under visse omstendigheter, for eksempel langvarige operasjoner eller plassering av kroniske implantater. - Se på dyret til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Husmus individuelt og injiser meloksikam (1 mg/kg; subkutan injeksjon; hver 24. uke) i en uke for å lindre postkirurgisk smerte. Sjekk dyret hver dag etter operasjonen for å sikre at det spiser, drikker og avføring normalt.
- Utfør baseplating etter 3 eller flere uker.
3. Baseplating
MERK: Vanligvis kan ikke basepletteringsprosedyren (figur 5) utføres innen 2-3 uker etter den første prosedyren på grunn av restitusjon og viral inkubasjonstid. Induksjonsprosedyrene for baseplettering ligner de som er beskrevet i trinn 2.1.1 til 2.1.8. Imidlertid er baseplating ikke en invasiv prosedyre, og dyret krever bare lett sedasjon. Derfor er 0,8-1,2% isofluran tilstrekkelig, så lenge dyret ikke kan bevege seg på den stereotaktiske rammen. I tillegg kan relativt lett isoflurananestesi også bidra til å lette ekspresjonen av fluorescenstransienter av nevroner under overvåking8 (supplerende video S2).
- Klipp forsiktig det tynne laget av tannsementtaket med en beinrongeur og fjern silikongummi. Rengjør overflaten på relélinsen med 75% alkohol.
- Fest en settskrue ved siden av bunnplaten for å feste den til bunnen av miniskopet (figur 5A1).
MERK: Bunnplaten må strammes godt under bunnen av miniskopet fordi forskjellen mellom en strammet og lett festet bunnplate kan forårsake en inkonsekvent avstand. - Juster fokuslysbildet til å være omtrent 2,7 - 3 mm fra hovedhuset (figur 5A2).
MERK: Selv om lengden kan justeres ytterligere under grunnpletteringsprosedyren, må du fikse den til omtrent 2,7 mm, fordi samtidig justering av miniskoplengden og den optimale lengden mellom den implanterte relélinsen og den forankrede objektivlinsen er veldig forvirrende. - Koble miniskopet til datainnsamlingskortet og koble det til en USB 3.0-port (eller nyere versjon) på en datamaskin.
- Kjør datainnsamlingsprogramvaren utviklet av UCLA-teamet.
- Juster eksponeringen til 255, forsterkningen til 64x og eksitasjonslampen til 5 %. Disse innstillingene anbefales for innledende baseplating; De spesifikke innstillingene vil variere avhengig av hjernegruppene og ekspresjonsnivåene til den genetisk kodede kalsiumindikatoren.
- Klikk på Koble til-knappen for å koble miniskopet til datainnsamlingsprogramvaren og se livestreamen.
- Juster miniskopets objektivlinse til relélinsen for hånd og begynn å søke etter fluorescenssignalene (figur 5B1).
MERK: I utgangspunktet vil søk etter fluorescenssignalet manuelt lette justeringer. Fordi et AAV-system ble brukt til å uttrykke den genetisk kodede kalsiumindikatoren, påvirket både promotortype og AAV-serotype effektiviteten av transfeksjon23,24. Forskere bør trenge å sjekke uttrykket av kalsiumindikatoren ved å finne individuelle nevroner som viser endringer i fluorescens før de fortsetter med fremtidige eksperimenter. - Bor tannsementen hvor som helst der den blokkerer miniskopet (valgfritt).
- Se direktesendingen av datainnsamlingsprogramvaren og bruk margen på relélinsen som et landemerke (tilleggsvideo S2). Margen på relélinsen vises som en månelignende grå sirkel på skjermen (figur 5B1; hvite piler).
- Når relélinsen er funnet, juster forsiktig miniskopets forskjellige vinkler og avstander til fluorescenssignalene er funnet.
MERK: Bildene av nevronene er hvitere enn bakgrunnen. En presis nevronform indikerer at nevronene ligger perfekt på relélinsens fokalplan. Runde nevroner antyder at de var nær fokalplanet. Nevronformen er forskjellig over hele hjernen, her er ventral CA1 vist som et eksempel. - Hvis ingen individuelle nevroner viser endringer i fluorescens som en funksjon av tid, forsegl basen med silikongummi. Fluorescens observeres ikke fordi inkubasjonsperioden også er avhengig av virusets egenskap23,24. Utfør trinn 3.1-3.12 etter en ekstra uke. (Dette er valgfritt).
- Hold miniskopet i optimal posisjon og beveg den stereotaktiske armen med en gjenbrukbar klebende leire mot miniskopet (figur 5B2). Fest miniskopet til den stereotaktiske armen med gjenbrukbar klebende leire.
- Juster x-, y- og z-armene litt for å søke etter den beste visningen (tilleggsvideo S2). Deretter justerer du vinkelen mellom overflaten på objektivlinsen og relélinsen ved å dreie ørestangen, tannstangen eller gjenbrukbar klebende leire på z-aksen. Viralt uttrykk og linseimplantasjon er vellykket når minst en celle viser fluorescenstransienter (figur 6A; Supplerende video S2) under baseplating (som også avhenger av hjerneområdet, for eksempel CA1).
