Summary
De krimp van tandcement tijdens het uitharden verdringt de bodemplaat. Dit protocol minimaliseert het probleem door een eerste fundering van het tandcement te creëren dat ruimte overlaat om de bodemplaat te cementeren. Weken later kan de bodemplaat op deze steiger worden gecementeerd met weinig nieuw cement, waardoor krimp wordt verminderd.
Abstract
Neurowetenschappers gebruiken miniatuurmicroscopen (miniscopen) om neuronale activiteit bij vrij gedragende dieren te observeren. Het Miniscope-team van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA) biedt open bronnen voor onderzoekers om zelf miniscopen te bouwen. De V3 UCLA Miniscope is een van de meest populaire open-source miniscopen die momenteel in gebruik zijn. Het maakt beeldvorming mogelijk van de fluorescentietransiënten die worden uitgezonden door genetisch gemodificeerde neuronen door een objectieve lens geïmplanteerd op de oppervlakkige cortex (een systeem met één lens), of in diepe hersengebieden door een combinatie van een relaislens geïmplanteerd in de diepe hersenen en een objectieve lens die is voorgeanchoreerd in de miniscoop om het doorgegeven beeld te observeren (een systeem met twee lenzen). Zelfs onder optimale omstandigheden (wanneer neuronen fluorescentie-indicatoren uitdrukken en de relaislens correct is geïmplanteerd), kan een volumeverandering van het tandcement tussen de bodemplaat en de bevestiging ervan aan de schedel bij cementuitharding een verkeerde uitlijning veroorzaken met een veranderde afstand tussen de objectief- en relaislenzen, wat resulteert in de slechte beeldkwaliteit. Een bodemplaat is een plaat die helpt de miniscoop op de schedel te monteren en de werkafstand tussen het objectief en de relaislenzen vast te stellen. Veranderingen in het volume van het tandcement rond de bodemplaat veranderen dus de afstand tussen de lenzen. Het huidige protocol heeft tot doel het verkeerde uitlijningsprobleem veroorzaakt door volumeveranderingen in het tandcement te minimaliseren. Het protocol vermindert de verkeerde uitlijning door een eerste fundering van tandcement te bouwen tijdens de implantatie van relaislenzen. De hersteltijd na implantatie is voldoende voor de fundering van tandcement om de bodemplaat volledig uit te harden, zodat de bodemplaat op deze steiger kan worden gecementeerd met zo min mogelijk nieuw cement. In dit artikel beschrijven we strategieën voor baseplating bij muizen om beeldvorming van neuronale activiteit mogelijk te maken met een objectieve lens verankerd in de miniscoop.
Introduction
Fluorescerende activiteitsreporters zijn ideaal voor beeldvorming van de neuronale activiteit omdat ze gevoelig zijn en een groot dynamisch bereik hebbenvan 1,2,3. Daarom gebruikt een toenemend aantal experimenten fluorescentiemicroscopie om neuronale activiteit direct te observeren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. De eerste geminiaturiseerde fluorescentiemicroscoop (miniscoop) met één foton werd in 2011 ontworpen door Mark Schnitzer et al.5. Deze miniscoop stelt onderzoekers in staat om de fluorescentiedynamiek van cerebellaire cellen te volgen bij zich vrij gedragende dieren5 (d.w.z. zonder enige fysieke beperking, hoofdsteun, sedatie of anesthesie voor de dieren). Momenteel kan de techniek worden toegepast om oppervlakkige hersengebieden zoals de cortex 6,8,15,16 te monitoren; subcorticale gebieden zoals de dorsale hippocampus 8,11,13,14 en striatum 6,17; en diepe hersengebieden zoals de ventrale hippocampus14, amygdala 10,18 en hypothalamus 8,12.
In de afgelopen jaren zijn er verschillende open-source miniscopen ontwikkeld.4,5,6,7,11,13,17,19. De miniscoop kan economisch worden samengesteld door onderzoekers als ze de stapsgewijze richtlijnen volgen van het Miniscope-team van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA)4,7,11,13. Omdat optische monitoring van neurale activiteit wordt beperkt door de beperkingen van lichttransmissie7 van en naar de neuronale populatie van belang, werd een miniscoop ontworpen die vereist dat een objectieve gradiënt brekingsindex (GRIN) lens (of objectieve lens) aan de onderkant van de miniscoop wordt voorgeanchored om het gezichtsveld te vergroten dat wordt doorgegeven door een relais GRIN-lens (of relaislens)6,7,8,10,16,17. Deze relaislens wordt geïmplanteerd in het doelhersengebied, zodat de fluorescentieactiviteit van het doelbreingebied wordt doorgegeven aan het oppervlak van de relaislens6,7,8,10,16,17. Ongeveer 1/4 van een volledige sinusoïdale periode van licht reist door de objectieve GRIN-lens (~ 0,25 toonhoogte) (Figuur 1A1), wat resulteert in een vergrote fluorescentieafbeelding6,7. De objectieflens is niet altijd aan de onderkant van de miniscoop bevestigd, noch is de implantatie van de relaislens nodig6,7,11,13,15. Concreet zijn er twee configuraties: een met een vaste objectieflens in de miniscoop en een relaislens geïmplanteerd in de hersenen8,10,12,14,16 (Figuur 1B1) en een andere met alleen een verwijderbare objectieflens6,7,11,13,15 (Figuur 1B2). In het ontwerp op basis van het vaste doel en de geïmplanteerde relaislenscombinatie worden de fluorescentiesignalen van de hersenen naar het bovenoppervlak van de relaislens gebracht (Figuur 1A1)7,8,10,12,14,16. Vervolgens kan de objectieflens het gezichtsveld vanaf het bovenoppervlak van de relaislens vergroten en verzenden (Figuur 1A2). Aan de andere kant is het ontwerp van de verwijderbare objectieve GRIN-lens flexibeler, wat betekent dat pre-implantatie van een relaislens in de hersenen niet verplicht is (Figuur 1B2)6,7,11,13,15. Bij het gebruik van een miniscoop op basis van een verwijderbaar objectieflensontwerp, moeten onderzoekers nog steeds een lens in het doelhersengebied implanteren, maar ze kunnen een objectieve lens implanteren6,7,11,13,15 of een relaislens in de hersenen6,7. De keuze van een objectief of een relaislens voor implantatie bepaalt de miniscoopconfiguratie die de onderzoeker moet gebruiken. De V3 UCLA Miniscope is bijvoorbeeld gebaseerd op een verwijderbaar objectief GRIN-lensontwerp. Onderzoekers kunnen ervoor kiezen om een objectieve lens rechtstreeks in het hersengebied van belang te implanteren en de "lege" miniscoop op de objectieve lens te monteren6,7,11,13,15 (een systeem met één lens; Figuur 1B2) of om een relaislens in de hersenen te implanteren en een miniscoop te monteren die vooraf is voorzien van een objectieve lens6,7 (een systeem met twee lenzen; Figuur 1B1). De miniscoop werkt vervolgens als een fluorescentiecamera om livestreambeelden vast te leggen van neuronale fluorescentie geproduceerd door een genetisch gecodeerde calciumindicator1,2,3. Nadat de miniscoop op een computer is aangesloten, kunnen deze fluorescentiebeelden naar de computer worden overgebracht en als videoclips worden opgeslagen. Onderzoekers kunnen neuronale activiteit bestuderen door de relatieve veranderingen in fluorescentie te analyseren met sommige analysepakketten20,21 of schrijf hun codes voor toekomstige analyse.
