Summary
इलाज के दौरान दंत सीमेंट का संकोचन बेसप्लेट को विस्थापित करता है। यह प्रोटोकॉल दंत सीमेंट की प्रारंभिक नींव बनाकर समस्या को कम करता है जो बेसप्लेट को सीमेंट करने के लिए जगह छोड़ देता है। हफ्तों बाद, बेसप्लेट को थोड़े से नए सीमेंट का उपयोग करके इस मचान पर स्थिति में सीमेंट किया जा सकता है, जिससे संकोचन कम हो जाता है।
Abstract
न्यूरोसाइंटिस्ट स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों में न्यूरोनल गतिविधि का निरीक्षण करने के लिए लघु माइक्रोस्कोप (मिनीस्कोप) का उपयोग करते हैं। कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स (यूसीएलए) मिनोस्कोप टीम शोधकर्ताओं को मिनीस्कोप बनाने के लिए खुले संसाधन प्रदान करती है। वी 3 यूसीएलए मिनिस्कोप वर्तमान में उपयोग में सबसे लोकप्रिय ओपन-सोर्स मिनीस्कोप में से एक है। यह सतही कॉर्टेक्स (एक लेंस प्रणाली) पर प्रत्यारोपित एक उद्देश्य लेंस के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित न्यूरॉन्स से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति क्षणिकता की इमेजिंग की अनुमति देता है, या गहरे मस्तिष्क में प्रत्यारोपित रिले लेंस के संयोजन के माध्यम से गहरे मस्तिष्क के क्षेत्रों में और एक उद्देश्य लेंस जो रिले छवि (दो-लेंस प्रणाली) का निरीक्षण करने के लिए मिनीस्कोप में पूर्वनिर्धारित होता है। यहां तक कि इष्टतम परिस्थितियों में (जब न्यूरॉन्स प्रतिदीप्ति संकेतक व्यक्त करते हैं और रिले लेंस ठीक से प्रत्यारोपित किया गया है), बेसप्लेट के बीच दंत सीमेंट का मात्रा परिवर्तन और सीमेंट के इलाज पर खोपड़ी से इसके लगाव से उद्देश्य और रिले लेंस के बीच एक परिवर्तित दूरी के साथ गलत संरेखण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप खराब छवि गुणवत्ता होती है। एक बेसप्लेट एक प्लेट है जो खोपड़ी पर मिनीस्कोप को माउंट करने में मदद करती है और उद्देश्य और रिले लेंस के बीच काम की दूरी तय करती है। इस प्रकार, बेसप्लेट के चारों ओर दंत सीमेंट की मात्रा में परिवर्तन लेंस के बीच की दूरी को बदल देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य दंत सीमेंट में मात्रा परिवर्तन के कारण होने वाली गलत संरेखण समस्या को कम करना है। प्रोटोकॉल रिले लेंस आरोपण के दौरान दंत सीमेंट की प्रारंभिक नींव का निर्माण करके गलत संरेखण को कम करता है। प्रत्यारोपण के बाद का समय बेसप्लेट को पूरी तरह से ठीक करने के लिए दंत सीमेंट की नींव के लिए पर्याप्त है, इसलिए बेसप्लेट को जितना संभव हो उतना कम नए सीमेंट का उपयोग करके इस मचान पर सीमेंट किया जा सकता है। वर्तमान लेख में, हम चूहों में बेसप्लेटिंग के लिए रणनीतियों का वर्णन करते हैं ताकि मिनीस्कोप में लंगर डाले गए एक उद्देश्य लेंस के साथ न्यूरोनल गतिविधि की इमेजिंग को सक्षम किया जा सके।
Introduction
फ्लोरोसेंट गतिविधि रिपोर्टर न्यूरोनल गतिविधि की इमेजिंग के लिए आदर्श हैं क्योंकि वे संवेदनशील हैं औरबड़ी गतिशील सीमा 1,2,3 है। इसलिए, प्रयोगों की बढ़ती संख्या न्यूरोनल गतिविधि 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 का सीधे निरीक्षण करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रही है , 16. पहला लघुकृत एक-फोटॉन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (मिनीस्कोप) 2011 में मार्क श्निट्जर एट अल.5 द्वारा डिजाइन किया गया था। यह मिनीस्कोप शोधकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों में अनुमस्तिष्क कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति गतिशीलता की निगरानी करने में सक्षम बनाता है5 (यानी, बिना किसी शारीरिक संयम, सिर संयम, बेहोश करने की क्रिया, या जानवरों को संज्ञाहरण के बिना)। वर्तमान में, तकनीक को सतही मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे कॉर्टेक्स 6,8,15,16 की निगरानी के लिए लागू किया जा सकता है; पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस 8,11,13,14 और स्ट्रेटम 6,17 जैसे उपकॉर्टिकल क्षेत्र; और वेंट्रल हिप्पोकैम्पस14, एमिग्डाला10,18 और हाइपोथैलेमस 8,12 जैसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्र।
हाल के वर्षों में, कई ओपन-सोर्स मिनीस्कोप विकसित किए गए हैं4,5,6,7,11,13,17,19. मिनोस्कोप को शोधकर्ताओं द्वारा आर्थिक रूप से इकट्ठा किया जा सकता है यदि वे कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स (यूसीएलए) मिनिस्कोप टीम द्वारा प्रदान किए गए चरण-दर-चरण दिशानिर्देशों का पालन करते हैं4,7,11,13. क्योंकि तंत्रिका गतिविधि की ऑप्टिकल निगरानी प्रकाश संचरण की सीमाओं से प्रतिबंधित है7 रुचि की न्यूरोनल आबादी से, एक मिनीस्कोप डिजाइन किया गया था, जिसके लिए एक ऑब्जेक्टिव ग्रेडिएंट अपवर्तक सूचकांक (GRIN) लेंस (या उद्देश्य लेंस) को मिनीस्कोप के निचले भाग में पूर्वनिर्धारित करने की आवश्यकता होती है ताकि रिले GRIN लेंस (या रिले लेंस) से रिले किए गए दृश्य के क्षेत्र को बढ़ाया जा सके।6,7,8,10,16,17. इस रिले लेंस को लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में प्रत्यारोपित किया जाता है जैसे कि लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र की प्रतिदीप्ति गतिविधि रिले लेंस की सतह पर रिले की जाती है6,7,8,10,16,17. प्रकाश की एक पूर्ण साइनसॉइडल अवधि का लगभग 1/4 उद्देश्य GRIN लेंस (~ 0.25 पिच) के माध्यम से यात्रा करता है ।चित्र 1A1), जिसके परिणामस्वरूप एक आवर्धित प्रतिदीप्ति छवि होती है6,7. उद्देश्य लेंस हमेशा मिनीस्कोप के निचले भाग में तय नहीं होता है और न ही रिले लेंस का आरोपण आवश्यक होता है6,7,11,13,15. विशेष रूप से, दो विन्यास हैं: एक मिनीस्कोप में एक निश्चित उद्देश्य लेंस के साथ और मस्तिष्क में प्रत्यारोपित एक रिले लेंस8,10,12,14,16 (चित्र 1B1) और सिर्फ एक हटाने योग्य उद्देश्य लेंस के साथ दूसरा6,7,11,13,15 (चित्र 1B2). निश्चित उद्देश्य और प्रत्यारोपित रिले लेंस संयोजन के आधार पर डिजाइन में, मस्तिष्क से प्रतिदीप्ति संकेतों को रिले लेंस की शीर्ष सतह पर लाया जाता है (चित्र 1A1)7,8,10,12,14,16. इसके बाद, उद्देश्य लेंस रिले लेंस की शीर्ष सतह से दृश्य क्षेत्र को आवर्धित और प्रसारित कर सकता है (चित्र 1A2). दूसरी ओर, हटाने योग्य उद्देश्य ग्रिन लेंस डिजाइन अधिक लचीला है, जिसका अर्थ है कि मस्तिष्क में रिले लेंस का प्रीइम्प्लांटेशन अनिवार्य नहीं है (चित्र 1B2)6,7,11,13,15. हटाने योग्य उद्देश्य लेंस डिजाइन के आधार पर एक मिनीस्कोप का उपयोग करते समय, शोधकर्ताओं को अभी भी लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में एक लेंस प्रत्यारोपित करने की आवश्यकता होती है लेकिन वे या तो एक उद्देश्य लेंस प्रत्यारोपित कर सकते हैं6,7,11,13,15 या मस्तिष्क में एक रिले लेंस6,7. आरोपण के लिए एक उद्देश्य या रिले लेंस का विकल्प मिनीस्कोप कॉन्फ़िगरेशन को निर्धारित करता है जिसे शोधकर्ता को उपयोग करना चाहिए। उदाहरण के लिए, वी 3 यूसीएलए मिनिस्कोप एक हटाने योग्य उद्देश्य ग्रिन लेंस डिजाइन पर आधारित है। शोधकर्ता या तो रुचि के मस्तिष्क क्षेत्र में सीधे एक उद्देश्य लेंस प्रत्यारोपित करने और उद्देश्य लेंस पर "खाली" मिनीस्कोप को माउंट करने का विकल्प चुन सकते हैं6,7,11,13,15 (एक लेंस प्रणाली; चित्र 1B2) या मस्तिष्क में एक रिले लेंस प्रत्यारोपित करने और एक मिनीस्कोप को माउंट करने के लिए जो एक उद्देश्य लेंस के साथ पूर्वनिर्धारित है6,7 (एक दो-लेंस प्रणाली; चित्र 1B1). मिनीस्कोप तब आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक द्वारा उत्पादित न्यूरोनल फ्लोरेसेंस की लाइवस्ट्रीम छवियों को कैप्चर करने के लिए एक प्रतिदीप्ति कैमरे के रूप में काम करता है1,2,3. मिनीस्कोप के कंप्यूटर से कनेक्ट होने के बाद, इन फ्लोरेसेंस छवियों को कंप्यूटर में स्थानांतरित किया जा सकता है और वीडियो क्लिप के रूप में सहेजा जा सकता है। शोधकर्ता कुछ विश्लेषण पैकेजों के साथ प्रतिदीप्ति में सापेक्ष परिवर्तनों का विश्लेषण करके न्यूरोनल गतिविधि का अध्ययन कर सकते हैं20,21 या भविष्य के विश्लेषण के लिए उनके कोड लिखें।
वी 3 यूसीएलए मिनिस्कोप उपयोगकर्ताओं को यह निर्धारित करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है कि एक या दो-लेंस सिस्टम 7 के साथ न्यूरोनल गतिविधि की छवि बनानीहै या नहीं। रिकॉर्डिंग सिस्टम की पसंद लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र की गहराई और आकार पर आधारित है। संक्षेप में, एक लेंस प्रणाली केवल एक ऐसे क्षेत्र की छवि बना सकती है जो सतही (लगभग 2.5 मिमी से कम गहरा) और अपेक्षाकृत बड़ा (लगभग 1.8 x 1.8 मिमी2 से बड़ा) है क्योंकि निर्माता केवल उद्देश्य लेंस के एक निश्चित आकार का उत्पादन करते हैं। इसके विपरीत, एक दो-लेंस प्रणाली को किसी भी लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र पर लागू किया जा सकता है। हालांकि, बेसप्लेट को चिपकाने के लिए दंत सीमेंट उद्देश्य और रिले लेंस के बीच एक परिवर्तित दूरी के साथ गलत संरेखण का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि की गुणवत्ता खराब होती है। यदि दो-लेंस प्रणाली का उपयोग किया जा रहा है, तो इष्टतम इमेजिंग गुणवत्ता (चित्रा 1 ए) प्राप्त करने के लिए दो कामकाजी दूरी को ठीक से लक्षित करने की आवश्यकता है। ये दो महत्वपूर्ण कार्य दूरी रिले लेंस के न्यूरॉन्स और निचली सतह के बीच हैं, और रिले लेंस की शीर्ष सतह और उद्देश्य लेंस की निचली सतह के बीच हैं (चित्रा 1 ए 1)। कामकाजी दूरी के बाहर लेंस के किसी भी गलत संरेखण या गलत स्थान के परिणामस्वरूप इमेजिंग विफलता होती है (चित्रा 1 सी 2)। इसके विपरीत, एक-लेंस प्रणाली को केवल एक सटीक कार्य दूरी की आवश्यकता होती है। हालांकि, उद्देश्य लेंस का आकार गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों की निगरानी के लिए इसके आवेदन को सीमित