Summary
Il restringimento del cemento dentale durante la polimerizzazione sposta la piastra di base. Questo protocollo minimizza il problema creando una base iniziale del cemento dentale che lascia spazio per cementare la piastra di base. Settimane dopo, la piastra di base può essere cementata in posizione su questa impalcatura utilizzando poco nuovo cemento, riducendo così il restringimento.
Abstract
I neuroscienziati usano microscopi in miniatura (miniscopi) per osservare l'attività neuronale negli animali che si comportano liberamente. Il team Miniscope dell'Università della California, Los Angeles (UCLA) fornisce risorse aperte ai ricercatori per costruire miniscopi stessi. Il miniscope UCLA V3 è uno dei miniscope open source più popolari attualmente in uso. Permette l'imaging dei transitori di fluorescenza emessi da neuroni geneticamente modificati attraverso una lente obiettiva impiantata sulla corteccia superficiale (un sistema a una lente), o nelle aree cerebrali profonde attraverso una combinazione di una lente relè impiantata nel cervello profondo e una lente obiettiva che è preancorata nel miniscopio per osservare l'immagine trasmessa (un sistema a due lenti). Anche in condizioni ottimali (quando i neuroni esprimono indicatori di fluorescenza e la lente del relè è stata impiantata correttamente), una variazione di volume del cemento dentale tra la piastra di base e il suo attaccamento al cranio durante la polimerizzazione del cemento può causare disallineamento con una distanza alterata tra l'obiettivo e le lenti del relè, con conseguente scarsa qualità dell'immagine. Una piastra di base è una piastra che aiuta a montare il miniscopio sul cranio e fissa la distanza di lavoro tra l'obiettivo e le lenti del relè. Pertanto, i cambiamenti nel volume del cemento dentale attorno alla piastra di base alterano la distanza tra le lenti. Il presente protocollo mira a ridurre al minimo il problema del disallineamento causato dalle variazioni di volume nel cemento dentale. Il protocollo riduce il disallineamento costruendo una base iniziale di cemento dentale durante l'impianto della lente relè. Il tempo di convalescenza dopo l'impianto è sufficiente per la fondazione del cemento dentale per polimerizzare completamente la piastra di base, quindi la piastra di base può essere cementata su questa impalcatura usando il minor cemento nuovo possibile. Nel presente articolo, descriviamo le strategie per il baseplating nei topi per consentire l'imaging dell'attività neuronale con una lente obiettiva ancorata al miniscopio.
Introduction
I reporter di attività fluorescente sono ideali per l'imaging dell'attività neuronale perché sono sensibili e hanno ampie gamme dinamiche 1,2,3. Pertanto, un numero crescente di esperimenti utilizza la microscopia a fluorescenza per osservare direttamente l'attività neuronale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Il primo microscopio miniaturizzato a fluorescenza a un fotone (miniscopio) è stato progettato nel 2011 da Mark Schnitzer et al.5. Questo miniscopio consente ai ricercatori di monitorare la dinamica della fluorescenza delle cellule cerebellari negli animali che si comportano liberamente5 (cioè, senza alcuna restrizione fisica, contenimento della testa, sedazione o anestesia agli animali). Attualmente, la tecnica può essere applicata per monitorare aree cerebrali superficiali come la corteccia 6,8,15,16; aree sottocorticali come l'ippocampo dorsale 8,11,13,14 e lo striato 6,17; e aree cerebrali profonde come l'ippocampo ventrale14, l'amigdala 10,18 e l'ipotalamo 8,12.
Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi miniscope open source4,5,6,7,11,13,17,19. Il miniscopio può essere assemblato economicamente dai ricercatori se seguono le linee guida passo-passo fornite dal team Miniscope dell'Università della California, Los Angeles (UCLA)4,7,11,13. Perché il monitoraggio ottico dell'attività neurale è limitato dalle limitazioni della trasmissione della luce7 da e verso la popolazione neuronale di interesse, è stato progettato un miniscopio che richiede una lente a gradiente di rifrazione oggettiva (GRIN) (o lente obiettivo) da preancorare nella parte inferiore del miniscopio per ingrandire il campo visivo che viene trasmesso da una lente GRIN relè (o lente relè)6,7,8,10,16,17. Questa lente relè viene impiantata nella regione cerebrale bersaglio in modo tale che l'attività di fluorescenza della regione cerebrale bersaglio venga trasmessa sulla superficie della lente relè.6,7,8,10,16,17. Circa 1/4 di un periodo sinusoidale completo di luce viaggia attraverso la lente GRIN dell'obiettivo (~ 0,25 passo) (Figura 1A1), ottenendo un'immagine a fluorescenza ingrandita6,7. La lente dell'obiettivo non è sempre fissata nella parte inferiore del miniscopio né è necessario l'impianto della lente relè.6,7,11,13,15. Nello specifico, ci sono due configurazioni: una con una lente fissa nel miniscopio e una lente relè impiantata nel cervello8,10,12,14,16 (Figura 1B1) e un altro con solo un obiettivo rimovibile6,7,11,13,15 (Figura 1B2). Nella progettazione basata sull'obiettivo fisso e sulla combinazione di lenti a relè impiantate, i segnali di fluorescenza dal cervello vengono portati sulla superficie superiore della lente del relè (Figura 1A1)7,8,10,12,14,16. Successivamente, la lente dell'obiettivo può ingrandire e trasmettere il campo visivo dalla superficie superiore della lente relè (Figura 1A2). D'altra parte, il design della lente GRIN dell'obiettivo rimovibile è più flessibile, il che significa che il preimpianto di una lente relè nel cervello non è obbligatorio (Figura 1B2)6,7,11,13,15. Quando si utilizza un miniscopio basato su un design di obiettivo rimovibile, i ricercatori devono ancora impiantare una lente nella regione del cervello bersaglio, ma possono impiantare una lente obiettiva6,7,11,13,15 o una lente relè nel cervello6,7. La scelta di un obiettivo o di una lente relè per l'impianto determina la configurazione del miniscopio che il ricercatore deve utilizzare. Ad esempio, il V3 UCLA Miniscope si basa su un obiettivo GRIN rimovibile. I ricercatori possono scegliere di impiantare direttamente una lente obiettiva nella regione cerebrale di interesse e montare il miniscopio "vuoto" sulla lente dell'obiettivo6,7,11,13,15 (un sistema a una lente; Figura 1B2) o di impiantare una lente relè nel cervello e montare un miniscopio preancorato con una lente obiettiva.6,7 (un sistema a due lenti; Figura 1B1). Il miniscopio funziona quindi come una fotocamera a fluorescenza per catturare immagini livestream della fluorescenza neuronale prodotta da un indicatore di calcio geneticamente codificato.1,2,3. Dopo aver collegato il miniscope a un computer, queste immagini a fluorescenza possono essere trasferite al computer e salvate come clip video. I ricercatori possono studiare l'attività neuronale analizzando i cambiamenti relativi nella fluorescenza con alcuni pacchetti di analisi20,21 o scrivere i loro codici per analisi future.
