Summary
يؤدي انكماش الأسمنت السني أثناء المعالجة إلى إزاحة الصفيحة الأساسية. يقلل هذا البروتوكول من المشكلة عن طريق إنشاء أساس أولي لأسمنت الأسنان يترك مساحة لتدعيم الصفيحة الأساسية. بعد أسابيع ، يمكن تثبيت الصفيحة الأساسية في موضعها على هذه السقالة باستخدام القليل من الأسمنت الجديد ، وبالتالي تقليل الانكماش.
Abstract
يستخدم علماء الأعصاب المجاهر المصغرة (المناظير) لمراقبة النشاط العصبي في الحيوانات التي تتصرف بحرية. يوفر فريق Miniscope بجامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (UCLA) موارد مفتوحة للباحثين لبناء مناظير صغيرة بأنفسهم. يعد V3 UCLA Miniscope أحد أشهر المناظير مفتوحة المصدر المستخدمة حاليا. يسمح بتصوير العابرات الفلورية المنبعثة من الخلايا العصبية المعدلة وراثيا من خلال عدسة موضوعية مزروعة على القشرة السطحية (نظام أحادي العدسة) ، أو في مناطق الدماغ العميقة من خلال مزيج من عدسة ترحيل مزروعة في الدماغ العميق وعدسة موضوعية مثبتة مسبقا في المنظار الصغير لمراقبة الصورة المنقولة (نظام ثنائي العدسات). حتى في ظل الظروف المثلى (عندما تعبر الخلايا العصبية عن مؤشرات مضان ويتم زرع عدسة الترحيل بشكل صحيح) ، يمكن أن يؤدي تغيير حجم الأسمنت السني بين الصفيحة الأساسية وتعلقها بالجمجمة عند معالجة الأسمنت إلى اختلال المحاذاة مع تغيير المسافة بين الهدف وعدسات التتابع ، مما يؤدي إلى ضعف جودة الصورة. الصفيحة الأساسية هي صفيحة تساعد على تركيب المنظار الصغير على الجمجمة وتثبت مسافة العمل بين الهدف وعدسات الترحيل. وبالتالي ، فإن التغيرات في حجم الأسمنت السني حول الصفيحة الأساسية تغير المسافة بين العدسات. يهدف البروتوكول الحالي إلى تقليل مشكلة الاختلال الناتجة عن التغيرات في الحجم في الأسمنت السني. يقلل البروتوكول من اختلال المحاذاة عن طريق بناء أساس أولي لأسمنت الأسنان أثناء زرع عدسة التتابع. وقت النقاهة بعد الزرع كاف لأساس الأسمنت السني لعلاج الصفيحة تماما ، لذلك يمكن تدعيم الصفيحة على هذه السقالة باستخدام أقل قدر ممكن من الأسمنت الجديد. في هذه المقالة ، نصف استراتيجيات الطلاء الأساسي في الفئران لتمكين تصوير النشاط العصبي باستخدام عدسة موضوعية مثبتة في المنظار المصغر.
Introduction
تعتبر مراسلات النشاط الفلوري مثالية لتصوير النشاط العصبي لأنها حساسة ولها نطاقات ديناميكية كبيرة1،2،3. لذلك ، يستخدم عدد متزايد من التجارب الفحص المجهري الفلوري لمراقبة النشاط العصبي مباشرة1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، 16. تم تصميم أول مجهر مضان مصغر أحادي الفوتون (miniscope) في عام 2011 بواسطة Mark Schnitzer et al.5. يمكن هذا المنظار الصغير الباحثين من مراقبة ديناميكيات التألق للخلايا المخيخية في الحيوانات التي تتصرف بحرية5 (أي دون أي تقييد جسدي أو تقييد للرأس أو تخدير أو تخدير للحيوانات). حاليا ، يمكن تطبيق هذه التقنية لمراقبة مناطق الدماغ السطحية مثل القشرة6،8،15،16. المناطق تحت القشرية مثل الحصين الظهري8،11،13،14 والمخطط6،17 ؛ ومناطق الدماغ العميقة مثل الحصين البطني14 واللوزة10،18 ، وما تحت المهاد8،12.
في السنوات الأخيرة ، تم تطوير العديد من المناظير مفتوحة المصدر4,5,6,7,11,13,17,19. يمكن تجميع المنظار الصغير اقتصاديا من قبل الباحثين إذا اتبعوا الإرشادات خطوة بخطوة المقدمة من فريق Miniscope بجامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (UCLA)4,7,11,13. لأن المراقبة البصرية للنشاط العصبي مقيدة بقيود انتقال الضوء7 من وإلى المجموعة العصبية ذات الاهتمام ، تم تصميم منظار صغير يتطلب عدسة معامل الانكسار المتدرج الموضوعي (GRIN) (أو العدسة الموضوعية) ليتم تثبيتها مسبقا في الجزء السفلي من المنظار المصغر لتكبير مجال الرؤية الذي يتم ترحيله من عدسة GRIN التتابع (أو عدسة الترحيل)6,7,8,10,16,17. يتم زرع عدسة التتابع هذه في منطقة الدماغ المستهدفة بحيث يتم نقل نشاط التألق لمنطقة الدماغ المستهدفة على سطح عدسة التتابع6,7,8,10,16,17. ينتقل ما يقرب من 1/4 من فترة الضوء الجيبية الكاملة عبر عدسة GRIN الموضوعية (~ 0.25 درجة) (الشكل 1A1)، مما أدى إلى صورة مضان مكبرة6,7. لا يتم تثبيت العدسة الشيئية دائما في الجزء السفلي من المنظار الصغير ولا يلزم زرع عدسة التتابع6,7,11,13,15. على وجه التحديد ، هناك تكوينان: أحدهما بعدسة موضوعية ثابتة في المنظار الصغير وعدسة ترحيل مزروعة في الدماغ8,10,12,14,16 (الشكل 1B1) وآخر مع عدسة موضوعية قابلة للإزالة فقط6,7,11,13,15 (الشكل 1B2). في التصميم القائم على الهدف الثابت ومجموعة عدسات الترحيل المزروعة ، يتم إحضار إشارات التألق من الدماغ إلى السطح العلوي لعدسة التتابع (الشكل 1A1)7,8,10,12,14,16. بعد ذلك ، يمكن للعدسة الشيئية تكبير المجال البصري ونقله من السطح العلوي لعدسة الترحيل (الشكل 1 أ 2). من ناحية أخرى ، فإن تصميم عدسة GRIN الموضوعي القابل للإزالة أكثر مرونة ، مما يعني أن الزرع المسبق لعدسة التتابع في الدماغ ليس إلزاميا (الشكل 1B2)6,7,11,13,15. عند استخدام منظار صغير يعتمد على تصميم عدسة موضوعية قابلة للإزالة ، لا يزال الباحثون بحاجة إلى زرع عدسة في منطقة الدماغ المستهدفة ولكن يمكنهم إما زرع عدسة موضوعية6,7,11,13,15 أو عدسة ترحيل في الدماغ6,7. يحدد اختيار الهدف أو عدسة التتابع للزرع تكوين المنظار المصغر الذي يجب على الباحث استخدامه. على سبيل المثال ، يعتمد V3 UCLA Miniscope على تصميم عدسة GRIN موضوعي قابل للإزالة. يمكن للباحثين اختيار إما زرع عدسة موضوعية مباشرة في منطقة الدماغ محل الاهتمام وتركيب المنظار الصغير "الفارغ" على العدسة الشيئية6,7,11,13,15 (نظام عدسة واحدة؛ الشكل 1B2) أو لزرع عدسة ترحيل في الدماغ وتركيب منظار صغير مثبت مسبقا بعدسة موضوعية6,7 (نظام ثنائي العدسة؛ الشكل 1B1). ثم يعمل المنظار الصغير ككاميرا مضان لالتقاط صور البث المباشر للتألق العصبي الناتج عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا1,2,3. بعد توصيل miniscope بجهاز كمبيوتر ، يمكن نقل صور التألق هذه إلى الكمبيوتر وحفظها كمقاطع فيديو. يمكن للباحثين دراسة النشاط العصبي من خلال تحليل التغيرات النسبية في التألق مع بعض حزم التحليل20,21 أو اكتب رموزهم للتحليل المستقبلي.