करता है (उद्देश्य लेंस जो मिनीस्कोप को फिट करता है वह लगभग 1.8 ~ 2.0 मिमी 6,11,13,15 है)। इसलिए, एक उद्देश्य लेंस का आरोपण सतह और अपेक्षाकृत बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों के अवलोकन के लिए सीमित है, जैसे कि चूहोंमें कॉर्टेक्स 6,15 और पृष्ठीय कॉर्नू एम्मोनिस 1 (सीए 1) 11,13। इसके अलावा, पृष्ठीयसीए 1 11,13 को लक्षित करने के लिए कॉर्टेक्स के एक बड़े क्षेत्र को एस्पिरेटेड किया जाना चाहिए। एक-लेंस कॉन्फ़िगरेशन की सीमा के कारण जो गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों की इमेजिंग को रोकता है, वाणिज्यिक मिनीस्कोप सिस्टम केवल एक संयुक्त उद्देश्य लेंस / रिले लेंस (दो-लेंस) डिजाइन प्रदान करते हैं। दूसरी ओर, वी 3 यूसीएलए मिनीस्कोप को एक-लेंस या दो-लेंस प्रणाली में संशोधित किया जा सकता है क्योंकि इसका उद्देश्य लेंसहटाने योग्य 6,11,13,15 है। दूसरे शब्दों में, वी 3 यूसीएलए मिनीस्कोप उपयोगकर्ता मस्तिष्क में प्रत्यारोपित करके (एक लेंस प्रणाली बनाकर), सतही मस्तिष्क अवलोकन (गहराई में 2.5 मिमी से कम) से जुड़े प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, या इसे मिनीस्कोप में प्रीएंचोर करके और मस्तिष्क में रिले लेंस प्रत्यारोपित करके (दो-लेंस सिस्टम बनाकर) हटाने योग्य लेंस का लाभ उठा सकते हैं। गहरे मस्तिष्क अवलोकनों से जुड़े प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय। दो-लेंस प्रणाली को मस्तिष्क को सतही रूप से देखने के लिए भी लागू किया जा सकता है, लेकिन शोधकर्ता को उद्देश्य लेंस और रिले लेंस के बीच सटीक कामकाजी दूरी को जानना चाहिए। एक-लेंस प्रणाली का मुख्य लाभ यह है कि दो-लेंस प्रणाली की तुलना में कामकाजी दूरी को याद करने की संभावना कम हो जाती है, यह देखते हुए कि दो-लेंस सिस्टम (चित्रा 1 ए) में इष्टतम इमेजिंग गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए दो कामकाजी दूरी को ठीक से लक्षित करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, हम सतही मस्तिष्क अवलोकनों के लिए एक लेंस प्रणाली का उपयोग करने की सलाह देते हैं। हालांकि, यदि प्रयोग को गहरे मस्तिष्क क्षेत्र में इमेजिंग की आवश्यकता होती है, तो शोधकर्ता को दो लेंसों के गलत संरेखण से बचना सीखना चाहिए।
प्रयोगों के लिए मिनीस्कोप के दो-लेंस कॉन्फ़िगरेशन के लिए मूल प्रोटोकॉल में लेंस आरोपण और बेसप्लेटिंग 8,10,16,17 शामिल हैं। बेसप्लेटिंग एक जानवर के सिर पर बेसप्लेट का चिपकना है ताकि मिनोस्कोप को अंततः जानवर के शीर्ष पर लगाया जा सके और न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति संकेतों को वीडियोटेप किया जा सके (चित्रा 1 बी)। इस प्रक्रिया में खोपड़ी पर बेसप्लेट को गोंद करने के लिए दंत सीमेंट का उपयोग करना शामिल है (चित्रा 1 सी), लेकिन दंत सीमेंट का संकोचन प्रत्यारोपित रिले लेंस और उद्देश्य लेंस 8,17 के बीच की दूरी में अस्वीकार्य परिवर्तन कर सकता है। यदि दो लेंसों के बीच स्थानांतरित दूरी बहुत बड़ी है, तो कोशिकाओं को ध्यान में नहीं लाया जा सकता है।
मिनीस्कोप का उपयोग करके गहरे मस्तिष्क कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पहले ही प्रकाशित किए जा चुके हैं8,10,16,17. इन प्रोटोकॉल के लेखकों ने इन्सकॉपिक्स सिस्टम का उपयोग किया है8,10,16 या अन्य अनुकूलित डिजाइन17 और वायरल चयन, सर्जरी और बेसप्लेट अटैचमेंट के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन किया है। हालांकि, उनके प्रोटोकॉल को अन्य ओपन-सोर्स सिस्टम, जैसे कि वी 3 यूसीएलए मिनोस्कोप सिस्टम, एनआईएनस्कोप पर सटीक रूप से लागू नहीं किया जा सकता है6, और फिंचस्कोप19. खोपड़ी में बेसप्लेट को सीमेंट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दंत सीमेंट के प्रकार के कारण यूसीएलए मिनोस्कोप के साथ दो-लेंस विन्यास में रिकॉर्डिंग के दौरान दो लेंसों का गलत संरेखण हो सकता है8,17 (चित्र 1C). वर्तमान प्रोटोकॉल की आवश्यकता है क्योंकि बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान दंत सीमेंट के अवांछनीय संकोचन के कारण प्रत्यारोपित रिले लेंस और उद्देश्य लेंस के बीच की दूरी बदलने की संभावना है। बेसप्लेटिंग के दौरान, प्रत्यारोपित रिले लेंस और उद्देश्य लेंस के बीच इष्टतम कार्य दूरी को मिनीस्कोप और रिले लेंस के शीर्ष के बीच की दूरी को समायोजित करके पाया जाना चाहिए, और बेसप्लेट को तब इस आदर्श स्थान पर चिपकाया जाना चाहिए। उद्देश्य लेंस और प्रत्यारोपित रिले लेंस के बीच सही दूरी निर्धारित होने के बाद, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर अनुदैर्ध्य माप प्राप्त किया जा सकता है (चित्र 1B; in vivo रिकॉर्डिंग)। चूंकि रिले लेंस की कामकाजी दूरी की इष्टतम सीमा छोटी है (50 - 350 μm)4,8इलाज के दौरान अत्यधिक सीमेंट संकोचन उद्देश्य लेंस और प्रत्यारोपित रिले लेंस को उचित सीमा के भीतर रखना मुश्किल बना सकता है। इस रिपोर्ट का समग्र लक्ष्य संकोचन समस्याओं को कम करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है8,17 जो बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान होता है और दो-लेंस कॉन्फ़िगरेशन में फ्लोरेसेंस सिग्नल की मिनीस्कोप रिकॉर्डिंग की सफलता दर को बढ़ाने के लिए होता है। सफल मिनीस्कोप रिकॉर्डिंग को स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवर में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति में ध्यान देने योग्य सापेक्ष परिवर्तनों के लाइवस्ट्रीम की रिकॉर्डिंग के रूप में परिभाषित किया गया है। यद्यपि दंत सीमेंट के विभिन्न ब्रांडों में अलग-अलग संकोचन दर होती है, शोधकर्ता एक ब्रांड का चयन कर सकते हैं जिसे पहले परीक्षण किया गया है6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. हालांकि, चिकित्सा सामग्री के लिए आयात नियमों के कारण कुछ देशों / क्षेत्रों में हर ब्रांड प्राप्त करना आसान नहीं है। इसलिए, हमने उपलब्ध दंत सीमेंट की संकोचन दरों का परीक्षण करने के तरीके विकसित किए हैं और महत्वपूर्ण रूप से एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो संकोचन समस्या को कम करता है। वर्तमान बेसप्लेटिंग प्रोटोकॉल पर लाभ उपकरण और सीमेंट के साथ कैल्शियम इमेजिंग की सफलता दर में वृद्धि है जिसे प्रयोगशालाओं में आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। यूसीएलए मिनीस्कोप का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया जाता है, लेकिन प्रोटोकॉल अन्य मिनीस्कोप पर भी लागू होता है। इस रिपोर्ट में, हम एक अनुकूलित बेसप्लेटिंग प्रक्रिया का वर्णन करते हैं और यूसीएलए मिनीस्कोप टू-लेंस सिस्टम को फिट करने के लिए कुछ रणनीतियों की भी सिफारिश करते हैं (चित्र 2A). यूसीएलए मिनीस्कोप के साथ दो-लेंस विन्यास के लिए सफल आरोपण (एन = 3 चूहों) और असफल आरोपण (एन = 2 चूहों) के दोनों उदाहरण सफलताओं और विफलताओं के कारणों के लिए चर्चा के साथ प्रस्तुत किए गए हैं।
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Protocol
इस अध्ययन में की गई सभी प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय ताइवान विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदन संख्या: एनटीयू -109-ईएल-00029 और एनटीयू -108-ईएल-00158) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. दंत सीमेंट की मात्रा परिवर्तन का आकलन
नोट: दंत सीमेंट की मात्रा में परिवर्तन इलाज प्रक्रिया के दौरान होता है। आरोपण और बेसप्लेटिंग से पहले दंत सीमेंट के मात्रा परिवर्तन का परीक्षण करें। शोधकर्ता दंत सीमेंट के किसी भी ब्रांड का परीक्षण कर सकते हैं और बेसप्लेट को सीमेंट करने के लिए सबसे कम मात्रा परिवर्तन वाले ब्रांड का उपयोग कर सकते हैं। एक उदाहरण चित्र 3 में दिखाया गया है।
- प्रत्येक दंत सीमेंट पाउडर के 0.5 ग्राम वजन करें और इसे इसके उपयुक्त समाधान (1 एमएल) के साथ मिलाएं।
नोट: दंत सीमेंट निर्देशों में अनुशंसित पाउडर / तरल अनुपात ठोस रूप प्राप्त करने के लिए घोल के 0.25 एमएल के लिए 0.5 ग्राम पाउडर है। यह परीक्षण प्रोटोकॉल अनुपात को 0.5 ग्राम / एमएल तक पतला करता है ताकि पिपेट युक्तियों में मात्रा परिवर्तन को मापने के लिए मिश्रण को तरल रूप में एस्पिरेटेड किया जा सके। - दंत सीमेंट मिश्रण के 2.5 μL को हटाने के लिए 0.1-10 μL पिपेट युक्तियों का उपयोग करें, और फिर पिपेट टिप को हल्के इलाज गोंद के साथ सील करें।
- युक्तियों को एक रैक पर रखें, दंत सीमेंट मिश्रण के शीर्ष स्तर को चिह्नित करें, और 40 मिनट के बाद दंत सीमेंट मिश्रण के स्तर को मापें (पूरक वीडियो एस 1)।
- युक्तियों में दंत सीमेंट के इलाज के दौरान स्तर परिवर्तन की निगरानी के अलावा, शेष सूखे दंत सीमेंट घनत्व को मापें। घनत्व की गणना करने के लिए, दंत सीमेंट के वजन को मापें, और आर्किमिडीज के सिद्धांत के साथ मात्रा को मापें।
- संक्षेप में, शेष सूखे दंत सीमेंट को पानी से भरे कप में रखें, और उस पानी का वजन करें जो ओवरफ्लो होता है।
- नीचे दिए गए सभी प्रोटोकॉल के लिए कम से कम संकोचन के साथ दंत सीमेंट का उपयोग करें।
2. संज्ञाहरण, सर्जिकल आरोपण, वायरल इंजेक्शन, और डमी बेसप्लेटिंग
- संज्ञाहरण
नोट: वर्तमान रिपोर्ट का उद्देश्य यूसीएलए मिनीस्कोप के लिए सर्जरी और बेसप्लेटिंग प्रक्रिया को अनुकूलित करना है; इसलिए, यह माना गया था कि लक्षित मस्तिष्क क्षेत्रों को संक्रमित करने के लिए इष्टतम वायरल टिटर ज्ञात था। इष्टतम वायरल टिटर खोजने के तरीके रेसेंडेज़ एट अल के चरण 1 से 5 में पाए जा सकते हैं।8. एक बार वायरल कमजोर पड़ने का अनुकूलन हो जाने के बाद, सर्जिकल आरोपण शुरू किया जा सकता है।- माउस को एक प्रेरण कंटेनर में रखें और ऑक्सीजन प्रदान करें (0.2 एल / मिनट की वायु प्रवाह दर पर 100%)। माउस को 5 से 10 मिनट के लिए प्रीऑक्सीजिनेट करें।