De V3 UCLA Miniscope biedt gebruikers flexibiliteit om te bepalen of ze neuronale activiteit in beeld willen brengen met een systeem met één of twee lenzen7. De keuze van het opnamesysteem is gebaseerd op de diepte en grootte van het doelhersengebied. Kortom, een systeem met één lens kan alleen een gebied in beeld brengen dat oppervlakkig (minder dan ongeveer 2,5 mm diep) en relatief groot (groter dan ongeveer 1,8 x 1,8 mm2) is omdat de fabrikanten slechts een bepaalde grootte objectieflens produceren. Daarentegen kan een systeem met twee lenzen worden toegepast op elk doelgebied van de hersenen. Het tandcement voor het lijmen van de bodemplaat heeft echter de neiging om een verkeerde uitlijning te veroorzaken met een veranderde afstand tussen het objectief en de relaislenzen, wat resulteert in een slechte beeldkwaliteit. Als het systeem met twee lenzen wordt gebruikt, moeten twee werkafstanden nauwkeurig worden gericht om de optimale beeldkwaliteit te bereiken (figuur 1A). Deze twee kritische werkafstanden liggen tussen de neuronen en het onderste oppervlak van de relaislens en tussen het bovenoppervlak van de relaislens en het onderste oppervlak van de objectieflens (figuur 1A1). Elke verkeerde uitlijning of misplaatsing van de lens buiten de werkafstand resulteert in beeldfalen (figuur 1C2). Het systeem met één lens daarentegen vereist slechts één precieze werkafstand. De grootte van de objectieve lens beperkt echter de toepassing ervan voor het monitoren van diepe hersengebieden (de objectieve lens die bij de miniscoop past, is ongeveer 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Daarom is implantatie van een objectieve lens beperkt voor de observatie van het oppervlak en relatief grote hersengebieden, zoals de cortex 6,15 en dorsale cornu ammonis 1 (CA1) bij muizen11,13 . Bovendien moet een groot deel van de cortex worden geaspireerd om de dorsale CA111,13 te targeten. Vanwege de beperking van de configuratie met één lens die beeldvorming van diepe hersengebieden voorkomt, bieden commerciële miniscoopsystemen alleen een gecombineerd objectief lens / relaislens (twee-lens) ontwerp. Aan de andere kant kan de V3 UCLA-miniscoop worden gewijzigd in een systeem met één lens of twee lenzen, omdat de objectieflens verwijderbaar is 6,11,13,15. Met andere woorden, V3 UCLA-miniscoopgebruikers kunnen profiteren van de verwijderbare lens door deze in de hersenen te implanteren (een systeem met één lens te creëren), bij het uitvoeren van experimenten met oppervlakkige hersenobservaties (minder dan 2,5 mm diep), of door deze vooraf in de miniscoop te implanteren en een relaislens in de hersenen te implanteren (waardoor een systeem met twee lenzen ontstaat), bij het uitvoeren van experimenten met diepe hersenobservaties. Het systeem met twee lenzen kan ook worden toegepast voor het oppervlakkig observeren van de hersenen, maar de onderzoeker moet de nauwkeurige werkafstanden tussen de objectieve lens en de relaislens kennen. Het grote voordeel van het systeem met één lens is dat er een kleinere kans is om de werkafstanden te missen dan bij een systeem met twee lenzen, aangezien er twee werkafstanden zijn die nauwkeurig moeten worden gericht om een optimale beeldkwaliteit in het systeem met twee lenzen te bereiken (figuur 1A). Daarom raden we aan om een systeem met één lens te gebruiken voor oppervlakkige hersenobservaties. Als het experiment echter beeldvorming in het diepe hersengebied vereist, moet de onderzoeker leren om verkeerde uitlijning van de twee lenzen te voorkomen.
Het basisprotocol voor de configuratie van miniscopen met twee lenzen voor experimenten omvat lensimplantatie en baseplating 8,10,16,17. Baseplating is het lijmen van een bodemplaat op het hoofd van een dier, zodat de miniscoop uiteindelijk bovenop het dier kan worden gemonteerd en de fluorescentiesignalen van neuronen kan worden gefilmd (figuur 1B). Deze procedure omvat het gebruik van tandcement om de bodemplaat op de schedel te lijmen (figuur 1C), maar de krimp van tandcement kan onaanvaardbare veranderingen veroorzaken in de afstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens 8,17. Als de verschoven afstand tussen de twee lenzen te groot is, kunnen cellen niet scherp worden gesteld.
Gedetailleerde protocollen voor diepe calciumbeeldvormingsexperimenten in de hersenen met behulp van miniscopen zijn al gepubliceerd8,10,16,17. De auteurs van deze protocollen hebben het Inscopix-systeem gebruikt8,10,16 of andere aangepaste ontwerpen17 en hebben de experimentele procedures voor virale selectie, chirurgie en baseplate attachment beschreven. Hun protocollen kunnen echter niet precies worden toegepast op andere open-sourcesystemen, zoals het V3 UCLA Miniscope-systeem, NINscope6en Finchscope19. Verkeerde uitlijning van de twee lenzen kan optreden tijdens de opname in een configuratie met twee lenzen met een UCLA-miniscoop vanwege het type tandcement dat wordt gebruikt om de bodemplaat aan de schedel te cementeren8,17 (Figuur 1C). Het huidige protocol is nodig omdat de afstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens gevoelig is voor verschuiving als gevolg van de ongewenste krimp van tandcement tijdens de baseplating-procedure. Tijdens baseplating moet de optimale werkafstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens worden gevonden door de afstand tussen de miniscoop en de bovenkant van de relaislens aan te passen, en de bodemplaat moet vervolgens op deze ideale locatie worden gelijmd. Nadat de juiste afstand tussen de objectieflens en de geïmplanteerde relaislens is ingesteld, kunnen longitudinale metingen worden verkregen met cellulaire resolutie (Figuur 1B; in vivo opname). Omdat het optimale bereik van werkafstanden van een relaislens klein is (50 - 350 μm)4,8kan overmatige cementkrimp tijdens het uitharden het moeilijk maken om de objectieflens en de geïmplanteerde relaislens binnen het juiste bereik te houden. Het algemene doel van dit rapport is om een protocol te bieden om de krimpproblemen te verminderen8,17 die optreden tijdens de baseplating-procedure en om het slagingspercentage van miniscoopregistraties van fluorescentiesignalen in een configuratie met twee lenzen te verhogen. Succesvolle miniscoopopname wordt gedefinieerd als opname van een livestream van merkbare relatieve veranderingen in de fluorescentie van individuele neuronen in een vrij gedragend dier. Hoewel verschillende merken tandcement verschillende krimpsnelheden hebben, kunnen onderzoekers een merk selecteren dat eerder is getest6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Niet elk merk is echter gemakkelijk te verkrijgen in sommige landen / regio's vanwege de importvoorschriften voor medische materialen. Daarom hebben we methoden ontwikkeld om de krimpsnelheden van beschikbare tandheelkundige cementen te testen en, belangrijker nog, een alternatief protocol te bieden dat het krimpprobleem minimaliseert. Het voordeel ten opzichte van het huidige baseplating protocol is een toename van het slagingspercentage van calcium beeldvorming met gereedschappen en cement dat gemakkelijk kan worden verkregen in laboratoria. De UCLA-miniscoop wordt als voorbeeld gebruikt, maar het protocol is ook van toepassing op andere miniscopen. In dit rapport beschrijven we een geoptimaliseerde baseplating-procedure en bevelen we ook enkele strategieën aan voor het monteren van het UCLA-miniscoopsysteem met twee lenzen (Figuur 2A). Zowel voorbeelden van succesvolle implantatie (n = 3 muizen) als voorbeelden van mislukte implantatie (n = 2 muizen) voor de configuratie met twee lenzen met de UCLA-miniscoop worden samen met de discussies gepresenteerd om de redenen van de successen en mislukkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de National Taiwan University Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer: NTU-109-EL-00029 en NTU-108-EL-00158).
1. Beoordeling van de volumeverandering van tandcement
OPMERKING: Veranderingen in het volume tandcement treden op tijdens het uithardingsproces. Test de volumeveranderingen van tandcement vóór implantatie en baseplating. Onderzoekers kunnen elk merk tandcement testen en het merk met de laagste volumeverandering gebruiken om de bodemplaat te cementeren. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 3.
- Weeg 0,5 g van elk tandcementpoeder af en meng dit met de juiste oplossing (1 ml).
OPMERKING: De aanbevolen poeder/vloeistofverhouding in de tandheelkundige cementinstructies is 0,5 g poeder tot 0,25 ml van de oplossing om een vaste vorm te verkrijgen. Dit testprotocol verdunt de verhouding tot 0,5 g/ml, zodat het mengsel in vloeibare vorm kan worden aangezogen om de volumeverandering in pipetpunten te meten. - Gebruik 0,1-10 μL pipetpunten om 2,5 μL van het tandcementmengsel te verwijderen en sluit vervolgens de pipetpunt af met een lichte uithardingslijm.
- Plaats de uiteinden op een rek, markeer de bovenste niveaus van het tandheelkundige cementmengsel en meet het niveau van het tandheelkundige cementmengsel na 40 minuten (aanvullende video S1).
- Naast het bewaken van de niveauveranderingen tijdens het uitharden van tandcement in de uiteinden, meet u de resterende droge tandcementdichtheid. Om de dichtheid te berekenen, meet u het gewicht van het tandcement en meet u het volume met het principe van Archimedes.
- Kortom, plaats het resterende droge tandcement in een beker gevuld met water en weeg het water dat overloopt.
- Gebruik het tandcement met de minste krimp voor alle onderstaande protocollen.
2. Anesthesie, chirurgische implantatie, virale injectie en dummy baseplating
- Anesthesie
OPMERKING: Dit rapport heeft tot doel de operatie- en baseplatingprocedure voor de UCLA-miniscoop te optimaliseren; daarom werd aangenomen dat de optimale virale titer voor het infecteren van de doelhersengebieden bekend was. De methoden voor het vinden van de optimale virale titer zijn te vinden in stap 1 tot en met 5 van Resendez et al.8. Zodra de virale verdunning is geoptimaliseerd, kan chirurgische implantatie worden gestart.- Plaats de muis in een inductiecontainer en geef zuurstof (100% bij een luchtdebiet van 0,2 l/min). Preoxygeneer de muis gedurende 5 tot 10 minuten.