يوفر V3 UCLA Miniscope المرونة للمستخدمين لتحديد ما إذا كانوا يريدون تصوير النشاط العصبي باستخدام نظام أحادي أو ثنائي العدسة7. يعتمد اختيار نظام التسجيل على عمق وحجم منطقة الدماغ المستهدفة. باختصار ، يمكن لنظام العدسة الواحدة فقط تصوير منطقة سطحية (أقل من عمق 2.5 مم تقريبا) وكبيرة نسبيا (أكبر من 1.8 × 1.8 مم2 تقريبا) لأن الشركات المصنعة تنتج فقط حجما معينا من العدسة الموضوعية. في المقابل ، يمكن تطبيق نظام ثنائي العدسة على أي منطقة دماغية مستهدفة. ومع ذلك ، فإن الأسمنت السني للصق الصفيحة يميل إلى التسبب في اختلال المحاذاة مع تغيير المسافة بين الهدف وعدسات الترحيل ، مما يؤدي إلى جودة صورة رديئة. إذا تم استخدام نظام العدستين ، فيجب استهداف مسافتين للعمل بدقة لتحقيق جودة التصوير المثلى (الشكل 1 أ). هاتان المسافتان الحرجتان للعمل هما بين الخلايا العصبية والسطح السفلي لعدسة الترحيل ، وبين السطح العلوي لعدسة الترحيل والسطح السفلي للعدسة الشيئية (الشكل 1A1). يؤدي أي اختلال في محاذاة العدسة أو وضعها في غير موضعها خارج مسافة العمل إلى فشل التصوير (الشكل 1C2). في المقابل ، يتطلب نظام العدسة الواحدة مسافة عمل دقيقة واحدة فقط. ومع ذلك ، فإن حجم العدسة الموضوعية يحد من تطبيقها لمراقبة مناطق الدماغ العميقة (العدسة الموضوعية التي تناسب المنظار الصغير هي حوالي 1.8 ~ 2.0 مم6،11،13،15). لذلك ، فإن زرع عدسة موضوعية محدود لمراقبة السطح ومناطق الدماغ الكبيرة نسبيا ، مثل القشرة6,15 والقرنية الظهرية ammonis 1 (CA1) في الفئران11,13 . بالإضافة إلى ذلك ، يجب استنشاق مساحة كبيرة من القشرة لاستهداف الظهرية CA111,13. نظرا لمحدودية تكوين العدسة الواحدة الذي يمنع تصوير مناطق الدماغ العميقة ، فإن أنظمة المنظار الصغير التجارية لا تقدم سوى تصميم عدسة موضوعية / عدسة ترحيل (عدستان). من ناحية أخرى ، يمكن تعديل المنظار المصغر V3 UCLA إلى نظام أحادي العدسة أو عدستين لأن عدسته الموضوعية قابلة للإزالة6،11،13،15. بمعنى آخر ، يمكن لمستخدمي V3 UCLA miniscope الاستفادة من العدسة القابلة للإزالة عن طريق زرعها في الدماغ (إنشاء نظام عدسة واحدة) ، عند إجراء تجارب تتضمن ملاحظات دماغية سطحية (أقل من 2.5 مم في العمق) ، أو عن طريق تثبيتها مسبقا في المنظار الصغير وزرع عدسة ترحيل في الدماغ (إنشاء نظام ثنائي العدسات) ، عند إجراء التجارب التي تنطوي على ملاحظات الدماغ العميقة. يمكن أيضا تطبيق نظام العدستين لمراقبة الدماغ بشكل سطحي ، ولكن يجب على الباحث معرفة مسافات العمل الدقيقة بين العدسة الشيئية وعدسة الترحيل. الميزة الرئيسية لنظام العدسة الواحدة هي أن هناك فرصة أقل لفقدان مسافات العمل مقارنة بنظام العدستين ، نظرا لوجود مسافتين للعمل يجب استهدافهما بدقة لتحقيق جودة التصوير المثلى في نظام العدستين (الشكل 1 أ). لذلك ، نوصي باستخدام نظام عدسة واحدة لملاحظات الدماغ السطحية. ومع ذلك ، إذا كانت التجربة تتطلب التصوير في منطقة الدماغ العميقة ، فيجب على الباحث أن يتعلم تجنب اختلال العدسات.
يتضمن البروتوكول الأساسي لتكوين العدسة الثنائية للمناظير للتجارب زرع العدسة والطلاء الأساسي8،10،16،17. الطلاء الأساسي هو لصق صفيحة أساسية على رأس بحيث يمكن تركيب المنظار الصغير في النهاية فوق الحيوان وتصوير إشارات التألق للخلايا العصبية بالفيديو (الشكل 1 ب). يتضمن هذا الإجراء استخدام الأسمنت السني لصق الصفيحة على الجمجمة (الشكل 1C) ، لكن انكماش الأسمنت السني يمكن أن يسبب تغييرات غير مقبولة في المسافة بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية 8,17. إذا كانت المسافة المتحولة بين العدستين كبيرة جدا ، فلا يمكن التركيز على الخلايا.