- 100% ऑक्सीजन (एयरफ्लो दर: 0.2 एल / मिनट) के साथ मिश्रित 5% आइसोफ्लुरेन का प्रबंधन करें जब तक कि माउस अपना संतुलन खोना शुरू न कर दे और अंततः एनेस्थेटाइज्ड न हो जाए।
- प्रेरण कक्ष से माउस को निकालें और एनाल्जेसिक के रूप में लार और ब्यूप्रेनोर्फिन (0.03 मिलीग्राम / किग्रा; चमड़े के नीचे इंजेक्शन) के संचय को रोकने के लिए एट्रोपिन (0.04 मिलीग्राम / किग्रा; चमड़े के नीचे इंजेक्शन) इंजेक्ट करें।
- चूहे का सिर मुंडवा लें।
- मास्क, बाँझ गाउन और दस्ताने पहनें। सर्जरी के लिए एक बाँझ स्थान और बाँझ सर्जिकल उपकरण तैयार करें। स्टीरियोटैक्सिक तंत्र पर माउस के सिर को स्थिर करें (इस चरण के दौरान 3 से 2.5% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें)। एनाल्जेसिक और एनेस्थेटिक प्रक्रियाओं के बाद, सुनिश्चित करें कि कान की सलाखों सुरक्षित रूप से सिर को स्थिर करती हैं। थर्मल सहायता प्रदान करें।
- सुनिश्चित करें कि सिर एक सीधी स्थिति में सेट है, बीटाडीन के साथ मुंडा सिर को निष्फल करें, और फिर सिर को जाइलोकेन (10%) के साथ स्प्रे करें, एक स्थानीय एनाल्जेसिक।
- सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम लागू करें।
नोट: ओकुलर चोट को रोकने के लिए सभी एनेस्थेटिक घटनाओं के दौरान आंखों की सुरक्षा के लिए नेत्र मरहम का उपयोग करें। - अपने पिछले पंजे को चुटकी मारकर जानवर के गहरे दर्द रिफ्लेक्स का परीक्षण करें। एक बार जब जानवर कोई पंजा वापसी रिफ्लेक्स नहीं दिखाता है, तो सर्जिकल प्रक्रियाओं के साथ आगे बढ़ें।
- खोपड़ी के मध्य तल के साथ एक छोटा सा चीरा लगाएं (लगभग 2 मिमी पूर्ववर्ती से ब्रेग्मा तक शुरू होता है और ब्रेग्मा के लगभग 6 मिमी पीछे समाप्त होता है)। फिर, खोपड़ी पर संयोजी ऊतक को साफ करें, और बाएं ललाट और इंटरपेराइटल हड्डियों पर तीन स्टेनलेस स्टील स्क्रू लंगर डालें।
- इस बिंदु पर, आइसोफ्लुरेन को 1-2% तक कम करें। पूरी शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान श्वास दर की निगरानी करें। यदि सांस लेने की दर बहुत धीमी है (जानवर के आधार पर लगभग 1/सेकंड), तो आइसोफ्लुरेन की एकाग्रता को कम करें।
- 0.7 मिमी टिप व्यास के साथ एक बर्र ड्रिल का उपयोग करके सर्जिकल माइक्रोस्कोप या स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत रिले लेंस आरोपण के लिए एक क्रैनियोटॉमी निष्पादित करें। बर्र ड्रिल बिट को पकड़ने के लिए एक माइक्रो-ड्रिल का उपयोग करें और इच्छित सर्कल क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करें (कैल्वेरियम की पूरी मोटाई को प्रवेश करने की आवश्यकता नहीं है)।
नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले रिले लेंस का व्यास 1.0 मिमी था, लंबाई ~ 9.0 मिमी 1 की पिच थी, और ~ 100 μm - 300 μm की कामकाजी दूरी सीमा थी; इसलिए, क्रैनियोटॉमी का व्यास 1.2 मिमी था।- धीरे से रूपरेखा को गहरा करें जब तक कि ड्यूरा उजागर न हो जाए।
- 3 एमएल सिरिंज में 3 एमएल बाँझ खारा तैयार करें और इसे बर्फ की बाल्टी में ठंडा करें। अक्सर क्षेत्र को ठंडा करने और गर्मी की क्षति और रक्तस्राव को रोकने के लिए सिरिंज से 0.1 एमएल खारा के साथ उजागर क्षेत्र को कुल्ला करें।
- हल्के से 27 जी सुई के साथ ड्यूरा को उठाएं और छील लें।
- 27 ग्राम कुंद सुई पर सिरे से 1 मिमी पर एक अंकन डालें और लेंस आरोपण 8,11,13,17 (चित्रा 2 बी 1) के लिए एक खिड़की बनाने के लिए मस्तिष्क के कॉर्टेक्स को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करने के लिए इसका उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो सैंडपेपर के साथ 27 ग्राम इंजेक्शन सुई की नोक को पीसकर एक कुंद सुई बनाएं। फिर, सुई को एक सिरिंज से कनेक्ट करें, सिरिंज को एक ट्यूब से कनेक्ट करें, और वैक्यूम बनाने के लिए ट्यूब को सक्शन के स्रोत से कनेक्ट करें।
नोट: रिले लेंस कुंद है और जब इसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्र में रखा जाता है तो मस्तिष्क के ऊतकों को संपीड़ित करेगा। इस प्रकार, कॉर्टेक्स की आकांक्षा रिले लेंस आरोपण के कारण ऊतक क्षति को कम करती है। कॉर्टेक्स चूहों में लगभग 1 मिमी मोटा होता है लेकिन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत कल्पना करना मुश्किल होता है। निशान सुई की गहराई को अकेले स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की तुलना में अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने की अनुमति देने के लिए एक मील का पत्थर बनाता है। इसके अलावा, कोई यह निर्धारित कर सकता है कि प्रतिरोध के आधार पर कॉर्टेक्स क्षेत्र तक पहुंच गया है या पारित किया गया है; कॉर्टेक्स का शीर्ष भाग अपेक्षाकृत नरम लगता है, जबकि सबकॉर्टिकल क्षेत्र घना महसूस करता है। इसलिए, एक बार जब बनावट सघन महसूस करना शुरू कर देती है, तो आकांक्षा को रोक दें (चित्रा 2 बी 3)। - 3 एमएल सिरिंज में 3 एमएल बाँझ खारा तैयार करें और इसे बर्फ की बाल्टी में ठंडा करें। रक्तस्राव को रोकने और मस्तिष्क एडिमा की संभावना को कम करने के लिए खारा के साथ क्षेत्र को कुल्ला करें।
- एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) इंजेक्शन
नोट: वर्तमान प्रयोग में AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE का उपयोग किया गया था। jGCaMP7s एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक है जो हरे रंग की प्रतिदीप्ति3 का उत्सर्जन करता है। क्योंकि वर्तमान अध्ययन ने एक विषय के रूप में एक जंगली प्रकार के माउस का उपयोग किया था, इसलिए न्यूरॉन्स को हरे-फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक जीन के साथ स्थानांतरित करने और अभिव्यक्ति को सक्षम करने के लिए एक वायरल वेक्टर की आवश्यकता थी। ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने वाले शोधकर्ता हरे-फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक को व्यक्त करते हैं क्योंकि उनके विषय प्रोटोकॉल 2.2 को छोड़ सकते हैं।- स्टीरियोटैक्सिक बांह पर 20 जी अंतःशिरा (यानी) कैथेटर की आंतरिक सुई को माउंट करें और उचित निर्देशांक (रिले लेंस प्रत्यारोपण के दौरान उपयोग किए जाने वाले समान निर्देशांक) पर धीरे-धीरे मस्तिष्क को पंचर (~ 100 - 200 μm / min) करें (चित्रा 2B3)।
- माइक्रोइंजेक्शन सुई को वेंट्रल सीए 1 में 100-200 μm / min की गति से कम करें और वायरल वेक्टर के 200 nL को लक्ष्य क्षेत्र (-3.16 मिमी एपी, 3.25 मिमी एमएल, और ब्रेग्मा से -3.50 मिमी डीवी) में इंजेक्ट करें।
- वायरस को फैलने की अनुमति देने और पीछे के प्रवाह को कम करने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- माइक्रोइंजेक्शन सुई को वापस लें (~ 100-200 μm / min)।
- रिले लेंस आरोपण
- रिले लेंस को 75% अल्कोहल10,16 के साथ कीटाणुरहित करें और फिर पाइरोजेन-मुक्त खारा के साथ कुल्ला करें। लेंस को प्रत्यारोपण तक ठंडे पाइरोजेन-मुक्त खारा में भिगोएं।
नोट: एक ठंडा लेंस मस्तिष्क में रखे जाने पर मस्तिष्क एडिमा को कम करता है। - एक माइक्रो बुलडॉग क्लैंप (चित्रा 2 बी 3) का उपयोग करके रिले लेंस को पकड़ें, जिसके दांत गर्मी-सिकुड़ने वाली ट्यूबिंग से ढके हुए हैं।
नोट: बुलडॉग क्लैंप लेंस को नुकसान पहुंचाए बिना दृढ़ता से पकड़ सकता है। ट्यूबिंग से ढके बुलडॉग क्लैंप बनाने की विधि के लिए रेसेंडेज़ एट अल.8 देखें। - धीरे-धीरे (~ 100 - 200 μm / min) रिले लेंस को लक्ष्य क्षेत्र (-3.16 मिमी एपी, 3.50 मिमी एमएल, और ब्रेग्मा से -3.50 मिमी डीवी) के शीर्ष पर रखें और इसे दंत सीमेंट के साथ स्थिर करें।
- रिले लेंस को 75% अल्कोहल10,16 के साथ कीटाणुरहित करें और फिर पाइरोजेन-मुक्त खारा के साथ कुल्ला करें। लेंस को प्रत्यारोपण तक ठंडे पाइरोजेन-मुक्त खारा में भिगोएं।
- डमी बेसप्लेटिंग
नोट: आरोपण सर्जरी के दौरान "डमी बेसप्लेटिंग" का उद्देश्य दंत सीमेंट की मात्रा को कम करने के लिए एक दंत सीमेंट आधार बनाना है जिसे कई हफ्तों बाद वास्तविक बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान लागू करने की आवश्यकता होती है। इस तरह, दंत सीमेंट की मात्रा में परिवर्तन का जोखिम कम से कम हो जाता है।- मिनीस्कोप के निचले भाग पर उद्देश्य लेंस को बांधें और बेसप्लेट को मिनीस्कोप पर इकट्ठा करें (इस चरण में, लंगर वाले उद्देश्य लेंस, बेसप्लेट और मिनीस्कोप की असेंबली अभी तक माउस की खोपड़ी पर नहीं रखी गई है)।
- बेसप्लेट के बाहर के चारों ओर 10 सेमी पैराफिन फिल्म लपेटें (चित्रा 4 ए)।
- पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली मिट्टी का उपयोग करके स्टीरियोटैक्सिक आर्म प्रोब के साथ मिनीस्कोप पकड़ें।
- रिले लेंस के शीर्ष पर उद्देश्य लेंस को लेंस के बीच जितना संभव हो उतना कम स्थान के साथ संरेखित करें (चित्रा 4 बी)।
- बेसप्लेट की स्थिति को सुरक्षित करने के लिए दंत सीमेंट का उपयोग करें (जैसे कि सीमेंट केवल पैराफिन फिल्म को छूता है)।
- जब डेंटल सीमेंट सूख जाए तो फिल्म को हटा दें।
- बेसप्लेट और मिनिस्कोप को हटा दें। दंत सीमेंट का आधार खोखला है (चित्रा 4 बी)।
- रिले लेंस को दैनिक गतिविधियों से बचाने और माउस द्वारा खरोंच से बचाने के लिए, रिले लेंस को कुछ मोल्डिंग सिलिकॉन रबर के साथ सील करें जब तक कि रिले लेंस कवर न हो जाए, और सिलिकॉन रबर को दंत सीमेंट की एक पतली परत के साथ कवर करें (चित्रा 4 बी)।
- स्टीरियोटैक्सिक उपकरणों से माउस को अलग करें और माउस को रिकवरी चैंबर में रखें।
- संक्रमण को रोकने के लिए एनाल्जेसिया और सेफ्टाज़िडीम (25 मिलीग्राम / किग्रा; चमड़े के नीचे इंजेक्शन) के लिए कारप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा; चमड़े के नीचे इंजेक्शन) या मेलोक्सिकैम (1 मिलीग्राम / किग्रा; चमड़े के नीचे इंजेक्शन) इंजेक्ट करें।
नोट: एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग एक सड़न रोकनेवाला तकनीक का विकल्प नहीं है। पेरीओपरेटिव एंटीबायोटिक्स (यानी, सेफ्टाज़िडिम) को कुछ परिस्थितियों में इंगित किया जा सकता है, जैसे कि लंबी अवधि की सर्जरी या क्रोनिक प्रत्यारोपण का प्लेसमेंट। - जानवर को तब तक देखें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