MERK: Hvis skjermen bare viser hvite blodlegemer, men ingen forbigående, er det en annen årsak (se figur 6B,C, tilleggsvideoer S4,S5, resultatdelen og feilsøkingsdelen). - Sement bunnplaten (figur 5B2) med tannsementen.
- Overvåk interesseområdet under sementering for å sikre at den optimale posisjonen ikke endres.
- Bruk minst mulig sement mens du fortsatt limer bunnplaten fast på tannsementbasen (figur 5B2). Påfør et andre og tredje lag sement rundt bunnplaten, men vær forsiktig så du ikke påvirker GRIN-linsen.
MERK: Påføring av sement på bunnplaten er enklere i dette trinnet siden bunnen av grunnplaten ble dannet under dummy-plating-prosedyren. - Løsne miniskopet forsiktig fra bunnplaten når sementen er herdet. Skru deretter på en beskyttelseshette.
- Flytt dyret til et gjenopprettingsbur. Se på dyret til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Husmus individuelt. Pass på at den spiser, drikker og gjør fra seg normalt hver dag. Vent i 5 dager til musen er helt gjenopprettet, og kontroller deretter kalsiumavbildningen.
MERK: Det er bare en liten mengde dental sement som holder baseplaten. Derfor, hvis grunnplaten har skiftet betydelig siden basepletteringsprosedyren, fjern tannsementen med en bor utfør basepletteringsprosedyren igjen. - Bedøve (ved intraperitoneal injeksjon av et ketamin (87 mg / kg) / xylazin (13 mg / kg) blanding) og perfusere25 dyret når alle eksperimenter er gjort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering av endring i dental sementvolum
Siden volumet av dental sement endres under herdeprosessen, kan det påvirke bildekvaliteten betydelig, gitt at arbeidsavstanden til en GRIN-linse er omtrent 50 til 350 μm 4,8. Derfor ble to kommersielt tilgjengelige tannsement testet i dette tilfellet, Tempron og Tokuso, før implantasjons- og basevaniseringsprosedyren (figur 5). Videoer ble først evaluert for å avgjøre om sementene hadde krympet, og deretter ble volumene av sement sammenlignet når de var helt tørket. Den samme konsentrasjonen og volumet av de første blandingene av tannsement ble lastet i pipettespisser og videofilmet (tilleggsvideo S1). Video S1 viste at begge sementene krympet under tørkeprosessen. Tokuso presterte bedre enn Tempron (dvs. den hadde et større volum enn Tempron selv etter krymping): Figur 3B; gjennomsnittlig volum av Tempron: 0,93 ± 0,07 ml; gjennomsnittlig volum av Tokuso: 1,18 ± 0,07 ml; t-test: p = 0,048, t(6) = 2,46, noe som tyder på at den krympet mindre. Sementens tettheter ble også testet 4 ganger etter fullstendig tørking. Tokuso hadde en lavere gjennomsnittlig tetthet enn Tempron (gjennomsnittlig tetthet av Tempron: 1,07 ± 0,12 g/ml; gjennomsnittlig tetthet av Tokuso: 0,93 ± 0,08 g/ml; t-test: p = 0,38, t(6) = -0,94), noe som antyder at den hadde en lavere krympingsrate. Derfor ble Tokuso brukt til følgende implantasjons- og basepletteringstrinn. Hensikten med å beskrive eksperimentet ovenfor er ikke å anbefale noen merker, men heller å minne eksperimenter om å finne en dental sement som ikke gjennomgår en betydelig volumendring ved herding.
Måling av bildeforskyvning
Vi simulerte dummy-baseplating og originale basepletteringsprosedyrer på et fast objekt for å undersøke om dummy-basepletteringsprosedyren resulterer i en mindre forskyvning i baseplateplasseringen enn den opprinnelige prosedyren. Et lysherdende lim ble brukt til å feste en 23 G 2,5 cm sprøytenål i midten av en baseplate med 1 cm stikkende ut av bunnplaten (figur 3C). Deretter ble baseplating simulert ved å holde nålene med armen til et stereotaktisk instrument. I stedet for å bruke forsøksdyr, ble et klistremerke festet på bordet til det stereotaksiske instrumentet. Sprøytenålen gjennomboret klistremerket, og representerte dermed den opprinnelige plasseringen. Deretter ble nålen forhøyet med 0,5 mm og simuleringsoperasjonene startet. I en operasjon som etterlignet engangs baseplatingprosedyre 8, ble dental sement påført til den dekket baseplate, som var 1 cm over klistremerket. Deretter var det en 2 timers ventetid for sementen å herde før du forsiktig presset nålen for å stikke hull på klistremerket igjen. Siden det lysherdende limet ikke stabiliserte nålen helt, kunne nålen skyves dypere for å skape et nytt hull, som representerte plasseringen av baseplaten etter at tannsementen hadde tørket. Avstanden mellom det første hullet og det andre hullet ble målt for å kvantifisere nålens plasseringsforskyvning. Resultatene viste at baseplate 1 cm over skallen resulterte i en posisjonsforskyvning på 1,76 ± 0,14 mm, men dummy-basepletteringen resulterte i forskyvning på bare 0,75 ± 0,17 mm (figur 3D; gjennomsnittlig skiftavstand for engangsbaseplettering versus dummybaseplating; t-test: p < 0,01, t (8) = 6,03).