- Dien 5% isofluraan gemengd met 100% zuurstof (luchtdebiet: 0,2 l/min) toe totdat de muis zijn evenwicht begint te verliezen en uiteindelijk wordt verdoofd.
- Verwijder de muis uit de inductiekamer en injecteer atropine (0,04 mg/kg; subcutane injectie) om de ophoping van speeksel en buprenorfine (0,03 mg/kg; subcutane injectie) als analgeticum te voorkomen.
- Scheer het hoofd van de muis.
- Draag een masker, steriele jurk en handschoenen. Bereid een steriele ruimte en steriele chirurgische instrumenten voor op een operatie. Stabiliseer het hoofd van de muis (onderhoud anesthesie met 3 tot 2,5% isofluraan tijdens deze stap) op het stereotaxische apparaat. Zorg er na de pijnstillende en anesthetische procedures voor dat de oorstaven het hoofd stevig stabiliseren. Zorg voor thermische ondersteuning.
- Zorg ervoor dat het hoofd in een rechte positie staat, steriliseer het geschoren hoofd met betadine en spuit het hoofd vervolgens met xylocaïne (10%), een lokaal analgeticum.
- Breng veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Gebruik oogzalf voor oogbescherming tijdens alle anesthetische gebeurtenissen om oogletsel te voorkomen. - Test de diepe pijnreflex van het dier door in zijn achterpoot te knijpen. Zodra het dier geen pootontwenningsreflex vertoont, gaat u verder met chirurgische ingrepen.
- Maak een kleine incisie langs het middelste sagittale vlak van de schedel (beginnend bij ongeveer 2 mm voor de bregma en eindigend ongeveer 6 mm achter de bregma). Reinig vervolgens het bindweefsel op de schedel en veranker drie roestvrijstalen schroeven op de linker frontale en interpariëtale botten.
- Verminder op dit punt het isofluraan tot 1-2%. Controleer de ademhalingsfrequentie tijdens de hele chirurgische ingreep. Als de ademhalingsfrequentie te langzaam is (ongeveer 1/s, afhankelijk van het dier), verlaag dan de concentratie isofluraan.
- Voer een craniotomie uit voor de implantatie van de relaislens onder een chirurgische microscoop of stereomicroscoop met behulp van een braamboor met een tipdiameter van 0,7 mm. Gebruik een microboor om de braamboor te pakken en een omtrek van het beoogde cirkelgebied te tekenen (de volledige dikte van het calvarium hoeft niet te worden gepenetreerd).
OPMERKING: De relaislens die in het huidige protocol wordt gebruikt, had een diameter van 1,0 mm, een lengte ~ 9,0 mm een toonhoogte van 1 en een werkafstandsbereik van ~ 100 μm - 300 μm; daarom had de craniotomie een diameter van 1,2 mm.- Verdiep de omtrek voorzichtig totdat de dura bloot komt te liggen.
- Bereid 3 ml steriele zoutoplossing in een spuit van 3 ml en koel deze af in een ijsemmer. Spoel het blootgestelde gebied regelmatig af met 0,1 ml zoutoplossing uit de spuit om het gebied af te koelen en hitteschade en bloedingen te voorkomen.
- Pluk en pel de dura lichtjes af met een 27G naald.
- Plaats een markering op een stompe naald van 27 G op 1 mm van de punt en gebruik deze om de cortex van de hersenen zorgvuldig op te zuigen om een venster te creëren voor lensimplantatie 8,11,13,17 (figuur 2B1). Maak indien nodig een stompe naald door de punt van een injectienaald van 27 G met schuurpapier te vermalen. Sluit vervolgens de naald aan op een spuit, sluit de spuit aan op een buis en sluit de buis aan op een zuigbron om een vacuüm te creëren.
OPMERKING: De relaislens is bot en zal het hersenweefsel comprimeren wanneer het in het diepe hersengebied wordt geplaatst. Aspiratie van de cortex vermindert dus weefselschade als gevolg van estafettelensimplantatie. De cortex is ongeveer 1 mm dik bij muizen, maar is moeilijk te visualiseren onder een stereomicroscoop. Het merkteken creëert een oriëntatiepunt om de diepte van de naald nauwkeuriger te kunnen bepalen dan met een stereomicroscoop alleen. Bovendien kan men bepalen of het cortexgebied is bereikt of gepasseerd, afhankelijk van de weerstand; het bovenste deel van de cortex voelt relatief zacht aan, terwijl het subcorticale gebied dicht aanvoelt. Daarom, zodra de textuur dichter begint aan te voelen, stop dan de aspiratie (figuur 2B3). - Bereid 3 ml steriele zoutoplossing in een spuit van 3 ml en koel deze af in een ijsemmer. Spoel het gebied met zoutoplossing om het bloeden te stoppen en de kans op hersenoedeem te verminderen.
- Adeno-geassocieerd virus (AAV) injectie
OPMERKING: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE werd gebruikt in dit experiment. jGCaMP7s is een genetisch gecodeerde calciumindicator die groene fluorescentie uitzendt3. Omdat de huidige studie een wild-type muis als onderwerp gebruikte, was een virale vector nodig om de neuronen te transfecteren met het groen-fluorescerende calciumindicatorgen en de expressie mogelijk te maken. Onderzoekers die transgene muizen gebruiken die de groen-fluorescerende calciumindicator tot expressie brengen, omdat hun proefpersonen protocol 2.2 kunnen overslaan.- Monteer de binnenste naald van een intraveneuze katheter van 20 G (i.v.) op de stereotaxische arm en prik de hersenen langzaam (~100 - 200 μm/min) door op de juiste coördinaten (dezelfde coördinaten die worden gebruikt tijdens de implantatie van de relaislens) (figuur 2B3).
- Laat de micro-injectienaald met een snelheid van 100-200 μm/min in de ventrale CA1 zakken en injecteer (~ 25 nL/min) 200 nL van de virale vector in het doelgebied (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML en -3,50 mm DV van de bregma).
- Wacht 10 minuten om het virus te laten diffunderen en de terugstroom te minimaliseren.
- Trek de microinjectielaald op (~100-200 μm/min).
- Implantatie van relaislenzen
- Desinfecteer de relaislens met 75% alcohol10,16 en spoel vervolgens af met pyrogene zoutoplossing. Week de lens in koude pyrogene-vrije zoutoplossing tot implantatie.
OPMERKING: Een koude lens minimaliseert hersenoedeem wanneer het in de hersenen wordt geplaatst. - Houd de relaislens vast met behulp van een micro-bulldogklem (figuur 2B3) waarvan de tanden zijn bedekt met krimpkousen.
OPMERKING: De bulldogklem kan de lens stevig vasthouden zonder deze te beschadigen. Raadpleeg Resendez et al.8 voor de methode om de met slangen bedekte bulldog te laten klemmen. - Plaats de relaislens langzaam (~ 100 - 200 μm / min) bovenop het doelgebied (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML en -3,50 mm DV van de bregma) en stabiliseer deze met tandcement.
- Desinfecteer de relaislens met 75% alcohol10,16 en spoel vervolgens af met pyrogene zoutoplossing. Week de lens in koude pyrogene-vrije zoutoplossing tot implantatie.
- Dummy baseplating
OPMERKING: Het doel van "dummy baseplating" tijdens de implantatiechirurgie is om een tandheelkundige cementbasis te creëren om de hoeveelheid tandheelkundig cement te verminderen die enkele weken later tijdens de echte baseplating-procedure moet worden aangebracht. Op deze manier wordt het risico op een verandering in het volume van het tandcement geminimaliseerd.- Bevestig de objectieflens aan de onderkant van de miniscoop en monteer de bodemplaat op de miniscoop (in deze stap is de assemblage van de verankerde objectieflens, bodemplaat en miniscoop nog niet over de schedel van de muis geplaatst).
- Wikkel 10 cm paraffinefolie rond de buitenkant van de bodemplaat (figuur 4A).
- Houd de miniscoop vast met de stereotaxische armsonde met behulp van herbruikbare kleefklei.
- Lijn de objectieflens uit op de relaislens met zo min mogelijk ruimte tussen de lenzen (figuur 4B).
- Gebruik tandcement om de positionering van de bodemplaat vast te zetten (zodat het cement alleen de paraffinefilm raakt).
- Wanneer het tandcement is opgedroogd, verwijdert u de film.
- Verwijder de bodemplaat en de miniscoop. De cementbasis van het tandcement is hol (figuur 4B).