Il miniscopio V3 UCLA offre agli utenti la flessibilità di determinare se visualizzare l'attività neuronale con un sistema a una o due lenti7. La scelta del sistema di registrazione si basa sulla profondità e sulle dimensioni dell'area cerebrale target. In breve, un sistema a una lente può solo visualizzare un'area superficiale (meno di circa 2,5 mm di profondità) e relativamente grande (più grande di circa 1,8 x 1,8 mm2) perché i produttori producono solo una certa dimensione di obiettivo obiettivo. Al contrario, un sistema a due lenti può essere applicato a qualsiasi area cerebrale target. Tuttavia, il cemento dentale per l'incollaggio della piastra di base tende a causare disallineamento con una distanza alterata tra l'obiettivo e le lenti del relè, con conseguente scarsa qualità dell'immagine. Se si utilizza il sistema a due lenti, è necessario puntare con precisione due distanze di lavoro per ottenere la qualità di imaging ottimale (Figura 1A). Queste due distanze di lavoro critiche sono tra i neuroni e la superficie inferiore della lente del relè e tra la superficie superiore della lente del relè e la superficie inferiore della lente dell'obiettivo (Figura 1A1). Qualsiasi disallineamento o posizionamento errato dell'obiettivo al di fuori della distanza di lavoro provoca un errore di imaging (Figura 1C2). Al contrario, il sistema a una lente richiede solo una distanza di lavoro precisa. Tuttavia, la dimensione della lente dell'obiettivo limita la sua applicazione per il monitoraggio delle regioni cerebrali profonde (la lente dell'obiettivo che si adatta al miniscopio è di circa 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Pertanto, l'impianto di una lente obiettiva è limitato per l'osservazione della superficie e di regioni cerebrali relativamente grandi, come la corteccia 6,15 e la cornu ammonis dorsale 1 (CA1) nei topi11,13 . Inoltre, una vasta area della corteccia deve essere aspirata per colpire il CA1 dorsale11,13. A causa della limitazione della configurazione a una lente che impedisce l'imaging delle regioni cerebrali profonde, i sistemi miniscope commerciali offrono solo un design combinato obiettivo / obiettivo relè (due lenti). D'altra parte, il miniscopio V3 UCLA può essere modificato in un sistema a una o due lenti perché il suo obiettivo è rimovibile 6,11,13,15. In altre parole, gli utenti del miniscopio V3 UCLA possono sfruttare la lente rimovibile impiantandola nel cervello (creando un sistema a una lente), quando eseguono esperimenti che coinvolgono osservazioni cerebrali superficiali (meno di 2,5 mm di profondità), o preancorandola nel miniscopio e impiantando una lente relè nel cervello (creando un sistema a due lenti), quando si eseguono esperimenti che coinvolgono osservazioni cerebrali profonde. Il sistema a due lenti può anche essere applicato per osservare superficialmente il cervello, ma il ricercatore deve conoscere le distanze di lavoro accurate tra la lente dell'obiettivo e la lente relè. Il vantaggio principale del sistema a una lente è che c'è una minore possibilità di perdere le distanze di lavoro rispetto a un sistema a due lenti, dato che ci sono due distanze di lavoro che devono essere mirate con precisione per ottenere una qualità di imaging ottimale nel sistema a due lenti (Figura 1A). Pertanto, si consiglia di utilizzare un sistema a una lente per le osservazioni cerebrali superficiali. Tuttavia, se l'esperimento richiede l'imaging nell'area profonda del cervello, il ricercatore deve imparare a evitare il disallineamento delle due lenti.
Il protocollo di base per la configurazione a due lenti di miniscopi per esperimenti include l'impianto di lenti e la placcatura di base 8,10,16,17. Il baseplating è l'incollaggio di una piastra di base sulla testa di un animale in modo che il miniscopio possa essere eventualmente montato sopra l'animale e videoregistrare i segnali di fluorescenza dei neuroni (Figura 1B). Questa procedura prevede l'uso di cemento dentale per incollare la piastra di base sul cranio (Figura 1C), ma il restringimento del cemento dentale può causare cambiamenti inaccettabili nella distanza tra la lente relè impiantata e la lente obiettiva 8,17. Se la distanza spostata tra le due lenti è troppo grande, le celle non possono essere messe a fuoco.
Sono già stati pubblicati protocolli dettagliati per esperimenti di imaging del calcio cerebrale profondo che utilizzano miniscopi8,10,16,17. Gli autori di questi protocolli hanno utilizzato il sistema Inscopix8,10,16 o altri disegni personalizzati17 e hanno descritto le procedure sperimentali per la selezione virale, la chirurgia e l'attaccamento della piastra di base. Tuttavia, i loro protocolli non possono essere applicati con precisione ad altri sistemi open source, come il sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope6e Finchscope19. Il disallineamento delle due lenti può verificarsi durante la registrazione in una configurazione a due lenti con un miniscopio UCLA a causa del tipo di cemento dentale che viene utilizzato per cementare la piastra di base al cranio8,17 (Figura 1C). Il presente protocollo è necessario perché la distanza tra la lente relè impiantata e la lente dell'obiettivo è soggetta a spostarsi a causa del restringimento indesiderato del cemento dentale durante la procedura di placcatura di base. Durante la placcatura di base, la distanza di lavoro ottimale tra la lente relè impiantata e la lente dell'obiettivo deve essere trovata regolando la distanza tra il miniscopio e la parte superiore della lente relè e la piastra di base deve quindi essere incollata in questa posizione ideale. Dopo aver impostato la distanza corretta tra la lente dell'obiettivo e la lente relè impiantata, è possibile ottenere misurazioni longitudinali alla risoluzione cellulare (Figura 1B; in vivo registrazione). Poiché la gamma ottimale di distanze di lavoro di una lente relè è piccola (50 - 350 μm)4,8, un eccessivo restringimento del cemento durante l'indurimento può rendere difficile mantenere la lente dell'obiettivo e la lente relè impiantata entro l'intervallo appropriato. L'obiettivo generale di questo rapporto è fornire un protocollo per ridurre i problemi di restringimento8,17 che si verificano durante la procedura di baseplating e per aumentare il tasso di successo delle registrazioni miniscope di segnali di fluorescenza in una configurazione a due lenti. La registrazione di successo del miniscopio è definita come la registrazione di un livestream di notevoli cambiamenti relativi nella fluorescenza dei singoli neuroni in un animale che si comporta liberamente. Sebbene diverse marche di cemento dentale abbiano tassi di restringimento diversi, i ricercatori possono selezionare un marchio che è stato precedentemente testato.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Tuttavia, non tutte le marche sono facili da ottenere in alcuni paesi/regioni a causa delle normative sull'importazione di materiali medici. Pertanto, abbiamo sviluppato metodi per testare i tassi di ritiro dei cementi dentali disponibili e, soprattutto, fornire un protocollo alternativo che minimizzi il problema del restringimento. Il vantaggio rispetto all'attuale protocollo di baseplating è un aumento del tasso di successo dell'imaging del calcio con strumenti e cemento che possono essere facilmente ottenuti in laboratorio. Il miniscope UCLA è usato come esempio, ma il protocollo è applicabile anche ad altri miniscope. In questo rapporto, descriviamo una procedura di baseplating ottimizzata e raccomandiamo anche alcune strategie per il montaggio del sistema a due lenti del miniscopio UCLA (Figura 2A). Vengono presentati sia esempi di impianto riuscito (n = 3 topi) che esempi di impianto fallito (n = 2 topi) per la configurazione a due lenti con il miniscopio UCLA insieme alle discussioni per le ragioni dei successi e dei fallimenti.
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Protocol
Tutte le procedure eseguite in questo studio sono state approvate dal National Taiwan University Animal Care and Use Committee (approvazione n.: NTU-109-EL-00029 e NTU-108-EL-00158).
1. Valutazione dell'alterazione volumetrica del cemento dentale
NOTA: Durante il processo di polimerizzazione si verificano cambiamenti nel volume del cemento dentale. Testare le variazioni di volume del cemento dentale prima dell'impianto e della placcatura di base. I ricercatori possono testare qualsiasi marca di cemento dentale e utilizzare il marchio con il più basso cambiamento di volume per cementare la piastra di base. Un esempio è illustrato nella Figura 3.
- Pesare 0,5 g di ogni polvere di cemento dentale e mescolarla con la sua soluzione appropriata (1 ml).
NOTA: Il rapporto polvere/liquido raccomandato nelle istruzioni per il cemento dentale è di 0,5 g di polvere per 0,25 ml della soluzione per ottenere una forma solida. Questo protocollo di prova diluisce il rapporto a 0,5 g/ml in modo che la miscela possa essere aspirata in forma liquida per misurare la variazione di volume nelle punte delle pipette. - Utilizzare punte per pipette da 0,1 a 10 μL per rimuovere 2,5 μL della miscela di cemento dentale, quindi sigillare la punta della pipetta con una colla fotopolimerizzante.
- Posizionare le punte su un rack, contrassegnare i livelli più alti della miscela di cemento dentale e misurare il livello della miscela di cemento dentale dopo 40 minuti (video supplementare S1).
- Oltre a monitorare le variazioni di livello durante la polimerizzazione del cemento dentale nelle punte, misurare la densità residua del cemento dentale secco. Per calcolare la densità, misurare il peso del cemento dentale e misurare il volume con il principio di Archimede.
- In breve, posizionare il cemento dentale asciutto rimanente in una tazza piena d'acqua e pesare l'acqua che trabocca.
- Utilizzare il cemento dentale con il minimo restringimento per tutti i protocolli descritti di seguito.
2. Anestesia, impianto chirurgico, iniezione virale e baseplating fittizio
- Anestesia
NOTA: Il presente rapporto mira a ottimizzare la chirurgia e la procedura di baseplating per il miniscopio UCLA; Pertanto, si presumeva che fosse noto il titolo virale ottimale per infettare le regioni cerebrali bersaglio. I metodi per trovare il titolo virale ottimale possono essere trovati nei passaggi da 1 a 5 di Resendez et al.8. Una volta ottimizzata la diluizione virale, è possibile iniziare l'impianto chirurgico.- Posizionare il mouse in un contenitore a induzione e fornire ossigeno (100% con una portata d'aria di 0,2 L/min). Preossigenare il mouse per 5-10 minuti.
