Summary
Krympningen af tandcement under hærdning fortrænger bundpladen. Denne protokol minimerer problemet ved at skabe et indledende fundament for tandcementen, der efterlader plads til at cementere bundpladen. Uger senere kan bundpladen cementeres på plads på dette stillads ved hjælp af lidt ny cement og derved reducere krympning.
Abstract
Neuroscientists bruger miniature mikroskoper (miniscopes) til at observere neuronal aktivitet i frit opfører dyr. University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet giver åbne ressourcer til forskere til selv at bygge miniscopes. V3 UCLA Miniscope er et af de mest populære open source-miniskoper, der i øjeblikket er i brug. Det tillader billeddannelse af fluorescenstransienter, der udsendes fra genetisk modificerede neuroner gennem en objektiv linse implanteret på den overfladiske cortex (et system med en linse) eller i dybe hjerneområder gennem en kombination af en relælinse implanteret i den dybe hjerne og en objektiv linse, der er præforankret i miniskopet for at observere det videresendte billede (et to-linsesystem). Selv under optimale forhold (når neuroner udtrykker fluorescensindikatorer, og relælinsen er korrekt implanteret), kan en volumenændring af tandcementen mellem bundpladen og dens fastgørelse til kraniet ved cementhærdning forårsage forskydning med en ændret afstand mellem objektiv- og relælinserne, hvilket resulterer i den dårlige billedkvalitet. En bundplade er en plade, der hjælper med at montere miniskopet på kraniet og fastgør arbejdsafstanden mellem objektiv- og relælinserne. Således ændrer ændringer i volumenet af tandcement omkring bundpladen afstanden mellem linserne. Denne protokol har til formål at minimere forskydningsproblemet forårsaget af volumenændringer i tandcementen. Protokollen reducerer forskydningen ved at opbygge et indledende fundament af tandcement under relælinseimplantation. Rekonvalescenstiden efter implantation er tilstrækkelig til, at fundamentet af tandcement hærder bundpladen fuldstændigt, så bundpladen kan cementeres på dette stillads ved hjælp af så lidt ny cement som muligt. I denne artikel beskriver vi strategier til baseplating i mus for at muliggøre billeddannelse af neuronal aktivitet med en objektiv linse forankret i miniskopet.
Introduction
Fluorescerende aktivitetsreportere er ideelle til billeddannelse af neuronal aktivitet, fordi de er følsomme og har store dynamiske områder 1,2,3. Derfor bruger et stigende antal eksperimenter fluorescensmikroskopi til direkte at observere neuronal aktivitet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Det første miniaturiserede en-foton fluorescensmikroskop (miniscope) blev designet i 2011 af Mark Schnitzer et al.5. Dette miniskop gør det muligt for forskere at overvåge cerebellære cellers fluorescensdynamik i dyr, der opfører sig frit5 (dvs. uden fysisk fastholdelse, nakkestøtte, sedation eller bedøvelse til dyrene). I øjeblikket kan teknikken anvendes til at overvåge overfladiske hjerneområder såsom cortex 6,8,15,16; subkortikale områder såsom dorsal hippocampus 8,11,13,14 og striatum 6,17; og dybe hjerneområder såsom ventral hippocampus 14, amygdala 10,18 og hypothalamus 8,12.
I de senere år er der udviklet flere open source-miniskoper4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskopet kan samles økonomisk af forskere, hvis de følger de trinvise retningslinjer fra University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet4,7,11,13. Fordi optisk overvågning af neural aktivitet er begrænset af begrænsningerne i lystransmission7 til og fra neuronpopulationen af interesse blev der designet et miniskop, der kræver, at en objektiv gradientbrydningsindeks (GRIN) linse (eller objektiv linse) skal forankres i bunden af miniskopet for at forstørre synsfeltet, der videresendes fra en relæ GRIN-linse (eller relælinse)6,7,8,10,16,17. Denne relælinse implanteres i målhjerneområdet, således at fluorescensaktiviteten i målhjerneområdet videresendes til overfladen af relælinsen6,7,8,10,16,17. Ca. 1/4 af en fuld sinusformet periode med lys bevæger sig gennem objektiv GRIN-linsen (~ 0,25 tonehøjde) (Figur 1A1), hvilket resulterer i et forstørret fluorescensbillede6,7. Objektivlinsen er ikke altid fastgjort i bunden af miniskopet, og implantation af relælinsen er heller ikke nødvendig6,7,11,13,15. Specifikt er der to konfigurationer: en med en fast objektiv linse i miniskopet og en relælinse implanteret i hjernen8,10,12,14,16 (Figur 1B1) og en anden med kun et aftageligt objektivobjektiv6,7,11,13,15 (Figur 1B2). I designet baseret på kombinationen af det faste objektiv og implanterede relælinse bringes fluorescenssignalerne fra hjernen til relælinsens øverste overflade (Figur 1A1)7,8,10,12,14,16. Derefter kan objektivlinsen forstørre og transmittere synsfeltet fra relælinsens øverste overflade (Figur 1A2). På den anden side er det aftagelige objektive GRIN-linsedesign mere fleksibelt, hvilket betyder, at præimplantation af en relælinse i hjernen ikke er obligatorisk (Figur 1B2)6,7,11,13,15. Når du bruger et miniskop baseret på et aftageligt objektivlinsedesign, skal forskere stadig implantere en linse i målhjerneområdet, men de kan enten implantere en objektiv linse6,7,11,13,15 eller en relælinse i hjernen6,7. Valget af et mål eller en relælinse til implantation bestemmer den miniskopkonfiguration, som forskeren skal bruge. For eksempel er V3 UCLA Miniscope baseret på et aftageligt objektiv GRIN-objektivdesign. Forskere kan vælge enten direkte at implantere en objektiv linse i hjerneområdet af interesse og montere det "tomme" miniskop på objektivlinsen6,7,11,13,15 (et system med én linse; Figur 1B2) eller til at implantere en relælinse i hjernen og montere et miniskop, der er præforankret med en objektiv linse6,7 (et system med to linser; Figur 1B1). Miniskopet fungerer derefter som et fluorescenskamera til at fange livestream-billeder af neuronal fluorescens produceret af en genetisk kodet calciumindikator1,2,3. Når miniskopet er tilsluttet en computer, kan disse fluorescensbilleder overføres til computeren og gemmes som videoklip. Forskere kan studere neuronal aktivitet ved at analysere de relative ændringer i fluorescens med nogle analysepakker20,21 eller skriv deres koder til fremtidig analyse.