- Om de relaislens te beschermen tegen dagelijkse activiteiten en tegen krassen door de muis, sluit u de relaislens af met wat gegoten siliconenrubber totdat de relaislens is bedekt en bedekt u het siliconenrubber met een dunne laag tandcement (figuur 4B).
- Ontkoppel de muis van de stereotaxische instrumenten en plaats de muis in een herstelkamer.
- Injecteer carprofen (5 mg/kg; subcutane injectie) of meloxicam (1 mg/kg; subcutane injectie) voor analgesie en ceftazidim (25 mg/kg; subcutane injectie) om infectie te voorkomen.
OPMERKING: Het gebruik van antibiotica is geen alternatief voor een aseptische techniek. Perioperatieve antibiotica (d.w.z. ceftazidim) kunnen in bepaalde omstandigheden geïndiceerd zijn, zoals langdurige operaties of plaatsing van chronische implantaten. - Houd het dier in de gaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft om de strengale lighouding te behouden.
- Huisvest muizen individueel en injecteer meloxicam (1 mg /kg; subcutane injectie; q24h) gedurende één week om postoperatieve pijn te verlichten. Controleer het dier elke dag na de operatie om er zeker van te zijn dat het normaal eet, drinkt en poept.
- Voer baseplating uit na 3 of meer weken.
3. Baseplating
OPMERKING: Gewoonlijk kan de baseplating-procedure (figuur 5) niet binnen 2-3 weken na de initiële procedure worden uitgevoerd vanwege de herstel- en virale incubatietijd. De inductieprocedures voor baseplating zijn vergelijkbaar met die beschreven in de stappen 2.1.1 tot en met 2.1.8. Baseplating is echter geen invasieve procedure en het dier heeft alleen lichte sedatie nodig. Daarom is 0,8-1,2% isofluraan voldoende, zolang het dier niet op het stereotaxische frame kan bewegen. Bovendien kan relatief lichte isofluraanane-anesthesie ook helpen bij het vergemakkelijken van de expressie van de fluorescentietransiënten van neuronen tijdens monitoring8 (Aanvullende video S2).
- Snijd voorzichtig de dunne laag van het tandheelkundige cementdak met een botrongeur en verwijder het siliconenrubber. Reinig het oppervlak van de relaislens met 75% alcohol.
- Bevestig een stelschroef naast de bodemplaat om deze aan de onderkant van de miniscoop te bevestigen (figuur 5A1).
OPMERKING: De bodemplaat moet stevig onder de onderkant van de miniscoop worden aangedraaid, omdat het verschil tussen een aangedraaide en licht bevestigde bodemplaat een inconsistente afstand kan veroorzaken. - Stel de scherpstelschuif in op ongeveer 2,7 - 3 mm van de hoofdbehuizing (figuur 5A2).
OPMERKING: Hoewel de lengte verder kan worden aangepast tijdens de baseplating-procedure, bevestigt u deze op ongeveer 2,7 mm, omdat het gelijktijdig aanpassen van de miniscooplengte en de optimale lengte tussen de geïmplanteerde relaislens en de preanchored objectieflens erg verwarrend is. - Sluit de miniscoop aan op het data-acquisitiebord en sluit deze aan op een USB 3.0-poort (of hogere versie) op een computer.
- Voer de data-acquisitiesoftware uit die is ontwikkeld door het UCLA-team.
- Stel de belichting in op 255, de winst op 64x en de excitatie-LED op 5%. Deze instellingen worden aanbevolen voor initiële baseplating; de specifieke instellingen zullen variëren afhankelijk van de hersengebieden en de expressieniveaus van de genetisch gecodeerde calciumindicator.
- Klik op de knop Verbinden om de miniscoop te verbinden met de software voor gegevensverzameling en de livestream te bekijken.
- Lijn de miniscoopobjectieflens met de hand uit op de relaislens en begin met zoeken naar de fluorescentiesignalen (figuur 5B1).
OPMERKING: In eerste instantie vergemakkelijkt het handmatig zoeken naar het fluorescentiesignaal aanpassingen. Omdat een AAV-systeem werd gebruikt om de genetisch gecodeerde calciumindicator tot expressie te brengen, beïnvloedden zowel het promotortype als het AAV-serotype de efficiëntie van transfectie23,24. Onderzoekers moeten de expressie van de calciumindicator controleren door individuele neuronen te vinden die veranderingen in fluorescentie vertonen voordat ze doorgaan met toekomstige experimenten. - Boor het tandcement op elke plaats waar het de miniscoop blokkeert (optioneel).
- Bekijk de livestream van de data-acquisitiesoftware en gebruik de marge van de relaislens als oriëntatiepunt (aanvullende video S2). De marge van de relaislens verschijnt als een maanachtige grijze cirkel op de monitor (figuur 5B1; witte pijlen).
- Zodra de relaislens is gevonden, past u de verschillende hoeken en afstanden van de miniscoop zorgvuldig aan totdat de fluorescentiesignalen zijn gevonden.
OPMERKING: De beelden van de neuronen zijn witter dan de achtergrond. Een precieze neuronale vorm geeft aan dat de neuronen perfect op het brandpuntsvlak van de relaislens liggen. Ronde neuronen suggereren dat ze zich in de buurt van het focale vlak bevonden. De neuronale vorm is anders in de hersenen, hier wordt ventrale CA1 als voorbeeld getoond. - Als geen enkel individueel neuron veranderingen in fluorescentie vertoont als functie van de tijd, sluit de basis dan opnieuw met siliconenrubber. Fluorescentie wordt niet waargenomen omdat de incubatietijd ook afhankelijk is van de eigenschap van het virus 23,24. Voer stap 3.1-3.12 uit na een extra week. (Dit is optioneel).
- Houd de miniscoop op de optimale positie en beweeg de stereotaxische arm met een herbruikbare kleefklei naar de miniscoop (figuur 5B2). Bevestig de miniscoop aan de stereotaxische arm met herbruikbare kleefklei.
- Pas de x-, y- en z-armen enigszins aan om te zoeken naar de beste weergave (aanvullende video S2). Pas vervolgens de hoek tussen het oppervlak van de objectieflens en de relaislens aan door de oorstang, tandstaaf of herbruikbare kleefklei op de z-as te draaien. Virale expressie en lensimplantatie is succesvol wanneer ten minste één cel fluorescentietransiënten vertoont (figuur 6A; Aanvullende video S2) tijdens baseplating (wat ook afhankelijk is van het gebied van de hersenen, zoals de CA1).
OPMERKING: Als de monitor alleen witte cellen maar geen transiënten toont, is er een andere oorzaak (zie Figuur 6B,C, Aanvullende video's S4,S5, de sectie Resultaten en het gedeelte probleemoplossing). - Cementeer de bodemplaat (figuur 5B2) met het tandcement.
- Controleer het gebied van belang tijdens het cementeren om ervoor te zorgen dat de optimale positie niet verandert.
- Gebruik de kleinst mogelijke hoeveelheid cement terwijl u de bodemplaat nog steeds stevig op de cementbasis van het tandcement lijmt (figuur 5B2). Breng een tweede en derde laag cement aan rond de bodemplaat, maar pas op dat u de GRIN-lens niet beïnvloedt.
OPMERKING: Het aanbrengen van cement op de bodemplaat is in deze stap eenvoudiger omdat de basis van de bodemplaat werd gevormd tijdens de dummy-beplatingsprocedure. - Maak de miniscoop voorzichtig los van de bodemplaat wanneer het cement is uitgehard. Schroef vervolgens een beschermkap vast.
- Verplaats het dier naar een herstelkooi. Houd het dier in de gaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft om de strengale lighouding te behouden.
- Huismuizen individueel. Zorg ervoor dat het elke dag normaal eet, drinkt en poept. Wacht 5 dagen tot de muis volledig is hersteld en controleer vervolgens de calciumbeeldvorming.
