Summary
牙科水泥在固化过程中的收缩会取代底板。该协议通过创建牙科水泥的初始基础来最大程度地减少问题，从而留出空间来粘合底板。几周后，底板可以使用很少的新水泥粘合到该脚手架上的位置，从而减少收缩。
Abstract
神经科学家使用微型显微镜（微型显微镜）来观察行为自由的动物的神经元活动。加州大学洛杉矶分校（UCLA）的Miniscope团队为研究人员提供开放资源，让他们自己构建微型镜。V3 UCLA Miniscope是目前使用的最流行的开源Miniscope之一。它允许通过植入浅表皮层的物镜（单透镜系统）对转基因神经元发出的荧光瞬变进行成像，或者通过植入深部大脑的中继透镜和预先锚定在微型镜中的物镜的组合在大脑深处区域成像，以观察中继图像（双镜头系统）。即使在最佳条件下（当神经元表达荧光指示剂并且中继透镜已正确植入时），水泥固化时底板及其与颅骨的连接之间的牙科水泥体积变化也会导致物镜和中继透镜之间距离改变的错位，从而导致图像质量差。底板是帮助将微型镜安装到头骨上并固定物镜和继电器透镜之间工作距离的板。因此，底板周围牙科水泥体积的变化会改变镜片之间的距离。本协议旨在最大限度地减少由牙科水泥体积变化引起的错位问题。该方案通过在中继晶状体植入期间建立牙科水泥的初始基础来减少错位。植入后的恢复时间足以使牙科水泥的基础完全固化底板，因此可以使用尽可能少的新水泥将底板粘合在该支架上。在本文中，我们描述了在小鼠中进行基底镀的策略，以便使用锚定在微型镜中的物镜对神经元活动进行成像。
Introduction
荧光活性报告基因是神经元活动成像的理想选择，因为它们灵敏且具有较大的动态范围1，2，3。因此，越来越多的实验使用荧光显微镜直接观察神经元活动1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16.第一台小型化单光子荧光显微镜（miniscope）由Mark Schnitzer等人于2011年设计5。该微型镜使研究人员能够监测行为自由的动物的小脑细胞的荧光动力学5（即，对动物没有任何物理约束，头部约束，镇静或麻醉）。目前，该技术可用于监测大脑浅表区域，例如皮层6，8，15，16;皮质下区域，如背侧海马体8、11、13、14 和纹状体6，17;和深部大脑区域，例如腹侧海马体 14、杏仁核10，18 和下丘脑8，12。
近年来，已经开发了几种开源微型示波器4,5,6,7,11,13,17,19.如果研究人员遵循加州大学洛杉矶分校（UCLA）微型望远镜团队提供的分步指南，则可以经济地组装微型镜4,7,11,13.因为神经活动的光学监测受到光传输限制的限制7 在感兴趣的神经元群体之间，设计了一个微型镜，该镜需要将物镜梯度折射率（GRIN）透镜（或物镜）预先锚定在微型镜的底部，以放大从中继GRIN透镜（或中继透镜）中继的视野6,7,8,10,16,17.该中继透镜被植入目标大脑区域，使得目标大脑区域的荧光活性被中继到中继透镜的表面上6,7,8,10,16,17.大约 1/4 的全正弦周期的光穿过物镜 GRIN 透镜（~ 0.25 间距）（图1A1），产生放大的荧光图像6,7.物镜并不总是固定在微型镜的底部，也不需要植入中继透镜6,7,11,13,15.具体来说，有两种配置：一种在微型镜中带有固定物镜，另一种在大脑中植入中继镜8,10,12,14,16 (图 1B1），另一个只有一个可拆卸的物镜6,7,11,13,15 (图1B2).在基于固定物镜和植入式中继透镜组合的设计中，来自大脑的荧光信号被带到中继透镜的顶部表面（图1A1)7,8,10,12,14,16.随后，物镜可以放大并透射来自中继透镜顶面的视野（图 1A2).另一方面，可拆卸物镜GRIN镜片设计更加灵活，这意味着将中继镜片预植入大脑不是强制性的（图1B2)6,7,11,13,15.当使用基于可拆卸物镜设计的微型镜时，研究人员仍然需要将晶状体植入目标大脑区域，但他们可以植入物镜6,7,11,13,15 或大脑中的中继透镜6,7.用于植入的物镜或中继透镜的选择决定了研究人员必须使用的微型镜配置。例如，V3 UCLA Miniscope基于可拆卸物镜GRIN镜头设计。研究人员可以选择直接在感兴趣的大脑区域植入物镜，并将“空”微型镜安装到物镜上。6,7,11,13,15 （单镜头系统; 图1B2）或在大脑中植入中继透镜并安装一个预先固定有物镜的微型镜6,7 （双镜头系统; 图 1B1).然后，微型镜用作荧光相机，以捕获由基因编码的钙指示剂产生的神经元荧光的实时图像1,2,3.将微型显微镜连接到计算机后，可以将这些荧光图像传输到计算机并保存为视频剪辑。研究人员可以通过分析一些分析包分析荧光的相对变化来研究神经元活动20,21 或编写代码以供将来分析。