V3 UCLA Miniscope giver brugerne fleksibilitet til at bestemme, om neuronal aktivitet skal afbildes med et system med et eller to linser7. Valget af registreringssystem er baseret på dybden og størrelsen af målhjerneområdet. Kort sagt kan et system med ét objektiv kun afbilde et område, der er overfladisk (mindre end ca. 2,5 mm dybt) og relativt stort (større end ca. 1,8 x 1,8 mm2), fordi producenterne kun producerer en vis størrelse objektivobjektiv. I modsætning hertil kan et to-linse system anvendes på ethvert mål hjerneområde. Imidlertid har tandcementen til limning af bundpladen tendens til at forårsage forkert justering med en ændret afstand mellem objektiv- og relælinserne, hvilket resulterer i en dårlig billedkvalitet. Hvis systemet med to objektiver anvendes, skal to arbejdsafstande målrettes præcist for at opnå den optimale billedkvalitet (figur 1A). Disse to kritiske arbejdsafstande er mellem neuronerne og den nederste overflade af relælinsen og mellem relælinsens øverste overflade og objektivlinsens nederste overflade (figur 1A1). Enhver forkert justering eller forkert placering af objektivet uden for arbejdsafstanden resulterer i billedfejl (figur 1C2). I modsætning hertil kræver systemet med ét objektiv kun én præcis arbejdsafstand. Imidlertid begrænser objektivlinsestørrelsen dens anvendelse til overvågning af dybe hjerneområder (objektivlinsen, der passer til miniskopet, er ca. 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Derfor er implantation af en objektiv linse begrænset til observation af overfladen og relativt store hjerneområder, såsom cortex6,15 og dorsal cornu ammonis 1 (CA1) hos mus11,13 . Derudover skal et stort område af cortex aspireres for at målrette dorsal CA111,13. På grund af begrænsningen af konfigurationen med én linse, der forhindrer billeddannelse af dybe hjerneområder, tilbyder kommercielle miniskopsystemer kun et kombineret objektivobjektiv/relæobjektiv (to-linse) design. På den anden side kan V3 UCLA miniscope ændres til enten et et-linse eller to-linse system, fordi dets objektiv linse er aftagelig 6,11,13,15. Med andre ord kan V3 UCLA miniscope-brugere drage fordel af den aftagelige linse ved at implantere den i hjernen (skabe et system med en linse), når de udfører eksperimenter, der involverer overfladiske hjerneobservationer (mindre end 2,5 mm i dybden) eller ved at forankre det i miniskopet og implantere en relælinse i hjernen (skabe et to-linsesystem), når du udfører eksperimenter, der involverer dybe hjerneobservationer. To-linsesystemet kan også anvendes til overfladisk observation af hjernen, men forskeren skal kende de nøjagtige arbejdsafstande mellem objektivlinsen og relælinsen. Den største fordel ved systemet med ét objektiv er, at der er en mindre risiko for at overskride arbejdsafstandene end med et system med to objektiver, da der er to arbejdsafstande, der skal målrettes præcist for at opnå optimal billedkvalitet i systemet med to objektiver (figur 1A). Derfor anbefaler vi at bruge et system med én linse til overfladiske hjerneobservationer. Men hvis eksperimentet kræver billeddannelse i det dybe hjerneområde, skal forskeren lære at undgå forkert justering af de to linser.
Den grundlæggende protokol for to-linse konfiguration af miniskoper til eksperimenter omfatter linseimplantation og baseplating 8,10,16,17. Baseplating er limning af en bundplade på et dyrs hoved, så miniskopet til sidst kan monteres oven på dyret og videobånd fluorescenssignalerne fra neuroner (figur 1B). Denne procedure involverer brug af tandcement til at lime bundpladen på kraniet (figur 1C), men krympning af tandcement kan forårsage uacceptable ændringer i afstanden mellem den implanterede relælinse og objektivlinsen 8,17. Hvis den forskudte afstand mellem de to linser er for stor, kan cellerne ikke bringes i fokus.
Detaljerede protokoller for dybe hjernekalciumbilleddannelseseksperimenter ved hjælp af miniskoper er allerede blevet offentliggjort8,10,16,17. Forfatterne af disse protokoller har brugt Inscopix-systemet8,10,16 eller andre tilpassede designs17 og har beskrevet de eksperimentelle procedurer for viral udvælgelse, kirurgi og baseplate fastgørelse. Imidlertid kan deres protokoller ikke anvendes præcist på andre open source-systemer, såsom V3 UCLA Miniscope-systemet, NINscope6og Finchscope19. Forkert justering af de to linser kan forekomme under optagelsen i en to-linsekonfiguration med et UCLA Miniscope på grund af den type tandcement, der bruges til at cementere bundpladen til kraniet8,17 (Figur 1C). Den nuværende protokol er nødvendig, fordi afstanden mellem den implanterede relælinse og objektivlinsen er tilbøjelig til at skifte på grund af uønsket krympning af tandcement under baseplatingproceduren. Under bundplettering skal den optimale arbejdsafstand mellem det implanterede relæobjektiv og objektivlinsen findes ved at justere afstanden mellem miniskopet og toppen af relælinsen, og bundpladen skal derefter limes på dette ideelle sted. Når den korrekte afstand mellem objektivlinsen og den implanterede relælinse er indstillet, kan der opnås længdemålinger ved cellulær opløsning (Figur 1B; in vivo optagelse). Da det optimale arbejdsområde for en relælinse er lille (50 - 350 μm)4,8, kan overdreven cementkrympning under hærdning gøre det vanskeligt at holde objektivlinsen og den implanterede relælinse inden for det passende område. Det overordnede mål med denne rapport er at tilvejebringe en protokol til reduktion af krympeproblemerne8,17 , der forekommer under baseplating-proceduren og for at øge succesraten for miniskopoptagelser af fluorescenssignaler i en to-linsekonfiguration. Vellykket miniskopoptagelse defineres som optagelse af en livestream af mærkbare relative ændringer i fluorescensen af individuelle neuroner i et dyr, der opfører sig frit. Selvom forskellige mærker af tandcement har forskellige krympningshastigheder, kan forskere vælge et mærke, der tidligere er testet6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Imidlertid er ikke alle mærker lette at få i nogle lande / regioner på grund af importreglerne for medicinske materialer. Derfor har vi udviklet metoder til at teste krympningshastighederne for tilgængelige tandcementer og, vigtigst af alt, give en alternativ protokol, der minimerer krympningsproblemet. Fordelen i forhold til den nuværende baseplating-protokol er en stigning i succesraten for calciumbilleddannelse med værktøjer og cement, der let kan opnås i laboratorier. UCLA-miniskopet bruges som eksempel, men protokollen gælder også for andre miniskoper. I denne rapport beskriver vi en optimeret baseplating-procedure og anbefaler også nogle strategier til montering af UCLA-miniscope-to-linsesystemet (Figur 2A). Både eksempler på vellykket implantation (n = 3 mus) og eksempler på mislykket implantation (n = 2 mus) til to-linsekonfigurationen med UCLA-miniskopet præsenteres sammen med diskussionerne om årsagerne til succeser og fiaskoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer udført i denne undersøgelse blev godkendt af National Taiwan University Animal Care and Use Committee (godkendelsesnr.: NTU-109-EL-00029 og NTU-108-EL-00158).
1. Vurdering af volumenændringen af tandcement
BEMÆRK: Ændringer i mængden af tandcement forekommer under hærdningsprocessen. Test volumenændringerne af tandcement før implantation og baseplating. Forskere kan teste ethvert mærke af tandcement og bruge mærket med den laveste volumenændring til at cementere bundpladen. Et eksempel er vist i figur 3.
- Der afvejes 0,5 g af hvert tandcementpulver og blandes med dets passende opløsning (1 ml).
BEMÆRK: Det anbefalede pulver/væske-forhold i tandcementinstruktionerne er 0,5 g pulver til 0,25 ml af opløsningen for at opnå en fast form. Denne testprotokol fortynder forholdet til 0,5 g/ml, så blandingen kan aspireres i flydende form for at måle volumenændringen i pipettespidserne. - Brug 0,1-10 μL pipettespidser til at fjerne 2,5 μL af tandcementblandingen, og forsegl derefter pipettespidsen med en let hærdende lim.
- Placer spidserne på en rist, markér de øverste niveauer af tandcementblandingen, og mål niveauet af tandcementblandingen efter 40 min (supplerende video S1).
- Ud over at overvåge niveauændringerne under tandcementhærdningen i spidserne måles den resterende tørre tandcementdensitet. For at beregne densiteten skal du måle vægten af tandcementen og måle volumenet med Archimedes 'princip.
- Kort sagt, læg den resterende tørre tandcement i en kop fyldt med vand, og vej vandet, der løber over.
- Brug tandcementen med mindst krympning til alle nedenstående protokoller.
2. Anæstesi, kirurgisk implantation, viral injektion og dummy baseplating
- Anæstesi
BEMÆRK: Denne rapport har til formål at optimere operations- og baseplatingproceduren for UCLA-miniscope; Derfor blev det antaget, at den optimale virale titer til infektion af målhjerneområderne var kendt. Metoderne til at finde den optimale virale titer findes i trin 1 til 5 i Resendez et al.8. Når den virale fortynding er optimeret, kan kirurgisk implantation påbegyndes.- Placer musen i en induktionsbeholder og giv ilt (100% ved en luftstrømshastighed på 0,2 l / min). Foroxygener musen i 5 til 10 minutter.