I tillegg var vi nysgjerrige på om høyden på tannsementen ville påvirke skiftet. Derfor testet vi videre en kortere høyde (figur 3E; 0,5 cm over) ved å bruke engangs basepletteringsprosedyre. Bunnplaten som var forankret 0,5 cm over hodeskallen forskjøv seg betydelig mindre enn bunnplaten 1 cm over skallen (figur 3F; gjennomsnittlig skiftavstand: 0,43 ± 0,11 vs 1,76 ± 0,14 mm; t-test: p < 0,01, t(8) = 9,73). Data antydet at høyden på baseplaten over skallen og avstanden baseplaten skiftet var positivt korrelert. Siden dummy-basepletteringsprosedyren etterfølges av et andre basepletteringstrinn som bare bruker en minimal mengde dental sement, støtter disse dataene også hypotesen om at dummy-baseplating bidrar til å forbedre presisjonen til basepletteringsprosedyren.
Avbildning ved hjelp av et miniskopsystem med to linser
Ved å følge operasjonsprotokollene for viral infusjon, dummybaseplating og baseplating (figur 2, figur 4, figur 5) observerte vi fluorescenstransienter av individuelle nevroner hos tre mus (n = 3/5) (figur 6A, tilleggsvideo S3) under basepletteringsprosedyren og etter basepletteringsprosedyren mens musene beveget seg fritt, og bekreftet at arbeidsavstanden mellom objektiv- og relélinsene forble den samme (figur 6A1 I motsetning til figur 6A3 skjedde det bare en liten endring i posisjon) etter at tannsementen hadde tørket helt. Her gir vi videoer av baseplettering av en mus (tilleggsvideo S2; mus #5) og påfølgende kalsiumavbildning mens mus beveget seg fritt (tilleggsvideo S3; mus #3, #4, #5; rådata). Vær oppmerksom på at datainnsamlingsprogramvaren for V3 ikke inneholder funksjoner for bakgrunnssubtraksjon, og kontrasten til videoen kan forbedres ved offline behandling). For tilleggsvideo S2 ble det utført et manuelt søk etter fluorescenssignalene, og deretter ble miniskopet festet til den stereotaktiske armen for finjusteringer. Noen fluorescenstransienter ble observert under sonderingen (Supplerende video S2; Figur 6A). En forbigående er et jevnt skifte i lysstyrke i grå eller hvite flekker, ikke et avfyringsmønster som ligner et blinkende lys; Figur 6A 1 til 6A2 viser bilder av transienter. Videoen av mus som oppfører seg fritt, viste et akseptabelt romlig skifte sammenlignet med interesseområdet under basepletteringsprosedyren (tilleggsvideo S3). Marginene til cellene kunne ikke forbedres betydelig på dette stadiet fordi vi ikke kunne justere avstanden mellom bunnen av relélinsen og de aktive nevronene. Spesielt kan det ofte oppstå noen problemer under basepletteringsprosedyren, inkludert fravær av noe annet enn en ensartet bakgrunn (figur 6B; Supplerende video S4) eller synlighet av hvite blodcellemarger uten fluorescenstransienter (figur 6C; Tilleggsvideo S5). Det gis også to eksempler på negative resultater (n = 2/5) (figur 6B,C, tilleggsvideoer S4, S5). De potensielle årsakene til feilene er undersøkt i diskusjonsdelen. De kirurgiske prosedyrene for disse to musene ble utført uten å bruke en 1 mm diameter nål for å rydde banen; Dermed ble relélinsen direkte implantert. Vi foreslår at i mus #2 kan relélinsen ha komprimert nevronene og dratt noen nevroner ned, noe som resulterer i skadede nevroner. Det ble derfor ikke funnet fluorescenstransienter.