V3 UCLA Miniscope为用户提供了灵活性，可以确定是使用单镜头还是双镜头系统对神经元活动进行成像7。记录系统的选择基于目标大脑区域的深度和大小。简而言之，单透镜系统只能对表面（小于约2.5毫米深）和相对较大的区域（大于约1.8 x 1.8 mm2）进行成像，因为制造商只生产一定尺寸的物镜。相比之下，双镜片系统可以应用于任何目标大脑区域。然而，用于粘合底板的牙科水泥往往会因物镜和中继透镜之间的距离改变而造成错位，从而导致图像质量差。如果使用双镜头系统，则需要精确定位两个工作距离，以实现最佳成像质量（图1A）。这两个关键的工作距离位于继电器透镜的神经元和底表面之间，以及中继透镜的顶表面和物镜的底表面之间（图1A1）。镜头在工作距离之外的任何错位或错位都会导致成像失败（图1C2）。相比之下，单透镜系统只需要一个精确的工作距离。然而，物镜尺寸限制了其用于监测脑深部区域的应用（适合微型镜的物镜约为1.8~2.0mm6，11，13，15）。因此，物镜的植入仅限于观察小鼠11，13的表面和相对较大的脑区域，例如皮层6，15和背角氨1（CA1）。此外，必须吸出大面积的皮层以靶向背侧CA111，13。由于单透镜配置的限制，无法对脑深部区域成像，商用微型镜系统仅提供组合物镜/中继透镜（双透镜）设计。另一方面，V3 UCLA微型镜可以修改为单镜头或双镜头系统，因为它的物镜是可拆卸的6，11，13，15。换句话说，V3 UCLA微型镜用户可以利用可拆卸镜头，将其植入大脑（创建单镜头系统），在进行涉及浅表大脑观察的实验（深度小于2.5毫米）时，或者将其预先固定在微型镜中并在大脑中植入中继镜头（创建双镜头系统）， 在进行涉及深部大脑观察的实验时。双透镜系统也可以应用于浅表观察大脑，但研究人员必须知道物镜和中继透镜之间的精确工作距离。单镜头系统的主要优点是，与双镜头系统相比，错过工作距离的机会更低，因为需要精确定位两个工作距离才能在双镜头系统中实现最佳成像质量（图1A）。因此，我们建议使用单镜头系统进行浅表大脑观察。但是，如果实验需要在深部大脑区域成像，研究人员必须学会避免两个镜头错位。
用于实验的微型镜的双透镜配置的基本协议包括透镜植入和基底电镀8，10，16，17。基底板是将底板粘在动物的头部上，以便微型镜最终可以安装在动物的顶部，并对神经元的荧光信号进行录像（图1B）。该过程涉及使用牙科水泥将底板粘在颅骨上（图1C），但是牙科水泥的收缩会导致植入的中继透镜和物镜之间的距离发生不可接受的变化8，17。如果两个镜头之间的偏移距离太大，则无法聚焦细胞。
使用微型镜进行深部脑钙成像实验的详细方案已经发表8,10,16,17.这些协议的作者使用了Inscopix系统8,10,16 或其他定制设计17 并描述了病毒选择、手术和底板附着的实验程序。但是，它们的协议不能精确地应用于其他开源系统，例如V3 UCLA Miniscope系统，NINscope。6和芬奇镜19.在加州大学洛杉矶分校Miniscope的双镜头配置中，由于用于将底板粘合到颅骨上的牙科水泥的类型，在使用UCLA Miniscope的双镜头配置中，两个镜头可能会发生错位8,17 (图1C).需要本方案，因为植入的中继透镜和物镜之间的距离容易由于基底铺设过程中牙科水泥的不良收缩而发生偏移。在基底镀过程中，必须通过调整微型镜和继电器透镜顶部之间的距离来找到植入式中继透镜和物镜之间的最佳工作距离，然后将底板粘合在这个理想位置。在物镜和植入的中继透镜之间设置正确的距离后，可以在蜂窝分辨率（图1B; in vivo 录音）。由于中继透镜的最佳工作距离范围很小（50 - 350 μm）4,8，固化过程中水泥过度收缩会使物镜和植入的中继镜难以保持在适当的范围内。本报告的总体目标是提供一个减少收缩问题的协议8,17 在基底电镀过程中发生，并提高双透镜配置中荧光信号的微型镜记录的成功率。成功的微型镜记录被定义为记录自由行为的动物中单个神经元荧光的显着相对变化的实时流。虽然不同品牌的牙科水泥收缩率不同，但研究人员可以选择以前测试过的品牌6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22.然而，由于医疗材料的进口规定，并非每个品牌在某些国家/地区都容易获得。因此，我们开发了测试可用牙科水泥收缩率的方法，重要的是，提供了一种替代方案，可以最大限度地减少收缩问题。与目前的基底电镀方案相比，其优点是提高了使用工具和水泥进行钙成像的成功率，这可以在实验室中轻松获得。加州大学洛杉矶分校微型镜用作示例，但该协议也适用于其他微型镜。在本报告中，我们描述了一种优化的基底电镀程序，并推荐了一些安装加州大学洛杉矶分校微型镜双透镜系统（图2A).介绍了使用加州大学洛杉矶分校微型镜进行双透镜配置的成功植入示例（n = 3只小鼠）和植入失败的示例（n = 2只小鼠），并讨论了成功和失败的原因。
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Protocol
本研究中执行的所有程序均已获得国立台湾大学动物护理和使用委员会的批准（批准文号：NTU-109-EL-00029和 NTU-108-EL-00158）。
1. 牙科水泥体积变化的评估
注意：在固化过程中，牙科水泥的体积会发生变化。在植入和基底之前测试牙科水泥的体积变化。研究人员可以测试任何品牌的牙科水泥，并使用体积变化最小的品牌来粘合底板。 示例如图 3 所示。
- 称取每种牙科水泥粉0.5克，并将其与适当的溶液（1毫升）混合。
注意：牙科水泥说明书中推荐的粉末/液体比例为0.5克粉末与0.25毫升溶液以获得固体形式。该测试方案将比例稀释至0.5 g / mL，以便可以液体形式吸入混合物，以测量移液器吸头的体积变化。 - 使用 0.1-10 μL 移液器吸头去除 2.5 μL 牙科水泥混合物，然后用光固化胶密封移液器吸头。
- 将尖端放在架子上，标记牙科水泥混合物的最顶层，并在40分钟后测量牙科水泥混合物的水平（补充视频S1）。
- 除了监测牙水泥固化过程中尖端的水平变化外，还要测量剩余的干牙水泥密度。要计算密度，请测量牙科水泥的重量，并用阿基米德原理测量体积。
- 简而言之，将剩余的干牙科水泥放入装满水的杯子中，并称量溢出的水。
- 对于下面详述的所有方案，使用收缩率最小的牙科水泥。
2.麻醉、手术植入、病毒注射、假基底板
- 麻醉