- Somministrare isoflurano al 5% miscelato con ossigeno al 100% (portata d'aria: 0,2 L/min) fino a quando il topo inizia a perdere l'equilibrio e viene infine anestetizzato.
- Rimuovere il topo dalla camera di induzione e iniettare atropina (0,04 mg/kg; iniezione sottocutanea), per prevenire l'accumulo di saliva e buprenorfina (0,03 mg/kg; iniezione sottocutanea) come analgesico.
- Rasare la testa del mouse.
- Indossare una maschera, un camice sterile e guanti. Preparare uno spazio sterile e strumenti chirurgici sterili per la chirurgia. Stabilizzare la testa del topo (mantenere l'anestesia con isoflurano dal 3 al 2,5% durante questa fase) sull'apparato stereotassico. Dopo le procedure analgesiche e anestetiche, assicurarsi che le barre auricolari stabilizzino saldamente la testa. Fornire supporto termico.
- Assicurarsi che la testa sia impostata in posizione diritta, sterilizzare la testa rasata con betadine e quindi spruzzare la testa con xilocaina (10%), un analgesico locale.
- Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza.
NOTA: Utilizzare unguento oftalmico per la protezione degli occhi durante tutti gli eventi anestetici per prevenire lesioni oculari. - Prova il riflesso del dolore profondo dell'animale pizzicando la zampa posteriore. Una volta che l'animale non mostra alcun riflesso di ritiro della zampa, procedere con le procedure chirurgiche.
- Fare una piccola incisione lungo il piano medio-sagittale del cranio (partendo da circa 2 mm anteriormente al bregma e terminando circa 6 mm posteriormente al bregma). Quindi, pulire il tessuto connettivo sul cranio e ancorare tre viti in acciaio inossidabile sulle ossa frontali e interparietali sinistre.
- A questo punto, ridurre l'isoflurano all'1-2%. Monitorare la frequenza respiratoria durante l'intera procedura chirurgica. Se la frequenza respiratoria è troppo lenta (circa 1/s, a seconda dell'animale), diminuire la concentrazione di isoflurano.
- Eseguire una craniotomia per l'impianto della lente relè al microscopio chirurgico o stereomicroscopio utilizzando un trapano di bava con un diametro della punta di 0,7 mm. Utilizzare un micro-trapano per afferrare la punta del trapano e disegnare un contorno dell'area circolare prevista (l'intero spessore del calvario non deve essere penetrato).
NOTA: La lente relè utilizzata nel presente protocollo aveva un diametro di 1,0 mm, una lunghezza ~ 9,0 mm un passo di 1 e un intervallo di distanza di lavoro di ~ 100 μm - 300 μm; Pertanto, la craniotomia aveva un diametro di 1,2 mm.- Approfondisci delicatamente il contorno fino a quando la dura è esposta.
- Preparare 3 ml di soluzione salina sterile in una siringa da 3 ml e raffreddarla in un secchiello per il ghiaccio. Risciacquare frequentemente l'area esposta con 0,1 ml di soluzione salina dalla siringa per raffreddare l'area e prevenire danni da calore ed emorragie.
- Prelevare e staccare leggermente la dura con un ago da 27G.
- Mettere una marcatura su un ago smussato da 27 G a 1 mm dalla punta e usarlo per aspirare attentamente la corteccia cerebrale al fine di creare una finestra per l'impianto della lente 8,11,13,17 (Figura 2B1). Se necessario, fare un ago smussato macinando la punta di un ago per iniezione da 27 G con carta vetrata. Quindi, collegare l'ago a una siringa, collegare la siringa a un tubo e collegare il tubo a una fonte di aspirazione per creare un vuoto.
NOTA: La lente del relè è smussata e comprime il tessuto cerebrale quando viene posizionato nell'area cerebrale profonda. Pertanto, l'aspirazione della corteccia riduce il danno tissutale dovuto all'impianto della lente del relè. La corteccia è spessa circa 1 mm nei topi, ma è difficile da visualizzare con uno stereomicroscopio. Il marchio crea un punto di riferimento per consentire di determinare la profondità dell'ago in modo più preciso rispetto a un solo stereomicroscopio. Inoltre, si può determinare se la regione della corteccia è stata raggiunta o superata a seconda della resistenza; La parte superiore della corteccia si sente relativamente morbida, mentre la regione sottocorticale si sente densa. Pertanto, una volta che la texture inizia a sentirsi più densa, interrompere l'aspirazione (Figura 2B3). - Preparare 3 ml di soluzione salina sterile in una siringa da 3 ml e raffreddarla in un secchiello per il ghiaccio. Risciacquare l'area con soluzione salina per fermare l'emorragia e ridurre la possibilità di edema cerebrale.
- Iniezione di virus adeno-associati (AAV)
NOTA: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE è stato utilizzato nel presente esperimento. jGCaMP7s è un indicatore di calcio geneticamente codificato che emette fluorescenza verde3. Poiché il presente studio ha utilizzato un topo wild-type come soggetto, era necessario un vettore virale per trasfettare i neuroni con il gene indicatore di calcio fluorescente verde e consentire l'espressione. I ricercatori che utilizzano topi transgenici che esprimono l'indicatore di calcio verde-fluorescente come soggetti possono saltare il protocollo 2.2.- Montare l'ago interno di un catetere endovenoso da 20 G (e.v.) sul braccio stereotassico e perforare lentamente (~100 - 200 μm/min) il cervello alle coordinate appropriate (le stesse coordinate utilizzate durante l'impianto del relente) (Figura 2B3).
- Abbassare l'ago di microiniezione ad una velocità di 100-200 μm/min nel CA1 ventrale e infondere (~ 25 nL/min) 200 nL del vettore virale nella regione bersaglio (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML e -3,50 mm DV dal bregma).
- Attendere 10 minuti per consentire al virus di diffondersi e ridurre al minimo il flusso di ritorno.
- Prelevare (~100-200 μm/min) l'ago per microiniezione.
- Impianto di lenti a relè
- Disinfettare la lente del relè con alcool al 75%10,16 e quindi risciacquare con soluzione salina priva di pirogeni. Immergere la lente in soluzione salina fredda priva di pirogeni fino all'impianto.
NOTA: Una lente fredda riduce al minimo l'edema cerebrale quando viene inserita nel cervello. - Tenere la lente del relè usando un micro morsetto bulldog (Figura 2B3) i cui denti sono stati coperti con tubi termorestringenti.
NOTA: il morsetto bulldog può tenere saldamente l'obiettivo senza danneggiarlo. Fare riferimento a Resendez et al.8 per il metodo per realizzare il morsetto bulldog coperto di tubi. - Posizionare lentamente (~100 - 200 μm/min) la lente relè sopra la regione target (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML e -3,50 mm DV dal bregma) e stabilizzarla con cemento dentale.
- Disinfettare la lente del relè con alcool al 75%10,16 e quindi risciacquare con soluzione salina priva di pirogeni. Immergere la lente in soluzione salina fredda priva di pirogeni fino all'impianto.
- Baseplating fittizio
NOTA: Lo scopo del "dummy baseplating" durante l'intervento chirurgico di impianto è quello di creare una base di cemento dentale al fine di ridurre la quantità di cemento dentale che deve essere applicata durante la procedura di baseplating reale diverse settimane dopo. In questo modo, il rischio di un cambiamento nel volume del cemento dentale è ridotto al minimo.- Fissare la lente dell'obiettivo sul fondo del miniscopio e assemblare la piastra di base sul miniscopio (in questa fase, l'assemblaggio della lente dell'obiettivo ancorato, della piastra di base e del miniscopio non è ancora stato posizionato sul cranio del topo).
- Avvolgere 10 cm di pellicola di paraffina intorno all'esterno della piastra di base (Figura 4A).
- Tenere il miniscopio con la sonda da braccio stereotassica utilizzando argilla adesiva riutilizzabile.
- Allineare l'obiettivo sulla parte superiore dell'obiettivo con il minor spazio possibile tra gli obiettivi (Figura 4B).
- Utilizzare il cemento dentale per fissare il posizionamento della piastra di base (in modo tale che il cemento tocchi solo il film di paraffina).
- Quando il cemento dentale si è asciugato, rimuovere la pellicola.
- Rimuovere la piastra di base e il miniscopio. La base del cemento dentale è cava (Figura 4B).