تم بالفعل نشر بروتوكولات مفصلة لتجارب تصوير الكالسيوم في الدماغ العميق باستخدام المناظير8,10,16,17. استخدم مؤلفو هذه البروتوكولات نظام Inscopix8,10,16 أو غيرها من التصاميم المخصصة17 ووصفت الإجراءات التجريبية للانتقاء الفيروسي والجراحة وربط الصفيحة الأساسية. ومع ذلك ، لا يمكن تطبيق بروتوكولاتهم بدقة على أنظمة أخرى مفتوحة المصدر ، مثل نظام V3 UCLA Miniscope ، NINscope6، وفينسكوب19. يمكن أن يحدث اختلال في محاذاة العدستين أثناء التسجيل في تكوين ثنائي العدسة باستخدام UCLA Miniscope بسبب نوع الأسمنت السني المستخدم لتثبيت الصفيحة الأساسية في الجمجمة8,17 (الشكل 1 ج). هناك حاجة إلى البروتوكول الحالي لأن المسافة بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية عرضة للتحول بسبب الانكماش غير المرغوب فيه لأسمنت الأسنان أثناء إجراء الطلاء الأساسي. أثناء الطلاء الأساسي ، يجب العثور على مسافة العمل المثلى بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية عن طريق ضبط المسافة بين المنظار الصغير وأعلى عدسة الترحيل ، ويجب بعد ذلك لصق الصفيحة الأساسية في هذا الموقع المثالي. بعد ضبط المسافة الصحيحة بين العدسة الشيئية وعدسة الترحيل المزروعة ، يمكن الحصول على قياسات طولية بدقة خلوية (الشكل 1 ب; in vivo تسجيل). نظرا لأن النطاق الأمثل لمسافات العمل لعدسة التتابع صغير (50 - 350 ميكرومتر)4,8، يمكن أن يؤدي الانكماش المفرط للأسمنت أثناء المعالجة إلى صعوبة الحفاظ على العدسة الموضوعية وعدسة الترحيل المزروعة ضمن النطاق المناسب. الهدف العام من هذا التقرير هو توفير بروتوكول للحد من مشاكل الانكماش8,17 التي تحدث أثناء إجراء الطلاء الأساسي ولزيادة معدل نجاح تسجيلات miniscope لإشارات التألق في تكوين ثنائي العدسات. يتم تعريف تسجيل miniscope الناجح على أنه تسجيل بث مباشر للتغيرات النسبية الملحوظة في مضان الخلايا العصبية الفردية في يتصرف بحرية. على الرغم من أن العلامات التجارية المختلفة لأسمنت الأسنان لها معدلات انكماش مختلفة ، يمكن للباحثين اختيار علامة تجارية تم اختبارها مسبقا6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. ومع ذلك ، ليس من السهل الحصول على كل علامة تجارية في بعض البلدان / المناطق بسبب لوائح استيراد المواد الطبية. لذلك ، قمنا بتطوير طرق لاختبار معدلات انكماش الأسمنت السني المتاح ، والأهم من ذلك توفير بروتوكول بديل يقلل من مشكلة الانكماش. الميزة على بروتوكول الطلاء الأساسي الحالي هي زيادة معدل نجاح تصوير الكالسيوم بالأدوات والأسمنت التي يمكن الحصول عليها بسهولة في المختبرات. يتم استخدام منظار UCLA المصغر كمثال ، ولكن البروتوكول ينطبق أيضا على المناظير الأخرى. في هذا التقرير ، نصف إجراء طلاء أساسي محسن ونوصي أيضا ببعض الاستراتيجيات لتركيب نظام UCLA miniscope ثنائي العدسة (الشكل 2 أ). يتم تقديم كل من أمثلة الزرع الناجح (ن = 3 فئران) وأمثلة على الزرع الفاشل (ن = 2 فئران) للتكوين ثنائي العدسة مع منظار UCLA المصغر جنبا إلى جنب مع المناقشات لأسباب النجاح والفشل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة تايوان الوطنية (رقم الموافقة: NTU-109-EL-00029 و NTU-108-EL-00158).
1. تقييم حجم تغيير الأسمنت السني
ملاحظة: تحدث تغييرات في حجم الأسمنت السني أثناء عملية المعالجة. اختبر التغيرات في حجم الأسمنت السني قبل الزرع والطلاء الأساسي. يمكن للباحثين اختبار أي نوع من الأسمنت السني واستخدام العلامة التجارية بأقل تغيير في الحجم لتدعيم الصفيحة الأساسية. مثال موضح في الشكل 3.
- تزن 0.5 غرام من كل مسحوق أسمنت أسنان وتخلطه مع محلوله المناسب (1 مل).
ملاحظة: نسبة المسحوق / السائل الموصى بها في تعليمات الأسمنت السني هي 0.5 جم من المسحوق إلى 0.25 مل من المحلول للحصول على شكل صلب. يخفف بروتوكول الاختبار هذا النسبة إلى 0.5 جم / مل بحيث يمكن استنشاق الخليط في شكل سائل من أجل قياس تغير الحجم في أطراف الماصة. - استخدم أطراف ماصة 0.1-10 ميكرولتر لإزالة 2.5 ميكرولتر من خليط الأسمنت السني ، ثم أغلق طرف الماصة بغراء معالجة خفيف.
- ضع الأطراف على رف ، وحدد أعلى مستويات خليط الأسمنت السني ، وقم بقياس مستوى خليط الأسمنت السني بعد 40 دقيقة (الفيديو التكميلي S1).
- بالإضافة إلى مراقبة تغيرات المستوى أثناء معالجة الأسمنت السني في الأطراف ، قم بقياس كثافة الأسمنت الجاف المتبقية. لحساب الكثافة ، قم بقياس وزن الأسمنت السني ، وقياس الحجم باستخدام مبدأ أرخميدس.
- باختصار ، ضع الأسمنت الجاف المتبقي في كوب مملوء بالماء ، وقم بوزن الماء الذي يفيض.
- استخدم الأسمنت السني بأقل انكماش لجميع البروتوكولات المفصلة أدناه.
2. التخدير ، والزرع الجراحي ، والحقن الفيروسي ، والطلاء الأساسي الوهمي
- تخدير
ملاحظة: يهدف هذا التقرير إلى تحسين إجراء الجراحة والطلاء الأساسي لمنظار UCLA المصغر. لذلك ، كان من المفترض أن العيار الفيروسي الأمثل لإصابة مناطق الدماغ المستهدفة كان معروفا. يمكن العثور على طرق العثور على العيار الفيروسي الأمثل في الخطوات من 1 إلى 5 من Resendez et al.8. بمجرد تحسين التخفيف الفيروسي ، يمكن البدء في الزرع الجراحي.- ضع الماوس في وعاء حثي وزود الأكسجين (100٪ بمعدل تدفق هواء يبلغ 0.2 لتر / دقيقة). قم بأكسجة الماوس لمدة 5 إلى 10 دقائق.
- يتم تطبيق 5٪ إيزوفلوران ممزوجا بأكسجين 100٪ (معدل تدفق الهواء: 0.2 لتر/دقيقة) حتى يبدأ الفأر في فقدان توازنه ويتم تخديره في النهاية.
- أخرج الفأر من غرفة الحث وحقن الأتروبين (0.04 مجم / كجم ؛ حقن تحت الجلد) ، لمنع تراكم اللعاب والبوبرينورفين (0.03 مجم / كجم ؛ حقن تحت الجلد) كمسكن.
- حلق رأس الماوس.
- ارتد قناعا وثوبا معقما وقفازات. إعداد مساحة معقمة وأدوات جراحية معقمة للجراحة. تثبيت رأس الماوس (الحفاظ على التخدير مع 3 إلى 2.5 ٪ إيزوفلوران خلال هذه الخطوة) على الجهاز المجسم. بعد إجراءات المسكنات والتخدير ، تأكد من أن قضبان الأذن تثبت الرأس بشكل آمن. توفير الدعم الحراري.
- تأكد من ضبط الرأس في وضع مستقيم ، وتعقيم الرأس المحلوق بالبيتادين ، ثم رش الرأس بالزيلوكايين (10٪) ، وهو مسكن موضعي.
- ضع مرهما بيطريا على العينين لمنع الجفاف.
ملاحظة: استخدم مرهم العيون لحماية العين أثناء جميع أحداث التخدير لمنع إصابة العين. - اختبار منعكس الألم العميق للحيوان عن طريق معسر مخلبه الخلفي. بمجرد أن لا يظهر الحيوان أي منعكس انسحاب مخلب ، تابع الإجراءات الجراحية.
- قم بعمل شق صغير على طول المستوى السهمي الأوسط للجمجمة (يبدأ من حوالي 2 مم من الأمام إلى البريغما وينتهي بحوالي 6 مم خلف البريغما). بعد ذلك ، قم بتنظيف النسيج الضام على الجمجمة ، وقم بتثبيت ثلاثة براغي من الفولاذ المقاوم للصدأ على العظام الأمامية اليسرى وبين الجداري.