- Administrer 5% isofluran blandet med 100% ilt (luftmængde: 0,2 l / min), indtil musen begynder at miste balancen og til sidst bedøves.
- Fjern musen fra induktionskammeret og injicer atropin (0,04 mg/kg; subkutan injektion) for at forhindre akkumulering af spyt og buprenorphin (0,03 mg/kg; subkutan injektion) som smertestillende middel.
- Barber musens hoved.
- Brug en maske, steril kjole og handsker. Forbered et sterilt rum og sterile kirurgiske instrumenter til kirurgi. Stabiliser musens hoved (bevar anæstesi med 3 til 2,5% isofluran under dette trin) på stereotaksiapparatet. Efter smertestillende og anæstetiske procedurer skal du sørge for, at ørestængerne stabiliserer hovedet sikkert. Giv termisk støtte.
- Sørg for, at hovedet er sat i en lige position, steriliser det barberede hoved med betadin, og sprøjt derefter hovedet med xylocain (10%), et lokalt smertestillende middel.
- Påfør veterinærsalve på øjnene for at forhindre tørhed.
BEMÆRK: Brug oftalmisk salve til øjenbeskyttelse under alle bedøvelseshændelser for at forhindre øjenskade. - Test dyrets dybe smerterefleks ved at klemme bagpoten. Når dyret ikke viser nogen poteudtagningsrefleks, skal du fortsætte med kirurgiske procedurer.
- Lav et lille snit langs kraniets midterste sagittale plan (startende fra ca. 2 mm foran til bregma og slutter ca. 6 mm bagved bregma). Rens derefter bindevævet på kraniet, og forankr tre skruer i rustfrit stål på venstre frontale og interparietale knogler.
- På dette tidspunkt reduceres isofluran til 1-2%. Overvåg vejrtrækningshastigheden under hele den kirurgiske procedure. Hvis vejrtrækningshastigheden er for langsom (ca. 1/s, afhængigt af dyret), nedsættes koncentrationen af isofluran.
- Udfør en kraniotomi til relælinseimplantation under et kirurgisk mikroskop eller stereomikroskop ved hjælp af en burrbor med en spidsdiameter på 0,7 mm. Brug en mikrobor til at få fat i gratboret og tegne en oversigt over det tilsigtede cirkelområde (calvariets fulde tykkelse behøver ikke at blive gennemtrængt).
BEMÆRK: Relælinsen, der anvendes i denne protokol, havde en diameter på 1,0 mm, en længde ~ 9,0 mm en stigning på 1 og et arbejdsområde på ~ 100 μm - 300 μm; Derfor havde kraniotomien en diameter på 1, 2 mm.- Uddyb forsigtigt omridset, indtil dura er udsat.
- Forbered 3 ml sterilt saltvand i en 3 ml sprøjte og afkøl det i en isspand. Skyl ofte det udsatte område med 0,1 ml saltvand fra sprøjten for at afkøle området og forhindre varmeskader og blødning.
- Pluk dura let og skræl den væk med en 27G nål.
- Sæt en markering på en 27 G stump nål 1 mm fra spidsen, og brug den til forsigtigt at aspirere hjernens cortex for at skabe et vindue til linseimplantation 8,11,13,17 (figur 2B1). Lav om nødvendigt en stump nål ved at slibe spidsen af en 27 G injektionsnål ned med sandpapir. Tilslut derefter nålen til en sprøjte, tilslut sprøjten til et rør, og tilslut røret til en sugekilde for at skabe et vakuum.
BEMÆRK: Relælinsen er stump og vil komprimere hjernevævet, når det placeres i det dybe hjerneområde. Således reducerer aspiration af cortex vævsskade på grund af relælinseimplantation. Cortex er ca. 1 mm tyk hos mus, men er vanskelig at visualisere under et stereomikroskop. Mærket skaber et vartegn, der gør det muligt at bestemme nålens dybde mere præcist end med et stereomikroskop alene. Derudover kan man bestemme, om cortex-regionen er nået eller passeret afhængigt af modstanden; Den øverste del af cortex føles relativt blød, mens den subkortiske region føles tæt. Derfor, når teksturen begynder at føles tættere, skal du stoppe aspirationen (figur 2B3). - Forbered 3 ml sterilt saltvand i en 3 ml sprøjte og afkøl det i en isspand. Skyl området med saltvand for at stoppe blødningen og mindske muligheden for hjerneødem.
- Adeno-associeret virus (AAV) injektion
BEMÆRK: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE blev brugt i dette eksperiment. jGCaMP7s er en genetisk kodet calciumindikator, der udsender grøn fluorescens3. Fordi den nuværende undersøgelse brugte en vildtypemus som emne, var en viral vektor nødvendig for at transfektere neuronerne med det grønfluorescerende calciumindikatorgen og muliggøre ekspressionen. Forskere, der bruger transgene mus, der udtrykker indikatoren for grønfluorescerende calcium som deres forsøgspersoner, kan springe protokol 2.2 over.- Monter den indre nål på et 20 G intravenøst (dvs.) kateter på stereotaksarmen, og punktering langsomt (~100 - 200 μm/min) hjernen ved de relevante koordinater (de samme koordinater, der anvendes under implantation af relæobjektiver) (figur 2B3).
- Mikroinjektionsnålen sænkes med en hastighed på 100-200 μm/min ned i den ventrale CA1, og infusionen (~ 25 nL/min) 200 nL af den virale vektor til målområdet (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML og -3,50 mm DV fra bregma).
- Vent i 10 minutter for at lade virussen diffundere og minimere tilbagestrømningen.
- Træk mikroinjektionskanylen (~100-200 μm/min) ud.
- Relælinse implantation
- Relælinsen desinficeres med 75% alkohol10,16 og skylles derefter med pyrogenfrit saltvand. Blødgør linsen i koldt pyrogenfrit saltvand indtil implantation.
BEMÆRK: En kold linse minimerer hjerneødem, når den placeres i hjernen. - Hold relælinsen ved hjælp af en mikro bulldogklemme (figur 2B3), hvis tænder er dækket af varmekrympeslanger.
BEMÆRK: Bulldogklemmen kan holde linsen fast uden at beskadige den. Se Resendez et al.8 for metoden til fremstilling af den slangedækkede bulldogklemme. - Placer langsomt (~ 100 - 200 μm / min) relælinsen oven på målområdet (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML og -3,50 mm DV fra bregma) og stabiliser den med tandcement.
- Relælinsen desinficeres med 75% alkohol10,16 og skylles derefter med pyrogenfrit saltvand. Blødgør linsen i koldt pyrogenfrit saltvand indtil implantation.
- Dummy baseplating
BEMÆRK: Formålet med "dummy baseplating" under implantationsoperationen er at skabe en tandcementbase for at reducere mængden af tandcement, der skal påføres under den reelle baseplatingprocedure flere uger senere. På denne måde minimeres risikoen for en ændring i tandcementens volumen.- Fastgør objektivlinsen i bunden af miniskopet, og saml bundpladen på miniskopet (i dette trin er samlingen af den forankrede objektivlinse, bundplade og miniskop endnu ikke placeret over musens kranium).
- Sæt 10 cm paraffinfilm rundt om ydersiden af bundpladen (figur 4A).
- Hold miniskopet med den stereotaksiske armsonde ved hjælp af genanvendeligt klæbende ler.
- Juster objektivlinsen oven på relælinsen med så lidt plads mellem linserne som muligt (figur 4B).
- Brug tandcement til at sikre placeringen af bundpladen (således at cementen kun berører paraffinfilmen).
- Når tandcementen er tørret, skal du fjerne filmen.