- चूहों को व्यक्तिगत रूप से घर दें और पोस्टसर्जिकल दर्द से राहत के लिए एक सप्ताह के लिए मेलोक्सिकैम (1 मिलीग्राम / किग्रा; चमड़े के नीचे इंजेक्शन; क्यू 24 एच) इंजेक्ट करें। सर्जरी के बाद हर दिन जानवर की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वह सामान्य रूप से खा रहा है, पी रहा है और शौच कर रहा है।
- 3 या अधिक सप्ताह के बाद बेसप्लेटिंग करें।
3. बेसप्लेटिंग
नोट: आमतौर पर, बेसप्लेटिंग प्रक्रिया (चित्रा 5) वसूली और वायरल इनक्यूबेशन समय के कारण प्रारंभिक प्रक्रिया के 2-3 सप्ताह के भीतर नहीं की जा सकती है। बेसप्लेटिंग के लिए प्रेरण प्रक्रियाएं चरण 2.1.1 से 2.1.8 में वर्णित के समान हैं। हालांकि, बेसप्लेटिंग एक आक्रामक प्रक्रिया नहीं है, और जानवर को केवल हल्की बेहोशी की आवश्यकता होती है। इसलिए, 0.8-1.2% आइसोफ्लुरेन पर्याप्त है, जब तक कि जानवर स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम पर आगे नहीं बढ़ सकता है। इसके अलावा, अपेक्षाकृत हल्के आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया भी निगरानी8 (पूरक वीडियो एस 2) के दौरान न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति क्षणिकों की अभिव्यक्ति को सुविधाजनक बनाने में मदद कर सकता है।
- सावधानी से दंत सीमेंट की छत की पतली परत को हड्डी के रोंगेर के साथ काटें और सिलिकॉन रबर को हटा दें। रिले लेंस की सतह को 75% अल्कोहल के साथ साफ करें।
- इसे मिनीस्कोप (चित्रा 5 ए 1) के निचले भाग में ठीक करने के लिए बेसप्लेट के बगल में एक सेट स्क्रू बांधें।
नोट: बेसप्लेट को मिनीस्कोप के तल के नीचे सुरक्षित रूप से कसा जाना चाहिए क्योंकि एक कसे हुए और हल्के से बंधे हुए बेसप्लेट के बीच का अंतर असंगत दूरी का कारण बन सकता है। - फोकस स्लाइड को मुख्य आवास से लगभग 2.7 - 3 मिमी समायोजित करें (चित्रा 5 ए 2)।
नोट: यद्यपि बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान लंबाई को और समायोजित किया जा सकता है, इसे लगभग 2.7 मिमी तक ठीक करें, क्योंकि साथ ही साथ प्रत्यारोपित रिले लेंस और प्रीएंकोर्ड ऑब्जेक्टिव लेंस के बीच मिनीस्कोप लंबाई और इष्टतम लंबाई को समायोजित करना बहुत भ्रामक है। - मिनीस्कोप को डेटा अधिग्रहण बोर्ड से कनेक्ट करें और इसे कंप्यूटर पर यूएसबी 3.0 (या उच्च संस्करण) पोर्ट में प्लग करें।
- यूसीएलए टीम द्वारा विकसित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चलाएँ।
- एक्सपोजर को 255, लाभ को 64x और उत्तेजना एलईडी को 5% तक समायोजित करें। प्रारंभिक बेसप्लेटिंग के लिए इन सेटिंग्स की सिफारिश की जाती है; विशिष्ट सेटिंग्स मस्तिष्क क्षेत्रों और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक के अभिव्यक्ति स्तरों के आधार पर भिन्न होंगी।
- मिनीस्कोप को डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर से कनेक्ट करने और लाइवस्ट्रीम देखने के लिए कनेक्ट बटन पर क्लिक करें।
- मिनीस्कोप उद्देश्य लेंस को हाथ से रिले लेंस से संरेखित करें और प्रतिदीप्ति संकेतों की खोज शुरू करें (चित्रा 5 बी1)।
नोट: प्रारंभ में, प्रतिदीप्ति संकेत की खोज मैन्युअल रूप से समायोजन की सुविधा प्रदान करती है। चूंकि आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक को व्यक्त करने के लिए एक एएवी प्रणाली का उपयोग किया गया था, प्रमोटर प्रकार और एएवी सीरोटाइप दोनों ने अभिकर्मक23,24 की दक्षता को प्रभावित किया। शोधकर्ताओं को व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को खोजकर कैल्शियम संकेतक की अभिव्यक्ति की जांच करने की आवश्यकता होनी चाहिए जो भविष्य के प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रतिदीप्ति में परिवर्तन दिखाते हैं। - दंत सीमेंट को किसी भी स्थान पर ड्रिल करें जहां यह मिनीस्कोप (वैकल्पिक) को अवरुद्ध करता है।
- डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की लाइव स्ट्रीम देखें और एक लैंडमार्क (पूरक वीडियो एस 2) के रूप में रिले लेंस के मार्जिन का उपयोग करें। रिले लेंस का मार्जिन मॉनिटर पर चंद्रमा जैसे भूरे सर्कल के रूप में दिखाई देता है (चित्रा 5 बी 1; सफेद तीर)।
- एक बार रिले लेंस पाए जाने के बाद, फ्लोरेसेंस सिग्नल पाए जाने तक मिनिस्कोप के विभिन्न कोणों और दूरी को सावधानीपूर्वक समायोजित करें।
नोट: न्यूरॉन्स की छवियां पृष्ठभूमि की तुलना में सफेद हैं। एक सटीक न्यूरोनल आकार इंगित करता है कि न्यूरॉन्स रिले लेंस के फोकल प्लेन पर पूरी तरह से स्थित हैं। गोल न्यूरॉन्स का सुझाव है कि वे फोकल प्लेन के पास थे। मस्तिष्क में न्यूरोनल आकार अलग है, यहां वेंट्रल सीए 1 को एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। - यदि कोई व्यक्तिगत न्यूरॉन समय के कार्य के रूप में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन प्रदर्शित नहीं करता है, तो सिलिकॉन रबर के साथ आधार को फिर से सील करें। प्रतिदीप्ति नहीं देखी जाती है क्योंकि इनक्यूबेशन अवधि भी वायरस23,24 की संपत्ति पर निर्भर है। एक अतिरिक्त सप्ताह के बाद चरण 3.1-3.12 निष्पादित करें। (यह वैकल्पिक है)।
- मिनीस्कोप को इष्टतम स्थिति में रखें और स्टीरियोटैक्सिक बांह को पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली मिट्टी के साथ मिनीस्कोप की ओर ले जाएं (चित्रा 5 बी 2)। पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली मिट्टी के साथ स्टीरियोटैक्सिक बांह के लिए मिनीस्कोप का पालन करें।
- सबसे अच्छा दृश्य (पूरक वीडियो S2) की खोज के लिए x, y, और z भुजाओं को थोड़ा समायोजित करें। इसके बाद, जेड-अक्ष पर कान बार, टूथ बार, या पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली मिट्टी को मोड़कर उद्देश्य लेंस और रिले लेंस की सतह के बीच के कोण को समायोजित करें। वायरल अभिव्यक्ति और लेंस आरोपण सफल होता है जब कम से कम एक सेल प्रतिदीप्ति क्षणिक प्रदर्शित करता है (चित्रा 6 ए; बेसप्लेटिंग के दौरान पूरक वीडियो एस 2 (जो मस्तिष्क के क्षेत्र पर भी निर्भर करता है, जैसे कि सीए 1)।
नोट: यदि मॉनिटर केवल सफेद कोशिकाओं को दिखाता है लेकिन कोई क्षणिक नहीं दिखाता है, तो एक और कारण है ( चित्रा 6 बी, सी, पूरक वीडियो एस 4, एस 5, परिणाम अनुभाग और समस्या निवारण अनुभाग देखें)। - दंत सीमेंट के साथ बेसप्लेट (चित्रा 5 बी 2) को सीमेंट करें।
- सीमेंटिंग के दौरान रुचि के क्षेत्र की निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि इष्टतम स्थिति नहीं बदलती है।
- दंत सीमेंट बेस पर बेसप्लेट को मजबूती से चिपकाते हुए सीमेंट की सबसे छोटी संभव मात्रा का उपयोग करें (चित्रा 5 बी 2)। बेसप्लेट के चारों ओर सीमेंट की दूसरी और तीसरी परत लागू करें लेकिन ग्रिन लेंस को प्रभावित न करने के लिए सावधान रहें।
नोट: बेसप्लेट पर सीमेंट लागू करना इस चरण में आसान है क्योंकि बेसप्लेट का आधार डमी चढ़ाना प्रक्रिया के दौरान बनाया गया था। - सीमेंट ठीक होने पर बेसप्लेट से मिनोस्कोप को सावधानीपूर्वक अलग कर दें। फिर, एक सुरक्षात्मक टोपी पर पेंच।
- जानवर को रिकवरी पिंजरे में ले जाएं। जानवर को तब तक देखें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
- व्यक्तिगत रूप से घर के चूहे। सुनिश्चित करें कि यह हर दिन सामान्य रूप से खा रहा है, पी रहा है और शौच कर रहा है। माउस को पूरी तरह से ठीक होने के लिए 5 दिनों तक प्रतीक्षा करें और फिर कैल्शियम इमेजिंग की जांच करें।
नोट: बेसप्लेट को धारण करने वाले दंत सीमेंट की केवल एक छोटी मात्रा है। इसलिए, यदि बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के बाद से बेसप्लेट काफी बदल गया है, तो ड्रिल के साथ दंत सीमेंट को हटा दें और बेसप्लेटिंग प्रक्रिया को फिर से करें। - एनेस्थेटाइज (केटामाइन (87 मिलीग्राम / किग्रा) / ज़ाइलज़िन (13 मिलीग्राम / किग्रा) मिश्रण के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा) और सभी प्रयोगों के बाद जानवरको 25 परफ्यूज करें।
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Representative Results
दंत सीमेंट की मात्रा परिवर्तन का आकलन
चूंकि इलाज प्रक्रिया के दौरान दंत सीमेंट की मात्रा बदल जाती है, इसलिए यह इमेजिंग गुणवत्ता को काफी प्रभावित कर सकता है, यह देखते हुए कि ग्रिन लेंस की कामकाजी दूरी लगभग 50 से 350 μm 4,8 है। इसलिए, इस मामले में दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दंत सीमेंट, टेम्परॉन और टोकुसो का परीक्षण किया गया था, आरोपण और बेसप्लेटिंग प्रक्रिया से पहले (चित्रा 5)। वीडियो का पहले यह निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया गया था कि क्या सीमेंट सिकुड़ गए थे और फिर पूरी तरह से सूखने पर सीमेंट की मात्रा की तुलना की गई थी। दंत सीमेंट के प्रारंभिक मिश्रण की समान एकाग्रता और मात्रा को पिपेट युक्तियों और वीडियोटेप (पूरक वीडियो एस 1) में लोड किया गया था। वीडियो एस 1 ने दिखाया कि सुखाने की प्रक्रिया के दौरान दोनों सीमेंट सिकुड़ गए। टोकुसो ने टेम्परॉन की तुलना में बेहतर प्रदर्शन किया (यानी, सिकुड़ने के बाद भी टेम्परॉन की तुलना में इसकी बड़ी मात्रा थी): चित्रा 3 बी; टेम्परॉन की औसत मात्रा: 0.93 ± 0.07 एमएल; टोकुसो का औसत आयतन: 1.18 ± 0.07 एमएल; टी-टेस्ट: पी = 0.048, टी (6) = 2.46, यह सुझाव देते हुए कि यह कम सिकुड़ गया। सीमेंट के घनत्व को भी पूरी तरह से सूखने के बाद 4 बार परीक्षण किया गया था। टोकुसो का टेम्परॉन की तुलना में कम औसत घनत्व था (टेम्परॉन का औसत घनत्व: 1.07 ± 0.12 ग्राम / एमएल; टोकुसो का औसत घनत्व: 0.93 ± 0.08 ग्राम / एमएल; टी-टेस्ट: पी = 0.38, टी (6) = -0.94), जिसका अर्थ है कि इसकी संकोचन दर कम थी। इसलिए, टोकुसो का उपयोग निम्नलिखित आरोपण और बेसप्लेटिंग चरणों के लिए किया गया था। उपरोक्त प्रयोग का वर्णन करने का उद्देश्य किसी भी ब्रांड की सिफारिश करना नहीं है, बल्कि प्रयोगकर्ताओं को एक दंत सीमेंट खोजने के लिए याद दिलाना है जो इलाज करते समय काफी मात्रा में बदलाव से नहीं गुजरता है।