Figur 1: Mekanismer i miniskopet og defekter som vanligvis forårsaker avbildningsfeil . (A) Tegneseriediagram over relélinsen og objektivlinsen som viser mekanismene som er nødvendige for visualisering av fluorescerende celler i et to-linsesystem. Signalbølgene til hver linse understreker viktigheten av og mekanismen som er involvert i å finne en arbeidsavstand for å visualisere fluorescerende celler. (A1) Reléet GRIN-linsen er plassert over målnevronene innenfor arbeidsavstanden. Siden tonehøyden til relélinsen er 0,5 * N (hvor N er et heltall), muliggjør linsen visualisering av målnevroner ved å videresende lys, og bringe de originale fluorescenssignalene til toppen av relélinsen. Deretter beveger omtrent 1/4 av en full sinusformet periode med lys seg gjennom den objektive GRIN-linsen (~ 0,25 tonehøyde) og resulterer i et forstørret bilde. (A2) Objektivlinsen overfører bildene til en komplementær metalloksid-halvleder (CMOS) sensor plassert på toppen (den grønne platen i diagrammet) av miniskopet. (B) Tegneseriediagram som presenterer forskjellene i GRIN-linseimplantasjonsprosedyrene mellom et (B1) tolinsesystem og (B2) et linsesystem. Generelt er den største forskjellen at ettlinsesystemet direkte bruker sin objektivlinse til å avbilde overflaten av hjernen; Som et resultat må objektivlinsen implanteres på toppen av målnevronene. (C) I kontrast, i tolinsesystemet, til sammenligning, er en ekstra relélinse implantert i hjernen og objektivlinsen er forankret i miniskopet. (C1) Formen på grunnplaten for V3-versjonen av UCLA Miniscope kan forårsake et ujevnt skift etter at tannsementen tørker helt. (C2) Denne forskyvningen forårsaker feiljustering eller avvik fra arbeidsavstanden mellom relélinsen og objektivlinsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Modifiserte protokoller og detaljerte kirurgiske protokoller for å forbedre suksessraten til miniskopsystemet med to linser. (A1) Modifisert kirurgisk protokoll for to-linsesystemet. Plasseringen av virusinjeksjonen og relé-GRIN-linseimplantasjonen vises. Dummy baseplating gjør at arbeidsavstanden nøyaktig omfatter nevronene av interesse og reduserer posisjonsforskyvningen forbundet med (A2) basepletteringsprosedyren. Derfor øker (A3) sannsynligheten for å avbilde fluorescerende celler i mus som oppfører seg fritt. (B) Tegneseriebilde av trinnene for viral injeksjon, og relé GRIN linse plassering. (B1) Merk først aspirasjonsnålen med en penn ca. 1 mm (for museeksperimenter) fra spissen for å hjelpe til med vurdering av cortexens aspirasjonsdybde. Deretter aspirerer bindevevet og cortex (ca. 1 mm dypt hos mus) fra hjernen. (B2) Bruk ventral hippocampus som målområde for å implantere en relélinse; Spesielt er det tøffe corpus callosum landemerket for å stoppe aspirasjon av den kortikale regionen. Den fibrøse tekstur av corpus callosum kan ses under stereomikroskopet under aspirasjon. (B3) For det andre, punkter interessepunktet med en indre nål på et 20 G kateter (ca. 1 mm i diameter; diameteren er lik relélinsens) for å fjerne en vei før viral infusjon. Under stereomikroskopet skal en bukke (stiplet sirkel på bildet) opprettet av nålen være synlig. Senk mikroinjeksjonsnålen og relélinsen ved bulken (eller bare 250 μm fra midten av bulken). Til slutt plasserer du reléet GRIN-linsen (i denne studien brukte vi et reléobjektiv 1 mm i diameter). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Måling av volumendring av herdet tannsement . (A) Et eksempel med herdet dental sement av to merker. De svarte pilene indikerer de opprinnelige nivåene etter at vi blandet pulveret og løsningen. De hvite pilene angir nivåene etter 10, 20 og 40 min herding. De røde pilene peker mot bunnen av spissene, som var forseglet med lysherdende lim. (B) Gjennomsnittlig volum av de gjenværende dental sementene etter at de har tørket helt. Stolpene og feilfeltene er midler ± SEM-er. * angir signifikans (P < 0,05) som bestemt av Student t-test. (C) Illustrasjoner og et fotografi som forklarer metoden som brukes til å måle plasseringen av bunnplaten. En nål ble limt gjennom baseplaten og ble brukt til å simulere den opprinnelige baseletteringsprosedyren (ett-trinns baseplating) og dummy-basepletteringsprosedyren. De røde og svarte pilene representerer nålens plassering før og etter at tannsementen ble herdet. (D) Gjennomsnittlige avstandsendringer på spissen av nålen (E) Illustrasjoner av metoden som brukes til å måle forholdet mellom baseplaten over skallenivå og posisjonsforskyvningen. (F) Gjennomsnittlige avstandsendringer på kanylespissen. Stolpene og feilfeltene er midler ± SEM-er. ** angir signifikans (P < 0,01) som bestemt av Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Detaljert dummy-basepletteringsprosedyre (utført umiddelbart etter implantasjon av relélinsen). (A1) Tre-trinns tegneserie av objektivlinse, baseplate og parafinfilmmontering på miniskopet. (A2) Fotoversjon av forsamlingen. (B1) Tegneserie som viser dummy baseplating prosedyren. Først er det monterte miniskopet justert med relélinsen. Objektivlinsen som er plassert er så nær relélinsen som mulig. For det andre legges dental sement til parafilmen som omgir grunnplaten og påføres på skallen for å lage en kvinnelig form for fremtidig baseplating. Deretter fjernes