- عند هذه النقطة ، قلل الأيزوفلوران إلى 1-2٪. مراقبة معدل التنفس خلال العملية الجراحية بأكملها. إذا كان معدل التنفس بطيئا جدا (حوالي 1 / ثانية ، اعتمادا على الحيوان) ، قلل من تركيز الأيزوفلوران.
- قم بإجراء حج القحف لزرع عدسة التتابع تحت المجهر الجراحي أو المجهر المجسم باستخدام مثقاب لدغ بقطر طرف 0.7 مم. استخدم مثقابا صغيرا للاستيلاء على مثقاب الأزيز ورسم مخطط تفصيلي لمنطقة الدائرة المقصودة (لا يلزم اختراق السماكة الكاملة للكالفايوم).
ملاحظة: يبلغ قطر عدسة الترحيل المستخدمة في البروتوكول الحالي 1.0 مم ، وطولها ~ 9.0 مم في الملعب 1 ، ونطاق مسافة العمل ~ 100 ميكرومتر - 300 ميكرومتر ؛ لذلك ، كان قطر حج القحف 1.2 ملم.- تعميق الخطوط العريضة برفق حتى تنكشف الجافية.
- تحضير 3 مل من محلول ملحي معقم في حقنة 3 مل وتبريده في دلو ثلج. اشطف المنطقة المكشوفة بشكل متكرر ب 0.1 مل من المحلول الملحي من المحقنة لتبريد المنطقة ومنع التلف الناتج عن الحرارة والنزيف.
- قطف الجافية وقشرها برفق بإبرة 27 جرام.
- ضع علامة على إبرة حادة 27 جم على بعد 1 مم من الطرف واستخدمها لشفط قشرة الدماغ بعناية من أجل إنشاء نافذة لزرع العدسة8،11،13،17 (الشكل 2B1). إذا لزم الأمر ، اصنع إبرة حادة عن طريق طحن طرف إبرة حقن 27 جم بورق صنفرة. بعد ذلك ، قم بتوصيل الإبرة بحقنة ، وقم بتوصيل المحقنة بأنبوب ، وقم بتوصيل الأنبوب بمصدر شفط لإنشاء فراغ.
ملاحظة: عدسة التتابع حادة وسوف تضغط على أنسجة المخ عند وضعها في منطقة الدماغ العميقة. وبالتالي ، فإن طموح القشرة يقلل من تلف الأنسجة بسبب زرع عدسة التتابع. يبلغ سمك القشرة حوالي 1 مم في الفئران ولكن يصعب تصورها تحت المجهر المجسم. تخلق العلامة معلما يسمح بتحديد عمق الإبرة بدقة أكبر من المجهر المجسم وحده. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء تحديد ما إذا كانت منطقة القشرة قد تم الوصول إليها أو تمريرها اعتمادا على المقاومة ؛ يشعر الجزء العلوي من القشرة بالنعومة نسبيا ، بينما تشعر المنطقة تحت القشرية بالكثافة. لذلك ، بمجرد أن يبدأ النسيج في الشعور بكثافة أكبر ، أوقف الطموح (الشكل 2B3). - تحضير 3 مل من محلول ملحي معقم في حقنة 3 مل وتبريده في دلو ثلج. شطف المنطقة بالمحلول الملحي لوقف النزيف وتقليل احتمالية حدوث وذمة في الدماغ.
- حقن الفيروس المرتبط ب Adeno (AAV)
ملاحظة: تم استخدام AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE في التجربة الحالية. jGCaMP7s هو مؤشر كالسيوم مشفر وراثيا ينبعث منه مضان أخضر3. نظرا لأن الدراسة الحالية استخدمت فأرا من النوع البري كموضوع ، فقد كانت هناك حاجة إلى ناقل فيروسي لنقل الخلايا العصبية باستخدام جين مؤشر الكالسيوم الفلوري الأخضر وتمكين التعبير. يمكن للباحثين الذين يستخدمون الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم الفلوري الأخضر حيث يمكن لموضوعاتهم تخطي البروتوكول 2.2.- قم بتركيب الإبرة الداخلية لقسطرة وريدية 20 جم (IV) على الذراع المجسمة وثقب ببطء (~ 100 - 200 ميكرومتر / دقيقة) الدماغ عند الإحداثيات المناسبة (نفس الإحداثيات المستخدمة أثناء زرع عدسة التتابع) (الشكل 2B3).
- خفض إبرة الحقن المجهري بسرعة 100-200 ميكرومتر / دقيقة في CA1 البطني وغرس (~ 25 nL / دقيقة) 200 nL من الناقل الفيروسي في المنطقة المستهدفة (-3.16 مم AP ، 3.25 مم ML ، و -3.50 مم DV من bregma).
- انتظر لمدة 10 دقائق للسماح للفيروس بالانتشار وتقليل التدفق الخلفي.
- سحب (~ 100-200 ميكرومتر / دقيقة) إبرة الحقن المجهري.
- زرع عدسة التتابع
- تطهير عدسة التتابع مع 75 ٪ الكحول10،16 ثم شطف بمحلول ملحي خال من البيروجين. انقع العدسة في محلول ملحي بارد خال من البيروجين حتى الزرع.
ملاحظة: تقلل العدسة الباردة من وذمة الدماغ عند وضعها في الدماغ. - أمسك عدسة الترحيل باستخدام مشبك البلدغ الصغير (الشكل 2B3) الذي تم تغطية أسنانه بأنابيب الانكماش الحراري.
ملاحظة: يمكن لمشبك البلدغ أن يمسك العدسة بإحكام دون إتلافها. ارجع إلى Resendez et al.8 لمعرفة طريقة صنع مشبك البلدغ المغطى بالأنابيب. - ضع ببطء (~ 100 - 200 ميكرومتر / دقيقة) عدسة التتابع أعلى المنطقة المستهدفة (-3.16 مم AP و 3.50 مم ML و -3.50 مم DV من bregma) وقم بتثبيتها باستخدام الأسمنت السني.
- تطهير عدسة التتابع مع 75 ٪ الكحول10،16 ثم شطف بمحلول ملحي خال من البيروجين. انقع العدسة في محلول ملحي بارد خال من البيروجين حتى الزرع.
- طلاء وهمي
ملاحظة: الغرض من "الطلاء الأساسي الوهمي" أثناء جراحة الزرع هو إنشاء قاعدة أسمنتية للأسنان من أجل تقليل كمية الأسمنت السني التي يجب تطبيقها أثناء إجراء الطلاء الأساسي الحقيقي بعد عدة أسابيع. بهذه الطريقة ، يتم تقليل خطر حدوث تغيير في حجم الأسمنت السني.- اربط العدسة الشيئية في الجزء السفلي من المنظار وقم بتجميع الصفيحة الأساسية على المنظار (في هذه الخطوة ، لم يتم بعد وضع تجميع العدسة الموضوعية المثبتة ، والصفيحة الأساسية ، والمنظار الصغير فوق جمجمة الماوس).
- لف 10 سم من فيلم البارافين حول الجزء الخارجي من الصفيحة الأساسية (الشكل 4 أ).
- امسك المنظار الصغير باستخدام مسبار الذراع المجسم باستخدام طين لاصق قابل لإعادة الاستخدام.
- قم بمحاذاة العدسة الشيئية أعلى عدسة الترحيل بأقل مساحة ممكنة بين العدسات (الشكل 4 ب).