छवि स्थानांतरण का मापन
हमने एक निश्चित वस्तु पर डमी बेसप्लेटिंग और मूल बेसप्लेटिंग प्रक्रियाओं का अनुकरण किया ताकि यह पता लगाया जा सके कि डमी बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के परिणामस्वरूप मूल प्रक्रिया की तुलना में बेसप्लेट स्थान में एक छोटा बदलाव होता है या नहीं। बेसप्लेट के केंद्र में 23 जी 2.5 सेमी सिरिंज सुई को ठीक करने के लिए एक प्रकाश-इलाज चिपकने वाला का उपयोग किया गया था, जिसमें बेसप्लेट से 1 सेमी चिपक गया था (चित्रा 3 सी)। फिर, बेसप्लेटिंग को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण की बांह के साथ सुइयों को पकड़कर अनुकरण किया गया था। प्रयोगशाला जानवरों का उपयोग करने के बजाय, स्टीरियोटैक्सिक उपकरण की मेज पर एक स्टिकर संलग्न किया गया था। सिरिंज सुई ने स्टिकर को छेद दिया, जिससे मूल स्थान का प्रतिनिधित्व हुआ। फिर, सुई को 0.5 मिमी तक बढ़ाया गया और सिमुलेशन सर्जरी शुरू की गई। एक बार बेसप्लेटिंग प्रक्रिया8 की नकल करने वाली एक सर्जरी में, दंत सीमेंट को तब तक लागू किया गया था जब तक कि यह बेसप्लेट को कवर नहीं करता था, जो स्टिकर से 1 सेमी ऊपर था। फिर, स्टिकर को फिर से छेदने के लिए सुई को धीरे से धक्का देने से पहले सीमेंट को ठीक करने के लिए 2 घंटे की प्रतीक्षा अवधि थी। चूंकि प्रकाश-इलाज चिपकने वाला सुई को पूरी तरह से स्थिर नहीं करता था, इसलिए सुई को एक और छेद बनाने के लिए गहराई से धक्का दिया जा सकता है, जो दंत सीमेंट के सूखने के बाद बेसप्लेट के स्थान का प्रतिनिधित्व करता है। सुई के स्थान बदलाव को मापने के लिए प्रारंभिक छेद और दूसरे छेद के बीच की दूरी को मापा गया था। परिणामों से पता चला कि खोपड़ी से 1 सेमी ऊपर बेसप्लेट के परिणामस्वरूप 1.76 ± 0.14 मिमी स्थान बदलाव हुआ, लेकिन डमी बेसप्लेटिंग के परिणामस्वरूप केवल 0.75 ± 0.17 मिमी की शिफ्ट हुई (चित्रा 3 डी; एक बार बेसप्लेटिंग बनाम डमी बेसप्लेटिंग की औसत शिफ्ट दूरी; टी-टेस्ट: पी < 0.01, टी (8) = 6.03)।
इसके अतिरिक्त, हम इस बारे में उत्सुक थे कि क्या दंत सीमेंट की ऊंचाई बदलाव को प्रभावित करेगी। इसलिए, हमने एक बार बेसप्लेटिंग प्रक्रिया का उपयोग करके एक छोटी ऊंचाई (चित्रा 3 ई; 0.5 सेमी ऊपर) का परीक्षण किया। खोपड़ी से 0.5 सेमी ऊपर लंगर डालने वाली बेसप्लेट खोपड़ी से 1 सेमी ऊपर बेसप्लेट की तुलना में काफी कम स्थानांतरित हो गई (चित्रा 3 एफ; औसत शिफ्ट दूरी: 0.43 ± 0.11 बनाम 1.76 ± 0.14 मिमी; टी-टेस्ट: पी < 0.01, टी (8) = 9.73)। डेटा ने सुझाव दिया कि खोपड़ी के ऊपर बेसप्लेट की ऊंचाई और बेसप्लेट की दूरी सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थी। चूंकि डमी बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के बाद एक दूसरा बेसप्लेटिंग चरण होता है जो केवल दंत सीमेंट की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करता है, यह डेटा इस परिकल्पना का भी समर्थन करता है कि डमी बेसप्लेटिंग बेसप्लेटिंग प्रक्रिया की सटीकता में सुधार करने में मदद करता है।
दो-लेंस मिनीस्कोप सिस्टम का उपयोग करइमेजिंग
वायरल इन्फ्यूजन, डमी बेसप्लेटिंग और बेसप्लेटिंग (चित्रा 2, चित्रा 4, चित्रा 5) के लिए सर्जिकल प्रोटोकॉल का पालन करके, हमने बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान और बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के बाद तीन चूहों (एन = 3/5) (चित्रा 6 ए, पूरक वीडियो एस 3) में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति क्षणिक ों को देखा, जबकि चूहे स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहे थे, यह पुष्टि करते हुए कि उद्देश्य और रिले लेंस के बीच काम करने की दूरी समान रही (चित्रा 6 ए 1) चित्र 6A3, दंत सीमेंट के पूरी तरह से सूख जाने के बाद स्थिति में केवल थोड़ा बदलाव हुआ। यहां, हम एक माउस (पूरक वीडियो एस 2; माउस # 5) और बाद में कैल्शियम इमेजिंग के वीडियो प्रदान करते हैं जबकि चूहे स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहे थे (पूरक वीडियो एस 3; माउस # 3, # 4, # 5; कच्चा डेटा)। कृपया ध्यान दें कि V3 के लिए डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में पृष्ठभूमि घटाव के लिए फ़ंक्शन नहीं हैं, और ऑफ़लाइन प्रोसेसिंग द्वारा वीडियो के कंट्रास्ट को बेहतर बनाया जा सकता है)। पूरक वीडियो एस 2 के लिए, प्रतिदीप्ति संकेतों के लिए एक मैन्युअल खोज की गई थी और फिर ठीक समायोजन के लिए मिनीस्कोप को स्टीरियोटैक्सिक बांह से जोड़ा गया था। जांच के दौरान कुछ प्रतिदीप्ति क्षणिक देखे गए (पूरक वीडियो एस 2; चित्र 6 ए)। एक क्षणिक भूरे या सफेद धब्बों में चमक में एक चिकनी बदलाव है, न कि चमकती रोशनी जैसा फायरिंग पैटर्न; आंकड़े 6 ए1 से 6 ए2 क्षणिकों की छवियों को प्रदर्शित करते हैं। स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों के वीडियो ने बेसप्लेटिंग प्रक्रिया (पूरक वीडियो एस 3) के दौरान रुचि के क्षेत्र की तुलना में एक स्वीकार्य स्थानिक बदलाव दिखाया। इस स्तर पर कोशिकाओं के मार्जिन में काफी सुधार नहीं किया जा सकता है क्योंकि हम रिले लेंस के तल और सक्रिय न्यूरॉन्स के बीच की दूरी को समायोजित नहीं कर सकते थे। विशेष रूप से, बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान कुछ मुद्दे अक्सर हो सकते हैं, जिसमें एक समान पृष्ठभूमि को छोड़कर कुछ भी शामिल है (चित्रा 6 बी; पूरक वीडियो एस 4) या बिना किसी प्रतिदीप्ति क्षणिक के सफेद सेल मार्जिन की दृश्यता (चित्रा 6 सी; पूरक वीडियो एस 5)। नकारात्मक परिणामों के दो उदाहरण भी प्रदान किए गए हैं (एन = 2/5) (चित्रा 6 बी, सी, पूरक वीडियो एस 4, एस 5)। विफलताओं के संभावित कारणों की जांच चर्चा अनुभाग में की जाती है। इन दो चूहों के लिए सर्जिकल प्रक्रियाओं को मार्ग को साफ करने के लिए 1 मिमी व्यास की सुई का उपयोग किए बिना किया गया था; इस प्रकार, रिले लेंस को सीधे प्रत्यारोपित किया गया था। हम प्रस्तावित करते हैं कि माउस # 2 में, रिले लेंस ने न्यूरॉन्स को संकुचित किया हो सकता है और कुछ न्यूरॉन्स को नीचे खींच लिया हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स हो सकते हैं। इसलिए, प्रतिदीप्ति क्षणिक नहीं पाए गए।
चित्र 1: मिनोस्कोप के तंत्र और दोष जो आमतौर पर इमेजिंग विफलता का कारण बनते हैं। (A) रिले लेंस और उद्देश्य लेंस का कार्टून आरेख दो-लेंस प्रणाली में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए आवश्यक तंत्र प्रदर्शित करता है। प्रत्येक लेंस की सिग्नलिंग तरंगें फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक कामकाजी दूरी खोजने में शामिल तंत्र के महत्व और तंत्र पर जोर देती हैं। (A1) रिले ग्रिन लेंस को काम की दूरी के भीतर लक्ष्य न्यूरॉन्स के ऊपर रखा जाता है। चूंकि रिले लेंस की पिच 0.5 * एन (जहां एन एक पूर्णांक है) है, लेंस प्रकाश को रिले करके लक्ष्य न्यूरॉन्स के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है, जिससे मूल फ्लोरेसेंस सिग्नल रिले लेंस के शीर्ष पर आ जाते हैं। फिर, प्रकाश की पूर्ण साइनसॉइडल अवधि का लगभग 1/4 उद्देश्य GRIN लेंस (~ 0.25 पिच) के माध्यम से यात्रा करता है और इसके परिणामस्वरूप एक आवर्धित छवि होती है। (A2) उद्देश्य लेंस छवियों को मिनीस्कोप के शीर्ष (आरेख में हरी प्लेट) पर स्थित एक पूरक धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक (सीएमओएस) सेंसर तक पहुंचाता है। (बी) कार्टून आरेख एक (बी 1) दो-लेंस प्रणाली और (बी 2) एक-लेंस प्रणाली के बीच ग्रिन लेंस आरोपण प्रक्रियाओं में अंतर प्रस्तुत करता है। सामान्य तौर पर, प्रमुख अंतर यह है कि एक-लेंस प्रणाली सीधे मस्तिष्क की सतह को चित्रित करने के लिए अपने उद्देश्य लेंस का उपयोग करती है; नतीजतन, उद्देश्य लेंस को लक्ष्य न्यूरॉन्स के शीर्ष पर प्रत्यारोपित करने की आवश्यकता होती है। (सी) इसके विपरीत, दो-लेंस प्रणाली में, तुलना में, मस्तिष्क में एक अतिरिक्त रिले लेंस प्रत्यारोपित किया जाता है और उद्देश्य लेंस को मिनीस्कोप में पूर्व-निर्धारित किया जाता है। (C1) यूसीएलए मिनोस्कोप के वी 3 संस्करण के लिए बेसप्लेट का आकार दंत सीमेंट के पूरी तरह से सूखने के बाद असमान बदलाव का कारण बन सकता है। (C2) यह बदलाव रिले लेंस और उद्देश्य लेंस के बीच काम की दूरी से गलत संरेखण या विचलन का कारण बनता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: दो-लेंस मिनीस्कोप प्रणाली की सफलता दर में सुधार के लिए संशोधित प्रोटोकॉल और विस्तृत सर्जिकल प्रोटोकॉल। (A1) दो-लेंस प्रणाली के लिए संशोधित सर्जिकल प्रोटोकॉल। वायरल इंजेक्शन के स्थान, और रिले ग्रिन लेंस आरोपण दिखाए गए हैं। डमी बेसप्लेटिंग काम की दूरी को रुचि के न्यूरॉन्स को सटीक रूप से शामिल करने की अनुमति देता है और (ए 2) बेसप्लेटिंग प्रक्रिया से जुड़े स्थितिगत स्थानांतरण को कम करता है। इसलिए, (ए 3) स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों में इमेजिंग फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संभावना बढ़ जाती है। (बी) वायरल इंजेक्शन के लिए चरणों की कार्टून छवि, और रिले ग्रिन लेंस प्लेसमेंट। (B1) सबसे पहले, कॉर्टेक्स आकांक्षा गहराई के आकलन में सहायता के लिए टिप से लगभग 1 मिमी (माउस प्रयोगों के लिए) पेन के साथ आकांक्षा सुई को चिह्नित करें। फिर, मस्तिष्क से संयोजी ऊतक और कॉर्टेक्स (चूहों में लगभग 1 मिमी गहरा) को एस्पिरेट करें। (B2) रिले लेंस प्रत्यारोपित करने के लिए लक्ष्य क्षेत्र के रूप में वेंट्रल हिप्पोकैम्पस का उपयोग करें; विशेष रूप से, कठिन कॉर्पस कॉलोसम कॉर्टिकल क्षेत्र की आकांक्षा