grunnplaten, og støping av silisiumgummi (rosa) tilsettes og toppes med tannsement for å beskytte hunnformen og relélinsen. Dyret får da lov til å komme seg fra anestesi. Etter minst 3 uker utføres baseplating-prosedyren. (B2) Fotoversjon av (B1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Trinn for basepletteringsprosedyren. (A1) Fest bunnplaten og (A2) juster fokusglidebryteren manuelt til 2,7 til 3 mm. En innstilling på 2,7 til 3 mm (i posisjonen vist på bildet) ser ut til å være det beste stedet å starte før du manuelt søker etter fluorescerende celler. (B1) Det første tegneseriediagrammet illustrerer betydningen av lengden mellom objektivlinsen og relélinsen for visualisering av fluorescerende celler (fluorescerende celler observeres vanligvis i en avstand mellom 0, 5 og 2 mm). Før den fluorescerende cellen dukker opp, bør forskeren se margen på relélinsen (piler i det øverste bildet). Det er nyttig å først manuelt justere objektivet til optimal visningsposisjon fordi det er lettere å foreta raske justeringer for hånd. (B2) Plasser gjenbrukbar selvklebende leire på den stereotaksiske armsonden, og stabiliser deretter miniskopet ved å feste det på armen med gjenbrukbar selvklebende leire. På dette stadiet kan interesseområdet ha skiftet, men dette kan enkelt løses ved å justere den stereotaksiske armen og den gjenbrukbare limleiren litt. Etter å ha sjekket etter og funnet det optimale området av interesse, legg til en liten mengde dental sement (representert i rødt). Lim bunnplaten med så lite dental sement som mulig. Separat miniskopet og grunnplaten etter at tannsementen tørker. Hvis grunnplaten ikke er stabil nok, legg til ekstra dental sement. (C) Dette diagrammet illustrerer viktigheten av hvert trinn for å oppnå suksess. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempler på suksess og fiasko under grunnpletteringsprosedyren. (A) Et eksempel på vellykket avbildning under basepletteringsprosedyren. Relélinsen var rettet mot ventral hippocampus. Fluorescenstransienter ble lagt merke til når dyret var i narkose med isofluran (se også tilleggsvideo S2). (A2) Kontrasten ble økt for bedre synlighet. De rødstiplede linjene indikerer blodårer. (A3) Fluorescenstransienter fem dager etter baseplettering når musen oppførte seg fritt i hjemmeburet (se også tilleggsvideo S3; bildene av mus #3 og #4 er også gitt i tilleggsvideo S3). Bare en liten endring i posisjon skjedde. (B1) Et eksempel på en fiasko. Under baseplettering ble det bare lagt merke til homogene hvite / grå områder som ikke var cellelignende i form (se også tilleggsvideo S4). (B2) Relélinsen bommet på målområdet og befant seg over et område uten infiserte celler. (C1) Et annet eksempel på en fiasko. I denne musen, selv om mange runde celler ble observert, ble det ikke observert fluorescenstransienter under basepletteringen (etter tre ukers inkubasjon og mens musen ble bedøvet/bedøvet). Videre ble det ikke servert fluorescenstransienter når basepletteringsprosedyren ble utført igjen (i den femte uken av inkubasjonen) eller til og med når dyret oppførte seg fritt. Bildet ble tatt under baseplettering i den femte uken av inkubasjon (se også tilleggsvideo S5). (K2 og C3) Relélinsen bommet på det pyramidale laget av ventral hippocampus. De blå prikkene er kjerner som ble farget med DAPI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Problem | Mulig årsak | Løsning | ||
| Hadde god bildebehandling ved baseplettering, men helt ute av fokus dagen etter | Volumendring ved herding av tannsementen mellom motivets skalle og baseplaten | Fortsett "dummy baseplating" etter linseimplantasjonsprosedyren som foreslått i denne rapporten. Velg en dental sement som har mindre volumendring. | ||
| Har homogene hvite/grå områder uten cellelignende form under grunnlegging (se også tilleggsvideo S4) | En. Relélinsen bommet på målområdet B. Dårlig uttrykk for fluorescensindikator C. Glem å installere en objektivlinse under miniskopet der fluorescensindikatoren faktisk uttrykkes | A. Bruk dummy-linser for å øve operasjoner. Kontroller koordinatene til dummy-linsen etter praktiserende implantasjon B. Finn en optimal viral titer for kalsiumavbildningseksperimenter (referert til Resendez et al. 2016) . Hvis pretesting av en eller annen grunn ikke kan utføres, anbefaler vi at nybegynnere prøver en høyere titer først. (Se Disscusion delen for detaljer) C. Skru på et objektivt GRIN linse (~ 0,25 pitch. ex: Edmund Optics; Stock #64-519) nederst i miniskopet. | ||
| Observer mange celler, men ingen fluorescensdynamikk under baseplettering | A. Usunne nevroner eller døde nevroner B. Sparsom fining type nevroner C. Dyp anestesi status | A. Vær forsiktig for alle kirurgiske prosedyrer. Bruk en ny sprøytenål som ligner diameteren på relélinsen til å kutte infusjons-/implantasjonsbanen først for å frigjøre trykket ved linseimplantasjon. Tilfør viruset langsomt og implanter linsen sakte. B. Vent i lengre tid for å overvåke aktivitetene til nevroner eller klem halen litt for å stimulere musen. C. Baseplating er ikke en invasiv prosedyre, og dyret trenger bare sedasjon. Derfor er det tilstrekkelig å opprettholde 1,2 ~ 0,8% isofluran, så lenge dyret ikke er i stand til å bevege seg på den stereotaksiske rammen. | ||
Tabell 1: Feilsøkingsdiagram.