- استخدم الأسمنت السني لتأمين وضع الصفيحة الأساسية (بحيث يلامس الأسمنت فيلم البارافين فقط).
- عندما يجف الأسمنت السني ، قم بإزالة الفيلم.
- قم بإزالة الصفيحة الأساسية والمنظار. قاعدة الأسمنت السني مجوفة (الشكل 4 ب).
- لحماية عدسة الترحيل من الأنشطة اليومية ومن التعرض للخدش بواسطة الماوس ، أغلق عدسة التتابع ببعض مطاط السيليكون المصبوب حتى يتم تغطية عدسة الترحيل ، وقم بتغطية مطاط السيليكون بطبقة رقيقة من الأسمنت السني (الشكل 4 ب).
- افصل الماوس عن الأدوات المجسمة وضع الماوس في غرفة الإنعاش.
- حقن كاربروفين (5 ملغ/كغ؛ حقن تحت الجلد) أو ميلوكسيكام (1 ملغ/كغ؛ حقن تحت الجلد) لتسكين وسيفتازيديم (25 ملغ/كغ؛ حقن تحت الجلد) لمنع العدوى.
ملاحظة: استخدام المضادات الحيوية ليس بديلا عن تقنية التعقيم. يمكن الإشارة إلى المضادات الحيوية المحيطة بالجراحة (أي سيفتازيديم) في ظروف معينة ، مثل العمليات الجراحية طويلة الأمد أو وضع الغرسات المزمنة. - راقب الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص.
- الفئران المنزلية بشكل فردي وحقن ميلوكسيكام (1 ملغ / كغ ؛ الحقن تحت الجلد ؛ q24h) لمدة أسبوع واحد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. افحص الحيوان كل يوم بعد الجراحة للتأكد من أنه يأكل ويشرب ويتغوط بشكل طبيعي.
- أداء الطلاء الأساسي بعد 3 أسابيع أو أكثر.
3. الطلاء الأساسي
ملاحظة: عادة ، لا يمكن إجراء إجراء الطلاء الأساسي (الشكل 5) في غضون 2-3 أسابيع من الإجراء الأولي بسبب وقت التعافي والحضانة الفيروسية. إجراءات الحث للطلاء الأساسي مماثلة لتلك الموضحة في الخطوات 2.1.1 إلى 2.1.8. ومع ذلك ، فإن الطلاء الأساسي ليس إجراء غازيا ، ولا يتطلب الحيوان سوى التخدير الخفيف. لذلك ، 0.8-1.2 ٪ isoflurane كافية ، طالما أن الحيوان لا يستطيع التحرك على الإطار المجسم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد التخدير الخفيف نسبيا في تسهيل التعبير عن العابرين المضان للخلايا العصبية أثناء المراقبة8 (الفيديو التكميلي S2).
- قطع بعناية الطبقة الرقيقة من سقف الأسمنت الأسنان مع rongeur العظام وإزالة المطاط سيليكون. نظف سطح عدسة التتابع بنسبة 75٪ كحول.
- اربط برغيا بجانب الصفيحة الأساسية لتثبيته في أسفل المنظار الصغير (الشكل 5A1).
ملاحظة: يجب شد الصفيحة الأساسية بإحكام أسفل الجزء السفلي من المنظار الصغير لأن الفرق بين الصفيحة الأساسية المشدودة والمثبتة برفق قد يتسبب في مسافة غير متسقة. - اضبط شريحة التركيز لتكون حوالي 2.7 - 3 مم من السكن الرئيسي (الشكل 5A2).
ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن تعديل الطول بشكل أكبر أثناء إجراء الطلاء الأساسي ، قم بتثبيته إلى 2.7 مم تقريبا ، لأن ضبط طول المنظار الصغير والطول الأمثل بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية المثبتة مسبقا أمر مربك للغاية. - قم بتوصيل miniscope بلوحة الحصول على البيانات وقم بتوصيله بمنفذ USB 3.0 (أو إصدار أعلى) على جهاز كمبيوتر.
- قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات الذي طوره فريق جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس.
- اضبط التعرض على 255 ، والكسب على 64x ، ومؤشر LED المثير على 5٪. يوصى بهذه الإعدادات للطلاء الأساسي الأولي ؛ ستختلف الإعدادات المحددة اعتمادا على مناطق الدماغ ومستويات التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا.
- انقر فوق الزر "اتصال " لتوصيل miniscope ببرنامج الحصول على البيانات ومشاهدة البث المباشر.
- قم بمحاذاة العدسة الموضوعية للمنظار المصغر مع عدسة الترحيل يدويا وابدأ في البحث عن إشارات التألق (الشكل 5B1).
ملاحظة: في البداية، يسهل البحث عن إشارة التألق عمليات الضبط يدويا. نظرا لاستخدام نظام AAV للتعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا ، فقد أثر كل من نوع المروج والنمط المصلي AAV على كفاءة النقل23,24. يجب أن يحتاج الباحثون إلى التحقق من التعبير عن مؤشر الكالسيوم من خلال العثور على الخلايا العصبية الفردية التي تظهر تغيرات في مضان قبل الشروع في التجارب المستقبلية. - حفر الأسمنت الأسنان في أي مكان حيث يمنع miniscope (اختياري).
- شاهد البث المباشر لبرنامج الحصول على البيانات واستخدم هامش عدسة الترحيل كمعلم (الفيديو التكميلي S2). يظهر هامش عدسة الترحيل كدائرة رمادية تشبه القمر على الشاشة (الشكل 5B1 ؛ الأسهم البيضاء).
- بمجرد العثور على عدسة الترحيل ، اضبط بعناية الزوايا والمسافات المختلفة للمنظار الصغير حتى يتم العثور على إشارات التألق.
ملاحظة: صور الخلايا العصبية أكثر بياضا من الخلفية. يشير الشكل العصبي الدقيق إلى أن الخلايا العصبية تقع بشكل مثالي على المستوى البؤري لعدسة الترحيل. تشير الخلايا العصبية المستديرة إلى أنها كانت بالقرب من المستوى البؤري. يختلف الشكل العصبي عبر الدماغ ، وهنا يظهر CA1 البطني كمثال. - إذا لم تظهر أي خلية عصبية فردية تغيرات في التألق كدالة للوقت ، فأعد إغلاق القاعدة بمطاط السيليكون. لا يلاحظ مضان لأن فترة الحضانة تعتمد أيضا على خاصية الفيروس23,24. نفذ الخطوات 3.1-3.12 بعد أسبوع إضافي. (هذا اختياري).
- امسك المنظار الصغير في الموضع الأمثل وحرك الذراع المجسمة بطرف لاصق قابل لإعادة الاستخدام باتجاه المنظار الصغير (الشكل 5B2). قم بلصق المنظار الصغير على الذراع المجسمة بالطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام.
- اضبط أذرع x وy وz قليلا للبحث عن أفضل عرض (الفيديو التكميلي S2). بعد ذلك ، اضبط الزاوية بين سطح العدسة الموضوعية وعدسة الترحيل عن طريق تدوير قضيب الأذن أو قضيب الأسنان أو الطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام على المحور z. ينجح التعبير الفيروسي وزرع العدسة عندما تعرض خلية واحدة على الأقل عابرات مضان (الشكل 6 أ ؛ فيديو تكميلي S2) أثناء الطلاء الأساسي (والذي يعتمد أيضا على منطقة الدماغ ، مثل CA1).