注意：本报告旨在优化加州大学洛杉矶分校微型镜的手术和基底板程序;因此，假设感染目标大脑区域的最佳病毒滴度是已知的。寻找最佳病毒滴度的方法可以在Resendez等人的步骤1至5中找到。8.一旦病毒稀释度得到优化，就可以开始手术植入。- 将鼠标放入感应容器中并提供氧气（100%的气流速率为0.2 L / min）。给小鼠预充氧5至10分钟。
- 施用5%异氟醚与100%氧气（气流速率：0.2L / min）混合，直到小鼠开始失去平衡并最终被麻醉。
- 将小鼠从诱导室中取出并注射阿托品（0.04mg / kg;皮下注射），以防止唾液和丁丙诺啡（0.03mg / kg;皮下注射）作为镇痛药的积聚。
- 剃掉老鼠的头。
- 戴口罩、无菌服和手套。准备无菌空间和无菌手术器械。在立体定位装置上稳定小鼠的头部（在此步骤中用3至2.5%异氟醚维持麻醉）。镇痛和麻醉程序后，确保耳杆牢固地稳定头部。提供热支持。
- 确保头部设置在笔直位置，用甜菜碱对剃光的头部进行消毒，然后用局部镇痛药木洛卡因（10%）喷洒头部。
- 在眼睛上涂抹兽药膏以防止干燥。
注意：在所有麻醉事件中使用眼药膏保护眼睛，以防止眼部受伤。 - 通过捏住后爪来测试动物的深层疼痛反射。一旦动物没有表现出爪子撤回反射，继续进行外科手术。
- 沿颅骨矢状面中部做一个小切口（从前膛前约 2 毫米开始，到前膛后约 6 毫米结束）。然后，清洁颅骨上的结缔组织，并将三个不锈钢螺钉固定在左额骨和顶骨上。
- 此时，将异氟醚降低至1-2%。在整个手术过程中监测呼吸频率。如果呼吸频率太慢（大约1 / s，取决于动物），降低异氟醚的浓度。
- 使用尖端直径为 0.7 mm 的毛刺钻头，在手术显微镜或体视显微镜下进行中继晶状体植入的开颅手术。使用微型钻头抓住毛刺钻头并绘制预期圆形区域的轮廓（不需要穿透颅骨的整个厚度）。
注意：本协议中使用的中继透镜的直径为1.0mm，长度~9.0mm，间距为1，工作距离范围为~100μm-300μm;因此，开颅术的直径为1.2毫米。- 轻轻加深轮廓，直到硬脑膜暴露出来。
- 在 3 mL 注射器中准备 3 mL 无菌盐水，并在冰桶中冷却。经常用注射器中的 0.1 mL 盐水冲洗暴露区域，以冷却该区域并防止热损伤和出血。
- 用27克针轻轻抠开硬脑膜。
- 在距离尖端 1 毫米处的 27 G 钝针上做标记，并用它来小心地吸出大脑皮层，以便为晶状体植入创造一个窗口8，11，13，17（图 2B1）。如果需要，用砂纸研磨 27 G 注射针的尖端来制作钝针。然后，将针头连接到注射器，将注射器连接到管子，并将管子连接到吸力源以产生真空。
注意：中继透镜是钝的，当它被放入大脑深部区域时会压缩脑组织。因此，皮质的抽吸减少了由于中继晶状体植入而导致的组织损伤。小鼠的皮层厚度约为1毫米，但在体视显微镜下难以观察。该标记创建了一个里程碑，可以比单独使用体视显微镜更精确地确定针的深度。此外，可以根据阻力确定皮层区域是否已到达或通过;皮层的顶部感觉相对柔软，而皮质下区域感觉致密。因此，一旦质地开始感觉更致密，就停止抽吸（图2B3）。 - 在 3 mL 注射器中准备 3 mL 无菌盐水，并在冰桶中冷却。用生理盐水冲洗该区域以止血并减少脑水肿的可能性。
- 腺相关病毒 （AAV） 注射
注意：AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE用于本实验。jGCaMP7s是一种基因编码的钙指示剂，可发出绿色荧光3。由于本研究使用野生型小鼠作为受试者，因此需要病毒载体用绿色荧光钙指示基因转染神经元并使其表达。使用表达绿色荧光钙指示剂的转基因小鼠作为受试者的研究人员可以跳过方案2.2。- 将20 G静脉（IV）导管的内针安装到立体定位臂上，并以适当的坐标（与中继晶状体植入期间使用的相同坐标）缓慢刺穿（~100 - 200μm / min）大脑（图2B3）。
- 以 100-200 μm/min 的速度将显微注射针降低到腹侧 CA1 中，并将 （~ 25 nL/min） 200 nL 的病毒载体注入目标区域（来自前膛的 -3.16 mm AP、3.25 mm ML 和 -3.50 mm DV）。
- 等待10分钟，让病毒扩散并尽量减少回流。
- 取出（~100-200μm/min）显微注射针。
- 中继透镜植入
- 用75%酒精10，16消毒继电器镜头，然后用无热原盐水冲洗。将晶状体浸泡在冷的无热原盐水中直至植入。
注意：冷镜片在放入大脑时可最大限度地减少脑水肿。 - 使用微型斗牛犬夹（图2B3）握住继电器透镜，其齿已用热缩管覆盖。
注意：斗牛犬夹可以牢固地固定镜头而不会损坏它。参考Resendez等人8，了解制作管子覆盖的斗牛犬夹的方法。 - 缓慢地将中继透镜放在目标区域（距前膛的-3.16 mm AP，3.50 mm ML和-3.50 mm DV）的顶部，并用牙科水泥将其稳定。
- 用75%酒精10，16消毒继电器镜头，然后用无热原盐水冲洗。将晶状体浸泡在冷的无热原盐水中直至植入。
- 假基底电镀
注意：植入手术期间“假基底”的目的是创建一个牙科水泥基底，以减少几周后在实际基底铺设过程中需要应用的牙科水泥量。通过这种方式，牙科水泥体积变化的风险被降至最低。- 将物镜固定在微型镜的底部，并将底板组装到微型镜上（在此步骤中，固定物镜、底板和微型镜的组件尚未放置在鼠标的头骨上）。
- 在底板外侧包裹10厘米的石蜡膜（图4A）。
- 使用可重复使用的粘土用立体定位臂探头握住微型镜。
- 将物镜对准中继透镜顶部，镜头之间的空间尽可能小（图4B）。