Tilleggsvideo S1: Volumtest av dental sement. Forskjellen mellom volumet ble målt i begynnelsen av tannsementpreparatet og at volumet etter sementen tørket. To merker av dental sement (f.eks Tempron og Tokuso Curefast) ble testet. For å teste volumet av tannsementen etter at den tørket, ble 0,5 g av hvert tannsementpulver veid og blandet med riktig løsning (1 ml). Deretter ble 0,1-10 μL pipettespisser lastet med 2,5 μL av tannsementblandingen og forseglet med lysherdende lim. Deretter ble spissene plassert på et stativ, overflatene av tannsementblandingene ble merket og videofilmet i 40 minutter. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo S2: Demonstrasjoner av grunnmuringsprosedyren. Vinkelen mellom overflaten på objektivlinsen og relélinsen ble justert ved å dreie ørestangen, tannstangen eller gjenbrukbar klebende leire på z-aksen. Margen på relélinsen dukket opp som en månelignende grå sirkel på skjermen. Vellykket virusuttrykk og linseimplantasjon bør avsløre minst en fluorescensdynamikk (piler) under baseplettering. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo S3: Demonstrasjoner av fluorescensdynamikk hos mus som oppfører seg fritt. Fluorescenstransienter fra mus #3, #4 og #5. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo S4: Et eksempel på en feil. En ensartet bakgrunn dukket opp under baseplating-prosedyren. Vær oppmerksom på at endringen i lysstyrke ikke var på grunn av fluorescenstransienter av individuelle celler; Det var forårsaket av søkeprosedyren. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo S5: Demonstrasjon av et annet feileksempel. Mangel på fluorescenstransienter oppsto under basepletteringsprosedyren, men noen runde cellemarginer var fortsatt synlige. Vær oppmerksom på at endringen i lysstyrke ikke var forårsaket av fluorescenstransienter av individuelle celler; Det var forårsaket av søkeprosedyren. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten beskriver en detaljert eksperimentell protokoll for forskere som bruker to-linse UCLA Miniscope-systemet. Verktøyene designet i protokollen vår er relativt rimelige for ethvert laboratorium som ønsker å prøve in vivo kalsiumavbildning. Noen protokoller, for eksempel viral injeksjon, linseimplantasjon, dummy baseplating og baseplating, kan også brukes til andre versjoner av miniskopsystemet for å forbedre suksessraten for kalsiumavbildning. Annet enn generelle problemer med viral injeksjon og linseimplantasjon som må løses uavhengig av miniskopversjonen, kan strukturen til UCLA-baseplaten forårsake et posisjonsskifte, noe som kan føre til uoverensstemmende arbeidsavstander mellom objektivet og relélinsene (figur 1C). En modifisert eksperimentell protokoll ble utviklet for å minimere posisjonsforskyvningen til de to linsene (figur 2, figur 4, figur 5). Vellykket kalsiumavbildning kan oppnås gjennom en kombinasjon av vellykket virusuttrykk, linseimplantasjon og basepletteringsprosedyrer (figur 5C). Bruk av et to-linsesystem for å observere dype hjerneområder krever et høyt nivå av nøyaktighet i basepletteringsprosedyrene fordi de relative posisjonene til den implanterte relélinsen og objektivlinsen også må være nøyaktige. Denne rapporten presenterer ikke bare en protokoll som løser problemer med baseplating, men diskuterer også noen tips for virusinjeksjon og linseimplantasjon. Nedenfor diskuterer vi basepletteringsprosedyrene først, etterfulgt av virusinjeksjonen og linseimplantasjonsprosedyrene, og vi beskriver noen eksempler på feil (figur 6).