ملاحظة: إذا كانت الشاشة تعرض خلايا بيضاء فقط ولكن لا توجد عابرات ، فهناك سبب آخر (انظر الشكل 6B و C ومقاطع الفيديو التكميلية S4 و S5 وقسم النتائج وقسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها). - قم بتدعيم الصفيحة الأساسية (الشكل 5B2) بأسمنت الأسنان.
- راقب المنطقة محل الاهتمام أثناء التدعيم للتأكد من عدم تغيير الموضع الأمثل.
- استخدم أقل كمية ممكنة من الأسمنت مع الاستمرار في لصق الصفيحة بإحكام على قاعدة الأسمنت السني (الشكل 5B2). ضع طبقة ثانية وثالثة من الأسمنت حول الصفيحة الأساسية ولكن احرص على عدم التأثير على عدسة GRIN.
ملاحظة: يكون تطبيق الأسمنت على الصفيحة أسهل في هذه الخطوة حيث تم تشكيل قاعدة الصفيحة الأساسية أثناء إجراء الطلاء الوهمي. - افصل المنظار بعناية عن الصفيحة الأساسية عند معالجة الأسمنت. ثم ، المسمار على غطاء واقية.
- نقل الحيوان إلى قفص الانتعاش. راقب الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص.
- الفئران المنزل بشكل فردي. تأكد من أنه يأكل ويشرب ويتغوط بشكل طبيعي كل يوم. انتظر لمدة 5 أيام حتى يتعافى الماوس تماما ثم تحقق من تصوير الكالسيوم.
ملاحظة: لا يوجد سوى كمية صغيرة من الأسمنت السني تحمل الصفيحة الأساسية. لذلك ، إذا تحولت الصفيحة الأساسية بشكل كبير منذ إجراء الطلاء الأساسي ، فقم بإزالة الأسمنت السني باستخدام مثقاب وقم بإجراء الطلاء الأساسي مرة أخرى. - تخدير (عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط الكيتامين (87 ملغ / كغ) / زيلازين (13 ملغ / كغ) ) وperpuse25 الحيوان عند الانتهاء من جميع التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقييم تغيير حجم الأسمنت السني
نظرا لأن حجم الأسمنت السني يتغير أثناء عملية المعالجة ، فقد يؤثر بشكل كبير على جودة التصوير ، نظرا لأن مسافة عمل عدسة GRIN تبلغ حوالي 50 إلى 350 ميكرومتر 4,8. لذلك ، تم اختبار اثنين من الأسمنت السني المتاح تجاريا في هذه الحالة ، Tempron و Tokuso ، قبل إجراء الزرع والطلاء الأساسي (الشكل 5). تم تقييم مقاطع الفيديو أولا لتحديد ما إذا كان الأسمنت قد تقلص ثم تمت مقارنة أحجام الأسمنت عند تجفيفه تماما. تم تحميل نفس تركيز وأحجام الخلائط الأولية من الأسمنت السني في أطراف ماصة وتصويرها بالفيديو (الفيديو التكميلي S1). أظهر الفيديو S1 أن كلا الأسمنتين تقلصت أثناء عملية التجفيف. كان أداء Tokuso أفضل من Tempron (أي أنه كان حجمه أكبر من Tempron حتى بعد الانكماش): الشكل 3B ؛ متوسط حجم تمبرون: 0.93 ± 0.07 مل ؛ متوسط حجم توكوسو: 1.18 ± 0.07 مل ؛ اختبار t: p = 0.048 ، t (6) = 2.46 ، مما يشير إلى أنه تقلص أقل. كما تم اختبار كثافات الأسمنت 4 مرات بعد التجفيف الكامل. كان لدى توكوسو متوسط كثافة أقل من تمبرون (متوسط كثافة تيمبرون: 1.07 ± 0.12 جم / مل ؛ متوسط كثافة توكوسو: 0.93 ± 0.08 جم / مل ؛ اختبار t: p = 0.38 ، t (6) = -0.94) ، مما يعني أن معدل انكماشه أقل. لذلك ، تم استخدام Tokuso لخطوات الزرع والطلاء الأساسي التالية. الغرض من وصف التجربة أعلاه ليس التوصية بأي علامات تجارية بل تذكير المجربين بالعثور على أسمنت أسنان لا يخضع لتغيير كبير في الحجم عند المعالجة.
قياس إزاحة الصورة
قمنا بمحاكاة إجراءات الطلاء الأساسي الوهمية وإجراءات الطلاء الأساسي الأصلية على كائن ثابت للتحقق مما إذا كان إجراء الطلاء الأساسي الوهمي يؤدي إلى تحول أصغر في موقع الصفيحة الأساسية من الإجراء الأصلي. تم استخدام مادة لاصقة معالجة بالضوء لتثبيت إبرة حقنة 23 جم 2.5 سم في وسط صفيحة أساسية مع 1 سم تخرج من الصفيحة الأساسية (الشكل 3C). بعد ذلك ، تم محاكاة الطلاء الأساسي عن طريق إمساك الإبر بذراع أداة مجسمة. بدلا من استخدام المختبر ، تم إرفاق ملصق على طاولة الأداة المجسمة. اخترقت إبرة المحقنة الملصق ، وبالتالي تمثل الموقع الأصلي. بعد ذلك ، تم رفع الإبرة بمقدار 0.5 مم وبدأت جراحات المحاكاة. في عملية جراحية تحاكي إجراء الطلاء الأساسيلمرة واحدة 8 ، تم تطبيق الأسمنت السني حتى غطى الصفيحة الأساسية ، التي كانت 1 سم فوق الملصق. بعد ذلك ، كانت هناك فترة انتظار لمدة 2 ساعة حتى يعالج الأسمنت قبل دفع الإبرة برفق لاختراق الملصق مرة أخرى. نظرا لأن المادة اللاصقة المعالجة بالضوء لم تثبت الإبرة تماما ، يمكن دفع الإبرة بشكل أعمق لإنشاء ثقب آخر ، يمثل موقع الصفيحة الأساسية بعد جفاف الأسمنت السني. تم قياس المسافة بين الثقب الأولي والثقب الثاني لتحديد تحول موقع الإبرة. أظهرت النتائج أن الصفيحة الأساسية التي يبلغ ارتفاعها 1 سم فوق الجمجمة أدت إلى تحول في الموقع بمقدار 1.76 ± 0.14 مم ، لكن الطلاء الأساسي الوهمي أدى إلى تحول قدره 0.75 ± 0.17 مم فقط (الشكل 3D ؛ متوسط مسافة التحول للطلاء الأساسي لمرة واحدة مقابل الطلاء الأساسي الوهمي ؛ اختبار t: p < 0.01 ، t (8) = 6.03).
بالإضافة إلى ذلك ، كنا نشعر بالفضول لمعرفة ما إذا كان ارتفاع الأسمنت السني سيؤثر على التحول. لذلك ، اختبرنا كذلك ارتفاعا أقصر (الشكل 3E ؛ 0.5 سم أعلاه) باستخدام إجراء الطلاء الأساسي لمرة واحدة. تحولت الصفيحة الأساسية التي كانت مثبتة على ارتفاع 0.5 سم فوق الجمجمة أقل بكثير من الصفيحة الأساسية 1 سم فوق الجمجمة (الشكل 3F ؛ متوسط مسافة التحول: 0.43 ± 0.11 مقابل 1.76 ± 0.14 مم ؛ اختبار t: p < 0.01 ، t (8) = 9.73). أشارت البيانات إلى أن ارتفاع الصفيحة فوق الجمجمة والمسافة التي تحولت إليها الصفيحة الأساسية مرتبطان بشكل إيجابي. نظرا لأن إجراء الطلاء الأساسي الوهمي يتبعه خطوة ثانية للطلاء الأساسي لا تستخدم سوى الحد الأدنى من الأسمنت السني ، فإن هذه البيانات تدعم أيضا الفرضية القائلة بأن الطلاء الأساسي الوهمي يساعد على تحسين دقة إجراء الطلاء الأساسي.