- 使用牙科水泥固定底板的定位（使水泥仅接触石蜡膜）。
- 牙科水泥干燥后，取下薄膜。
- 卸下底板和微型内窥镜。牙科水泥基体是中空的（图4B）。
- 为了保护继电器镜头免受日常活动和被鼠标划伤，请用一些模压硅橡胶密封继电器镜头，直到继电器镜头被覆盖，并用一层薄薄的牙科水泥覆盖硅橡胶（图4B）。
- 将鼠标从立体定位仪器上脱离，并将鼠标放入恢复室。
- 注射卡洛芬（5毫克/千克;皮下注射）或美洛昔康（1毫克/千克;皮下注射）镇痛和头孢他啶（25毫克/千克;皮下注射）预防感染。
注意：使用抗生素不能替代无菌技术。围手术期抗生素（即头孢他啶）可能适用于某些情况，例如长时间手术或放置慢性植入物。 - 观察动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
- 单独饲养小鼠并注射美洛昔康（1mg / kg;皮下注射;q24h）一周以缓解术后疼痛。手术后每天检查动物，确保其正常进食、饮水和排便。
- 3 周或更长时间后进行基底铺。
3. 基底电镀
注意：通常，由于回收和病毒孵育时间，基底铺板程序（图5）无法在初始程序的2-3周内进行。基底电镀的诱导程序类似于步骤2.1.1至2.1.8中描述的程序。然而，基底铺不是侵入性手术，动物只需要轻度镇静。因此，只要动物不能在立体定位框架上移动，0.8-1.2%异氟醚就足够了。此外，相对较轻的异氟醚麻醉也有助于促进监测期间 神经元荧光瞬变的表达8（补充视频S2）。
- 用骨架小心地切割牙科水泥屋顶的薄层，然后去除硅橡胶。用 75% 的酒精清洁继电器镜头的表面。
- 将固定螺钉固定在底板旁边，将其固定到微型内窥镜的底部（图 5A1）。
注意： 底板必须牢固地拧紧在微型内窥镜底部下方，因为拧紧和轻紧的底板之间的差异可能会导致距离不一致。 - 将焦点滑块调整到距主外壳约 2.7 - 3 mm（图 5A2）。
注意：虽然在基底电镀过程中可以进一步调整长度，但请将其固定为约2.7 mm，因为同时调整微型镜长度和植入式中继透镜和预锚定物镜之间的最佳长度非常混乱。 - 将微型内窥镜连接到数据采集板，并将其插入计算机上的USB 3.0（或更高版本）端口。
- 运行加州大学洛杉矶分校团队开发的数据采集软件。
- 将曝光调整为 255，将增益调整为 64x，将激励 LED 调整为 5%。建议将这些设置用于初始基底板;具体设置将根据大脑区域和基因编码钙指示剂的表达水平而有所不同。
- 单击 “连接 ”按钮，将微型内窥镜连接到数据采集软件并观看直播。
- 用手将微型物镜对准中继镜，并开始搜索荧光信号（图5B1）。
注意：最初，手动搜索荧光信号有助于调整。由于使用AAV系统表达基因编码的钙指示剂，启动子类型和AAV血清型都会影响转染效率23，24。研究人员应该需要通过找到显示荧光变化的单个神经元来检查钙指示剂的表达，然后再进行未来的实验。 - 在阻挡微型镜的任何地方钻牙科水泥（可选）。
- 观看数据采集软件的实时流，并使用中继镜头的边距作为地标（补充视频S2）。接力镜头的边距在显示器上显示为类似月亮的灰色圆圈（图5B1;白色箭头）。
- 找到中继透镜后，仔细调整微型镜的各种角度和距离，直到找到荧光信号。
注意：神经元的图像比背景更白。精确的神经元形状表明神经元完美地位于中继透镜的焦平面上。圆形神经元表明它们靠近焦平面。整个大脑的神经元形状是不同的，这里以腹侧CA1为例。 - 如果没有单个神经元显示荧光随时间的变化，请用硅橡胶重新密封基座。未观察到荧光，因为潜伏期也取决于病毒23，24的性质。再过一周后执行步骤 3.1-3.12。（这是可选的）。
- 将微型镜保持在最佳位置，并用可重复使用的粘土将立体定位臂移向微型镜（图 5B2）。用可重复使用的粘土将微型镜粘附在立体定位臂上。
- 稍微调整 x、y 和 z 臂以搜索最佳视图（补充视频 S2）。接下来，通过在z轴上转动耳杆，齿条或可重复使用的粘土来调整物镜和中继镜表面之间的角度。当至少一个细胞显示荧光瞬变时，病毒表达和晶状体植入成功（图6A;补充视频S2）在基底铺层期间（这也取决于大脑的区域，例如CA1）。
注：如果显示器仅显示白色单元格而没有瞬变，则还有其他原因（请参阅 图 6B，C、补充视频 S4、S5、结果部分和故障排除部分）。 - 用牙科水泥粘合底板（图5B2）。
- 在固井过程中监测感兴趣的区域，以确保最佳位置不会改变。
- 使用尽可能少的水泥，同时仍然将底板牢固地粘在牙科水泥底座上（图 5B2）。在底板周围涂上第二层和第三层水泥，但要注意不要影响GRIN透镜。
注意：在此步骤中，将水泥涂在底板上更容易，因为底板的底座是在虚拟电镀过程中形成的。 - 水泥固化后，小心地将微型镜从底板上拆下。然后，拧上保护盖。
- 将动物移至恢复笼中。观察动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
- 单独饲养老鼠。确保每天正常进食、饮水和排便。等待5天，让小鼠完全恢复，然后检查钙成像。
注意：只有少量的牙科水泥固定底板。因此，如果底板自基底铺设程序以来发生了很大偏移，请用钻头取出牙科水泥，然后再次执行底板程序。 - 麻醉（通过腹膜内注射氯胺酮（87mg / kg）/甲苯噻嗪（13mg / kg）混合物）并在所有实验完成后灌注25 动物。
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Representative Results
牙科水泥体积变化的评估