Grunnmuring
V3-versjonen av UCLA Miniscope er for tiden den mest brukte designen og kan bestilles online. Grunnplaten til denne versjonen består av to kanter uten vegger (figur 1C1), men formen kan forårsake et ujevnt skifte (figur 1C1, C2) etter at tannsementen er helt tørr. Dummy-basepletteringsprosedyrene i protokollen vår (figur 4) minimerer problemene med feiljustering og baseplateforskyvning fordi den bruker parafinfilm for å redusere den tilgjengelige plassen for tannsementen under ekte baseplating (figur 5B). Den gjenværende plassen er fortsatt tilstrekkelig til å finne en optimal avbildningsposisjon under den virkelige basepletteringsprosedyren. Derfor kan forskeren lime bunnplaten med så lite tannsement som mulig (figur 5B2). I tillegg tar dummy baseplating prosedyren relativt kort tid (ca. 15 til 20 min) siden det ikke krever en perfekt avstand mellom objektivlinsen og reléobjektivet som skal oppnås. Imidlertid er dummy baseplating bare en av nøkkelfaktorene for vellykket kalsiumavbildning; For eksempel, under overvåking av fluorescenssignaler, kan nevroner virke uskarpe hvis de er litt utenfor arbeidsplanet (avhengig av arbeidsavstanden til relélinsen, ofte ca. 100 ~ 300 μm). Evnen til å forbedre arbeidsavstanden er begrenset, siden arbeidsavstanden til nevronene er forhåndsbestemt av relélinsens implantasjonsprosedyre. Et eksperiment ble utført uten dummy baseplating-prosedyren, og interesseområdet ble alltid (i fire av fire mus) savnet etter engangs baseplating. Derfor ble disse løsningene utviklet for å redusere krympeproblemet. Noen lysherdende dental sement kan unngå problemet med krymping under herding fordi de herder veldig raskt; Disse sementene kan hjelpe forskere med å justere avstanden under basepletteringsprosedyren. Selv om rekkevidden av bølgelengder for å spenne kalsiumindikatorene og herding av tannsementen er forskjellig, må fotobleking under basepletteringsprosedyren forhindres. For å forhindre fotobleking må rekkevidden av bølgelengder generert av lyskilden være ganske smal for å unngå kryssreaksjoner mellom kalsiumindikatorene og den lysherdende tannsementen. Derfor anbefales ikke bruk av lysherdende dental sement for grunnpletteringsprosedyren. I tillegg er noen spesifikke merker av dental sement ofte brukt til liming av baseplater av andre forskerteam 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . De lave krympeegenskapene til disse sementene kan løse problemet, men vi hadde ikke mulighet til å teste disse merkene på grunn av vanskeligheter med å kjøpe (importere) dem. Produkter av medisinsk kvalitet kan være underlagt importforskrifter avhengig av land/region. Hvis forskere har problemer med å få tilgang til sementene nevnt i litteraturen 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, vil vår protokoll løse tannsementkrympingsproblemet.
I tillegg til krympeproblemet kan strukturell slitasje forekomme i selve miniskopet og på grunnplaten (spesielt magneter i bunnplaten) i løpet av mange eksperimenter. Ethvert lite gap forårsaket av slitasje reduserer stabiliteten til avstanden mellom de to linsene. Igjen er nøyaktighet over hele den optiske banen nøkkelen til avbildning av kalsiumtransienter i mus som oppfører seg fritt ved hjelp av et miniskop.
Feilsøking av viral injeksjon / linseimplantasjon
Før infusjon av viruset i hjernegruppen, anbefales det å montere en ny nål på den stereotaktiske armen og sakte punktere hjernen ved passende koordinater. Fordi den nye nålen er veldig skarp, fungerer denne punkteringen som et forberedelsestrinn for å rydde banen (eller kutte en bane) for den faktiske mikroinjeksjonsnålen og relélinsen og minimerer vevskader, som kan skyldes kompresjon fra mikroinjeksjonsnålen eller relélinsen. Den skarpe nålen skjærer en bane for den stumpe relélinsen; Dermed bør spissen av nålen senkes til de samme koordinatene med relélinsen. Den indre nålen til et 20 g i.v. kateter ble valgt fordi den hadde en diameter på 1 mm, som var lik diameteren på relélinsen vår. En annen nålmåler kan brukes avhengig av diameteren på relélinsen.
Selv om denne studien ikke fokuserte på egenskapene og titerne til virale vektorer, er disse faktorene fortsatt kritiske for vellykket kalsiumavbildning (figur 5C). Det er nødvendig å forhåndsteste ekspresjonskvaliteten til virusvektoren. Trinn 1 til 5 i Resendez et al.s protokoll gir detaljerte metoder for identifisering av en optimal viral titer for kalsiumavbildningseksperimenter8. Hvis pretesting ikke kan utføres av en eller annen grunn, anbefales det at nybegynnere prøver en relativt høy titer først. En av ulempene ved å bruke en høy viral titer ercytotoksisitet8. Døde nevroner gir opphav til autofluorescens og er synlige som lyse hvite flekker under miniskopet8. Imidlertid er disse døde nevronene gode landemerker for nybegynnere å finne og praktisere basepletteringsprosedyren. På den annen side, selv om infusjon av et lavtitervirus har lavere risiko for å drepe celler, kan fluorescensen maskeres av bakgrunnen hvis cellene ikke viser noen fluorescenstransienter under basepletteringsprosedyren. Det er vanskelig å finne årsakene til svikt fordi målnevronene kan bli savnet på grunn av relélinseimplantasjon eller på grunn av det dårlige uttrykket av virusvektoren. Å bestemme årsaken er veldig forvirrende uten histologisk bekreftelse. Derfor anbefales bruk av relativt høye titervirus hvis virusvektorene ikke kan testes på forhånd.