- Per proteggere la lente del relè dalle attività quotidiane e dai graffi del mouse, sigillare la lente del relè con una gomma siliconica stampata fino a coprire la lente del relè e coprire la gomma siliconica con un sottile strato di cemento dentale (Figura 4B).
- Sganciare il mouse dagli strumenti stereotassici e collocarlo in una camera di recupero.
- Iniettare carprofen (5 mg/kg; iniezione sottocutanea) o meloxicam (1 mg/kg; iniezione sottocutanea) per analgesia e ceftazidima (25 mg/kg; iniezione sottocutanea) per prevenire l'infezione.
NOTA: L'uso di antibiotici non è un'alternativa a una tecnica asettica. Gli antibiotici perioperatori (cioè ceftazidima) possono essere indicati in determinate circostanze, come interventi chirurgici di lunga durata o posizionamento di impianti cronici. - Guarda l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale.
- Ospitare i topi singolarmente e iniettare meloxicam (1 mg/kg; iniezione sottocutanea; q24h) per una settimana per alleviare il dolore post-chirurgico. Controlla l'animale ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per assicurarti che stia mangiando, bevendo e defecando normalmente.
- Eseguire la placcatura di base dopo 3 o più settimane.
3. Baseplating
NOTA: Di solito, la procedura di baseplating (Figura 5) non può essere eseguita entro 2-3 settimane dalla procedura iniziale a causa del recupero e del tempo di incubazione virale. Le procedure di induzione per la placcatura di base sono simili a quelle descritte nei punti da 2.1.1 a 2.1.8. Tuttavia, la placcatura di base non è una procedura invasiva e l'animale richiede solo una leggera sedazione. Pertanto, lo 0,8-1,2% di isoflurano è sufficiente, purché l'animale non possa muoversi sul telaio stereotassico. Inoltre, l'anestesia isoflurana relativamente leggera può anche aiutare a facilitare l'espressione dei transitori di fluorescenza dei neuroni durante il monitoraggio8 (Video supplementare S2).
- Tagliare con cura lo strato sottile del tetto in cemento dentale con un rongeur osseo e rimuovere la gomma siliconica. Pulire la superficie della lente del relè con alcool al 75%.
- Fissare una vite di fissaggio accanto alla piastra di base per fissarla alla parte inferiore del miniscopio (Figura 5A1).
NOTA: La piastra di base deve essere serrata saldamente sotto la parte inferiore del miniscopio perché la differenza tra una piastra di base serrata e leggermente fissata può causare una distanza incoerente. - Regolare la slitta di messa a fuoco in modo che si trovi a circa 2,7 - 3 mm dall'alloggiamento principale (Figura 5A2).
NOTA: Sebbene la lunghezza possa essere ulteriormente regolata durante la procedura di placcatura di base, fissarla a circa 2,7 mm, perché la regolazione simultanea della lunghezza del miniscopio e della lunghezza ottimale tra la lente relè impiantata e la lente dell'obiettivo preancorata è molto confusa. - Collegare il miniscope alla scheda di acquisizione dati e collegarlo a una porta USB 3.0 (o versione successiva) su un computer.
- Eseguire il software di acquisizione dati sviluppato dal team UCLA.
- Regolare l'esposizione a 255, il guadagno a 64x e il LED di eccitazione al 5%. Queste impostazioni sono consigliate per la placcatura di base iniziale; Le impostazioni specifiche variano a seconda delle regioni del cervello e dei livelli di espressione dell'indicatore di calcio geneticamente codificato.
- Fare clic sul pulsante Connetti per collegare il miniscope al software di acquisizione dati e guardare il livestream.
- Allineare manualmente la lente dell'obiettivo del miniscopio alla lente del relè e iniziare a cercare i segnali di fluorescenza (Figura 5B1).
NOTA: Inizialmente, la ricerca manuale del segnale di fluorescenza facilita le regolazioni. Poiché è stato utilizzato un sistema AAV per esprimere l'indicatore di calcio geneticamente codificato, sia il tipo di promotore che il sierotipo AAV hanno influenzato l'efficienza della trasfezione23,24. I ricercatori dovrebbero verificare l'espressione dell'indicatore di calcio trovando singoli neuroni che mostrano cambiamenti nella fluorescenza prima di procedere con esperimenti futuri. - Forare il cemento dentale in qualsiasi punto in cui blocca il miniscopio (opzionale).
- Guarda il live streaming del software di acquisizione dati e utilizza il margine dell'obiettivo relè come punto di riferimento (video supplementare S2). Il margine dell'obiettivo relè appare come un cerchio grigio simile a una luna sul monitor (Figura 5B1; frecce bianche).
- Una volta trovata la lente del relè, regolare attentamente i vari angoli e distanze del miniscopio fino a trovare i segnali di fluorescenza.
NOTA: Le immagini dei neuroni sono più bianche dello sfondo. Una precisa forma neuronale indica che i neuroni si trovano perfettamente sul piano focale della lente del relè. I neuroni rotondi suggeriscono che erano vicini al piano focale. La forma neuronale è diversa in tutto il cervello, qui CA1 ventrale è mostrato come esempio. - Se nessun singolo neurone mostra cambiamenti nella fluorescenza in funzione del tempo, richiudere la base con gomma siliconica. La fluorescenza non viene osservata perché il periodo di incubazione dipende anche dalla proprietà del virus23,24. Eseguire i passaggi 3.1-3.12 dopo un'ulteriore settimana. (Questo è facoltativo).
- Tenere il miniscopio nella posizione ottimale e spostare il braccio stereotassico con un'argilla adesiva riutilizzabile verso il miniscopio (Figura 5B2). Far aderire il miniscopio al braccio stereotassico con argilla adesiva riutilizzabile.
- Regolare leggermente i bracci x, y e z per cercare la visualizzazione migliore (video supplementare S2). Quindi, regolare l'angolo tra la superficie dell'obiettivo e l'obiettivo del relè ruotando la barra auricolare, la barra del dente o l'argilla adesiva riutilizzabile sull'asse z. L'espressione virale e l'impianto del cristallino hanno successo quando almeno una cellula mostra transitori di fluorescenza (Figura 6A; Video supplementare S2) durante il baseplating (che dipende anche dall'area del cervello, come il CA1).
NOTA: se il monitor mostra solo globuli bianchi ma nessun transitorio, esiste un'altra causa (vedere la Figura 6B, C, Video supplementari S4,S5, la sezione Risultati e la sezione Risoluzione dei problemi). - Cementare la piastra di base (Figura 5B2) con il cemento dentale.
- Monitorare la regione di interesse durante la cementazione per assicurarsi che la posizione ottimale non cambi.
- Utilizzare la minor quantità possibile di cemento incollando saldamente la piastra di base sulla base di cemento dentale (Figura 5B2). Applicare un secondo e un terzo strato di cemento attorno alla piastra di base, ma fare attenzione a non influenzare la lente GRIN.
NOTA: L'applicazione del cemento alla piastra di base è più semplice in questa fase poiché la base della piastra di base è stata formata durante la procedura di placcatura fittizia. - Staccare con attenzione il miniscopio dalla piastra di base quando il cemento è indurito. Quindi, avvitare un cappuccio protettivo.
- Sposta l'animale in una gabbia di recupero. Guarda l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale.
- Topi domestici individualmente. Assicurati che stia mangiando, bevendo e defecando normalmente ogni giorno. Attendere 5 giorni affinché il mouse si riprenda completamente e quindi controllare l'imaging del calcio.
NOTA: C'è solo una piccola quantità di cemento dentale che tiene la piastra di base. Pertanto, se la piastra di base si è spostata considerevolmente dalla procedura di baseplating, rimuovere il cemento dentale con un trapano eseguire nuovamente la procedura di baseplating. - Anestetizzare (mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (87 mg/kg) / xilazina (13 mg/kg)) e perfondere25 l'animale quando tutti gli esperimenti sono fatti.