由于牙科水泥的体积在固化过程中会发生变化，因此可能会显着影响成像质量，因为GRIN透镜的工作距离约为50至350μm4，8。因此，在这种情况下，在植入和基底铺设程序之前测试了两种市售牙科水泥，Tempron和Tokuso（图5）。首先评估视频以确定水泥是否收缩，然后在完全干燥时比较水泥的体积。将相同浓度和体积的牙科水泥初始混合物装入移液器吸头并录像（补充视频S1）。视频S1展示了两种水泥在干燥过程中都收缩。Tokuso的表现优于Tempron（即，即使在收缩后，它的体积也比Tempron大）： 图3B;坦普龙的平均体积：0.93 ± 0.07 mL;德庄的平均体积：1.18 ± 0.07 mL;t检验：p = 0.048，t（6） = 2.46，表明它缩小得较小。完全干燥后，水泥的密度也进行了4次测试。德创的平均密度低于Tempron（Tempron的平均密度：1.07 ± 0.12 g/mL;Tokuso的平均密度：0.93 ± 0.08 g/mL;t检验：p = 0.38，t（6） = -0.94），这意味着其收缩率较低。因此，Tokuso用于以下植入和基底铺设步骤。描述上述实验的目的不是推荐任何品牌，而是提醒实验者找到固化时体积变化不大的牙科水泥。
图像偏移的测量
我们在固定物体上模拟了虚拟基底电镀和原始基底电镀程序，以研究假基底电镀程序是否会导致底板位置的偏移小于原始程序。使用光固化粘合剂将23 G 2.5 cm注射器针头固定在底板的中心，从底板伸出1 cm（图3C）。然后，通过用立体定位仪器的臂握住针来模拟基底板。没有使用实验动物，而是在立体定位仪器的桌子上贴上了贴纸。注射器针刺穿贴纸，从而代表原始位置。然后，将针头抬高0.5毫米并开始模拟手术。在模仿一次性基底板程序8的手术中，应用牙科水泥直到覆盖底板，底板在贴纸上方1厘米处。然后，等待水泥固化2小时，然后轻轻推动针头再次刺穿贴纸。由于光固化粘合剂不能完全稳定针头，因此可以将针头推得更深以形成另一个孔，代表牙科水泥干燥后底板的位置。测量第一个孔和第二个孔之间的距离以量化针的位置偏移。结果表明，颅骨上方1厘米的底板导致1.76±0.14毫米的位置偏移，但假基底板仅导致0.75±0.17毫米的偏移（图3D;一次性基底板与虚拟基底板的平均移位距离;t检验：p < 0.01，t（8） = 6.03）。
此外，我们很好奇牙科水泥的高度是否会影响这种转变。因此，我们通过使用一次性基底电镀程序进一步测试了较短的高度（图3E;上文0.5厘米）。锚定在颅骨上方0.5厘米的底板明显小于底板在头骨上方1厘米处的移动（图3F;平均移位距离：0.43±0.11 vs 1.76 ± 0.14毫米;t检验：p < 0.01，t（8） = 9.73）。数据表明，底板在颅骨上方的高度与底板移动的距离呈正相关。由于虚拟基底镀程序之后是仅使用最少量的牙科水泥的第二个基底电镀步骤，因此该数据也支持假基底镀有助于提高基底程序精度的假设。
使用双镜头微型镜系统成像
通过遵循病毒输注，假基底铺和基底铺板的手术方案（图2，图4，图5），我们观察到三只小鼠（n = 3 / 5）（图6A，补充视频S3）中单个神经元的荧光瞬变在基底接种过程中和基底电镀程序之后，当小鼠自由移动时，确认物镜和中继透镜之间的工作距离保持不变（图6A1与图6A3相比，在牙科水泥完全干燥后，仅发生了轻微的位置变化。在这里，我们提供了一只小鼠基底板的视频（补充视频S2;小鼠#5）以及小鼠自由移动时的随后钙成像（补充视频S3;小鼠#3，#4，#5;原始数据）。请注意，V3的数据采集软件不包含背景减法功能，可以通过离线处理提高视频的对比度）。对于补充视频S2，对荧光信号进行手动搜索，然后将微型镜连接到立体定位臂上进行微调。在探测过程中观察到一些荧光瞬变（补充视频S2;图6A）。瞬态是灰色或白色斑点亮度的平滑变化，而不是类似于闪光灯的触发模式;图6A1至6A2显示了瞬态图像。在基底铺板过程中，与感兴趣区域相比，自由行为小鼠的视频显示出可接受的空间偏移（补充视频S3）。在这个阶段，细胞的边缘无法显着改善，因为我们无法调整中继透镜底部和活动神经元之间的距离。值得注意的是，在基底电镀过程中可能经常出现一些问题，包括除了统一的背景外没有任何问题（图6B;补充视频S4）或无荧光瞬变的白细胞边缘可见度（图6C;补充视频S5）。还提供了两个阴性结果的示例（n = 2/5）（图6B，C，补充视频S4，S5）。失败的潜在原因在“讨论”部分中进行检查。这两只小鼠的外科手术是在不使用直径为1毫米的针清除通路的情况下进行的;因此，直接植入了中继透镜。我们提出，在小鼠#2中，中继透镜可能压缩了神经元并向下拖动了一些神经元，导致神经元受损。因此，未发现荧光瞬变。
图1：微型镜的机制和通常导致成像失败的缺陷 。 （A）中继透镜和物镜的卡通图，显示了在双透镜系统中可视化荧光细胞所需的机制。每个晶状体的信号波强调了寻找工作距离以可视化荧光细胞的重要性和所涉及的机制。（答1）中继GRIN透镜放置在工作距离内的目标神经元上方。由于中继透镜的间距为0.5*N（其中N为整数），因此该透镜通过中继光实现目标神经元的可视化，将原始荧光信号带到中继透镜的顶部。然后，大约1/4的全正弦周期的光穿过物镜GRIN透镜（~0.25间距）并产生放大的图像。（答2）物镜将图像传输到位于微型镜顶部（图中的绿色板）的互补金属氧化物半导体（CMOS）传感器。（B）卡通图，展示了（B1）双镜片系统和（B2）单镜片系统在GRIN晶状体植入过程中的差异。一般来说，主要区别在于单透镜系统直接使用其物镜对大脑表面进行成像;因此，物镜需要植入目标神经元的顶部。