OPMERKING: Er is slechts een kleine hoeveelheid tandcement die de bodemplaat vasthoudt. Daarom, als de bodemplaat aanzienlijk is verschoven sinds de baseplating-procedure, verwijder het tandcement met een boor en voer de baseplating-procedure opnieuw uit. - Anesthetine (door intraperitoneale injectie van een ketamine (87 mg/kg) /xylazine (13 mg/kg) mengsel) en perfuseer25 het dier wanneer alle experimenten zijn uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling van de volumeverandering van het tandcement
Aangezien het volume tandcement tijdens het uithardingsproces verandert, kan dit de beeldkwaliteit aanzienlijk beïnvloeden, aangezien de werkafstand van een GRIN-lens ongeveer 50 tot 350 μm 4,8 is. Daarom werden in dit geval twee in de handel verkrijgbare tandheelkundige cementen getest, Tempron en Tokuso, vóór de implantatie- en baseplatingprocedure (figuur 5). Video's werden eerst geëvalueerd om te bepalen of de cementen waren gekrompen en vervolgens werden de volumes cement vergeleken wanneer ze volledig waren gedroogd. Dezelfde concentratie en volumes van de oorspronkelijke mengsels van tandcementen werden in pipetpunten geladen en op video opgenomen (aanvullende video S1). Video S1 toonde aan dat beide cementen krompen tijdens het droogproces. Tokuso presteerde beter dan Tempron (d.w.z. het had een groter volume dan Tempron, zelfs na krimp): Figuur 3B; gemiddeld volume Tempron: 0,93 ± 0,07 ml; gemiddeld volume Tokuso: 1,18 ± 0,07 ml; t-test: p = 0,048, t(6) = 2,46, wat suggereert dat het minder kromp. De dichtheden van de cementen werden ook 4 keer getest na volledige droging. Tokuso had een lagere gemiddelde dichtheid dan Tempron (gemiddelde dichtheid van Tempron: 1,07 ± 0,12 g/ml; gemiddelde dichtheid van Tokuso: 0,93 ± 0,08 g/ml; t-test: p = 0,38, t(6) = -0,94), wat impliceert dat het een lagere krimpsnelheid had. Daarom werd Tokuso gebruikt voor de volgende implantatie- en baseplatingstappen. Het doel van het beschrijven van het bovenstaande experiment is niet om merken aan te bevelen, maar eerder om experimentatoren eraan te herinneren een tandcement te vinden dat geen aanzienlijke volumeverandering ondergaat bij het uitharden.
Meting van beeldverschuiving
We simuleerden de dummy baseplating en originele baseplating procedures op een vast object om te onderzoeken of de dummy baseplating procedure resulteert in een kleinere verschuiving in de baseplate locatie dan de oorspronkelijke procedure. Een lichthardende lijm werd gebruikt om een naald van een spuit van 23 G van 2,5 cm in het midden van een bodemplaat te bevestigen met 1 cm die uit de bodemplaat steekt (figuur 3C). Vervolgens werd baseplating gesimuleerd door de naalden vast te houden met de arm van een stereotaxisch instrument. In plaats van proefdieren te gebruiken, werd een sticker op de tafel van het stereotaxische instrument geplakt. De naald van de spuit doorboorde de sticker en vertegenwoordigde daarmee de oorspronkelijke locatie. Vervolgens werd de naald met 0,5 mm verhoogd en werden de simulatieoperaties gestart. Bij een operatie die de eenmalige baseplating-procedure8 nabootste, werd tandcement aangebracht totdat het de bodemplaat bedekte, die 1 cm boven de sticker lag. Vervolgens was er een wachttijd van 2 uur voordat het cement was uitgehard voordat de naald voorzichtig werd ingedrukt om de sticker opnieuw te doorboren. Omdat de lichthardende lijm de naald niet volledig stabiliseerde, kon de naald dieper worden geduwd om een ander gat te maken, wat de locatie van de bodemplaat vertegenwoordigt nadat het tandcement was opgedroogd. De afstand tussen het eerste gat en het tweede gat werd gemeten om de locatieverschuiving van de naald te kwantificeren. De resultaten toonden aan dat de basisplaat 1 cm boven de schedel resulteerde in een verschuiving van 1,76 ± 0,14 mm, maar de basisverschuiving van de dummy resulteerde in een verschuiving van slechts 0,75 ± 0,17 mm (figuur 3D; gemiddelde verschuivingsafstand van eenmalige baseplating versus dummy baseplating; t-test: p < 0,01, t(8) = 6,03).
Daarnaast waren we benieuwd of de hoogte van het tandcement de verschuiving zou beïnvloeden. Daarom hebben we verder een kortere hoogte getest (figuur 3E; 0,5 cm hierboven) met behulp van de eenmalige baseplating-procedure. De bodemplaat die 0,5 cm boven de schedel was verankerd, verschoof aanzienlijk minder dan de bodemplaat 1 cm boven de schedel (figuur 3F; gemiddelde verschuivingsafstand: 0,43 ± 0,11 vs 1,76 ± 0,14 mm; t-test: p < 0,01, t(8) = 9,73). Gegevens suggereerden dat de hoogte van de bodemplaat boven de schedel en de afstand die de grondplaat verschoof positief gecorreleerd waren. Aangezien de dummy baseplating procedure wordt gevolgd door een tweede baseplating stap die slechts een minimale hoeveelheid tandheelkundig cement gebruikt, ondersteunen deze gegevens ook de hypothese dat dummy baseplating helpt de precisie van de baseplating procedure te verbeteren.
Beeldvorming met behulp van een miniscoopsysteem met twee lenzen
Door de chirurgische protocollen voor virale infusie, dummy baseplating en baseplating (figuur 2, figuur 4, figuur 5) te volgen, observeerden we fluorescentietransiënten van individuele neuronen bij drie muizen (n = 3/5) (figuur 6A, aanvullende video S3) tijdens de baseplating-procedure en na de baseplating-procedure terwijl de muizen vrij bewogen, wat bevestigt dat de werkafstand tussen de objectief- en relaislenzen hetzelfde bleef (figuur 6A1 ten opzichte van figuur 6A3 trad slechts een lichte verschuiving in positie op) nadat het tandcement volledig was opgedroogd. Hier bieden we video's van het baseplating van één muis (aanvullende video S2; muis # 5) en daaropvolgende calciumbeeldvorming terwijl muizen vrij bewogen (aanvullende video S3; muis # 3, # 4, # 5; onbewerkte gegevens). Houd er rekening mee dat de software voor gegevensverzameling voor V3 geen functies voor de achtergrondaftrek bevat en dat het contrast van de video kan worden verbeterd door offline verwerking). Voor Supplementary video S2 werd handmatig gezocht naar de fluorescentiesignalen en vervolgens werd de miniscoop bevestigd aan de stereotaxische arm voor fijne aanpassingen. Sommige fluorescentietransiënten werden waargenomen tijdens het tasten (aanvullende video S2; Figuur 6A). Een transiënt is een vloeiende verschuiving in helderheid in grijze of witte vlekken, niet een vuurpatroon dat lijkt op een knipperend licht; Figuren 6A1 tot en met 6A2 tonen beelden van transiënten. De video van vrij gedragende muizen toonde een acceptabele ruimtelijke verschuiving in vergelijking met het gebied van belang tijdens de baseplating-procedure (aanvullende video S3). De marges van de cellen konden in dit stadium niet significant worden verbeterd omdat we de afstand tussen de onderkant van de relaislens en de actieve neuronen niet konden aanpassen. Met name kunnen sommige problemen vaak optreden tijdens de baseplating-procedure, waaronder een afwezigheid van iets anders dan een uniforme achtergrond (figuur 6B; Aanvullende video S4) of zichtbaarheid van witte celmarges zonder fluorescentietransiënten (figuur 6C; Aanvullende video S5). Er worden ook twee voorbeelden van negatieve resultaten gegeven (n = 2/5) (figuur 6B,C, Aanvullende video's S4, S5). De mogelijke redenen voor de mislukkingen worden onderzocht in de sectie Discussie. De chirurgische procedures voor deze twee muizen werden uitgevoerd zonder een naald met een diameter van 1 mm te gebruiken om het pad vrij te maken; zo werd de relaislens direct geïmplanteerd. We stellen voor dat in muis # 2 de relaislens de neuronen kan hebben gecomprimeerd en sommige neuronen naar beneden heeft gesleept, wat resulteert in beschadigde neuronen. Daarom werden geen fluorescentietransiënten gevonden.