- Fjern bundpladen og miniskopet. Dentalcementbasen er hul (figur 4B).
- For at beskytte relælinsen mod daglige aktiviteter og mod at blive ridset af musen skal du forsegle relælinsen med noget støbt silikonegummi, indtil relælinsen er dækket, og dække silikonegummiet med et tyndt lag tandcement (figur 4B).
- Frakobl musen fra de stereotaksiske instrumenter, og placer musen i et gendannelseskammer.
- Injicer carprofen (5 mg/kg; subkutan injektion) eller meloxicam (1 mg/kg; subkutan injektion) for analgesi og ceftazidim (25 mg/kg; subkutan injektion) for at forhindre infektion.
BEMÆRK: Brug af antibiotika er ikke et alternativ til en aseptisk teknik. Perioperative antibiotika (dvs. ceftazidim) kan være indiceret under visse omstændigheder, såsom langvarige operationer eller placering af kroniske implantater. - Se dyret, indtil det genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende.
- Husmus individuelt og injicer meloxicam (1 mg/kg; subkutan injektion; q24 timer) i en uge for at lindre postkirurgiske smerter. Kontroller dyret hver dag efter operationen for at sikre, at det spiser, drikker og afføring normalt.
- Udfør baseplating efter 3 eller flere uger.
3. Grundbelægning
BEMÆRK: Normalt kan baseplatingproceduren (figur 5) ikke udføres inden for 2-3 uger efter den indledende procedure på grund af restitutions- og viral inkubationstid. Induktionsprocedurerne for grundbelægning svarer til dem, der er beskrevet i trin 2.1.1 til 2.1.8. Baseplating er dog ikke en invasiv procedure, og dyret kræver kun let sedation. Derfor er 0,8-1,2% isofluran tilstrækkeligt, så længe dyret ikke kan bevæge sig på den stereotaxiske ramme. Derudover kan relativt let isofluranbedøvelse også hjælpe med at lette ekspressionen af fluorescenstransienterne af neuroner under overvågning8 (supplerende video S2).
- Skær forsigtigt det tynde lag af tandcementtaget med en knoglerongeur og fjern silikonegummiet. Rengør relælinsens overflade med 75% alkohol.
- Fastgør en sætskrue ved siden af bundpladen for at fastgøre den til bunden af miniskopet (figur 5A1).
BEMÆRK: Bundpladen skal strammes sikkert under bunden af miniskopet, da forskellen mellem en strammet og let fastgjort bundplade kan forårsage en inkonsekvent afstand. - Fokusskyderen indstilles til at være ca. 2,7 - 3 mm fra hovedhuset (figur 5A2).
BEMÆRK: Selvom længden kan justeres yderligere under bundpletteringsproceduren, skal du fastgøre den til ca. 2,7 mm, fordi samtidig justering af miniskoplængden og den optimale længde mellem det implanterede relæobjektiv og den præforankrede objektivlinse er meget forvirrende. - Tilslut miniskopet til dataindsamlingskortet, og sæt det i en USB 3.0 (eller højere version) port på en computer.
- Kør dataindsamlingssoftwaren udviklet af UCLA-teamet.
- Juster eksponeringen til 255, forstærkningen til 64x og excitations-LED'en til 5%. Disse indstillinger anbefales til indledende baseplating; De specifikke indstillinger varierer afhængigt af hjerneområderne og ekspressionsniveauerne for den genetisk kodede calciumindikator.
- Klik på knappen Opret forbindelse for at forbinde miniskopet til dataindsamlingssoftwaren og se livestreamen.
- Juster miniscope-objektivlinsen til relælinsen manuelt, og begynd at søge efter fluorescenssignalerne (figur 5B1).
BEMÆRK: Indledningsvis letter manuel søgning efter fluorescenssignalet justeringer. Fordi et AAV-system blev brugt til at udtrykke den genetisk kodede calciumindikator, påvirkede både promotortypen og AAV-serotypen effektiviteten af transfektion23,24. Forskere bør være nødt til at kontrollere ekspressionen af calciumindikatoren ved at finde individuelle neuroner, der viser ændringer i fluorescens, før de fortsætter med fremtidige eksperimenter. - Bor tandcementen på ethvert sted, hvor den blokerer miniskopet (valgfrit).
- Se livestreamen af dataindsamlingssoftwaren, og brug relæobjektivets margen som et vartegn (supplerende video S2). Relæobjektivets margen vises som en månelignende grå cirkel på skærmen (figur 5B1; hvide pile).
- Når relælinsen er fundet, skal du omhyggeligt justere miniskopets forskellige vinkler og afstande, indtil fluorescenssignalerne er fundet.
BEMÆRK: Billederne af neuronerne er hvidere end baggrunden. En præcis neuronal form indikerer, at neuronerne ligger perfekt på relælinsens brændplan. Runde neuroner tyder på, at de var nær fokalplanet. Den neuronale form er forskellig på tværs af hjernen, her er ventral CA1 vist som et eksempel. - Hvis ingen individuel neuron viser ændringer i fluorescens som en funktion af tiden, skal du forsegle basen igen med silikonegummi. Fluorescens observeres ikke, fordi inkubationsperioden også er afhængig af virusets egenskab23,24. Udfør trin 3.1-3.12 efter yderligere en uge. (Dette er valgfrit).
- Hold miniskopet i den optimale position, og flyt stereotaksarmen med et genanvendeligt klæbende ler mod miniskopet (figur 5B2). Fastgør miniskopet til stereotaxarmen med genanvendeligt klæbende ler.
- Juster armene x, y og z lidt for at søge efter den bedste visning (supplerende video S2). Juster derefter vinklen mellem overfladen af objektivlinsen og relælinsen ved at dreje ørestangen, tandstangen eller genanvendeligt klæbende ler på z-aksen. Viral ekspression og linseimplantation er vellykket, når mindst en celle viser fluorescenstransienter (figur 6A; Supplerende video S2) under baseplating (som også afhænger af hjernens område, såsom CA1).
BEMÆRK: Hvis skærmen kun viser hvide blodlegemer, men ingen transienter, er der en anden årsag (se figur 6B,C, Supplerende videoer S4,S5, afsnittet Resultater og afsnittet om fejlfinding). - Cementer bundpladen (figur 5B2) med tandcementen.
- Overvåg interesseområdet under cementering for at sikre, at den optimale position ikke ændres.
- Brug den mindst mulige mængde cement, mens du stadig limer bundpladen fast på dentalcementbasen (figur 5B2). Påfør et andet og tredje lag cement omkring bundpladen, men pas på ikke at påvirke GRIN-linsen.
BEMÆRK: Det er lettere at påføre cement på bundpladen i dette trin, da bundpladens bund blev dannet under prøvebelægningsproceduren. - Fjern forsigtigt miniskopet fra bundpladen, når cementen er hærdet. Skru derefter en beskyttelseshætte på.
- Flyt dyret til et genopretningsbur. Se dyret, indtil det genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende.
- Husmus individuelt. Sørg for, at den spiser, drikker og afføring normalt hver dag. Vent i 5 dage på, at musen er helt genoprettet, og kontroller derefter calciumbilleddannelsen.