（C）相比之下，在双透镜系统中，相比之下，在大脑中植入了一个额外的中继透镜，并且物镜预先锚定在微型镜中。（C1）加州大学洛杉矶分校Miniscope的V3版本底板的形状可能会导致牙科水泥完全干燥后不均匀的移动。（C2）这种偏移会导致中继透镜和物镜之间的工作距离错位或偏差。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：修改后的方案和详细的手术方案，以提高双透镜微型镜系统的成功率。 （答1）修改了双镜片系统的手术方案。显示了病毒注射和中继GRIN晶状体植入的位置。虚拟基底板允许工作距离准确地包含感兴趣的神经元，并减少与（A2）基底电镀程序相关的位置移动。因此，（A3）在自由行为的小鼠中成像荧光细胞的可能性增加。（B）病毒注射步骤的卡通图像，以及GRIN镜头的接力放置。（地下一）首先，用笔标记吸液针（用于小鼠实验）距离尖端约1毫米，以帮助评估皮层抽吸深度。然后，从大脑中吸出结缔组织和皮层（小鼠约1毫米深）。（地下2层）以腹侧海马体为目标区域植入中继晶状体;值得注意的是，坚韧的胼胝体是停止皮质区域抽吸的标志。在抽吸过程中，可以在体视显微镜下看到胼胝体的纤维质地。（地下3层）其次，在病毒输注前，用 20 G 导管的内针（直径约 1 mm;直径与中继透镜相似）刺穿兴趣点以清除通路。在体视显微镜下，针头产生的凹痕（图片中的虚线圆圈）应该是可见的。降低凹痕处的显微注射针和中继透镜（或距离凹痕中心仅 250 μm）。最后，放置中继GRIN透镜（在本研究中，我们使用直径为1毫米的中继透镜）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：固化牙科水泥体积变化的测量 。 （A）以两个品牌的固化牙科水泥为例。黑色箭头表示我们混合粉末和溶液后的原始水平。白色箭头表示固化10，20和40分钟后的水平。红色箭头指向尖端的底部，这些尖端用光固化胶密封。（B）完全干燥后剩余牙科水泥的平均体积。条形和误差线是 SEM ±平均值。* 表示由学生 t 检验确定的显著性 （P < 0.05）。（C） 说明用于测量底板位置偏移的方法的插图和照片。将针粘在底板上，用于模拟原始底板程序（一步基底）和虚拟基底程序。红色和黑色箭头代表牙科水泥固化前后针的位置。（D）针尖的平均距离变化 （E）用于测量颅骨水平以上底板与位置偏移之间关系的方法图示。（F）针尖的平均距离变化。条形和误差线是 SEM ±平均值。** 表示由学生 t 检验确定的显著性 （P < 0.01）。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：详细的假基底电镀程序（在中继透镜植入后立即执行）。 （A1） 微型镜上物镜、底板和石蜡薄膜组件的三步卡通。（答2）程序集的照片版本。（地下一）显示假基底电镀程序的卡通。首先，组装好的微型镜与中继透镜对齐。物镜的位置尽可能靠近中继透镜。其次，将牙科水泥添加到底板周围的封口膜中，并涂在头骨上，以制作用于将来基底镀的女性模具。然后，取下底板，加入成型硅橡胶（粉红色）并用牙科水泥覆盖，以保护母模和中继透镜。然后让动物从麻醉中恢复。至少3周后，进行基底铺程序。（地下2层）（B1）的照片版本。请点击此处查看此图的大图。
图 5：基底电镀程序的步骤。 （答1）安装底板，然后 （A2） 手动将对焦滑块调整到 2.7 至 3 mm。在手动搜索荧光细胞之前，2.7至3毫米（在图片所示的位置）的设置似乎是最好的起点。（地下一）第一张卡通图说明了物镜和中继透镜之间的长度对于荧光细胞可视化的重要性（荧光细胞通常在0.5到2毫米之间的距离处观察到）。在荧光细胞出现之前，研究人员应该看到中继透镜的边缘（上图中的箭头）。首先手动将镜头调整到最佳观看位置会很有帮助，因为手动进行快速调整更容易。（地下2层）将可重复使用的粘土放在立体定位臂探头上，然后用可重复使用的粘土将其粘附在臂上来稳定微型镜。在这个阶段，感兴趣的区域可能已经移动，但这可以通过稍微调整立体定位臂和可重复使用的粘土来轻松修复。检查并找到感兴趣的最佳区域后，添加少量牙科水泥（以红色表示）。用尽可能少的牙科水泥粘合底板。牙科水泥干燥后，将微型镜和底板分开。如果底板不够稳定，请添加额外的牙科水泥。（C）这张图说明了每一步对取得成功的重要性。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：基底电镀过程中的成功和失败示例。 （A）基底电镀过程中成功成像的示例。中继透镜针对腹侧海马体。当动物用异氟醚麻醉时，注意到荧光瞬变（另见补充视频S2）。（答2）对比度增加以获得更好的可见性。红色虚线表示血管。（答3）基底接种五天后，当小鼠在其笼子中自由行为时，荧光瞬变（另见补充视频S3;补充视频S3中也提供了小鼠#3和#4的图像）。只是位置发生了轻微变化。（地下一）失败的示例。在基底镀过程中，仅注意到形状不呈细胞状的均匀白色/灰色区域（另见补充视频S4）。（地下2层）中继透镜错过了目标区域，位于没有感染细胞的区域上方。（C1）另一个失败的例子。在这只小鼠中，尽管观察到许多圆形细胞，但在基底接种期间（孵育三周后和小鼠麻醉/镇静时）未观察到荧光瞬变。此外，当再次进行基底铺层程序（在孵育的第五周）甚至当动物行为自由时，没有保留荧光瞬变。该图像是在孵育第五周的基底接种期间获得的（另见补充视频S5）。（C2 和 C3）中继透镜错过了腹侧海马体的锥体层。蓝点是用DAPI染色的细胞核。请点击此处查看此图的大图。
| 问题 | 可能的原因 | 溶液 | ||