Figuur 1: Mechanismen van de miniscoop en de defecten die gewoonlijk beeldvormingsfouten veroorzaken. (A) Cartoondiagram van de relaislens en objectieve lens met de mechanismen die nodig zijn voor de visualisatie van fluorescerende cellen in een systeem met twee lenzen. De signaalgolven van elke lens benadrukken het belang van en het mechanisme dat betrokken is bij het vinden van een werkafstand om de fluorescerende cellen te visualiseren. (A1) De relais GRIN-lens wordt boven de doelneuronen binnen de werkafstand geplaatst. Aangezien de toonhoogte van de relaislens 0,5 * N is (waarbij N een geheel getal is), maakt de lens visualisatie van doelneuronen mogelijk door licht door te geven, waardoor de oorspronkelijke fluorescentiesignalen naar de bovenkant van de relaislens worden gebracht. Vervolgens reist ongeveer 1/4 van een volledige sinusoïdale periode van licht door de objectieve GRIN-lens (~ 0,25 toonhoogte) en resulteert in een vergroot beeld. (A2) De objectieflens verzendt de beelden naar een complementaire metaaloxide-halfgeleidersensor (CMOS) aan de bovenkant (de groene plaat in het diagram) van de miniscoop. (B) Cartoondiagram met de verschillen in de GRIN-lensimplantatieprocedures tussen een (B1) systeem met twee lenzen en (B2) een systeem met één lens. Over het algemeen is het grote verschil dat het systeem met één lens direct zijn objectieve lens gebruikt om het oppervlak van de hersenen in beeld te brengen; als gevolg hiervan moet de objectieve lens bovenop de doelneuronen worden geïmplanteerd. (C) In tegenstelling tot het systeem met twee lenzen wordt ter vergelijking een extra relaislens in de hersenen geïmplanteerd en wordt de objectieve lens vooraf in de miniscoop geplaatst. (C1) De vorm van de bodemplaat voor de V3-versie van de UCLA Miniscope kan een ongelijke verschuiving veroorzaken nadat het tandcement volledig is opgedroogd. (C2) Deze verschuiving veroorzaakt een verkeerde uitlijning of afwijking van de werkafstand tussen de relaislens en de objectieflens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gewijzigde protocollen en gedetailleerde chirurgische protocollen om het slagingspercentage van het miniscoopsysteem met twee lenzen te verbeteren. (A1) Aangepast chirurgisch protocol voor het systeem met twee lenzen. De locaties van de virale injectie en relais GRIN lensimplantatie worden getoond. Dummy baseplating zorgt ervoor dat de werkafstand nauwkeurig de neuronen van belang omvat en vermindert de positionele verschuiving geassocieerd met de (A2) baseplating procedure. Vandaar dat (A3) de kans op beeldvorming van fluorescerende cellen bij vrij gedragende muizen is toegenomen. (B) Cartoonafbeelding van de stappen voor virale injectie en relais GRIN-lensplaatsing. (B1) Markeer eerst de aspiratienaald met een pen van ongeveer 1 mm (voor muisexperimenten) vanaf de punt om te helpen bij de beoordeling van de cortexaspiratiediepte. Aspirateer vervolgens het bindweefsel en de cortex (ongeveer 1 mm diep bij muizen) uit de hersenen. (B2) Gebruik de ventrale hippocampus als doelgebied om een relaislens te implanteren; met name het taaie corpus callosum is het oriëntatiepunt voor het stoppen van de aspiratie van het corticale gebied. De vezelachtige textuur van het corpus callosum is te zien onder de stereomicroscoop tijdens aspiratie. (B3) Ten tweede, prik het punt van belang door met een binnenste naald van een katheter van 20 G (ongeveer 1 mm in diameter; de diameter is vergelijkbaar met die van de relaislens) om een pad vrij te maken vóór virale infusie. Onder de stereomicroscoop moet een deuk (stippelcirkel in de afbeelding) zichtbaar zijn die door de naald wordt gemaakt. Laat de microinjectienaald en relaislens bij de deuk zakken (of slechts 250 μm verwijderd van het midden van de deuk). Plaats ten slotte de relais GRIN-lens (in het huidige onderzoek hebben we een relaislens met een diameter van 1 mm gebruikt). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Meting van de volumeverandering van het uitgeharde tandcement. (A) Een voorbeeld met uitgehard tandcement van twee merken. De zwarte pijlen geven de oorspronkelijke niveaus aan nadat we het poeder en de oplossing hebben gemengd. De witte pijlen geven de niveaus aan na 10, 20 en 40 minuten uitharding. De rode pijlen wijzen naar de onderkant van de uiteinden, die waren afgedicht met lichthardende lijm. (B) Gemiddelde volumes van de resterende tandcementen nadat ze volledig zijn gedroogd. De balken en foutbalken zijn de middelen ± SEMs. * duidt op significantie (P < 0,05) zoals bepaald door de t-toets van student. (C) Illustraties en een foto waarin de methode wordt uitgelegd die is gebruikt om de locatieverschuiving van de bodemplaat te meten. Een naald werd door de bodemplaat gelijmd en werd gebruikt om de oorspronkelijke baseplating-procedure (one-step baseplating) en de dummy baseplating-procedure te simuleren. De rode en zwarte pijlen vertegenwoordigen de locaties van de naald voor en nadat het tandcement was uitgehard. (D) Gemiddelde afstandsveranderingen van de punt van de naald (E) Illustraties van de methode die wordt gebruikt om de relatie tussen de bodemplaat boven schedelniveau en de locatieverschuiving te meten. (F) Gemiddelde afstandsveranderingen van de punt van de naald. De balken en foutbalken zijn de middelen ± SEMs. ** duidt op significantie (P < 0,01) zoals bepaald door de t-toets van student. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gedetailleerde dummy baseplating procedure (uitgevoerd onmiddellijk na relais lens implantatie). (A1) Drie-staps cartoon van objectieve lens, bodemplaat en paraffine film assemblage op de miniscoop. (A2) Fotoversie van de assemblage. (B1) Cartoon met de dummy baseplating procedure. Eerst wordt de geassembleerde miniscoop uitgelijnd met de relaislens. De objectieflens bevindt zich zo dicht mogelijk bij de relaislens. Ten tweede wordt tandcement toegevoegd aan de parafilm rond de bodemplaat en op de schedel aangebracht om een vrouwelijke mal te maken voor toekomstige baseplating. Vervolgens wordt de bodemplaat verwijderd en wordt het vormen van siliciumrubber (roze) toegevoegd en afgetopt met tandcement om de vrouwelijke mal en relaislens te beschermen. Het dier mag dan herstellen van de anesthesie. Na ten minste 3 weken wordt de baseplating-procedure uitgevoerd. (B2) Fotoversie van (B1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Stappen voor de baseplating procedure. (A1) Bevestig de bodemplaat en (A2) stel de scherpstelschuifregelaar handmatig in op 2,7 tot 3 mm. Een instelling van 2,7 tot 3 mm (op de positie op de foto) lijkt de beste plek om te beginnen voordat u handmatig naar de fluorescerende cellen zoekt. (B1) Het eerste cartoondiagram illustreert het belang van de lengte tussen de objectieflens en de relaislens voor visualisatie van de fluorescerende cellen (fluorescerende cellen worden meestal waargenomen op een afstand tussen 0,5 en 2 mm). Voordat de fluorescerende cel tevoorschijn komt, moet de onderzoeker de marge van de relaislens zien (pijlen in de bovenste foto). Het is handig om de lens eerst handmatig aan te passen aan de optimale kijkpositie omdat het makkelijker is om snel met de hand af te stellen. (B2) Plaats herbruikbare kleefklei op de stereotaxische armsonde en stabiliseer vervolgens de miniscoop door deze op de arm te hechten met herbruikbare kleefklei. In dit stadium kan het interessegebied zijn verschoven, maar dit kan eenvoudig worden opgelost door de stereotaxische arm en de herbruikbare kleefklei enigszins aan te passen. Na het controleren op en het vinden van de optimale regio van belang, voegt u een kleine hoeveelheid tandcement toe (weergegeven in rood). Lijm de bodemplaat met zo min mogelijk tandcement. Scheid de miniscoop en de bodemplaat nadat het tandcement is opgedroogd. Als de bodemplaat niet stabiel genoeg is, voeg dan extra tandcement toe. (C) Dit diagram illustreert het belang van elke stap voor het behalen van succes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeelden van succes en falen tijdens de baseplating procedure. (A) Een voorbeeld van succesvolle beeldvorming tijdens de baseplating procedure. De relaislens richtte zich op de ventrale hippocampus. Fluorescentietransiënten werden opgemerkt wanneer het dier onder narcose was met isofluraan (zie ook Aanvullende video S2). (A2) Het contrast werd verhoogd voor een betere zichtbaarheid. De rode stippellijnen geven bloedvaten aan. (A3) Fluorescentietransiënten vijf dagen na baseplating toen de muis (#5) zich vrij gedroeg in zijn thuiskooi (zie ook Aanvullende video S3; de beelden van muizen #3 en #4 zijn ook te vinden in de Aanvullende video S3). Slechts een kleine verschuiving in positie vond plaats. (B1) Een voorbeeld van een mislukking. Tijdens baseplating werden alleen homogene wit/grijze gebieden opgemerkt die niet celachtig van vorm waren (zie ook Aanvullende video S4). (B2) De relaislens miste het doelgebied en bevond zich boven een gebied zonder geïnfecteerde cellen. (C1) Weer een voorbeeld van een mislukking. Bij deze muis werden, hoewel veel ronde cellen waargenomen, geen fluorescentietransiënten waargenomen tijdens de baseplating (na drie weken incubatie en terwijl de muis werd verdoofd / verdoofd). Bovendien werden er geen fluorescentietransiënten waargenomen wanneer de baseplating-procedure opnieuw werd uitgevoerd (in de vijfde week van incubatie) of zelfs wanneer het dier zich vrij gedroeg. Het beeld werd verkregen tijdens baseplating in de vijfde week van incubatie (zie ook Aanvullende video S5). (C2 en C3) De relaislens miste de piramidale laag van de ventrale hippocampus. De blauwe stippen zijn kernen die gekleurd waren met DAPI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Probleem | Mogelijke oorzaak | Oplossing | ||
| Had goede beeldvorming bij baseplating, maar volledig onscherp de volgende dag | Volumeverandering bij het uitharden van het tandcement tussen de schedel van de proefpersoon en de bodemplaat | Ga verder met "dummy baseplating" na de lensimplantatieprocedure zoals voorgesteld in dit rapport. Kies een tandcement dat minder volumeverandering heeft. | ||
| Heeft homogene wit/grijze gebieden zonder celachtige vorm tijdens baseplating (zie ook aanvullende video S4) | Een. De relaislens miste het doelgebied B. Slechte expressie van fluorescentie-indicator C. Vergeet een objectieflens onder de miniscoop te installeren waar de fluorescentie-indicator daadwerkelijk wordt uitgedrukt | A. Gebruik dummy lenzen voor het oefenen van operaties. Controleer de coördinaten van de dummylens na het oefenen van implantatie B. Zoek een optimale virale titer voor calciumbeeldvormingsexperimenten (verwezen naar Resendez et al. 2016). Als om wat voor reden dan ook geen pretesting kan worden uitgevoerd, raden we beginners aan eerst een hogere titer te proberen. (Zie disscussie sectie voor details) C. Schroef op een objectieve GRIN lens (~ 0,25 pitch. ex: Edmund Optics; Voorraad #64-519) onderaan de miniscoop. | ||
| Observeer veel cellen, maar geen fluorescentiedynamiek tijdens baseplating | A. Ongezonde neuronen of dode neuronen B. Schaars fining type neuronen C. Diepe anesthesiestatus | A. Wees voorzichtig voor elke chirurgische ingreep. Gebruik een nieuwe syringingnaald die vergelijkbaar is met de diameter van uw relaislens om eerst het infusie-/implantatiepad te snijden om de druk door lensimplantatie te verlichten. Injecteer het virus langzaam en implanteer langzaam de lens. B. Wacht langer om de activiteiten van neuronen te controleren of knijp een beetje in de staart om de muis te stimuleren. C. Baseplating is geen invasieve procedure en het dier heeft alleen sedatie nodig. Daarom is het handhaven van 1,2 ~ 0,8% isofluraan voldoende, zolang het dier niet in staat is om op het stereotaxische frame te bewegen. | ||
Tabel 1: Grafiek voor probleemoplossing.