BEMÆRK: Der er kun en lille mængde tandcement, der holder bundpladen. Derfor, hvis bundpladen har flyttet sig betydeligt siden bundbelægningsproceduren, skal du fjerne tandcementen med en boremaskine og udføre baseplatingproceduren igen. - Anbedring (ved intraperitoneal injektion af en ketamin (87 mg / kg) / xylazin (13 mg / kg) blanding) og perfus25 dyret, når alle forsøg er udført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering af volumenændringen i tandcement
Da mængden af tandcement ændres under hærdningsprocessen, kan det påvirke billedkvaliteten betydeligt, da arbejdsafstanden for et GRIN-objektiv er ca. 50 til 350 μm 4,8. Derfor blev to kommercielt tilgængelige tandcementer testet i dette tilfælde, Tempron og Tokuso, før implantations- og baseplatingproceduren (figur 5). Videoer blev først evalueret for at afgøre, om cementerne var krympet, og derefter blev mængderne af cement sammenlignet, når de var helt tørrede. Den samme koncentration og de samme volumener af de oprindelige blandinger af dentalcement blev lagt i pipettespidser og videofilmet (supplerende video S1). Video S1 viste, at begge cementer krympede under tørringsprocessen. Tokuso klarede sig bedre end Tempron (dvs. den havde et større volumen end Tempron, selv efter krympning): Figur 3B; gennemsnitligt volumen af Tempron: 0,93 ± 0,07 ml; gennemsnitligt volumen af Tokuso: 1,18 ± 0,07 ml t-test: p = 0,048, t(6) = 2,46, hvilket tyder på, at den krympede mindre. Cementernes tætheder blev også testet 4 gange efter fuldstændig tørring. Tokuso havde en lavere middeldensitet end Tempron (gennemsnitlig massefylde af Tempron: 1,07 ± 0,12 g/ml; gennemsnitlig massefylde af Tokuso: 0,93 ± 0,08 g/ml; t-test: p = 0,38, t(6) = -0,94), hvilket antyder, at den havde en lavere krympehastighed. Tokuso blev derfor anvendt til følgende implantations- og baseplatingtrin. Formålet med at beskrive eksperimentet ovenfor er ikke at anbefale nogen mærker, men snarere at minde eksperimenter om at finde en tandcement, der ikke undergår en betydelig volumenændring ved hærdning.
Måling af billedforskydning
Vi simulerede dummy-baseplating og originale baseplating-procedurer på et fast objekt for at undersøge, om dummy-baseplating-proceduren resulterer i et mindre skift i bundpladens placering end den oprindelige procedure. Et lyshærdende klæbemiddel blev brugt til at fastgøre en 23 G 2,5 cm sprøjtenål i midten af en bundplade med 1 cm stikkende ud af bundpladen (figur 3C). Derefter blev baseplating simuleret ved at holde nålene med armen på et stereotaxisk instrument. I stedet for at bruge forsøgsdyr blev der fastgjort et klistermærke på bordet på det stereotaksiske instrument. Sprøjtenålen gennemborede klistermærket og repræsenterede derved den oprindelige placering. Derefter blev nålen forhøjet med 0,5 mm, og simuleringsoperationerne blev startet. I en operation, der efterlignede engangsbelægningsproceduren8, blev tandcement påført, indtil den dækkede bundpladen, som var 1 cm over klistermærket. Derefter var der en ventetid på 2 timer på, at cementen hærdede, før man forsigtigt skubbede nålen for at gennembore klistermærket igen. Da lyshærdningsklæbemidlet ikke stabiliserede nålen fuldstændigt, kunne nålen skubbes dybere for at skabe et andet hul, der repræsenterer bundpladens placering, efter at tandcementen var tørret. Afstanden mellem det indledende hul og det andet hul blev målt for at kvantificere nålens placeringsforskydning. Resultaterne viste, at bundpladen 1 cm over kraniet resulterede i en placeringsforskydning på 1,76 ± 0,14 mm, men dummy-baseplating resulterede i forskydning på kun 0,75 ± 0,17 mm (figur 3D; gennemsnitlig forskydningsafstand for engangsbaseplating versus dummy baseplating; t-test: p < 0,01, t (8) = 6,03).
Derudover var vi nysgerrige på, om højden på tandcementen ville påvirke skiftet. Derfor testede vi yderligere en kortere højde (figur 3E; 0,5 cm ovenfor) ved hjælp af engangsbelægningsproceduren. Bundpladen, der var forankret 0,5 cm over kraniet, forskydede sig betydeligt mindre end bundpladen 1 cm over kraniet (figur 3F; gennemsnitlig forskydningsafstand: 0,43 ± 0,11 vs 1,76 ± 0,14 mm; t-test: p < 0,01, t (8) = 9,73). Data antydede, at højden af bundpladen over kraniet og afstanden basepladen forskudt var positivt korreleret. Da dummy-baseplatingproceduren efterfølges af et andet baseplating-trin, der kun bruger en minimal mængde tandcement, understøtter disse data også hypotesen om, at dummy-baseplating hjælper med at forbedre præcisionen af baseplatingproceduren.
Billedbehandling ved hjælp af et miniskopsystem med to linser
Ved at følge de kirurgiske protokoller for viral infusion, dummy baseplating og baseplating (figur 2, figur 4, figur 5) observerede vi fluorescenstransienter af individuelle neuroner hos tre mus (n = 3/5) (figur 6A, supplerende video S3) under baseplatingproceduren og efter baseplatingproceduren, mens musene bevægede sig frit, hvilket bekræftede, at arbejdsafstanden mellem objektiv- og relælinserne forblev den samme (figur 6A1 i forhold til figur 6A3, skete der kun et lille skift i position), efter at tandcementen var tørret helt. Her leverer vi videoer af baseplating af en mus (supplerende video S2; mus #5) og efterfølgende calciumbilleddannelse, mens mus bevægede sig frit (supplerende video S3; mus #3, #4, #5; rå data). Bemærk, at dataindsamlingssoftwaren til V3 ikke indeholder funktioner til baggrundssubtraktionen, og videoens kontrast kan forbedres ved offlinebehandling). For supplerende video S2 blev der udført en manuel søgning efter fluorescenssignalerne, og derefter blev miniskopet fastgjort til stereotaksarmen for finjusteringer. Nogle fluorescenstransienter blev observeret under sonderingen (supplerende video S2; Figur 6A). En forbigående er et jævnt skift i lysstyrke i grå eller hvide pletter, ikke et fyringsmønster, der ligner et blinkende lys; Figur 6A 1 til 6A2 viser billeder af transienter. Videoen af frit opførte mus viste et acceptabelt rumligt skift sammenlignet med det relevante område under baseplatingproceduren (supplerende video S3). Cellernes margener kunne ikke forbedres signifikant på dette stadium, fordi vi ikke kunne justere afstanden mellem bunden af relælinsen og de aktive neuroner. Navnlig kan der ofte opstå nogle problemer under baseplatingproceduren, herunder fravær af andet end en ensartet baggrund (figur 6B; Supplerende video S4) eller synlighed af hvide blodlegemer uden fluorescenstransienter (figur 6C; Supplerende video S5). Der gives også to eksempler på negative resultater (n = 2/5) (figur 6B,C, supplerende videoer S4, S5). De potentielle årsager til fejlene undersøges i afsnittet Diskussion. De kirurgiske procedurer for disse to mus blev udført uden brug af en nål med en diameter på 1 mm for at rydde vejen; Således blev relælinsen direkte implanteret. Vi foreslår, at relælinsen i mus #2 kan have komprimeret neuronerne og trukket nogle neuroner ned, hvilket resulterer i beskadigede neuroner. Derfor blev fluorescenstransienter ikke fundet.