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Representative Results
Valutazione dell'alterazione del volume del cemento dentale
Poiché il volume del cemento dentale cambia durante il processo di polimerizzazione, può influire in modo significativo sulla qualità dell'immagine, dato che la distanza di lavoro di una lente GRIN è di circa 50-350 μm 4,8. Pertanto, in questo caso sono stati testati due cementi dentali disponibili in commercio, Tempron e Tokuso, prima della procedura di impianto e di baseplating (Figura 5). I video sono stati prima valutati per determinare se i cementi si erano ridotti e quindi i volumi dei cementi sono stati confrontati quando completamente essiccati. La stessa concentrazione e gli stessi volumi delle miscele iniziali di cementi dentali sono stati caricati nelle punte delle pipette e videoregistrati (video supplementare S1). Il video S1 ha dimostrato che entrambi i cementi si sono ridotti durante il processo di essiccazione. Tokuso ha ottenuto risultati migliori di Tempron (cioè, aveva un volume maggiore di Tempron anche dopo la contrazione): Figura 3B; volume medio di Tempron: 0,93 ± 0,07 ml; volume medio di Tokuso: 1,18 ± 0,07 ml; T-test: p = 0,048, t(6) = 2,46, suggerendo che si è ridotto meno. Anche le densità dei cementi sono state testate 4 volte dopo la completa essiccazione. Tokuso aveva una densità media inferiore a Tempron (densità media di Tempron: 1,07 ± 0,12 g/ml; densità media di Tokuso: 0,93 ± 0,08 g/ml; t-test: p = 0,38, t(6) = -0,94), il che implica che aveva un tasso di ritiro inferiore. Pertanto, Tokuso è stato utilizzato per le seguenti fasi di impianto e baseplating. Lo scopo nel descrivere l'esperimento di cui sopra non è quello di raccomandare alcuna marca, ma piuttosto di ricordare agli sperimentatori di trovare un cemento dentale che non subisca un notevole cambiamento di volume durante la polimerizzazione.
Misurazione dello spostamento dell'immagine
Abbiamo simulato le procedure di baseplating fittizio e di baseplating originale su un oggetto fisso per verificare se la procedura di baseplating fittizia comporta uno spostamento minore nella posizione della piastra di base rispetto alla procedura originale. Un adesivo fotopolimerizzabile è stato utilizzato per fissare un ago da siringa da 23 G da 2,5 cm al centro di una piastra di base con 1 cm che sporge dalla piastra di base (Figura 3C). Quindi, la placcatura di base è stata simulata tenendo gli aghi con il braccio di uno strumento stereotassico. Invece di usare animali da laboratorio, un adesivo è stato attaccato sul tavolo dello strumento stereotassico. L'ago della siringa ha perforato l'adesivo, rappresentando così la posizione originale. Quindi, l'ago è stato sollevato di 0,5 mm e sono stati avviati gli interventi chirurgici di simulazione. In un intervento chirurgico che imitavala procedura di baseplating 8, il cemento dentale è stato applicato fino a coprire la piastra di base, che era 1 cm sopra l'adesivo. Quindi, c'è stato un periodo di attesa di 2 ore per la polimerizzazione del cemento prima di spingere delicatamente l'ago per perforare nuovamente l'adesivo. Poiché l'adesivo fotopolimerizzato non stabilizzava completamente l'ago, l'ago poteva essere spinto più in profondità per creare un altro foro, che rappresentava la posizione della piastra di base dopo che il cemento dentale si era asciugato. La distanza tra il foro iniziale e il secondo foro è stata misurata per quantificare lo spostamento di posizione dell'ago. I risultati hanno dimostrato che la piastra di base 1 cm sopra il cranio ha comportato uno spostamento di posizione di 1,76 ± 0,14 mm, ma la placcatura di base fittizia ha comportato uno spostamento di soli 0,75 ± 0,17 mm (Figura 3D; distanza media di spostamento della placcatura di base una tantum rispetto alla placcatura di base fittizia; test t: p < 0,01, t (8) = 6,03).
Inoltre, eravamo curiosi di sapere se l'altezza del cemento dentale avrebbe influenzato lo spostamento. Pertanto, abbiamo ulteriormente testato un'altezza più corta (Figura 3E; 0,5 cm sopra) utilizzando la procedura di baseplating una tantum. La piastra di base che era ancorata 0,5 cm sopra il cranio si spostava significativamente meno della piastra di base 1 cm sopra il cranio (Figura 3F; distanza media di spostamento: 0,43 ± 0,11 vs 1,76 ± 0,14 mm; test t: p < 0,01, t(8) = 9,73). I dati suggerivano che l'altezza della piastra di base sopra il cranio e la distanza spostata dalla piastra di base erano positivamente correlate. Poiché la procedura di baseplating fittizio è seguita da una seconda fase di baseplating che utilizza solo una quantità minima di cemento dentale, questi dati supportano anche l'ipotesi che la baseplating fittizia aiuti a migliorare la precisione della procedura di baseplating.
Imaging con un miniscopio a due lenti
Seguendo i protocolli chirurgici per l'infusione virale, il baseplating fittizio e il baseplating (Figura 2, Figura 4, Figura 5), abbiamo osservato transitori di fluorescenza di singoli neuroni in tre topi (n = 3/5) (Figura 6A, Video supplementare S3) durante la procedura di baseplating e dopo la procedura di baseplating mentre i topi si muovevano liberamente, confermando che la distanza di lavoro tra l'obiettivo e le lenti del relè è rimasta la stessa (Figura 6A1 rispetto alla figura 6A3, si è verificato solo un leggero spostamento di posizione) dopo che il cemento dentale si era completamente asciugato. Qui, forniamo video della placcatura di base di un mouse (video supplementare S2; mouse #5) e successiva imaging del calcio mentre i topi si muovevano liberamente (video supplementare S3; mouse #3, #4, #5; dati grezzi). Si noti che il software di acquisizione dati per V3 non contiene funzioni per la sottrazione dello sfondo e il contrasto del video può essere migliorato con l'elaborazione offline). Per il video supplementare S2, è stata eseguita una ricerca manuale per i segnali di fluorescenza e quindi il miniscopio è stato collegato al braccio stereotassico per le regolazioni fini. Durante il sondaggio sono stati osservati alcuni transitori di fluorescenza (Video supplementare S2; Figura 6A). Un transitorio è uno spostamento graduale della luminosità in macchie grigie o bianche, non un modello di accensione simile a una luce lampeggiante; Le figure da 6A 1 a 6A2 mostrano immagini di transitori. Il video di topi che si comportano liberamente ha mostrato uno spostamento spaziale accettabile rispetto alla regione di interesse durante la procedura di baseplating (video supplementare S3). I margini delle cellule non potevano essere significativamente migliorati in questa fase perché non potevamo regolare la distanza tra la parte inferiore della lente del relè e i neuroni attivi. In particolare, alcuni problemi possono verificarsi frequentemente durante la procedura di baseplating, tra cui l'assenza di qualsiasi cosa tranne uno sfondo uniforme (Figura 6B; Video supplementare S4) o visibilità dei margini dei globuli bianchi senza transitori di fluorescenza (Figura 6C; Video supplementare S5). Vengono inoltre forniti due esempi di risultati negativi (n = 2/5) (Figura 6B,C, Video supplementari S4, S5). Le potenziali cause degli errori vengono esaminate nella sezione Discussione. Le procedure chirurgiche per questi due topi sono state eseguite senza utilizzare un ago di 1 mm di diametro per liberare il percorso; Pertanto, la lente del relè è stata impiantata direttamente. Proponiamo che nel topo #2, la lente del relè possa aver compresso i neuroni e trascinato alcuni neuroni verso il basso, causando neuroni danneggiati. Pertanto, non sono stati trovati transitori di fluorescenza.