| 基底镀时成像良好，但第二天完全失焦 | 固化受试者头骨和底板之间的牙科水泥时的体积变化 | 按照本报告的建议，在晶状体植入手术后进行“假基底电镀”。选择体积变化较小的牙科水泥。 | ||
| 在基底镀过程中具有均匀的白色/灰色区域，没有任何细胞状形状（另见补充视频S4） | 一个。中继透镜未击中目标区域 B.荧光指示剂表达不良 C.忘记在实际表达荧光指示剂的微型镜下方安装物镜 | A.使用假镜片进行手术。在练习植入后检查假透镜的坐标 B.找到钙成像实验的最佳病毒滴度（参考Resendez等人，2016）。如果由于某种原因无法进行预测试，我们建议初学者先尝试更高的滴度。（详见讨论部分） C. 拧上物镜 GRIN 透镜（~ 0.25 间距，例如：爱特蒙特光学;库存 #64-519）在微型镜的底部。 | ||
| 观察许多细胞，但在基底接种过程中没有荧光动力学 | A. 不健康的神经元或死亡的神经元 B. 稀疏精细型神经元 C. 深度麻醉状态 | A.每次外科手术都要小心。使用与中继镜片直径相似的新注射针头首先切割输液/植入路径，以通过晶状体植入释放压力。慢慢注入病毒，慢慢植入晶状体。B.等待较长时间以监测神经元的活动或稍微捏一下尾巴以刺激小鼠。C.基底板不是侵入性手术，动物只需要镇静。因此，维持1.2~0.8%异氟醚就足够了，只要动物不能在立体定位框架上移动。 | ||
表 1：故障排除图表。
补充视频S1：牙科水泥体积测试。 在牙科水泥制备开始时测量体积与水泥干燥后的体积之间的差异。测试了两种品牌的牙科水泥（例如Tempron和Tokuso Curefast）。为了测试牙科水泥干燥后的体积，称取每种牙科水泥粉0.5g并与其适当的溶液（1mL）混合。然后，将0.1-10 μL移液器吸头装入2.5 μL牙科水泥混合物，并用光固化胶密封。然后，将尖端放在架子上，标记牙科水泥混合物的表面，并录像40分钟。 请点击此处下载此视频。
补充视频 S2：底镀程序演示。 通过在z轴上转动耳杆、齿条或可重复使用的粘土来调整物镜和中继透镜表面之间的角度。中继镜头的边缘在显示器上显示为类似月亮的灰色圆圈。成功的病毒表达和晶状体植入应在基底接种过程中显示至少一种荧光动态（箭头）。 请点击此处下载此视频。
补充视频S3：自由行为小鼠的荧光动力学演示。 来自小鼠#3，#4和#5的荧光瞬变。 请点击此处下载此视频。
补充视频 S4：失败示例。 在底板过程中出现了统一的背景。请注意，亮度的变化不是因为单个细胞的荧光瞬变;这是由搜索程序引起的。 请点击此处下载此视频。
补充视频 S5：演示另一个故障示例。 在基底电镀过程中没有荧光瞬变，但一些圆形细胞边缘仍然可见。请注意，亮度的变化不是由单个细胞的荧光瞬变引起的;这是由搜索程序引起的。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
本报告描述了使用双镜头加州大学洛杉矶分校Miniscope系统的研究人员的详细实验方案。对于任何希望尝试体内钙成像的实验室来说，我们协议中设计的工具相对实惠。一些方案，如病毒注射、晶状体植入、假基底板和基底板，也可用于其他版本的微型镜系统，以提高钙成像的成功率。除了病毒注射和镜头植入的普遍问题（无论微型镜版本如何）都需要固定外，UCLA底板的结构可能会导致位置偏移，这可能导致物镜和中继透镜之间的工作距离不匹配（图1C）。开发了一种改进的实验方案，以最小化两个镜头的位置偏移（图2，图4，图5）。成功的钙成像可以通过成功的病毒表达、晶状体植入和基底电镀程序的组合来实现（图5C）。使用双透镜系统观察大脑深部区域需要在基底电镀过程中具有很高的精度，因为植入式中继透镜和物镜的相对位置也需要准确。本报告不仅提出了解决基底镀问题的方案，还讨论了病毒注射和晶状体植入的一些技巧。下面，我们首先讨论基底电镀程序，然后是病毒注射和晶状体植入程序，并描述一些失败的例子（图6）。
基底电镀
加州大学洛杉矶分校Miniscope的V3版本是目前最常用的设计，可以在线订购。该版本的底板由两个没有壁的边缘组成（图1C1），但是在牙科水泥完全干燥后，其形状会导致不均匀的移动（图1C1，C2）。我们协议中的虚拟基底板程序（图 4）最大限度地减少了错位和底板移动问题，因为它使用石蜡膜来减少实际基底铺设期间牙科水泥的可用空间（图 5B）。剩余的空间仍然足以在实际基底电镀过程中找到最佳成像位置。因此，研究人员可以用尽可能少的牙科水泥粘合底板（图5B2）。此外，假基底电镀过程需要相对较少的时间（约15至20分钟），因为它不需要物镜和中继镜之间的完美距离即可实现。然而，假基底镀只是钙成像成功的关键因素之一;例如，在监测荧光信号期间，如果神经元稍微偏离工作平面，它们可能会显得模糊（取决于中继透镜的工作距离;通常约为100~300μm）。改善工作距离的能力是有限的，因为神经元的工作距离是由中继晶状体植入程序预先确定的。在没有虚拟基底板程序的情况下进行实验，并且在一次性基底接种后总是（在四只小鼠中的四只）遗漏感兴趣区域。因此，设计了这些解决方案来减少收缩问题。一些光固化牙科水泥可以避免固化过程中的收缩问题，因为它们固化得非常快;这些水泥可以帮助研究人员在基底电镀过程中调整距离。尽管激发钙指示剂和固化牙科水泥的波长范围不同，但需要防止基底电镀过程中的光漂白。为了防止光漂白，光源产生的波长范围需要相当窄，以避免钙指示剂和光固化牙科水泥之间的交叉反应。因此，不建议在基底电镀过程中使用光固化牙科水泥。此外，一些特定品牌的牙科水泥经常被其他研究团队用于粘合底板6，7，8，10，11，12，13，14，15，16，22.这些水泥的低收缩性能可能会解决问题，但由于购买（进口）困难，我们没有机会测试这些品牌。医疗级产品可能需要遵守进口法规，具体取决于国家/地区。如果研究人员难以获得文献6，7，8，10，11，12，13，14，15，16，22中提到的水泥，我们的协议将解决牙科水泥收缩问题。