Figur 1: Miniskopets mekanismer og de defekter, der normalt forårsager billeddannelsesfejl . (A) Tegneseriediagram over relælinsen og objektivlinsen, der viser de mekanismer, der er nødvendige for visualisering af fluorescerende celler i et to-linsesystem. Signalbølgerne i hver linse understreger vigtigheden af og den mekanisme, der er involveret i at finde en arbejdsafstand til at visualisere de fluorescerende celler. (A1) Relæ-GRIN-linsen er placeret over målneuronerne inden for arbejdsafstanden. Da relælinsens tonehøjde er 0,5 * N (hvor N er et heltal), muliggør linsen visualisering af målneuroner ved at videresende lys, hvilket bringer de originale fluorescenssignaler til toppen af relælinsen. Derefter bevæger ca. 1/4 af en fuld sinusformet periode med lys sig gennem objektiv GRIN-linsen (~ 0,25 tonehøjde) og resulterer i et forstørret billede. (A2) Objektivlinsen overfører billederne til en komplementær metaloxid-halvleder (CMOS) sensor placeret øverst (den grønne plade i diagrammet) på miniskopet. (B) Tegneseriediagram, der viser forskellene i GRIN-linseimplantationsprocedurerne mellem et (B1) to-linsesystem og (B2) et et-linsesystem. Generelt er den største forskel, at systemet med en linse direkte bruger sin objektive linse til at afbilde hjernens overflade; Som et resultat skal objektivlinsen implanteres oven på målneuronerne. (C) I modsætning hertil implanteres der i to-linsesystemet til sammenligning en ekstra relælinse i hjernen, og objektivlinsen er præforankret i miniskopet. (C1) Formen på bundpladen til V3-versionen af UCLA Miniscope kan forårsage et ujævnt skift, efter at tandcementen tørrer helt. (C2) Dette skift forårsager forskydning eller afvigelse fra arbejdsafstanden mellem relælinsen og objektivlinsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Modificerede protokoller og detaljerede kirurgiske protokoller for at forbedre succesraten for miniskopsystemet med to linser. (A1) Modificeret kirurgisk protokol for to-linsesystemet. Placeringen af den virale injektion og relæ GRIN-linseimplantation vises. Dummy baseplating gør det muligt for arbejdsafstanden nøjagtigt at omfatte neuroner af interesse og reducerer positionsforskydningen forbundet med (A2) baseplatingproceduren. Derfor (A3) øges sandsynligheden for billeddannelse af fluorescerende celler i mus, der opfører sig frit. (B) Tegneseriebillede af trinene til viral injektion og relæ GRIN-linseplacering. (B1) Først skal du markere aspirationsnålen med en pen ca. 1 mm (til museforsøg) fra spidsen for at hjælpe med at vurdere cortex-aspirationsdybden. Derefter aspireres bindevæv og cortex (ca. 1 mm dybt i mus) fra hjernen. (B2) Brug den ventrale hippocampus som målområde til at implantere en relælinse; Især er det hårde corpus callosum landemærket for at stoppe aspirationen i den kortikale region. Den fibrøse tekstur af corpus callosum kan ses under stereomikroskopet under aspiration. (B3) For det andet punkteres interessepunktet med en indre nål på et 20 G kateter (ca. 1 mm i diameter; diameteren svarer til relælinsens) for at rydde en vej før viral infusion. Under stereomikroskopet skal en bule (stiplede cirkel på billedet) skabt af nålen være synlig. Sænk mikroinjektionsnålen og relælinsen ved bulen (eller kun 250 μm væk fra midten af bulen). Til sidst skal du placere relæ-GRIN-linsen (i denne undersøgelse brugte vi en relælinse på 1 mm i diameter). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Måling af volumenændringen af den hærdede tandcement. (A) Et eksempel med hærdet tandcement af to mærker. De sorte pile angiver de oprindelige niveauer, efter at vi har blandet pulveret og opløsningen. De hvide pile angiver niveauerne efter 10, 20 og 40 minutters hærdning. De røde pile peger på bunden af spidserne, som var forseglet med lyshærdende lim. B) Gennemsnitlige mængder af den resterende dentalcement, efter at den er tørret helt. Søjlerne og fejlbjælkerne er midlerne ± SEM'er. * angiver signifikans (P < 0,05) som bestemt af elevens t-test. C) Illustrationer og et fotografi, der forklarer den metode, der er anvendt til at måle bundpladens placeringsforskydning. En nål blev limet gennem bundpladen og blev brugt til at simulere den oprindelige baseplating-procedure (et-trins baseplating) og dummy-baseplatingproceduren. De røde og sorte pile repræsenterer nålens placering før og efter tandcementen blev hærdet. (D) Gennemsnitlige afstandsændringer for nålespidsen (E) Illustrationer af den metode, der er anvendt til at måle forholdet mellem bundpladen over kranieniveau og placeringsforskydningen. F) Ændringer i den gennemsnitlige afstand af kanylespidsen. Søjlerne og fejlbjælkerne er midlerne ± SEM'er. ** angiver signifikans (P < 0,01) som bestemt af elevens t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Detaljeret prøvedukke baseplating procedure (udføres umiddelbart efter relæobjektivimplantation). (A1) Tre-trins tegneserie af objektiv linse, bundplade og paraffinfilm samling på miniscope. (A2) Fotoversion af samlingen. (B1) Tegneserie, der viser dummy-baseplatingproceduren. For det første er det samlede miniskop justeret med relælinsen. Den objektivlinse, der er placeret, er så tæt på relælinsen som muligt. For det andet tilsættes tandcement til parafilmen, der omgiver bundpladen og påføres kraniet for at fremstille en kvindelig form til fremtidig baseplating. Derefter fjernes bundpladen, og støbning af siliciumgummi (lyserød) tilsættes og toppes med tandcement for at beskytte hunformen og relælinsen. Dyret får derefter lov til at komme sig efter anæstesi. Efter mindst 3 uger udføres baseplatingproceduren. (B2) Fotoversion af (B1). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Trin til baseplatingproceduren. (A1) Fastgør bundpladen, og juster fokusskyderen manuelt til 2,7 til 3 mm. En indstilling på 2,7 til 3 mm (på den position, der er vist på billedet) synes at være det bedste sted at starte, før du manuelt søger efter fluorescerende celler. (B1) Det første tegneseriediagram illustrerer betydningen af længden mellem objektivlinsen og relælinsen til visualisering af de fluorescerende celler (fluorescerende celler observeres normalt i en afstand mellem 0,5 og 2 mm). Før den fluorescerende celle dukker op, skal forskeren se relælinsens margen (pile i det øverste billede). Det er nyttigt først manuelt at justere objektivet til den optimale synsposition, fordi det er lettere at foretage hurtige justeringer manuelt. (B2) Placer genanvendeligt klæbende ler på den stereotaksiske armsonde, og stabiliser derefter miniskopet ved at klæbe det på armen med genanvendeligt klæbende ler. På dette stadium kan interesseområdet have skiftet, men dette kan let løses ved let at justere stereotaxarmen og den genanvendelige klæbende ler. Efter at have kontrolleret og fundet det optimale interesseområde, tilsættes en lille mængde tandcement (repræsenteret i rødt). Lim bundpladen med så lidt tandcement som muligt. Adskil miniskopet og bundpladen, når tandcementen tørrer. Hvis bundpladen ikke er stabil nok, tilsættes yderligere tandcement. (C) Dette diagram illustrerer betydningen af hvert trin for at opnå succes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Eksempler på succes og fiasko under baseplatingproceduren. (A) Et eksempel på vellykket billeddannelse under baseplatingproceduren. Relælinsen målrettede mod den ventrale hippocampus. Fluorescenstransienter blev bemærket, når dyret var under bedøvelse med isofluran (se også supplerende video S2). (A2) Kontrasten blev øget for bedre synlighed. De røde stiplede linjer angiver blodkar. (A3) Fluorescenstransienter fem dage efter baseplating, når musen # 5 opførte sig frit i sit bur (se også supplerende video S3; billederne af mus #3 og #4 findes også i den supplerende video S3). Der skete kun et lille skift i position. (B1) Et eksempel på en fiasko. Under baseplating blev der kun bemærket homogene hvide / grå områder, der ikke var cellelignende i form (se også supplerende video S4). (B2) Relælinsen savnede målområdet og var placeret over et område uden inficerede celler. (C1) Et andet eksempel på en fiasko. Selv om der blev observeret mange runde celler i denne mus, blev der ikke observeret fluorescenstransienter under baseplatingen (efter tre ugers inkubation, og mens musen blev bedøvet/bedøvet). Desuden blev der ikke serveret fluorescenstransienter, når baseplatingproceduren blev udført igen (i den femte uge af inkubationen), eller selv når dyret opførte sig frit. Billedet blev taget under baseplating i den femte uge af inkubationen (se også supplerende video S5). (C2 og C3) Relælinsen savnede det pyramidale lag af den ventrale hippocampus. De blå prikker er kerner, der blev farvet med DAPI. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Problem | Mulig årsag | Opløsning | ||
| Havde god billeddannelse ved baseplating, men helt ude af fokus næste dag | Volumenændring ved hærdning af tandcementen mellem motivets kranium og bundpladen | Fortsæt "dummy baseplating" efter linseimplantationsproceduren som foreslået i denne rapport. Vælg en tandcement, der har mindre volumenændring. | ||
| Har homogene hvide/grå områder uden cellelignende form under grundbelægning (se også supplerende video S4) | En. Relælinsen nåede ikke målområdet B. Dårligt udtryk for fluorescensindikator C. Glem at installere en objektiv linse under miniskopet, hvor fluorescensindikatoren faktisk udtrykkes | A. Brug dummy-linser til at øve operationer. Kontroller koordinaterne for dummylinsen efter den praktiserende implantation B. Find en optimal viral titer til calciumbilleddannelseseksperimenter (henvist til Resendez et al. 2016). Hvis pretesting af en eller anden grund ikke kan udføres, anbefaler vi, at begyndere først prøver en højere titer. (Se afsnittet Disscusion for detaljer) C. Skru på en objektiv GRIN-linse (~ 0,25 tonehøjde. ex: Edmund Optics; Lager #64-519) i bunden af miniscope. | ||
| Overhold mange celler, men ingen fluorescensdynamik under baseplating | A. Usunde neuroner eller døde neuroner B. Sparsom bøde type neuroner C. Dyb anæstesi status | A. Vær forsigtig for hver kirurgisk procedure. Brug en ny sprøjtenål, der svarer til diameteren på din relælinse, til at skære infusions-/implantationsvejen først for at frigøre trykket ved linseimplantation. Infunderes langsomt virussen og implanter langsomt linsen. B. Vent længere tid for at overvåge neuronernes aktiviteter eller klem halen lidt for at stimulere musen. C. Baseplating er ikke en invasiv procedure, og dyret behøver kun sedation. Derfor er det tilstrækkeligt at opretholde 1,2 ~ 0,8% isofluran, så længe dyret ikke er i stand til at bevæge sig på den stereotaxiske ramme. | ||
Tabel 1: Diagram over fejlfinding.