Figura 1: Meccanismi del miniscopio e difetti che di solito causano errori di imaging . (A) Diagramma a fumetti della lente relè e della lente obiettiva che mostra i meccanismi necessari per la visualizzazione delle celle fluorescenti in un sistema a due lenti. Le onde di segnalazione di ciascuna lente sottolineano l'importanza e il meccanismo coinvolto nel trovare una distanza di lavoro per visualizzare le celle fluorescenti. (A1) La lente GRIN del relè è posizionata sopra i neuroni bersaglio entro la distanza di lavoro. Poiché il passo della lente relè è 0,5 * N (dove N è un numero intero), la lente consente la visualizzazione dei neuroni bersaglio trasmettendo la luce, portando i segnali di fluorescenza originali nella parte superiore della lente del relè. Quindi, circa 1/4 di un periodo sinusoidale completo di luce viaggia attraverso la lente GRIN dell'obiettivo (~ 0,25 passo) e si traduce in un'immagine ingrandita. (A2) L'obiettivo trasmette le immagini a un sensore complementare metallo-ossido-semiconduttore (CMOS) situato sulla parte superiore (la piastra verde nel diagramma) del miniscopio. (B) Diagramma a fumetti che presenta le differenze nelle procedure di impianto della lente GRIN tra un sistema a due lenti (B1) e (B2) un sistema a una lente. In generale, la differenza principale è che il sistema a una lente utilizza direttamente la sua lente obiettiva per visualizzare la superficie del cervello; Di conseguenza, la lente obiettiva deve essere impiantata sopra i neuroni bersaglio. (C) Al contrario, nel sistema a due lenti, in confronto, una lente relè aggiuntiva viene impiantata nel cervello e la lente dell'obiettivo è preancorata nel miniscopio. (C1) La forma della piastra di base per la versione V3 dell'UCLA Miniscope può causare uno spostamento irregolare dopo che il cemento dentale si asciuga completamente. (C2) Questo spostamento causa disallineamento o deviazione dalla distanza di lavoro tra l'obiettivo del relè e l'obiettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Protocolli modificati e protocolli chirurgici dettagliati per migliorare il tasso di successo del sistema di miniscopio a due lenti. (A1) Protocollo chirurgico modificato per il sistema a due lenti. Vengono mostrate le posizioni dell'iniezione virale e l'impianto della lente GRIN del relè. Il baseplating fittizio consente alla distanza di lavoro di comprendere con precisione i neuroni di interesse e riduce lo spostamento posizionale associato alla procedura di baseplating (A2). Quindi, (A3) la probabilità di imaging delle cellule fluorescenti nei topi che si comportano liberamente è aumentata. (B) Immagine a fumetti dei passaggi per l'iniezione virale e posizionamento della lente GRIN del relè. (B1) In primo luogo, segnare l'ago di aspirazione con una penna a circa 1 mm (per esperimenti su topi) dalla punta per aiutare nella valutazione della profondità di aspirazione della corteccia. Quindi, aspirare il tessuto connettivo e la corteccia (circa 1 mm di profondità nei topi) dal cervello. (B2) Utilizzare l'ippocampo ventrale come area target per impiantare una lente relè; In particolare, il duro corpo calloso è il punto di riferimento per fermare l'aspirazione della regione corticale. La trama fibrosa del corpo calloso può essere vista sotto lo stereomicroscopio durante l'aspirazione. (B3) In secondo luogo, perforare il punto di interesse con un ago interno di un catetere da 20 G (circa 1 mm di diametro; il diametro è simile a quello della lente del relè) per liberare un percorso prima dell'infusione virale. Sotto lo stereomicroscopio, dovrebbe essere visibile un'ammaccatura (cerchio tratteggiato nell'immagine) creata dall'ago. Abbassare l'ago di microiniezione e la lente del relè sull'ammaccatura (o a soli 250 μm di distanza dal centro dell'ammaccatura). Infine, posizionare l'obiettivo GRIN relè (nel presente studio, abbiamo usato un obiettivo relè di 1 mm di diametro). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Misurazione della variazione di volume del cemento dentale polimerizzato . (A) Un esempio con cemento dentale polimerizzato di due marche. Le frecce nere indicano i livelli originali dopo aver mescolato la polvere e la soluzione. Le frecce bianche indicano i livelli dopo 10, 20 e 40 minuti di polimerizzazione. Le frecce rosse indicano il fondo delle punte, che sono state sigillate con colla fotopolimerica. (B) Volumi medi dei cementi dentali rimanenti dopo che si sono completamente asciugati. Le barre e le barre di errore sono il mezzo ± SEM. * indica la significatività (P < 0,05) determinata dal test t di Student. (C) Illustrazioni e una fotografia che spieghi il metodo utilizzato per misurare lo spostamento di posizione della piastra di base. Un ago è stato incollato attraverso la piastra di base ed è stato utilizzato per simulare la procedura di baseplating originale (baseplating one-step) e la procedura di baseplating fittizio. Le frecce rosse e nere rappresentano le posizioni dell'ago prima e dopo che il cemento dentale è stato curato. (D) Variazioni della distanza media della punta dell'ago (E) Illustrazioni del metodo utilizzato per misurare la relazione tra la piastra di base sopra il livello del cranio e lo spostamento della posizione. (F) Variazioni della distanza media della punta dell'ago. Le barre e le barre di errore sono il mezzo ± SEM. ** indica la significatività (P < 0,01) determinata dal test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Procedura dettagliata di baseplating fittizio (eseguita immediatamente dopo l'impianto della lente relè). (A1) Cartone animato in tre fasi dell'obiettivo e dell'assemblaggio della pellicola di paraffina sul miniscopio. (A2) Versione fotografica dell'assemblea. (B1) Cartone animato che mostra la procedura di baseplating fittizio. Innanzitutto, il miniscopio assemblato è allineato con l'obiettivo del relè. L'obiettivo posizionato è il più vicino possibile all'obiettivo del relè. In secondo luogo, il cemento dentale viene aggiunto al parafilm che circonda la piastra di base e applicato sul cranio per creare uno stampo femminile per la futura placcatura di base. Quindi, la piastra di base viene rimossa e la gomma siliconica di stampaggio (rosa) viene aggiunta e completata con cemento dentale per proteggere lo stampo femmina e la lente del relè. L'animale è quindi autorizzato a riprendersi dall'anestesia. Dopo almeno 3 settimane, viene eseguita la procedura di baseplating. (B2) Versione fotografica di (B1). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Fasi della procedura di baseplating. (A1) Fissare la piastra di base e (A2) regolare manualmente il cursore di messa a fuoco da 2,7 a 3 mm. Un'impostazione da 2,7 a 3 mm (nella posizione mostrata nella figura) sembra essere il miglior punto di partenza prima di cercare manualmente le celle fluorescenti. (B1) Il primo diagramma a fumetti illustra l'importanza della lunghezza tra la lente dell'obiettivo e la lente relè per la visualizzazione delle celle fluorescenti (le celle fluorescenti sono solitamente osservate a una distanza compresa tra 0,5 e 2 mm). Prima che la cella fluorescente emerga, il ricercatore dovrebbe vedere il margine della lente relè (frecce nell'immagine in alto). È utile prima regolare manualmente l'obiettivo nella posizione di visualizzazione ottimale perché è più facile effettuare regolazioni rapide a mano. (B2) Posizionare argilla adesiva riutilizzabile sulla sonda del braccio stereotassico, quindi stabilizzare il miniscopio facendolo aderire al braccio con argilla adesiva riutilizzabile. In questa fase, la regione di interesse potrebbe essersi spostata, ma questo può essere facilmente risolto regolando leggermente il braccio stereotassico e l'argilla adesiva riutilizzabile. Dopo aver controllato e trovato la regione ottimale di interesse, aggiungere una piccola quantità di cemento dentale (rappresentato in rosso). Incollare la piastra di base con il minor cemento dentale possibile. Separare il miniscopio e la piastra di base dopo che il cemento dentale si asciuga. Se la piastra di base non è abbastanza stabile, aggiungere ulteriore cemento dentale. (C) Questo diagramma illustra l'importanza di ogni passo per raggiungere il successo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Esempi di successo e fallimento durante la procedura di baseplating. (A) Un esempio di imaging riuscito durante la procedura di baseplating. La lente relè mirava all'ippocampo ventrale. Sono stati osservati transitori di fluorescenza quando l'animale era sotto anestesia con isoflurano (vedi anche Video supplementare S2). (A2) Il contrasto è stato aumentato per una migliore visibilità. Le linee tratteggiate rosse indicano i vasi sanguigni. (A3) Transitori di fluorescenza cinque giorni dopo la placcatura di base quando il topo # 5 si comportava liberamente nella sua gabbia domestica (vedi anche Video supplementare S3; le immagini dei topi #3 e #4 sono fornite anche nel video supplementare S3). Si è verificato solo un leggero spostamento di posizione. (B1) Un esempio di fallimento. Durante la placcatura di base, sono state notate solo aree bianche / grigie omogenee che non erano di forma cellulare (vedi anche Video supplementare S4). (B2) La lente del relè mancava l'area bersaglio e si trovava sopra una regione senza cellule infette. (C1) Un altro esempio di fallimento. In questo topo, sebbene siano state osservate molte cellule rotonde, non sono stati osservati transitori di fluorescenza durante la placcatura di base (dopo tre settimane di incubazione e mentre il topo era anestetizzato / sedato). Inoltre, non sono stati applicati transitori di fluorescenza quando la procedura di placcatura di base è stata eseguita nuovamente (nella quinta settimana di incubazione) o anche quando l'animale si comportava liberamente. L'immagine è stata ottenuta durante la placcatura di base alla quinta settimana di incubazione (vedi anche Video supplementare S5). (C2 e C3) La lente del relè mancava lo strato piramidale dell'ippocampo ventrale. I punti blu sono nuclei che sono stati colorati con DAPI. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Problema | Possibile causa | Soluzione | ||
| Aveva una buona immagine durante la placcatura di base ma completamente fuori fuoco il giorno successivo | Variazione di volume dopo l'indurimento del cemento dentale tra il cranio del soggetto e la piastra di base | Procedere al "fittizio baseplating" dopo la procedura di impianto della lente come suggerito nel presente rapporto. Scegli un cemento dentale che abbia meno variazioni di volume. | ||
| Ha aree bianche/grigie omogenee senza alcuna forma simile a una cella durante la placcatura di base (vedi anche video supplementare S4) | Un. La lente del relè ha mancato l'area target B. Cattiva espressione dell'indicatore di fluorescenza C. Dimenticare di installare una lente obiettiva sotto il miniscopio dove l'indicatore di fluorescenza è effettivamente espresso | A. Utilizzare lenti fittizie per praticare interventi chirurgici. Controllare le coordinate della lente fittizia dopo l'impianto praticato B. Trova un titolo virale ottimale per gli esperimenti di imaging del calcio (riferimento a Resendez et al. 2016). Se per qualche motivo, il pretest non può essere condotto, si consiglia ai principianti di provare prima un titolo più alto. (Vedi la sezione Disscusion per i dettagli) C. Avvitamento su un obiettivo GRIN (~ 0,25 passo. es: Edmund Optics; Stock #64-519) nella parte inferiore del miniscope. | ||
| Osservare molte cellule ma nessuna dinamica di fluorescenza durante la placcatura di base | A. Neuroni malsani o neuroni morti B. Tipo di neuroni sparsi C. Stato di anestesia profonda | R. Fare attenzione per ogni procedura chirurgica. Utilizzare un nuovo ago per siringhe simile al diametro della lente del relè per tagliare prima il percorso di infusione/impianto per rilasciare la pressione mediante l'impianto della lente. Infondere lentamente il virus e impiantare lentamente la lente. B. Attendere più tempo per monitorare le attività dei neuroni o pizzicare un po 'la coda per stimolare il topo. C. La placcatura di base non è una procedura invasiva e l'animale ha solo bisogno di sedazione. Pertanto, è sufficiente mantenere l'isoflurano 1,2 ~ 0,8%, purché l'animale non sia in grado di muoversi sul telaio stereotassico. | ||
Tabella 1: Tabella dei problemi relativi alla risoluzione dei problemi.