Aanvullende video S1: Tandcementvolumetest. Het verschil tussen het volume werd gemeten aan het begin van het tandheelkundige cementpreparaat en dat het volume na het cement was opgedroogd. Twee merken tandcement (bijv. Tempron en Tokuso Curefast) werden getest. Om het volume van het tandcement na het drogen te testen, werd 0,5 g van elk tandheelkundig cementpoeder gewogen en gemengd met de juiste oplossing (1 ml). Vervolgens werden 0,1-10 μL pipetpunten geladen met 2,5 μL van het tandheelkundige cementmengsel en afgedicht met lichthardende lijm. Vervolgens werden de uiteinden op een rek geplaatst, de oppervlakken van de tandheelkundige cementmengsels werden gemarkeerd en gedurende 40 minuten gefilmd. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video S2: Demonstraties van de baseplating procedure. De hoek tussen het oppervlak van de objectieflens en de relaislens werd aangepast door de oorstang, tandstaaf of herbruikbare kleefklei op de z-as te draaien. De marge van de relaislens verscheen als een maanachtige grijze cirkel op de monitor. Succesvolle virale expressie en lensimplantatie moeten ten minste één fluorescentiedynamiek (pijlen) onthullen tijdens baseplating. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video S3: Demonstraties van fluorescentiedynamiek bij vrij gedragende muizen. Fluorescentietransiënten van muizen #3, #4 en #5. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video S4: Een voorbeeld van een storing. Tijdens de baseplatingprocedure verscheen een uniforme achtergrond. Houd er rekening mee dat de verandering in helderheid niet te wijten was aan de fluorescentietransiënten van individuele cellen; het werd veroorzaakt door de zoekprocedure. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video S5: Demonstratie van een ander voorbeeld van een storing. Een gebrek aan fluorescentietransiënten trad op tijdens de baseplating-procedure, maar sommige ronde celranden waren nog steeds zichtbaar. Houd er rekening mee dat de verandering in helderheid niet werd veroorzaakt door de fluorescentietransiënten van individuele cellen; het werd veroorzaakt door de zoekprocedure. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige rapport beschrijft een gedetailleerd experimenteel protocol voor onderzoekers die het UCLA Miniscope-systeem met twee lenzen gebruiken. De tools die in ons protocol zijn ontworpen, zijn relatief betaalbaar voor elk laboratorium dat in vivo calciumbeeldvorming wil proberen. Sommige protocollen, zoals virale injectie, lensimplantatie, dummy baseplating en baseplating, kunnen ook worden gebruikt voor andere versies van het miniscoopsysteem om het succespercentage van calciumbeeldvorming te verbeteren. Afgezien van algemene problemen met virale injectie en lensimplantatie die moeten worden opgelost, ongeacht de miniscoopversie, kan de structuur van de UCLA-bodemplaat een positionele verschuiving veroorzaken, wat kan leiden tot niet-overeenkomende werkafstanden tussen de objectief- en relaislenzen (figuur 1C). Er werd een aangepast experimenteel protocol ontwikkeld om de positionele verschuiving van de twee lenzen te minimaliseren (figuren 2, figuur 4, figuur 5). Succesvolle calciumbeeldvorming kan worden bereikt door een combinatie van succesvolle virale expressie, lensimplantatie en baseplating-procedures (figuur 5C). Het gebruik van een systeem met twee lenzen om diepe hersengebieden te observeren, vereist een hoge mate van nauwkeurigheid in de baseplating-procedures, omdat de relatieve posities van de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens ook nauwkeurig moeten zijn. Dit rapport presenteert niet alleen een protocol dat baseplating-problemen oplost, maar bespreekt ook enkele tips voor virale injectie en lensimplantatie. Hieronder bespreken we eerst de baseplating-procedures, gevolgd door de virale injectie en lensimplantatieprocedures, en we beschrijven enkele voorbeelden van mislukkingen (figuur 6).
Baseplating
De V3-versie van de UCLA Miniscope is momenteel het meest gebruikte ontwerp en kan online worden besteld. De bodemplaat van deze versie bestaat uit twee randen zonder wanden (figuur 1C1), maar de vorm kan een ongelijke verschuiving veroorzaken (figuur 1C1, C2) nadat het tandcement volledig droog is. De dummy baseplating procedures in ons protocol (Figuur 4) minimaliseren de verkeerde uitlijning en baseplate shifting problemen omdat het paraffine film gebruikt om de beschikbare ruimte voor het tandcement te verminderen tijdens echte baseplating (Figuur 5B). De resterende ruimte is nog voldoende voor het vinden van een optimale beeldpositie tijdens de echte baseplating procedure. Daarom kan de onderzoeker de bodemplaat verlijmen met zo min mogelijk tandcement (figuur 5B2). Bovendien kost de dummy baseplating procedure relatief weinig tijd (ongeveer 15 tot 20 min), omdat het geen perfecte afstand tussen de objectieflens en de relaislens vereist om te worden bereikt. Dummy baseplating is echter slechts een van de belangrijkste factoren voor succesvolle calciumbeeldvorming; tijdens het monitoren van fluorescentiesignalen kunnen neuronen bijvoorbeeld wazig lijken als ze zich iets buiten het werkvlak bevinden (afhankelijk van de werkafstand van de relaislens; vaak ongeveer 100 ~ 300 μm). Het vermogen om de werkafstand te verbeteren is beperkt, omdat de werkafstand van de neuronen vooraf wordt bepaald door de implantatieprocedure voor relaislenzen. Een experiment werd uitgevoerd zonder de dummy baseplating procedure en de regio van belang werd altijd (in vier van de vier muizen) gemist na eenmalige baseplating. Daarom zijn deze oplossingen bedacht om het krimpprobleem te verminderen. Sommige lichthardende tandcementen kunnen het probleem van krimp tijdens het uitharden voorkomen, omdat ze zeer snel genezen; deze cementen kunnen onderzoekers helpen de afstand aan te passen tijdens de baseplating-procedure. Hoewel het bereik van golflengten voor het opwinden van de calciumindicatoren en het uitharden van het tandcement anders is, moet fotobleaching tijdens de baseplating-procedure worden voorkomen. Om fotobleaching te voorkomen, moet het golflengtebereik dat door de lichtbron wordt gegenereerd vrij smal zijn om kruisreacties tussen de calciumindicatoren en het lichthardende tandcement te voorkomen. Daarom wordt het gebruik van lichthardend tandcement niet aanbevolen voor de baseplating-procedure. Daarnaast worden sommige specifieke merken tandcementen vaak gebruikt voor het verlijmen van bodemplaten door andere onderzoeksteams 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . De krimparme eigenschappen van deze cementen kunnen het probleem oplossen, maar we hadden niet de mogelijkheid om deze merken te testen vanwege problemen bij het kopen (importeren) ervan. Producten van medische kwaliteit kunnen onderworpen zijn aan importvoorschriften, afhankelijk van het land/de regio. Als onderzoekers moeite hebben om toegang te krijgen tot de cementen die in de literatuur worden genoemd 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, zal ons protocol het probleem van de tandcementkrimp oplossen.