Resendez et al. anbefaler å sette inn mikroinjeksjonsnålen 250 μm lateral og ventral til plassering av linsen. Våre observasjoner viste at infusjon av viruset på samme dybde som relélinsen også kan føre til uttrykk for gode kalsiumsignaler. Vi foreslår at på grunn av muligheten for infeksjon og spredning, er infusjon av viruset i samme dybde som koordinaten til relélinsen optimal for å redusere vevskader og øke nøyaktigheten av avstanden mellom de infiserte nevronene og relélinsen. Resendez et al anbefaler også å utføre viral injeksjon og linseimplantasjon under samme operasjon gitt det smale spekteret av arbeidsavstander mellom målceller og relélinsen8. Noen forskere følger imidlertid en protokoll der virusinfusjonstrinnet og linseimplantasjonstrinnet utføres med to (eller flere) ukers mellomrom18,26. Forlengelse av tiden mellom trinnene reduserer den individuelle operative tiden. Men i denne protokollen ble disse to trinnene slått sammen til en operasjon, fordi kirurgen i enoperasjonsprotokollen kan overvåke posisjonen mellom mikroinjeksjonsnålen og relélinsen når de senkes ned i målområdet, noe som reduserer sjansen for mislykket målretting (figur 2B3).
For to mus (mus #1 og #2) ble også bruk av en nål for å lage en bane for linsen utelatt, og i mus #2 ble runde cellelignende grå flekker observert (figur 6C). Fluorescensdynamikk (supplerende video S5) ble imidlertid ikke observert. Ved å undersøke hjernestykket i dette eksemplet (figur 6C2, C3), postulerte vi at relélinsen dro noen celler ned mens den ble senket. Disse dratte nevronene var usunne, så ingen aktivitet ble lagt merke til under basepletteringsprosedyren eller under forsøket.
Vi hadde en mus med et helt homogent grått signal og ingen synlige cellelignende bilder under basepletteringsprosedyren (figur 6B1). Etter å ha ofret musen, ble hjerneskivene observert. Det ble lagt merke til at linsen var på medialsiden av det buede pyramidelaget; målområdet (figur 6B2) ble fullstendig savnet. Disse mislykkede forsøkene var kritiske erfaringer som førte til at vi endret operasjonsprotokollen og til slutt lyktes med tre mus (tilleggsvideo S3).
Kanyle ved mikroinjeksjon
Corpus callosum er en tøff fibrøs kanal som overlegger dorsal hippocampus. På grunn av sin stivhet, motstår den penetrasjon av en flat-tipped microinjection nål. Derfor anbefaler vi å bruke en mikroinjeksjonsnål med skrå spiss. Denne typen nål reduserer ikke bare vevskader, men reduserer også muligheten for manglende infusjon av viruset i målområdet på grunn av blokkering av nærliggende fibre. Vi har oppsummert de ovennevnte problemene i et feilsøkingsdiagram (tabell 1).
Tidsramme
Tidsrammen for hele prosedyren er oppsummert i figur 2A, med dager som enhetene. I detalj kan operasjonsdelen (viral injeksjon, relélinseimplantasjon, dummy baseplating) ta 3 timer for nybegynnere eller 1,5 timer for tilstrekkelig trente forskere. Mus har liten kroppsstørrelse og raskt stoffskifte, og de er mer utsatt for helseproblemer forårsaket av lange perioder i narkose enn større arter27. Forskeren bør ha som mål å holde tiden i kirurgi under 3 timer. Real baseplating kan utføres etter 3 til 6 uker med kalsiumindikatoruttrykk. Denne prosedyren kan ta 1 time. Den påfølgende langsgående kalsiumaktivitetsobservasjonen kan fortsette i mer enn 1 måned.
Konklusjoner
UCLA Miniscope er en åpen kildekode in vivo kalsiumavbildningsenhet. Uten en ferdig, forhåndsinstallert baseplate eller linsemodul, må personer som utfører eksperimenter være i stand til nøyaktig å oppnå den optimale avstanden mellom objektivlinsen og relélinsen under basepletteringsprosedyren. Den økte vanskeligheten ved å bruke to-linse UCLA Miniscope-systemet ligger i volumendringen av dental sement. Vi har optimalisert de opprinnelige protokollene og minimert feilene forårsaket av problemene nevnt ovenfor, og dermed økt suksessraten for kalsiumavbildning med tolinses UCLA Miniscope-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette er ikke en bransjestøttet studie. Forfatterne oppgir ingen økonomiske interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