Video supplementare S1: Test del volume del cemento dentale. La differenza tra il volume è stata misurata all'inizio della preparazione del cemento dentale e che il volume dopo l'essiccazione del cemento. Sono state testate due marche di cemento dentale (ad esempio, Tempron e Tokuso Curefast). Per testare il volume del cemento dentale dopo l'essiccazione, sono stati pesati 0,5 g di ciascuna polvere di cemento dentale e miscelati con la sua soluzione appropriata (1 ml). Quindi, le punte delle pipette da 0,1-10 μL sono state caricate con 2,5 μL della miscela di cemento dentale e sigillate con colla fotopolimerizzata. Quindi, le punte sono state posizionate su un rack, le superfici delle miscele di cemento dentale sono state contrassegnate e videoregistrate per 40 minuti. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare S2: Dimostrazioni della procedura di baseplating. L'angolo tra la superficie dell'obiettivo e la lente relè è stato regolato ruotando la barra auricolare, la barra del dente o l'argilla adesiva riutilizzabile sull'asse z. Il margine dell'obiettivo del relè appariva come un cerchio grigio simile alla luna sul monitor. Il successo dell'espressione virale e dell'impianto del cristallino dovrebbe rivelare almeno una dinamica di fluorescenza (frecce) durante la placcatura di base. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare S3: Dimostrazioni della dinamica della fluorescenza in topi che si comportano liberamente. Transienti di fluorescenza da topi #3, #4 e #5. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare S4: Un esempio di errore. Uno sfondo uniforme è apparso durante la procedura di baseplating. Si noti che l'alterazione della luminosità non era dovuta ai transitori di fluorescenza delle singole cellule; È stato causato dalla procedura di ricerca. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare S5: Dimostrazione di un altro esempio di guasto. Una mancanza di transitori di fluorescenza si è verificata durante la procedura di placcatura di base, ma alcuni margini delle cellule rotonde erano ancora visibili. Si noti che l'alterazione della luminosità non è stata causata dai transitori di fluorescenza delle singole cellule; È stato causato dalla procedura di ricerca. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Il presente rapporto descrive un protocollo sperimentale dettagliato per i ricercatori che utilizzano il sistema Miniscope UCLA a due lenti. Gli strumenti progettati nel nostro protocollo sono relativamente convenienti per qualsiasi laboratorio che desideri provare l'imaging del calcio in vivo . Alcuni protocolli, come l'iniezione virale, l'impianto di lenti, il baseplating fittizio e il baseplating, potrebbero anche essere utilizzati per altre versioni del sistema miniscope per migliorare il tasso di successo dell'imaging del calcio. Oltre ai problemi generali con l'iniezione virale e l'impianto della lente che devono essere risolti indipendentemente dalla versione del miniscopio, la struttura della piastra di base UCLA può causare uno spostamento di posizione, che può portare a distanze di lavoro non corrispondenti tra l'obiettivo e le lenti del relè (Figura 1C). È stato sviluppato un protocollo sperimentale modificato per ridurre al minimo lo spostamento di posizione delle due lenti (Figure 2, Figura 4, Figura 5). L'imaging del calcio di successo può essere ottenuto attraverso una combinazione di espressione virale di successo, impianto del cristallino e procedure di placcatura di base (Figura 5C). L'utilizzo di un sistema a due lenti per osservare le aree cerebrali profonde richiede un alto livello di precisione nelle procedure di baseplating perché anche le posizioni relative della lente relè impiantata e della lente obiettiva devono essere accurate. Questo rapporto non solo presenta un protocollo che risolve i problemi di baseplating, ma discute anche alcuni suggerimenti per l'iniezione virale e l'impianto della lente. Di seguito, discutiamo prima le procedure di baseplating, seguite dall'iniezione virale e dalle procedure di impianto della lente, e descriviamo alcuni esempi di fallimenti (Figura 6).
Placcatura di base
La versione V3 dell'UCLA Miniscope è attualmente il design più comunemente utilizzato e può essere ordinato online. La piastra di base di questa versione è costituita da due bordi senza pareti (Figura 1C1), ma la sua forma può causare uno spostamento irregolare (Figura 1C1, C2) dopo che il cemento dentale è completamente asciutto. Le procedure di baseplating fittizio nel nostro protocollo (Figura 4) riducono al minimo i problemi di disallineamento e spostamento della piastra di base perché utilizza film di paraffina per ridurre lo spazio disponibile per il cemento dentale durante la placcatura di base reale (Figura 5B). Lo spazio rimanente è ancora sufficiente per trovare una posizione di imaging ottimale durante la procedura di baseplating reale. Pertanto, il ricercatore può incollare la piastra di base con il minor cemento dentale possibile (Figura 5B2). Inoltre, la procedura di baseplating fittizio richiede relativamente poco tempo (circa 15-20 minuti) poiché non richiede una distanza perfetta tra l'obiettivo e la lente relè per essere raggiunta. Tuttavia, la placcatura di base fittizia è solo uno dei fattori chiave per il successo dell'imaging del calcio; Ad esempio, durante il monitoraggio dei segnali di fluorescenza, i neuroni possono apparire sfocati se sono leggermente fuori dal piano di lavoro (a seconda della distanza di lavoro della lente del relè; spesso circa 100 ~ 300 μm). La capacità di migliorare la distanza di lavoro è limitata, poiché la distanza di lavoro dei neuroni è predeterminata dalla procedura di impianto della lente relè. È stato eseguito un esperimento senza la procedura di baseplating fittizio e la regione di interesse è stata sempre (in quattro topi su quattro) persa dopo una placcatura di base. Pertanto, queste soluzioni sono state ideate per ridurre il problema del restringimento. Alcuni cementi dentali fotopolimerizzabili possono evitare il problema del restringimento durante la polimerizzazione perché polimerizzano molto rapidamente; Questi cementi possono aiutare i ricercatori a regolare la distanza durante la procedura di baseplating. Sebbene la gamma di lunghezze d'onda per eccitare gli indicatori di calcio e polimerizzare il cemento dentale sia diversa, è necessario prevenire il fotosbiancamento durante la procedura di placcatura di base. Al fine di prevenire il fotosbiancamento, la gamma di lunghezze d'onda generate dalla sorgente luminosa deve essere piuttosto stretta per evitare reazioni crociate tra gli indicatori di calcio e il cemento dentale fotopolimerizzato. Pertanto, l'uso di cemento dentale fotopolimerizzato non è raccomandato per la procedura di baseplating. Inoltre, alcune marche specifiche di cementi dentali sono frequentemente utilizzate per l'incollaggio di piastre di base da altri gruppi di ricerca 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . Le proprietà di basso ritiro di questi cementi possono risolvere il problema, ma non abbiamo avuto l'opportunità di testare questi marchi a causa delle difficoltà nell'acquisto (importazione). I prodotti di grado medico possono essere soggetti a normative di importazione a seconda del paese/regione. Se i ricercatori hanno difficoltà ad accedere ai cementi menzionati in letteratura 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, il nostro protocollo risolverà il problema del ritiro del cemento dentale.