को रोकने के लिए मील का पत्थर है। कॉर्पस कॉलोसम की रेशेदार बनावट को आकांक्षा के दौरान स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है। (B3) दूसरा, वायरल जलसेक से पहले एक मार्ग को साफ करने के लिए 20 ग्राम कैथेटर (लगभग 1 मिमी व्यास; व्यास रिले लेंस के समान है) की आंतरिक सुई के साथ रुचि के बिंदु को पंचर करें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे, सुई द्वारा बनाई गई एक डेंट (तस्वीर में डैश्ड सर्कल) दिखाई देना चाहिए। डेंट पर माइक्रोइंजेक्शन सुई और रिले लेंस को कम करें (या डेंट के केंद्र से केवल 250 μm दूर)। अंत में, रिले ग्रिन लेंस रखें (वर्तमान अध्ययन में, हमने व्यास में 1 मिमी रिले लेंस का उपयोग किया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: ठीक किए गए दंत सीमेंट के आयतन परिवर्तन का मापन। (A) दो ब्रांडों के ठीक किए गए दंत सीमेंट के साथ एक उदाहरण। पाउडर और घोल को मिलाने के बाद काले तीर मूल स्तर को इंगित करते हैं। सफेद तीर 10, 20 और 40 मिनट के इलाज के बाद के स्तर को इंगित करते हैं। लाल तीर युक्तियों के तल को इंगित करते हैं, जिन्हें हल्के-इलाज गोंद के साथ सील किया गया था। (बी) शेष डेंटल सीमेंट ्स की औसत मात्रा पूरी तरह से सूखने के बाद। सलाखों और त्रुटि पट्टियाँ एसईएम ± साधन हैं। * छात्र के टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित महत्व (पी < 0.05) को दर्शाता है। (सी) बेसप्लेट के स्थान परिवर्तन को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि की व्याख्या करने वाले चित्र और एक तस्वीर। बेसप्लेट के माध्यम से एक सुई चिपकाई गई थी और इसका उपयोग मूल बेसप्लेटिंग प्रक्रिया (एक-चरण बेसप्लेटिंग) और डमी बेसप्लेटिंग प्रक्रिया को अनुकरण करने के लिए किया गया था। लाल और काले तीर दंत सीमेंट के ठीक होने से पहले और बाद में सुई के स्थानों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी) सुई की नोक की औसत दूरी परिवर्तन (ई) खोपड़ी के स्तर से ऊपर बेसप्लेट और स्थान परिवर्तन के बीच संबंध को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि के चित्र। (एफ) सुई की नोक की औसत दूरी परिवर्तन। सलाखों और त्रुटि पट्टियाँ एसईएम ± साधन हैं। ** छात्र के टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित महत्व (पी < 0.01) को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: विस्तृत डमी बेसप्लेटिंग प्रक्रिया (रिले लेंस आरोपण के तुरंत बाद निष्पादित)। (ए 1) मिनीस्कोप पर उद्देश्य लेंस, बेसप्लेट और पैराफिन फिल्म असेंबली का तीन-चरण कार्टून। (A2) असेंबली का फोटोग्राफ संस्करण। (B1) डमी बेसप्लेटिंग प्रक्रिया दिखाने वाला कार्टून। सबसे पहले, इकट्ठे मिनीस्कोप को रिले लेंस के साथ संरेखित किया जाता है। ऑब्जेक्टिव लेंस जितना संभव हो उतना रिले लेंस के करीब है। दूसरा, बेसप्लेट के आसपास पैराफिल्म में दंत सीमेंट जोड़ा जाता है और भविष्य के बेसप्लेटिंग के लिए एक महिला मोल्ड बनाने के लिए खोपड़ी पर लगाया जाता है। फिर, बेसप्लेट को हटा दिया जाता है, और मोल्डिंग सिलिकॉन रबर (गुलाबी) को जोड़ा जाता है और महिला मोल्ड और रिले लेंस की रक्षा के लिए दंत सीमेंट के साथ शीर्ष पर रखा जाता है। जानवर को तब संज्ञाहरण से ठीक होने की अनुमति दी जाती है। कम से कम 3 सप्ताह के बाद, बेसप्लेटिंग प्रक्रिया की जाती है। (B2) (बी 1) का फोटो संस्करण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के लिए कदम। (A1) बेसप्लेट संलग्न करें और (ए 2) मैन्युअल रूप से फोकस स्लाइडर को 2.7 से 3 मिमी तक समायोजित करें। फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की मैन्युअल रूप से खोज करने से पहले 2.7 से 3 मिमी (चित्र में दिखाए गए स्थान पर) की सेटिंग शुरू करने के लिए सबसे अच्छी जगह प्रतीत होती है। (B1) पहला कार्टून आरेख फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उद्देश्य लेंस और रिले लेंस के बीच की लंबाई के महत्व को दर्शाता है (फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को आमतौर पर 0.5 और 2 मिमी के बीच की दूरी पर देखा जाता है)। फ्लोरोसेंट सेल के उभरने से पहले, शोधकर्ता को रिले लेंस (शीर्ष चित्र में तीर) का मार्जिन देखना चाहिए। पहले लेंस को मैन्युअल रूप से इष्टतम देखने की स्थिति में समायोजित करना सहायक होता है क्योंकि हाथ से त्वरित समायोजन करना आसान होता है। (B2) स्टीरियोटैक्सिक आर्म प्रोब पर पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली मिट्टी रखें, और फिर पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली मिट्टी के साथ बांह पर पालन करके मिनीस्कोप को स्थिर करें। इस स्तर पर, रुचि का क्षेत्र स्थानांतरित हो सकता है, लेकिन इसे स्टीरियोटैक्सिक बांह और पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली मिट्टी को थोड़ा समायोजित करके आसानी से तय किया जा सकता है। रुचि के इष्टतम क्षेत्र की जांच करने और खोजने के बाद, दंत सीमेंट की एक छोटी मात्रा जोड़ें (लाल रंग में दर्शाया गया)। बेसप्लेट को जितना संभव हो उतना कम दंत सीमेंट के साथ गोंद करें। डेंटल सीमेंट सूखने के बाद मिनिस्कोप और बेसप्लेट को अलग कर लें। यदि बेसप्लेट पर्याप्त स्थिर नहीं है, तो अतिरिक्त दंत सीमेंट जोड़ें। (C) यह आरेख सफलता प्राप्त करने के लिए हर कदम के महत्व को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान सफलता और विफलता के उदाहरण। (ए) बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान सफल इमेजिंग का एक उदाहरण। रिले लेंस ने वेंट्रल हिप्पोकैम्पस को लक्षित किया। फ्लोरेसेंस ट्रांसिएंट्स तब देखा गया जब जानवर आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण के अधीन था ( पूरक वीडियो एस 2 भी देखें)। (A2) बेहतर दृश्यता के लिए कंट्रास्ट बढ़ा दिया गया था। लाल धराशायी रेखाएं रक्त वाहिकाओं को इंगित करती हैं। (A3) बेसप्लेटिंग के पांच दिन बाद फ्लोरेसेंस ट्रांसिएंट्स जब माउस (# 5) अपने होमकेज में स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर रहा था ( पूरक वीडियो एस 3 भी देखें; पूरक वीडियो एस 3 में चूहों # 3 और # 4 की छवियां भी प्रदान की जाती हैं)। केवल स्थिति में थोड़ा बदलाव हुआ। (B1) एक विफलता का एक उदाहरण। बेसप्लेटिंग के दौरान, केवल सजातीय सफेद / ग्रे क्षेत्रों को देखा गया जो आकार में सेल जैसे नहीं थे ( पूरक वीडियो एस 4 भी देखें)। (B2) रिले लेंस लक्ष्य क्षेत्र से चूक गया और एक ऐसे क्षेत्र के ऊपर स्थित था जिसमें कोई संक्रमित कोशिका नहीं थी। (C1) विफलता का एक और उदाहरण। इस माउस में, हालांकि कई गोल कोशिकाओं को देखा गया था, बेसप्लेटिंग के दौरान कोई प्रतिदीप्ति क्षणिक नहीं देखा गया था (इनक्यूबेशन के तीन सप्ताह के बाद और जबकि माउस को एनेस्थेटाइज्ड / बेहोश किया गया था)। इसके अलावा, जब बेसप्लेटिंग प्रक्रिया फिर से की गई थी (इनक्यूबेशन के पांचवें सप्ताह में) या यहां तक कि जब जानवर स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर रहा था, तो कोई प्रतिदीप्ति क्षणिक नहीं था। छवि इनक्यूबेशन के पांचवें सप्ताह में बेसप्लेटिंग के दौरान प्राप्त की गई थी ( पूरक वीडियो एस 5 भी देखें)। (C2 और C3) रिले लेंस उदर हिप्पोकैम्पस की पिरामिड परत से चूक गया। नीले बिंदु नाभिक हैं जो DAPI से दागदार थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| समस्या | संभावित कारण | घोल | ||
| बेसप्लेटिंग करते समय अच्छी इमेजिंग थी लेकिन अगले दिन पूरी तरह से फोकस से बाहर थी | विषय की खोपड़ी और बेसप्लेट के बीच दंत सीमेंट को ठीक करने पर मात्रा में परिवर्तन | लेंस प्रत्यारोपण प्रक्रिया के बाद "डमी बेसप्लेटिंग" आगे बढ़ें जैसा कि वर्तमान रिपोर्ट में सुझाव दिया गया है। एक दंत सीमेंट चुनें जिसमें कम मात्रा परिवर्तन हो। | ||
| बेसप्लेटिंग के दौरान किसी भी सेल जैसी आकृति के बिना सजातीय सफेद / ग्रे क्षेत्र हैं (पूरक वीडियो एस 4 भी देखें) | एक। रिले लेंस लक्ष्य क्षेत्र से चूक गया B. प्रतिदीप्ति संकेतक की खराब अभिव्यक्ति C. मिनीस्कोप के नीचे एक उद्देश्य लेंस स्थापित करना भूल जाओ जहां प्रतिदीप्ति संकेतक वास्तव में व्यक्त किया जाता है | ए. सर्जरी का अभ्यास करने के लिए डमी लेंस का उपयोग करें। अभ्यास आरोपण के बाद डमी लेंस के निर्देशांक की जांच करें बी. कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए एक इष्टतम वायरल टिटर खोजें (जिसे रेसेंडेज़ एट अल 2016 के रूप में संदर्भित किया गया है)। यदि किसी कारण से, प्रीटेस्टिंग आयोजित नहीं की जा सकती है, तो हम अनुशंसा करते हैं कि शुरुआती पहले उच्च टिटर का प्रयास करें। (विवरण के लिए डिस्कशन अनुभाग देखें) सी. स्क्रू एक उद्देश्य GRIN लेंस पर (~ 0.25 पिच. उदा. उदा. : एडमंड ऑप्टिक्स; स्टॉक # 64-519) मिनीस्कोप के निचले भाग में। | ||
| कई कोशिकाओं का निरीक्षण करें लेकिन बेसप्लेटिंग के दौरान कोई प्रतिदीप्ति गतिशीलता नहीं | A. अस्वास्थ्यकर न्यूरॉन्स या मृत न्यूरॉन्स B. विरल फिनिंग प्रकार के न्यूरॉन्स C. गहरी संज्ञाहरण स्थिति | ए. हर शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के लिए सावधान रहें। लेंस आरोपण द्वारा दबाव छोड़ने के लिए पहले जलसेक / आरोपण पथ को काटने के लिए एक नई सिरिंगिंग सुई का उपयोग करें जो आपके रिले लेंस के व्यास के समान है। धीरे-धीरे वायरस को संक्रमित करें और धीरे-धीरे लेंस प्रत्यारोपित करें। न्यूरॉन्स की गतिविधियों की निगरानी के लिए लंबे समय तक प्रतीक्षा करें या माउस को उत्तेजित करने के लिए पूंछ को थोड़ा सा चुटकी लें। बेसप्लेटिंग एक आक्रामक प्रक्रिया नहीं है, और जानवर को केवल बेहोश करने की जरूरत होती है। इसलिए, 1.2 ~ 0.8% आइसोफ्लुरेन को बनाए रखना पर्याप्त है, जब तक कि जानवर स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर जाने में असमर्थ है। | ||
तालिका 1: समस्या निवारण चार्ट.