Supplerende video S1: Volumentest af tandcement. Forskellen mellem volumenet blev målt i begyndelsen af tandcementpræparatet, og at volumenet efter cementen tørrede. To mærker af tandcement (f.eks. Tempron og Tokuso Curefast) blev testet. For at teste volumenet af tandcementen, efter at den var tørret, blev 0,5 g af hvert tandcementpulver vejet og blandet med dets passende opløsning (1 ml). Derefter blev 0,1-10 μL pipettespidser fyldt med 2,5 μL af tandcementblandingen og forseglet med lyshærdende lim. Derefter blev spidserne anbragt på et stativ, overfladerne af tandcementblandingerne blev markeret og videofilmet i 40 minutter. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video S2: Demonstrationer af baseplatingproceduren. Vinklen mellem overfladen af objektivlinsen og relælinsen blev justeret ved at dreje ørestangen, tandstangen eller genanvendeligt klæbende ler på z-aksen. Relælinsens margen fremstod som en månelignende grå cirkel på skærmen. Vellykket viral ekspression og linseimplantation bør afsløre mindst en fluorescensdynamik (pile) under baseplating. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video S3: Demonstrationer af fluorescensdynamik i frit opførte mus. Fluorescenstransienter fra mus #3, #4 og #5. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video S4: Et eksempel på en fejl. En ensartet baggrund dukkede op under baseplatingproceduren. Bemærk, at ændringen i lysstyrke ikke skyldtes fluorescenstransienterne i individuelle celler; Det var forårsaget af søgeproceduren. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video S5: Demonstration af et andet fejleksempel. Der opstod en mangel på fluorescenstransienter under baseplatingproceduren, men nogle runde cellemargener var stadig synlige. Bemærk, at ændringen i lysstyrke ikke var forårsaget af fluorescenstransienterne i individuelle celler; Det var forårsaget af søgeproceduren. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport beskriver en detaljeret eksperimentel protokol for forskere, der bruger UCLA Miniscope-systemet med to linser. Værktøjerne designet i vores protokol er relativt overkommelige for ethvert laboratorium, der ønsker at prøve in vivo calciumbilleddannelse. Nogle protokoller, såsom viral injektion, linseimplantation, dummy baseplating og baseplating, kan også bruges til andre versioner af miniscope-systemet for at forbedre succesraten for calciumbilleddannelse. Bortset fra generelle problemer med viral injektion og linseimplantation, der skal rettes uanset miniscope-versionen, kan strukturen af UCLA-bundpladen forårsage et positionsskift, hvilket kan føre til uoverensstemmende arbejdsafstande mellem objektiv- og relælinserne (figur 1C). En modificeret eksperimentel protokol blev udviklet for at minimere positionsforskydningen af de to linser (figur 2, figur 4, figur 5). Vellykket calciumbilleddannelse kan opnås gennem en kombination af vellykket viral ekspression, linseimplantation og baseplatingprocedurer (figur 5C). Brug af et to-linsesystem til at observere dybe hjerneområder kræver en høj grad af nøjagtighed i baseplatingprocedurerne, fordi de relative positioner af den implanterede relælinse og objektivlinsen også skal være nøjagtige. Denne rapport præsenterer ikke kun en protokol, der løser baseplating problemer, men diskuterer også nogle tips til viral injektion, og linse implantation. Nedenfor diskuterer vi baseplatingprocedurerne først, efterfulgt af viral injektion og linseimplantationsprocedurer, og vi beskriver nogle eksempler på fejl (figur 6).
Belægning
V3-versionen af UCLA Miniscope er i øjeblikket det mest anvendte design og kan bestilles online. Bundpladen i denne version består af to kanter uden vægge (figur 1C1), men dens form kan forårsage et ujævnt skift (figur 1C1, C2), efter at tandcementen er helt tør. Dummy-baseplatingprocedurerne i vores protokol (figur 4) minimerer problemerne med forkert justering og baseplate-skift, fordi den bruger paraffinfilm til at reducere den tilgængelige plads til tandcementen under reel baseplating (figur 5B). Den resterende plads er stadig tilstrækkelig til at finde en optimal billeddannelsesposition under den reelle baseplating-procedure. Derfor kan forskeren lime bundpladen med så lidt tandcement som muligt (figur 5B2). Derudover tager dummy-baseplatingproceduren relativt lidt tid (ca. 15 til 20 min), da det ikke kræver en perfekt afstand mellem objektivobjektivet og relæobjektivet for at opnå. Imidlertid er dummy baseplating kun en af nøglefaktorerne for vellykket calciumbilleddannelse; For eksempel kan neuroner under overvågning af fluorescenssignaler forekomme slørede, hvis de er lidt væk fra arbejdsplanet (afhængigt af relælinsens arbejdsafstand; ofte ca. 100 ~ 300 μm). Evnen til at forbedre arbejdsafstanden er begrænset, da neuronernes arbejdsafstand er forudbestemt af relælinseimplantationsproceduren. Et eksperiment blev udført uden dummy-baseplating-proceduren, og interesseområdet blev altid (hos fire ud af fire mus) savnet efter engangsbaseplating. Derfor blev disse løsninger udtænkt for at reducere krympeproblemet. Nogle lethærdende tandcementer kan undgå problemet med krympning under hærdning, fordi de hærder meget hurtigt; Disse cementer kan hjælpe forskere med at justere afstanden under baseplatingproceduren. Selvom bølgelængdeområdet for spænding af calciumindikatorerne og hærdning af tandcementen er forskellige, skal fotoblegning under baseplatingproceduren forhindres. For at forhindre fotoblegning skal bølgelængdeområdet, der genereres af lyskilden, være ret snævert for at undgå krydsreaktioner mellem calciumindikatorerne og lyshærdende tandcement. Derfor anbefales det ikke at bruge lyshærdende tandcement til bundbelægningsproceduren. Derudover bruges nogle specifikke mærker af tandcement ofte til limning af bundplader af andre forskerhold 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . Disse cementers lave krympningsegenskaber kan løse problemet, men vi havde ikke mulighed for at teste disse mærker på grund af vanskeligheder med at købe (importere) dem. Produkter af medicinsk kvalitet kan være underlagt importbestemmelser afhængigt af land/region. Hvis forskere har svært ved at få adgang til de cementer, der er nævnt i litteraturen 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, vil vores protokol løse problemet med krympning af tandcement.