Oltre al problema del ritiro, nel corso di molti esperimenti può verificarsi usura strutturale nel miniscopio stesso e sulla piastra di base (in particolare i magneti nella piastra di base). Qualsiasi piccolo spazio causato dall'usura riduce la stabilità della distanza tra le due lenti. Ancora una volta, la precisione sull'intero percorso ottico è la chiave per l'imaging dei transitori di calcio nei topi che si comportano liberamente usando un miniscopio.
Risoluzione dei problemi relativi all'iniezione virale/impianto del cristallino
Prima di infondere il virus nella regione del cervello, si consiglia di montare un nuovo ago sul braccio stereotassico e perforare lentamente il cervello alle coordinate appropriate. Poiché il nuovo ago è molto affilato, questa perforazione serve come fase di preparazione per liberare il percorso (o tagliare un percorso) per l'ago di microiniezione e la lente del relè e riduce al minimo il danno tissutale, che può essere causato dalla compressione dall'ago di microiniezione o dalla lente del relè. L'ago affilato taglia un percorso per la lente del relè smussato; Pertanto, la punta dell'ago deve essere abbassata alle stesse coordinate con la lente del relè. L'ago interno di un catetere per via endovenosa da 20 G è stato scelto perché aveva un diametro di 1 mm, simile al diametro della nostra lente a relè. È possibile utilizzare un calibro ad ago diverso a seconda del diametro della lente del relè.
Sebbene il presente studio non si sia concentrato sulle proprietà e sui titoli dei vettori virali, questi fattori sono ancora critici per il successo dell'imaging del calcio (Figura 5C). È necessario testare preventivamente la qualità di espressione del vettore virale. I passaggi da 1 a 5 del protocollo di Resendez et al. forniscono metodi dettagliati per l'identificazione di un titolo virale ottimale per gli esperimenti di imaging del calcio8. Se il pretest non può essere condotto per qualche motivo, si consiglia ai principianti di provare prima un titolo relativamente alto. Uno degli svantaggi dell'utilizzo di un titolo virale elevato è citotossicità8. I neuroni morti danno origine all'autofluorescenza e sono visibili come macchie bianche luminose sotto il miniscopio8. Tuttavia, questi neuroni morti sono buoni punti di riferimento per i principianti per trovare e praticare la procedura di baseplating. D'altra parte, sebbene l'infusione di un virus a basso titolo abbia un rischio inferiore di uccidere le cellule, la fluorescenza può essere mascherata dallo sfondo se le cellule non mostrano transitori di fluorescenza durante la procedura di placcatura di base. È difficile individuare le ragioni del fallimento perché i neuroni bersaglio possono essere persi a causa dell'impianto della lente relè o a causa della scarsa espressione da parte del vettore virale. Determinare la causa è molto confuso senza conferma istologica. Pertanto, l'uso di virus a titolo relativamente alto è raccomandato se i vettori virali non possono essere pretestati.
Resendez et al. raccomandano di inserire l'ago di microiniezione 250 μm lateralmente e ventrale al posizionamento della lente. Le nostre osservazioni hanno dimostrato che l'infusione del virus alla stessa profondità della lente del relè può anche portare all'espressione di buoni segnali di calcio. Proponiamo che, a causa della possibilità di infezione e diffusione, l'infusione del virus alla stessa profondità della coordinata della lente relè sia ottimale per ridurre il danno tissutale e aumentare la precisione della distanza tra i neuroni infetti e la lente del relè. Resendez et al raccomandano anche di eseguire l'iniezione virale e l'impianto della lente durante lo stesso intervento chirurgico, data la stretta gamma di distanze di lavoro tra le cellule bersaglio e la lente relè8. Tuttavia, alcuni ricercatori seguono un protocollo in cui la fase di infusione virale e la fase di impianto della lente sono condotte a due (o più) settimane di distanza18,26. L'allungamento del tempo tra una fase e l'altra riduce il tempo operativo individuale. Ma in questo protocollo questi due passaggi sono stati fusi in un unico intervento chirurgico, perché nel protocollo a un intervento chirurgico, il chirurgo può monitorare la posizione tra l'ago di microiniezione e la lente del relè quando li abbassa nell'area target, il che riduce la possibilità di fallire il targeting (Figura 2B3).
Per due topi (topi #1 e #2), è stato omesso anche l'uso di un ago per creare un percorso per la lente, e nel topo #2 sono state osservate macchie grigie rotonde simili a cellule (Figura 6C). Tuttavia, non sono state osservate dinamiche di fluorescenza (video supplementare S5). Dopo aver esaminato la fetta di cervello di questo esempio (Figura 6C2, C3), abbiamo postulato che la lente del relè trascinasse alcune cellule verso il basso mentre veniva abbassata. Questi neuroni trascinati erano malsani, quindi non è stata notata alcuna attività durante la procedura di baseplating o durante l'esperimento.
Abbiamo avuto un topo con un segnale grigio completamente omogeneo e nessuna immagine visibile simile a una cella durante la procedura di placcatura di base (Figura 6B1). Dopo aver sacrificato il topo sono state osservate le sue fette di cervello. Si notò che la lente si trovava sul lato mediale dello strato piramidale curvo; l'area target (Figura 6B2) è stata completamente mancata. Questi tentativi infruttuosi sono stati esperienze critiche che ci hanno portato a modificare il nostro protocollo chirurgico e alla fine avere successo con tre topi (Video supplementare S3).
Ago per microiniezione
Il corpo calloso è un tratto fibroso duro che si sovrappone all'ippocampo dorsale. A causa della sua rigidità, resiste alla penetrazione di un ago da microiniezione a punta piatta. Pertanto, si consiglia di utilizzare un ago per microiniezione con una punta smussata. Questo tipo di ago non solo riduce il danno tissutale, ma riduce anche la possibilità di infondere il virus nell'area bersaglio a causa del blocco da parte delle fibre vicine. Abbiamo riassunto i problemi sopra menzionati in una tabella di risoluzione dei problemi (Tabella 1).
Lasso di tempo
L'intervallo di tempo per l'intera procedura è riepilogato nella Figura 2A, con i giorni come unità. Nel dettaglio, la parte chirurgica (iniezione virale, impianto di lenti relè, baseplating fittizio) può richiedere 3 ore per i principianti o 1,5 ore per ricercatori sufficientemente addestrati. I topi hanno una piccola dimensione corporea e un metabolismo veloce e sono più suscettibili ai problemi di salute causati da lunghi periodi sotto anestesia rispetto alle specie più grandi27. I ricercatori dovrebbero mirare a mantenere il tempo trascorso in chirurgia sotto le 3 ore. La placcatura di base reale può essere eseguita dopo 3-6 settimane di espressione dell'indicatore di calcio. Questa procedura può richiedere 1 ora. La successiva osservazione longitudinale dell'attività del calcio può essere continuata per più di 1 mese.
Conclusioni
L'UCLA Miniscope è un dispositivo di imaging del calcio in vivo open source. Senza una piastra di base o un modulo obiettivo preinstallato e pronto all'uso, le persone che conducono esperimenti devono essere in grado di raggiungere con precisione la distanza ottimale tra l'obiettivo e la lente relè durante la procedura di baseplating. La maggiore difficoltà di utilizzare il sistema Miniscope UCLA a due lenti risiede nella variazione di volume del cemento dentale. Abbiamo ottimizzato i protocolli originali e ridotto al minimo i difetti causati dai problemi sopra menzionati, aumentando così il tasso di successo dell'imaging del calcio con il sistema Miniscope UCLA a due lenti.
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Disclosures
Questo non è uno studio supportato dall'industria. Gli autori non segnalano conflitti di interesse finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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