पूरक वीडियो एस 1: डेंटल सीमेंट वॉल्यूम टेस्ट। मात्रा के बीच का अंतर दंत सीमेंट तैयारी की शुरुआत में मापा गया था और सीमेंट के सूखने के बाद की मात्रा। दंत सीमेंट के दो ब्रांडों (जैसे, टेम्परॉन और टोकुसो क्योरफास्ट) का परीक्षण किया गया था। सूखने के बाद दंत सीमेंट की मात्रा का परीक्षण करने के लिए, प्रत्येक दंत सीमेंट पाउडर के 0.5 ग्राम का वजन किया गया और इसके उपयुक्त समाधान (1 एमएल) के साथ मिलाया गया। फिर, 0.1-10 μL पिपेट युक्तियों को दंत सीमेंट मिश्रण के 2.5 μL के साथ लोड किया गया और हल्के-इलाज गोंद के साथ सील किया गया। फिर, युक्तियों को एक रैक पर रखा गया था, दंत सीमेंट मिश्रण की सतहों को चिह्नित किया गया था, और 40 मिनट के लिए वीडियो टेप किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो एस 2: बेसप्लेटिंग प्रक्रिया का प्रदर्शन। उद्देश्य लेंस और रिले लेंस की सतह के बीच के कोण को जेड-अक्ष पर कान बार, टूथ बार या पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली मिट्टी को मोड़कर समायोजित किया गया था। रिले लेंस का मार्जिन मॉनिटर पर चंद्रमा जैसे ग्रे सर्कल के रूप में दिखाई दिया। सफल वायरल अभिव्यक्ति और लेंस आरोपण को बेसप्लेटिंग के दौरान कम से कम एक प्रतिदीप्ति गतिशील (तीर) प्रकट करना चाहिए। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो एस 3: स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों में प्रतिदीप्ति गतिशीलता का प्रदर्शन। चूहों # 3, # 4, और # 5 से प्रतिदीप्ति क्षणिक। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो एस 4: एक विफलता का एक उदाहरण। बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान एक समान पृष्ठभूमि दिखाई दी। कृपया ध्यान दें कि चमक में परिवर्तन व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति क्षणिकता के कारण नहीं था; यह खोज प्रक्रिया के कारण हुआ था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो एस 5: एक और विफलता उदाहरण का प्रदर्शन। बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान प्रतिदीप्ति क्षणिक की कमी हुई, लेकिन कुछ गोल सेल मार्जिन अभी भी दिखाई दे रहे थे। कृपया ध्यान दें कि चमक में परिवर्तन व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति क्षणिकता के कारण नहीं हुआ था; यह खोज प्रक्रिया के कारण हुआ था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वर्तमान रिपोर्ट दो-लेंस यूसीएलए मिनीस्कोप प्रणाली का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। हमारे प्रोटोकॉल में डिज़ाइन किए गए उपकरण किसी भी प्रयोगशाला के लिए अपेक्षाकृत सस्ती हैं जो विवो कैल्शियम इमेजिंग में कोशिश करना चाहते हैं। कुछ प्रोटोकॉल, जैसे वायरल इंजेक्शन, लेंस आरोपण, डमी बेसप्लेटिंग और बेसप्लेटिंग, कैल्शियम इमेजिंग की सफलता दर में सुधार के लिए मिनीस्कोप सिस्टम के अन्य संस्करणों के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। वायरल इंजेक्शन के साथ सामान्य समस्याओं के अलावा, और लेंस आरोपण जिन्हें मिनीस्कोप संस्करण की परवाह किए बिना ठीक करने की आवश्यकता होती है, यूसीएलए बेसप्लेट की संरचना एक स्थितिगत बदलाव का कारण बन सकती है, जिससे उद्देश्य और रिले लेंस के बीच बेमेल कामकाजी दूरी हो सकती है (चित्रा 1 सी)। दो लेंसों की स्थितिगत बदलाव को कम करने के लिए एक संशोधित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था (आंकड़े 2, चित्रा 4, चित्रा 5)। सफल कैल्शियम इमेजिंग को सफल वायरल अभिव्यक्ति, लेंस आरोपण और बेसप्लेटिंग प्रक्रियाओं (चित्रा 5 सी) के संयोजन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों का निरीक्षण करने के लिए दो-लेंस प्रणाली का उपयोग करने के लिए बेसप्लेटिंग प्रक्रियाओं में उच्च स्तर की सटीकता की आवश्यकता होती है क्योंकि प्रत्यारोपित रिले लेंस और उद्देश्य लेंस की सापेक्ष स्थिति भी सटीक होनी चाहिए। यह रिपोर्ट न केवल एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है जो बेसप्लेटिंग मुद्दों को हल करती है, बल्कि वायरल इंजेक्शन और लेंस आरोपण के लिए कुछ युक्तियों पर भी चर्चा करती है। नीचे, हम पहले बेसप्लेटिंग प्रक्रियाओं पर चर्चा करते हैं, इसके बाद वायरल इंजेक्शन, और लेंस आरोपण प्रक्रियाएं, और हम विफलताओं के कुछ उदाहरणों का वर्णन करते हैं (चित्रा 6)।
Baseplating
यूसीएलए मिनिस्कोप का वी 3 संस्करण वर्तमान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला डिज़ाइन है और इसे ऑनलाइन ऑर्डर किया जा सकता है। इस संस्करण के बेसप्लेट में दीवारों के बिना दो किनारे होते हैं (चित्रा 1 सी 1), लेकिन दंत सीमेंट के पूरी तरह से सूखने के बाद इसका आकार असमान बदलाव (चित्रा 1 सी 1, सी 2) का कारण बन सकता है। हमारे प्रोटोकॉल (चित्रा 4) में डमी बेसप्लेटिंग प्रक्रियाएं गलत संरेखण और बेसप्लेट शिफ्टिंग मुद्दों को कम करती हैं क्योंकि यह वास्तविक बेसप्लेटिंग के दौरान दंत सीमेंट के लिए उपलब्ध स्थान को कम करने के लिए पैराफिन फिल्म का उपयोग करती है (चित्रा 5 बी)। शेष स्थान अभी भी वास्तविक बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान एक इष्टतम इमेजिंग स्थिति खोजने के लिए पर्याप्त है। इसलिए, शोधकर्ता बेसप्लेट को जितना संभव हो उतना कम दंत सीमेंट के साथ गोंद कर सकता है (चित्रा 5 बी 2)। इसके अलावा, डमी बेसप्लेटिंग प्रक्रिया में अपेक्षाकृत कम समय (लगभग 15 से 20 मिनट) लगता है क्योंकि इसे प्राप्त करने के लिए उद्देश्य लेंस और रिले लेंस के बीच एक सही दूरी की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, डमी बेसप्लेटिंग सफल कैल्शियम इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण कारकों में से एक है; उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति संकेतों की निगरानी के दौरान, न्यूरॉन्स धुंधले दिखाई दे सकते हैं यदि वे कामकाजी विमान से थोड़ा दूर हैं (रिले लेंस की कामकाजी दूरी के आधार पर; अक्सर लगभग 100 ~ 300 μm)। काम की दूरी में सुधार करने की क्षमता सीमित है, क्योंकि न्यूरॉन्स की कामकाजी दूरी रिले लेंस आरोपण प्रक्रिया द्वारा पूर्व निर्धारित है। डमी बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के बिना एक प्रयोग किया गया था और रुचि का क्षेत्र हमेशा (चार चूहों में से चार में) एक बार बेसप्लेटिंग के बाद छूट गया था। इसलिए, इन समाधानों को संकोचन समस्या को कम करने के लिए तैयार किया गया था। कुछ हल्के-इलाज दंत सीमेंट इलाज के दौरान संकोचन की समस्या से बच सकते हैं क्योंकि वे बहुत जल्दी ठीक हो जाते हैं; ये सीमेंट शोधकर्ताओं को बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान दूरी को समायोजित करने में मदद कर सकते हैं। यद्यपि कैल्शियम संकेतकों को रोमांचक बनाने और दंत सीमेंट को ठीक करने के लिए तरंग दैर्ध्य की सीमा अलग-अलग है, बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान फोटोब्लीचिंग को रोकने की आवश्यकता है। फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए, कैल्शियम संकेतकों और प्रकाश-इलाज दंत सीमेंट के बीच क्रॉस-प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए प्रकाश स्रोत द्वारा उत्पन्न तरंग दैर्ध्य की सीमा को काफी संकीर्ण होना चाहिए। इसलिए, बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के लिए हल्के इलाज दंत सीमेंट के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है। इसके अलावा, दंत सीमेंट के कुछ विशिष्ट ब्रांडों का उपयोग अक्सर अन्य शोध टीमों 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 द्वारा बेसप्लेट को चिपकाने के लिए किया जाता है . इन सीमेंटों के कम सिकुड़न गुण समस्या को हल कर सकते हैं, लेकिन हमें उन्हें खरीदने (आयात) करने में कठिनाइयों के कारण इन ब्रांडों का परीक्षण करने का अवसर नहीं मिला। चिकित्सा-गे्रड उत्पाद देश/क्षेत्र के आधार पर आयात विनियमों के अधीन हो सकते हैं। यदि शोधकर्ताओं को साहित्य 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 में उल्लिखित सीमेंट तक पहुंचने में कठिनाई होती है, तो हमारा प्रोटोकॉल दंत सीमेंट संकोचन समस्या को हल करेगा।