Naast het krimpprobleem kan structurele slijtage optreden in de miniscoop zelf en op de bodemplaat (vooral de magneten in de bodemplaat) in de loop van vele experimenten. Elke kleine opening veroorzaakt door slijtage vermindert de stabiliteit van de afstand tussen de twee lenzen. Nogmaals, nauwkeurigheid over het hele optische pad is de sleutel tot beeldvorming van calciumtransiënten bij vrij gedragende muizen met behulp van een miniscoop.
Probleemoplossing van virale injectie/lensimplantatie
Voordat het virus in het hersengebied wordt toegediend, wordt aanbevolen om een nieuwe naald op de stereotaxische arm te monteren en de hersenen langzaam op de juiste coördinaten te prikken. Omdat de nieuwe naald zeer scherp is, dient deze punctie als een voorbereidingsstap om het pad vrij te maken (of een pad te snijden) voor de eigenlijke microinjectielaald en relaislens en minimaliseert weefselschade, die kan worden veroorzaakt door compressie van de micro-injectienaald of relaislens. De scherpe naald snijdt een pad voor de stompe relaislens; daarom moet de punt van de naald worden neergelaten op dezelfde coördinaten als de relaislens. De binnenste naald van een 20 G I.V. katheter werd gekozen omdat deze een diameter had van 1 mm, wat vergelijkbaar was met de diameter van onze relaislens. Afhankelijk van de diameter van de relaislens kan een andere naaldmeter worden gebruikt.
Hoewel de huidige studie zich niet richtte op de eigenschappen en titers van virale vectoren, zijn deze factoren nog steeds van cruciaal belang voor succesvolle calciumbeeldvorming (figuur 5C). Het is noodzakelijk om de expressiekwaliteit van de virale vector vooraf te testen. Stap 1 tot en met 5 van het protocol van Resendez et al. bieden gedetailleerde methoden voor de identificatie van een optimale virale titer voor calciumbeeldvormingsexperimenten8. Als pretesting om de een of andere reden niet kan worden uitgevoerd, wordt aanbevolen dat beginners eerst een relatief hoge titer proberen. Een van de nadelen van het gebruik van een hoge virale titer iscytotoxiciteit8. Dode neuronen geven aanleiding tot autofluorescentie en zijn zichtbaar als heldere witte vlekken onder de miniscoop8. Deze dode neuronen zijn echter goede oriëntatiepunten voor beginners om de baseplating-procedure te vinden en te oefenen. Aan de andere kant, hoewel infusie van een laagtitervirus een lager risico heeft om cellen te doden, kan de fluorescentie door de achtergrond worden gemaskeerd als de cellen geen fluorescentietransiënten vertonen tijdens de baseplating-procedure. Het is moeilijk om de redenen voor falen aan te wijzen, omdat de doelneuronen kunnen worden gemist als gevolg van relaislensimplantatie of vanwege de slechte expressie door de virale vector. Het bepalen van de oorzaak is erg verwarrend zonder histologische bevestiging. Daarom wordt het gebruik van relatief hoogtitervirussen aanbevolen als de virale vectoren niet vooraf kunnen worden getest.
Resendez et al. raden aan om de micro-injectienaald 250 μm lateraal en ventraal in te brengen in de plaatsing van de lens. Onze waarnemingen toonden aan dat infusie van het virus op dezelfde diepte als de relaislens ook kan leiden tot de expressie van goede calciumsignalen. We stellen voor dat vanwege de mogelijkheid van infectie en verspreiding, het infunderen van het virus op dezelfde diepte als de coördinaat van de relaislens optimaal is voor het verminderen van weefselschade en het vergroten van de nauwkeurigheid van de afstand tussen de geïnfecteerde neuronen en de relaislens. Resendez et al. bevelen ook aan om virale injectie en lensimplantatie uit te voeren tijdens dezelfde operatie, gezien het smalle bereik van werkafstanden tussen doelcellen en de relaislens8. Sommige onderzoekers volgen echter een protocol waarin de virale infusiestap en lensimplantatiestap twee (of meer) weken na elkaar18,26 worden uitgevoerd. Het verlengen van de tijd tussen de stappen vermindert de individuele operatietijd. Maar in dit protocol werden deze twee stappen samengevoegd tot één operatie, omdat de chirurg in het protocol met één operatie de positie tussen de micro-injectienaald en de relaislens kan controleren wanneer deze in het doelgebied wordt neergelaten, wat de kans op mislukte targeting vermindert (figuur 2B3).
Voor twee muizen (muizen # 1 en # 2) werd het gebruik van een naald om een pad voor de lens te maken ook weggelaten, en in muis # 2 werden ronde celachtige grijze vlekken waargenomen (figuur 6C). Fluorescentiedynamiek (aanvullende video S5) werd echter niet waargenomen. Bij het onderzoeken van het hersendeel van dit voorbeeld (figuur 6C2, C3), postuleerden we dat de relaislens enkele cellen naar beneden sleepte terwijl deze werd neergelaten. Deze gesleepte neuronen waren ongezond, dus er werd geen activiteit opgemerkt tijdens de baseplating-procedure of tijdens het experiment.
We hadden één muis met een volledig homogeen grijs signaal en geen zichtbare celachtige beelden tijdens de baseplating procedure (figuur 6B1). Na het offeren van de muis werden zijn hersenschijfjes waargenomen. Het viel op dat de lens zich aan de mediale kant van de gebogen piramidale laag bevond; het doelgebied (figuur 6B2) werd volledig gemist. Deze mislukte pogingen waren kritieke ervaringen die ons ertoe brachten ons operatieprotocol aan te passen en uiteindelijk te slagen met drie muizen (aanvullende video S3).
Microinjectie naald
Het corpus callosum is een taai vezelig kanaal dat de dorsale hippocampus bedekt. Vanwege zijn stijfheid is het bestand tegen penetratie door een micro-injectienaald met platte punt. Daarom raden we aan om een microinjectielaald met een afgeschuinde punt te gebruiken. Dit type naald vermindert niet alleen weefselschade, maar vermindert ook de kans dat het virus niet in het doelgebied wordt toegediend als gevolg van verstopping door nabijgelegen vezels. We hebben de bovengenoemde problemen samengevat in een grafiek voor probleemoplossing (tabel 1).
Tijdsbestek
Het tijdsbestek voor de gehele procedure is samengevat in figuur 2A, met dagen als eenheden. In detail kan het operatiegedeelte (virale injectie, estafettelensimplantatie, dummy baseplating) 3 uur duren voor beginners of 1,5 uur voor voldoende opgeleide onderzoekers. Muizen hebben een kleine lichaamsgrootte en een snel metabolisme, en ze zijn vatbaarder voor gezondheidsproblemen veroorzaakt door lange perioden onder narcose dan grotere soorten27. Onderzoekers moeten ernaar streven om de tijd besteed aan chirurgie onder de 3 uur te houden. Echte baseplating kan worden uitgevoerd na 3 tot 6 weken calciumindicatorexpressie. Deze procedure kan 1 uur duren. De daaropvolgende longitudinale calciumactiviteitswaarneming kan langer dan 1 maand worden voortgezet.
Conclusies
De UCLA Miniscope is een open-source in vivo calcium imaging apparaat. Zonder een kant-en-klare, voorgeïnstalleerde bodemplaat of lensmodule moeten personen die experimenten uitvoeren in staat zijn om nauwkeurig de optimale afstand tussen de objectieflens en de relaislens te bereiken tijdens de baseplating-procedure. De verhoogde moeilijkheid van het gebruik van het UCLA Miniscope-systeem met twee lenzen ligt in de volumeverandering van het tandcement. We hebben de oorspronkelijke protocollen geoptimaliseerd en de defecten veroorzaakt door de hierboven genoemde problemen geminimaliseerd, waardoor het slagingspercentage van calciumbeeldvorming met het UCLA Miniscope-systeem met twee lenzen is toegenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit is geen door de industrie gesteunde studie. De auteurs melden geen financiële belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