Ud over krympeproblemet kan strukturelt slid forekomme i selve miniskopet og på bundpladen (især magneterne i bundpladen) i løbet af mange eksperimenter. Ethvert lille mellemrum forårsaget af slid reducerer stabiliteten af afstanden mellem de to linser. Igen er nøjagtighed over hele den optiske vej nøglen til billeddannelse af calciumtransienter i frit opførte mus ved hjælp af et miniskop.
Fejlfinding af viral injektion / linseimplantation
Før du infunderer virussen i hjerneområdet, anbefales det at montere en ny nål på stereotaksarmen og langsomt punktere hjernen ved de relevante koordinater. Fordi den nye nål er meget skarp, fungerer denne punktering som et forberedelsestrin for at rydde stien (eller skære en sti) til den faktiske mikroinjektionsnål og relælinse og minimerer vævsskade, som kan være forårsaget af kompression fra mikroinjektionsnålen eller relælinsen. Den skarpe nål skærer en sti til den stumpe relælinse; Således skal nålens spids sænkes til de samme koordinater med relælinsen. Den indre nål på et 20 G I.V. kateter blev valgt, fordi det havde en diameter på 1 mm, hvilket svarede til diameteren på vores relælinse. En anden nålemåler kan bruges afhængigt af relælinsens diameter.
Selvom denne undersøgelse ikke fokuserede på egenskaberne og titerne af virale vektorer, er disse faktorer stadig kritiske for vellykket calciumbilleddannelse (figur 5C). Det er nødvendigt at pretest ekspressionskvaliteten af den virale vektor. Trin 1 til 5 i Resendez et al.'s protokol giver detaljerede metoder til identifikation af en optimal viral titer til calciumbilleddannelseseksperimenter8. Hvis pretesting af en eller anden grund ikke kan udføres, anbefales det, at begyndere først prøver en relativt høj titer. En af ulemperne ved at anvende en høj viral titer er cytotoksicitet8. Døde neuroner giver anledning til autofluorescens og er synlige som lyse hvide pletter under miniscope8. Disse døde neuroner er dog gode vartegn for begyndere at finde og øve baseplatingproceduren. På den anden side, selvom infusion af en lavtitervirus har en lavere risiko for at dræbe celler, kan fluorescensen maskeres af baggrunden, hvis cellerne ikke viser nogen fluorescenstransienter under baseplatingproceduren. Det er vanskeligt at fastslå årsagerne til fiasko, fordi målneuronerne kan blive savnet på grund af relælinseimplantation eller på grund af det dårlige udtryk af den virale vektor. At bestemme årsagen er meget forvirrende uden histologisk bekræftelse. Derfor anbefales det at bruge relativt høje titervirus, hvis de virale vektorer ikke kan testes på forhånd.
Resendez et al. anbefaler at indsætte mikroinjektionsnålen 250 μm lateral og ventral til placeringen af linsen. Vores observationer viste, at infusion af virussen i samme dybde som relælinsen også kan føre til ekspression af gode calciumsignaler. Vi foreslår, at på grund af muligheden for infektion og spredning er infusion af virussen i samme dybde som relælinsens koordinat optimal til at reducere vævsskade og øge nøjagtigheden af afstanden mellem de inficerede neuroner og relælinsen. Resendez et al anbefaler også at udføre viral injektion og linseimplantation under den samme operation i betragtning af det smalle arbejdsområde mellem målceller og relælinsen8. Nogle forskere følger dog en protokol, hvor det virale infusionstrin og linseimplantationstrinnet udføres med to (eller flere) ugers mellemrummed 18,26. Forlængelse af tiden mellem trin reducerer den individuelle driftstid. Men i denne protokol blev disse to trin slået sammen til en operation, fordi kirurgen i protokollen med en operation kan overvåge positionen mellem mikroinjektionsnålen og relælinsen, når de sænkes ned i målområdet, hvilket reducerer risikoen for mislykket målretning (figur 2B3).
For to mus (mus #1 og #2) blev brugen af en nål til at skabe en sti til linsen også udeladt, og i mus #2 blev der observeret runde cellelignende grå pletter (figur 6C). Imidlertid blev fluorescensdynamikken (supplerende video S5) ikke observeret. Ved at undersøge hjerneskiven i dette eksempel (figur 6C2, C3) postulerede vi, at relælinsen trak nogle celler ned, mens den blev sænket. Disse trukne neuroner var usunde, så der blev ikke bemærket nogen aktivitet under baseplatingproceduren eller under eksperimentet.
Vi havde en mus med et helt homogent gråt signal og ingen synlige cellelignende billeder under baseplatingproceduren (figur 6B1). Efter at have ofret musen blev dens hjerneskiver observeret. Det blev bemærket, at linsen var på den mediale side af det buede pyramidelag; målområdet (figur 6B2) blev fuldstændig savnet. Disse mislykkede forsøg var kritiske oplevelser, der fik os til at ændre vores operationsprotokol og i sidste ende lykkes med tre mus (supplerende video S3).
Mikroinjektion nål
Corpus callosum er en hård fibrøs kanal, der overlejrer dorsal hippocampus. På grund af sin stivhed modstår den penetration af en mikroinjektionsnål med flad spids. Derfor anbefaler vi at bruge en mikroinjektionsnål med en skrå spids. Denne type nål reducerer ikke kun vævsskade, men reducerer også muligheden for manglende infusion af virussen i målområdet på grund af blokering af nærliggende fibre. Vi har opsummeret ovennævnte problemer i et fejlfindingsdiagram (tabel 1).
Tidsramme
Tidsrammen for hele proceduren er opsummeret i figur 2A med dage som enheder. I detaljer kan operationsdelen (viral injektion, relælinseimplantation, dummy baseplating) tage 3 timer for begyndere eller 1,5 timer for tilstrækkeligt uddannede forskere. Mus har en lille kropsstørrelse og hurtig metabolisme, og de er mere modtagelige for sundhedsproblemer forårsaget af lange perioder under anæstesi end større arter27. Forskere bør sigte mod at holde tiden brugt i kirurgi under 3 timer. Ægte baseplating kan udføres efter 3 til 6 ugers calciumindikatorekspression. Denne procedure kan tage 1 time. Den efterfølgende langsgående calciumaktivitetsobservation kan fortsættes i mere end 1 måned.
Konklusioner
UCLA Miniscope er en open source in vivo calciumbilleddannelsesenhed. Uden en færdiglavet, forudinstalleret bundplade eller objektivmodul skal personer, der udfører eksperimenter, være i stand til nøjagtigt at opnå den optimale afstand mellem objektivlinsen og relælinsen under baseplatingproceduren. Den øgede vanskelighed ved at bruge UCLA Miniscope-systemet med to linser ligger i volumenændringen af tandcementen. Vi har optimeret de originale protokoller og minimeret fejlene forårsaget af ovennævnte problemer, hvilket øger succesraten for calciumbilleddannelse med UCLA Miniscope-systemet med to linser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette er ikke en industristøttet undersøgelse. Forfatterne rapporterer ingen økonomiske interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (108-2320-B-002-074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