除了收缩问题外，在许多实验过程中，微型镜本身和底板（尤其是基板中的磁铁）也可能发生结构磨损。磨损引起的任何小间隙都会降低两个镜头之间距离的稳定性。同样，整个光路的准确性是使用微型镜对自由行为小鼠的钙瞬变进行成像的关键。
病毒注射/晶状体植入的故障排除
在将病毒注入大脑区域之前，建议将新针头安装到立体定位臂上，并在适当的坐标处缓慢刺穿大脑。由于新针非常锋利，因此这种穿刺可作为准备步骤，为实际的显微注射针和中继透镜清除路径（或切割路径），并最大限度地减少组织损伤，这可能是由显微注射针或中继透镜的压迫引起的。锋利的针为钝接透镜切割出一条路径;因此，针尖应降低到与继电器透镜相同的坐标。选择20 G IV导管的内针，因为它的直径为1毫米，与我们的中继透镜的直径相似。根据继电器透镜的直径，可以使用不同的针规。
尽管本研究没有关注病毒载体的特性和滴度，但这些因素对于成功的钙成像仍然至关重要（图5C）。有必要预先测试病毒载体的表达质量。Resendez等人方案的步骤1至5提供了鉴定钙成像实验最佳病毒滴度的详细方法8。如果由于某种原因无法进行预测试，建议初学者先尝试相对较高的滴度。使用高病毒滴度的缺点之一缺细胞毒性8.死神经元产生自发荧光，在微型镜8下可见为明亮的白点。然而，这些死神经元是初学者寻找和练习基底铺层程序的良好地标。另一方面，尽管输注低滴度病毒杀死细胞的风险较低，但如果细胞在基底接种过程中未显示任何荧光瞬变，则荧光可能会被背景掩盖。很难确定失败的原因，因为由于中继晶状体植入或病毒载体表达不良，可能会错过目标神经元。在没有组织学证实的情况下，确定病因是非常令人困惑的。因此，如果无法对病毒载体进行预测试，建议使用相对高滴度的病毒。
Resendez等人建议将显微注射针横向和腹侧250μm插入晶状体的位置。我们的观察表明，在与中继透镜相同的深度输注病毒也可以导致良好钙信号的表达。我们建议，由于感染和传播的可能性，在与中继透镜坐标相同的深度注入病毒对于减少组织损伤和提高受感染神经元与中继透镜之间距离的准确性是最佳的。Resendez等人还建议在同一手术中进行病毒注射和晶状体植入，因为靶细胞和中继晶状体8之间的工作距离范围很窄。然而，一些研究人员遵循一种协议，其中病毒输注步骤和晶状体植入步骤相隔两周（或更长时间）进行18，26。延长步骤之间的时间可减少单个操作时间。但是在该方案中，这两个步骤合并为一个手术，因为在一次手术方案中，外科医生可以在将显微注射针和中继透镜降低到目标区域时监测它们之间的位置，这减少了瞄准失败的机会（图2B3）。
对于两只小鼠（小鼠#1和#2），也省略了使用针为晶状体创建路径，并且在小鼠#2中观察到圆形细胞状灰色斑点（图6C）。然而，没有观察到荧光动力学（补充视频S5）。在检查这个例子的大脑切片（图6C2，C3）时，我们假设中继透镜在降低时拖拽了一些细胞。这些拖曳的神经元是不健康的，因此在基底铺板过程或实验过程中没有注意到任何活动。
我们有一只小鼠具有完全均匀的灰色信号，并且在基底接种过程中没有可见的细胞样图像（图6B1）。在牺牲小鼠后，观察到它的脑切片。注意到晶状体位于弯曲的锥体层的内侧;目标区域（图6B2）完全错过。这些不成功的尝试是关键的经验，导致我们修改手术方案并最终成功使用三只小鼠（补充视频S3）。
显微注射针
胼胝体是一个坚韧的纤维束，覆盖着背海马体。由于其刚度，它可以抵抗平头显微注射针的穿透。因此，我们建议使用带有斜面尖端的显微注射针。这种类型的针头不仅可以减少组织损伤，还可以减少由于附近纤维堵塞而无法将病毒注入目标区域的可能性。我们在故障排除图表中总结了上述问题（表1）。
时间框架
整个过程的时间范围总结在 图2A中，以天为单位。详细地说，手术部分（病毒注射，中继晶状体植入，假基底镀）对于初学者可能需要3小时，对于训练有素的研究人员可能需要1.5小时。小鼠体型小，新陈代谢快，比较大的物种更容易出现长时间麻醉引起的健康问题27。研究人员应致力于将手术时间保持在3小时以内。真正的基底接种可以在钙指示剂表达 3 至 6 周后进行。此过程可能需要1小时。随后的纵向钙活性观察可持续1个月以上。
结论
加州大学洛杉矶分校Miniscope是一种开源 的体内 钙成像设备。如果没有现成的预安装底板或透镜模块，进行实验的人员需要能够在基底电镀过程中准确地达到物镜和中继透镜之间的最佳距离。使用双透镜UCLA微型镜系统的难度增加在于牙科水泥的体积变化。我们优化了原有的方案，最大限度地减少了上述问题造成的缺陷，从而提高了双镜头UCLA Miniscope系统钙成像的成功率。
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Disclosures
这不是一项行业支持的研究。作者报告不存在财务利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了台湾科学技术部（108-2320-B-002 -074，109-2320-B-002-023-MY2）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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