संकोचन समस्या के अलावा, कई प्रयोगों के दौरान मिनीस्कोप में और बेसप्लेट (विशेष रूप से बेसप्लेट में मैग्नेट) पर संरचनात्मक घिसने की घटना हो सकती है। पहनने के कारण होने वाला कोई भी छोटा अंतर दो लेंसों के बीच की दूरी की स्थिरता को कम करता है। फिर, पूरे ऑप्टिकल पथ पर सटीकता एक मिनीस्कोप का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों में कैल्शियम क्षणिकों की इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है।
वायरल इंजेक्शन/लेंस प्रत्यारोपण की समस्या का निवारण
मस्तिष्क क्षेत्र में वायरस को शामिल करने से पहले, स्टीरियोटैक्सिक बांह पर एक नई सुई लगाने और धीरे-धीरे मस्तिष्क को उचित निर्देशांक पर पंचर करने की सिफारिश की जाती है। क्योंकि नई सुई बहुत तेज है, यह पंचरिंग वास्तविक माइक्रोइंजेक्शन सुई और रिले लेंस के लिए पथ (या एक पथ को काटने) को साफ करने के लिए एक तैयारी कदम के रूप में कार्य करता है और ऊतक क्षति को कम करता है, जो माइक्रोइंजेक्शन सुई या रिले लेंस से संपीड़न के कारण हो सकता है। तेज सुई कुंद रिले लेंस के लिए एक रास्ता काटती है; इस प्रकार, सुई की नोक को रिले लेंस के साथ समान निर्देशांक तक कम किया जाना चाहिए। 20 जी आईवी कैथेटर की आंतरिक सुई को चुना गया था क्योंकि इसमें 1 मिमी का व्यास था, जो हमारे रिले लेंस के व्यास के समान था। रिले लेंस के व्यास के आधार पर एक अलग सुई गेज का उपयोग किया जा सकता है।
यद्यपि वर्तमान अध्ययन ने वायरल वैक्टर के गुणों और टिटर्स पर ध्यान केंद्रित नहीं किया, ये कारक अभी भी सफल कैल्शियम इमेजिंग (चित्रा 5 सी) के लिए महत्वपूर्ण हैं। वायरल वेक्टर की अभिव्यक्ति गुणवत्ता का पूर्व परीक्षण करना आवश्यक है। Resendez et al.के प्रोटोकॉल के चरण 1 से 5 कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए एक इष्टतम वायरल टिटर की पहचान के लिए विस्तृत तरीके प्रदानकरते हैं। यदि किसी कारण से प्रीटेस्टिंग आयोजित नहीं की जा सकती है, तो यह अनुशंसा की जाती है कि शुरुआती लोग पहले अपेक्षाकृत उच्च टिटर की कोशिश करें। उच्च वायरल टिटर का उपयोग करने के नुकसान में से एक है साइटोटॉक्सिसिटी8. मृत न्यूरॉन्स ऑटोफ्लोरेसेंस को जन्म देते हैं और मिनीस्कोप8 के नीचे उज्ज्वल सफेद धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं। हालांकि, ये मृत न्यूरॉन्स शुरुआती लोगों के लिए बेसप्लेटिंग प्रक्रिया को खोजने और अभ्यास करने के लिए अच्छे स्थल हैं। दूसरी ओर, हालांकि कम-टिटर वायरस के जलसेक में कोशिकाओं को मारने का कम जोखिम होता है, प्रतिदीप्ति को पृष्ठभूमि द्वारा मुखौटा किया जा सकता है यदि कोशिकाएं बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान कोई प्रतिदीप्ति क्षणिक नहीं दिखाती हैं। विफलता के कारणों को इंगित करना मुश्किल है क्योंकि रिले लेंस आरोपण के कारण या वायरल वेक्टर द्वारा खराब अभिव्यक्ति के कारण लक्ष्य न्यूरॉन्स छूट सकते हैं। हिस्टोलॉजिकल पुष्टि के बिना कारण निर्धारित करना बहुत भ्रामक है। इसलिए, अपेक्षाकृत उच्च-टिटर वायरस का उपयोग करने की सलाह दी जाती है यदि वायरल वैक्टर का पूर्व परीक्षण नहीं किया जा सकता है।
रीसेंडेज़ एट अल लेंस के प्लेसमेंट के लिए माइक्रोइंजेक्शन सुई 250 μm पार्श्व और उदर डालने की सलाह देते हैं। हमारे अवलोकनों से पता चला है कि रिले लेंस के समान गहराई पर वायरस के जलसेक से अच्छे कैल्शियम संकेतों की अभिव्यक्ति भी हो सकती है। हम प्रस्तावित करते हैं कि संक्रमण और प्रसार की संभावना के कारण, रिले लेंस के समन्वय के समान गहराई पर वायरस को शामिल करना ऊतक क्षति को कम करने और संक्रमित न्यूरॉन्स और रिले लेंस के बीच की दूरी की सटीकता बढ़ाने के लिए इष्टतम है। रेसेंडेज़ एट अल भी लक्ष्य कोशिकाओं और रिले लेंस8 के बीच काम की दूरी की संकीर्ण सीमा को देखते हुए एक ही सर्जरी के दौरान वायरल इंजेक्शन और लेंस आरोपण करने की सलाह देते हैं। हालांकि, कुछ शोधकर्ता एक प्रोटोकॉल का पालन करते हैं जिसमें वायरल इन्फ्यूजन चरण और लेंस आरोपण चरण18,26 के बीच दो (या अधिक) सप्ताह का संचालन किया जाता है। चरणों के बीच समय को लंबा करने से व्यक्तिगत ऑपरेटिव समय कम हो जाता है। लेकिन इस प्रोटोकॉल में इन दो चरणों को एक सर्जरी में विलय कर दिया गया था, क्योंकि एक-सर्जरी प्रोटोकॉल में, सर्जन लक्ष्य क्षेत्र में कम करते समय माइक्रोइंजेक्शन सुई और रिले लेंस के बीच की स्थिति की निगरानी कर सकता है, जिससे असफल लक्ष्यीकरण की संभावना कम हो जाती है (चित्रा 2 बी 3)।
दो चूहों (चूहों # 1 और # 2) के लिए, लेंस के लिए एक पथ बनाने के लिए सुई का उपयोग भी छोड़ दिया गया था, और माउस # 2 में, गोल सेल जैसे भूरे धब्बे देखे गए थे (चित्रा 6 सी)। हालांकि, प्रतिदीप्ति गतिशीलता (पूरक वीडियो एस 5) नहीं देखी गई थी। इस उदाहरण (चित्रा 6 सी 2, सी 3) के मस्तिष्क के टुकड़े की जांच करने पर, हमने माना कि रिले लेंस ने कुछ कोशिकाओं को नीचे खींच लिया, जबकि इसे कम किया जा रहा था। ये खींचे गए न्यूरॉन्स अस्वास्थ्यकर थे, इसलिए बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान या प्रयोग के दौरान कोई गतिविधि नहीं देखी गई थी।
हमारे पास पूरी तरह से समरूप ग्रे सिग्नल के साथ एक माउस था और बेसप्लेटिंग प्रक्रिया (चित्रा 6 बी 1) के दौरान कोई दृश्यमान सेल जैसी छवियां नहीं थीं। माउस का त्याग करने के बाद इसके मस्तिष्क स्लाइस देखे गए। यह देखा गया कि लेंस घुमावदार पिरामिड परत के मध्यवर्ती पक्ष पर था; लक्ष्य क्षेत्र (चित्रा 6 बी 2) पूरी तरह से छूट गया था। ये असफल प्रयास महत्वपूर्ण अनुभव थे जिन्होंने हमें अपने सर्जरी प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए प्रेरित किया और अंततः तीन चूहों (पूरक वीडियो एस 3) के साथ सफल हुए।
माइक्रोइंजेक्शन सुई
कॉर्पस कॉलोसम एक कठिन रेशेदार पथ है जो पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस को ओवरले करता है। इसकी कठोरता के कारण, यह एक सपाट-टिंप माइक्रोइंजेक्शन सुई द्वारा प्रवेश का विरोध करता है। इसलिए, हम एक बेवेल टिप के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन सुई का उपयोग करने की सलाह देते हैं। इस प्रकार की सुई न केवल ऊतक क्षति को कम करती है, बल्कि आस-पास के तंतुओं द्वारा रुकावट के कारण वायरस को लक्षित क्षेत्र में डालने में विफलता की संभावना को भी कम करती है। हमने एक समस्या निवारण चार्ट (तालिका 1) में उपर्युक्त समस्याओं को संक्षेप में प्रस्तुत किया है।
समय सीमा
पूरी प्रक्रिया के लिए समय सीमा को चित्रा 2 ए में संक्षेपित किया गया है, जिसमें इकाइयों के रूप में दिन हैं। विस्तार से, सर्जरी भाग (वायरल इंजेक्शन, रिले लेंस प्रत्यारोपण, डमी बेसप्लेटिंग) शुरुआती लोगों के लिए 3 घंटे या पर्याप्त रूप से प्रशिक्षित शोधकर्ताओं के लिए 1.5 घंटे ले सकता है। चूहों में एक छोटा शरीर का आकार और तेज चयापचय होता है, और वे बड़ी प्रजातियों27 की तुलना में संज्ञाहरण के तहत लंबी अवधि के कारण होने वाली स्वास्थ्य समस्याओं के लिए अधिक संवेदनशील होते हैं। शोधकर्ताओं को सर्जरी में बिताए गए समय को 3 घंटे से कम रखने का लक्ष्य रखना चाहिए। कैल्शियम संकेतक अभिव्यक्ति के 3 से 6 सप्ताह के बाद वास्तविक बेसप्लेटिंग की जा सकती है। इस प्रक्रिया में 1 घंटे लग सकते हैं। बाद के अनुदैर्ध्य कैल्शियम गतिविधि अवलोकन को 1 महीने से अधिक समय तक जारी रखा जा सकता है।
निष्कर्ष
यूसीएलए मिनोस्कोप विवो कैल्शियम इमेजिंग डिवाइस में एक ओपन-सोर्स है। एक तैयार, प्रीइंस्टॉल्ड बेसप्लेट या लेंस मॉड्यूल के बिना, प्रयोगों का संचालन करने वाले व्यक्तियों को बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान उद्देश्य लेंस और रिले लेंस के बीच इष्टतम दूरी को सटीक रूप से प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए। दो-लेंस यूसीएलए मिनोस्कोप प्रणाली का उपयोग करने की बढ़ती कठिनाई दंत सीमेंट के मात्रा परिवर्तन में निहित है। हमने मूल प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है और ऊपर उल्लिखित समस्याओं के कारण दोषों को कम किया है, इस प्रकार दो-लेंस यूसीएलए मिनोस्कोप सिस्टम के साथ कैल्शियम इमेजिंग की सफलता दर में वृद्धि हुई है।
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Disclosures
यह उद्योग समर्थित अध्ययन नहीं है। लेखकों ने हितों के वित्तीय टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (108-2320-बी-002-074, 109-2320-बी-002-023-एमवाई 2) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
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