التصوير باستخدام نظام منظار صغير ثنائي العدسة
باتباع البروتوكولات الجراحية للتسريب الفيروسي ، والطلاء الأساسي الوهمي ، والطلاء الأساسي (الشكل 2 ، الشكل 4 ، الشكل 5) ، لاحظنا عابرات مضان للخلايا العصبية الفردية في ثلاثة فئران (ن = 3/5) (الشكل 6 أ ، الفيديو التكميلي S3) أثناء إجراء الطلاء الأساسي وبعد إجراء الطلاء الأساسي بينما كانت الفئران تتحرك بحرية ، مما يؤكد أن مسافة العمل بين الهدف وعدسات الترحيل ظلت كما هي (الشكل 6 أ 1 مقابل الشكل 6A3 ، حدث تحول طفيف فقط في الموضع) بعد أن يجف الأسمنت السني تماما. هنا ، نقدم مقاطع فيديو للطلاء الأساسي لفأر واحد (الفيديو التكميلي S2 ؛ الماوس # 5) وتصوير الكالسيوم اللاحق أثناء تحرك الفئران بحرية (الفيديو التكميلي S3 ؛ الماوس # 3 ، # 4 ، # 5 ؛ البيانات الأولية). يرجى ملاحظة أن برنامج الحصول على البيانات ل V3 لا يحتوي على وظائف لطرح الخلفية ، ويمكن تحسين تباين الفيديو عن طريق المعالجة في وضع عدم الاتصال). بالنسبة للفيديو التكميلي S2 ، تم إجراء بحث يدوي عن إشارات التألق ثم تم توصيل المنظار الصغير بالذراع المجسمة لإجراء تعديلات دقيقة. وقد لوحظت بعض العابرات الفلورية أثناء الفحص (الفيديو التكميلي S2; الشكل 6 أ). العابر هو تحول سلس في السطوع في البقع الرمادية أو البيضاء ، وليس نمط إطلاق يشبه الضوء الوامض ؛ تعرض الأشكال 6 أ 1 إلى 6 أ2 صورا للعابرين. أظهر فيديو الفئران التي تتصرف بحرية تحولا مكانيا مقبولا مقارنة بالمنطقة محل الاهتمام أثناء إجراء الطلاء الأساسي (الفيديو التكميلي S3). لا يمكن تحسين هوامش الخلايا بشكل كبير في هذه المرحلة لأننا لم نتمكن من ضبط المسافة بين الجزء السفلي من عدسة التتابع والخلايا العصبية النشطة. والجدير بالذكر أن بعض المشكلات قد تحدث بشكل متكرر أثناء إجراء الطلاء الأساسي ، بما في ذلك عدم وجود أي شيء باستثناء خلفية موحدة (الشكل 6 ب ؛ فيديو تكميلي S4) أو رؤية هوامش الخلايا البيضاء دون أي عابرات مضان (الشكل 6C ؛ الفيديو التكميلي S5). كما يتم تقديم مثالين على النتائج السلبية (n = 2/5) (الشكل 6B ، C ، مقاطع الفيديو التكميلية S4 ، S5). يتم فحص الأسباب المحتملة للفشل في قسم المناقشة. تم إجراء العمليات الجراحية لهذين الفئران دون استخدام إبرة قطرها 1 مم لمسح المسار. وهكذا ، تم زرع عدسة التتابع مباشرة. نقترح أنه في الماوس # 2 ، قد تكون عدسة التتابع قد ضغطت الخلايا العصبية وسحبت بعض الخلايا العصبية لأسفل ، مما أدى إلى تلف الخلايا العصبية. لذلك ، لم يتم العثور على عابرات مضان.
الشكل 1: آليات المنظار الصغير والعيوب التي تسبب عادة فشل التصوير . (أ) رسم كاريكاتوري لعدسة التتابع والعدسة الموضوعية يوضح الآليات اللازمة لتصور الخلايا الفلورية في نظام ثنائي العدسة. تؤكد موجات الإشارات لكل عدسة على أهمية وآلية إيجاد مسافة عمل لتصور الخلايا الفلورية. (أ 1) يتم وضع عدسة التتابع GRIN فوق الخلايا العصبية المستهدفة ضمن مسافة العمل. نظرا لأن درجة عدسة الترحيل هي 0.5 * N (حيث N عدد صحيح) ، فإن العدسة تتيح تصور الخلايا العصبية المستهدفة عن طريق ترحيل الضوء ، مما يجعل إشارات التألق الأصلية إلى أعلى عدسة الترحيل. بعد ذلك ، ينتقل ما يقرب من 1/4 من فترة الضوء الجيبية الكاملة عبر عدسة GRIN الموضوعية (~ 0.25 درجة) وينتج عنه صورة مكبرة. (أ 2) تنقل العدسة الشيئية الصور إلى مستشعر تكميلي لأشباه الموصلات المعدنية (CMOS) الموجود في الجزء العلوي (اللوحة الخضراء في الرسم التخطيطي) من المنظار الصغير. (ب) رسم كاريكاتوري يوضح الاختلافات في إجراءات زرع عدسة GRIN بين نظام (B1) ثنائي العدسة و (B2) نظام عدسة واحدة. بشكل عام ، الفرق الرئيسي هو أن نظام العدسة الواحدة يستخدم عدسته الموضوعية مباشرة لتصوير سطح الدماغ. نتيجة لذلك ، يجب زرع العدسة الموضوعية فوق الخلايا العصبية المستهدفة. (ج) في المقابل، في نظام العدستين بالمقارنة، تزرع عدسة مرحل إضافية في الدماغ، وتثبت العدسة الشيئية مسبقا في المنظار الصغير. (ج1) قد يتسبب شكل الصفيحة الأساسية لإصدار V3 من UCLA Miniscope في حدوث تحول غير متساو بعد أن يجف الأسمنت السني تماما. (ج2) يتسبب هذا التحول في اختلال المحاذاة أو الانحراف عن مسافة العمل بين عدسة الترحيل والعدسة الشيئية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: بروتوكولات معدلة وبروتوكولات جراحية مفصلة لتحسين معدل نجاح نظام المنظار المصغر ثنائي العدسات. (أ 1) بروتوكول جراحي معدل لنظام العدسات. يتم عرض مواقع الحقن الفيروسي ، وزرع عدسة GRIN التتابع. يسمح الطلاء الأساسي الوهمي لمسافة العمل بتضمين الخلايا العصبية ذات الاهتمام بدقة ويقلل من التحول الموضعي المرتبط بإجراء الطلاء الأساسي (A2). وبالتالي ، (A3) يزداد احتمال تصوير الخلايا الفلورية في الفئران التي تتصرف بحرية. (ب) صورة كرتونية لخطوات الحقن الفيروسي ، وترحيل وضع عدسة GRIN. (ب1) أولا ، ضع علامة على إبرة الشفط بقلم حوالي 1 مم (لتجارب الفأر) من الطرف للمساعدة في تقييم عمق شفط القشرة. بعد ذلك ، قم بشفط النسيج الضام والقشرة (حوالي 1 مم في الفئران) من الدماغ. (ب2) استخدام الحصين البطني كمنطقة مستهدفة لزرع عدسة مرحلية. والجدير بالذكر أن الجسم الثفني الصعب هو معلم لوقف طموح المنطقة القشرية. يمكن رؤية النسيج الليفي للجسم الثفني تحت المجهر المجسم أثناء الشفط. (ب3) ثانيا ، قم بثقب نقطة الاهتمام بإبرة داخلية لقسطرة 20 G (قطرها حوالي 1 مم ؛ القطر مشابه لقطر عدسة الترحيل) لمسح المسار قبل التسريب الفيروسي. تحت المجهر المجسم ، يجب أن يكون الانبعاج (دائرة متقطعة في الصورة) تم إنشاؤه بواسطة الإبرة مرئيا. اخفض إبرة الحقن المجهري وعدسة الترحيل عند الانبعاج (أو على بعد 250 ميكرومتر فقط من مركز الانبعاج). أخيرا ، ضع عدسة التتابع GRIN (في الدراسة الحالية ، استخدمنا عدسة ترحيل قطرها 1 مم). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: قياس التغير في حجم الأسمنت السني المعالج. (أ) مثال مع الأسمنت السني المعالج من علامتين تجاريتين. تشير الأسهم السوداء إلى المستويات الأصلية بعد خلط المسحوق والمحلول. تشير الأسهم البيضاء إلى المستويات بعد 10 و 20 و 40 دقيقة من المعالجة. تشير الأسهم الحمراء إلى قيعان النصائح ، التي كانت مختومة بغراء علاج خفيف. (ب) متوسط أحجام الأسمنت السني المتبقي بعد أن يجف تماما. الأشرطة وأشرطة الخطأ هي الوسائل ± SEMs. * تشير إلى الأهمية (P < 0.05) على النحو الذي يحدده اختبار t للطالب. (ج) رسوم توضيحية وصورة فوتوغرافية تشرح الطريقة المستخدمة لقياس إزاحة موقع الصفيحة الأساسية. تم لصق إبرة من خلال الصفيحة الأساسية وتم استخدامها لمحاكاة إجراء الطلاء الأساسي الأصلي (الطلاء الأساسي بخطوة واحدة) وإجراء الطلاء الأساسي الوهمي. تمثل الأسهم الحمراء والسوداء مواقع الإبرة قبل وبعد علاج الأسمنت السني. د: متوسط تغيرات المسافة في طرف الإبرة ه: الرسوم التوضيحية للطريقة المستخدمة لقياس العلاقة بين الصفيحة فوق مستوى الجمجمة وتحول الموقع. (و) متوسط تغيرات المسافة في طرف الإبرة. الأشرطة وأشرطة الخطأ هي الوسائل ± SEMs. ** تشير إلى الأهمية (P < 0.01) على النحو الذي يحدده اختبار t للطالب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: إجراء طلاء أساسي وهمي مفصل (يتم تنفيذه مباشرة بعد زرع عدسة التتابع). (A1) رسم كاريكاتوري من ثلاث خطوات للعدسة الموضوعية ، والصفيحة ، ومجموعة أفلام البارافين على المنظار. (أ 2) نسخة فوتوغرافية من التجميع. (ب1) رسم كاريكاتوري يظهر إجراء الطلاء الأساسي الوهمي. أولا ، يتم محاذاة miniscope المجمعة مع عدسة الترحيل. العدسة الموضوعية الموضوعة قريبة من عدسة الترحيل قدر الإمكان. ثانيا ، يضاف الأسمنت السني إلى البارافيلم المحيط بالصفيحة ويوضع على الجمجمة لصنع قالب أنثوي للطلاء الأساسي في المستقبل. بعد ذلك ، تتم إزالة الصفيحة الأساسية ، ويضاف مطاط السيليكون المصبوب (الوردي) ويعلوه أسمنت الأسنان لحماية القالب الأنثوي وعدسة الترحيل. ثم يسمح للحيوان بالتعافي من التخدير. بعد 3 أسابيع على الأقل ، يتم تنفيذ إجراء الطلاء الأساسي. (ب2) نسخة فوتوغرافية من (B1). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: خطوات إجراء الطلاء الأساسي. (أ 1) قم بتوصيل الصفيحة الأساسية واضبط شريط تمرير التركيز البؤري يدويا على 2.7 إلى 3 مم. يبدو أن الإعداد من 2.7 إلى 3 مم (في الموضع الموضح في الصورة) هو أفضل مكان للبدء قبل البحث يدويا عن خلايا الفلورسنت. (ب1) يوضح الرسم البياني الكرتوني الأول أهمية الطول بين العدسة الموضوعية وعدسة الترحيل لتصور الخلايا الفلورية (عادة ما يتم ملاحظة خلايا الفلورسنت على مسافة تتراوح بين 0.5 و 2 مم). قبل ظهور خلية الفلورسنت ، يجب أن يرى الباحث هامش عدسة التتابع (الأسهم في الصورة العلوية). من المفيد أولا ضبط العدسة يدويا على موضع العرض الأمثل لأنه من الأسهل إجراء تعديلات سريعة يدويا. (ب2) ضع الطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام على مسبار الذراع المجسم ، ثم قم بتثبيت المنظار الصغير عن طريق لصقه على الذراع باستخدام طين لاصق قابل لإعادة الاستخدام. في هذه المرحلة ، قد تكون منطقة الاهتمام قد تغيرت ، ولكن يمكن إصلاح ذلك بسهولة عن طريق ضبط الذراع المجسم والطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام قليلا. بعد التحقق من المنطقة المثلى للاهتمام والعثور عليها ، أضف كمية صغيرة من الأسمنت السني (ممثلة باللون الأحمر). الغراء الصفيحة بأقل قدر ممكن من الأسمنت الأسنان. افصل المنظار والصفيحة بعد أن يجف الأسمنت السني. إذا كانت الصفيحة الأساسية غير مستقرة بدرجة كافية ، أضف أسمنت أسنان إضافي. (ج) يوضح هذا الرسم البياني أهمية كل خطوة لتحقيق النجاح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: أمثلة على النجاح والفشل أثناء إجراء الطلاء الأساسي. (أ) مثال على التصوير الناجح أثناء إجراء الطلاء الأساسي. استهدفت عدسة التتابع الحصين البطني. لوحظت عابرات مضان عندما كان الحيوان تحت التخدير مع إيزوفلوران (انظر أيضا الفيديو التكميلي S2). (أ 2) تم زيادة التباين لتحسين الرؤية. تشير الخطوط الحمراء المتقطعة إلى الأوعية الدموية. (أ 3) عابرة مضان خمسة أيام بعد الطلاء الأساسي عندما كان الماوس يتصرف بحرية في قفصه المنزلي (انظر أيضا الفيديو التكميلي S3 ؛ يتم توفير صور الفئران # 3 و # 4 أيضا في الفيديو التكميلي S3). حدث تحول طفيف فقط في الموقف. (ب1) مثال على الفشل. أثناء الطلاء الأساسي ، لوحظت فقط مناطق بيضاء / رمادية متجانسة لم تكن شبيهة بالخلية في الشكل (انظر أيضا الفيديو التكميلي S4). (ب2) أخطأت عدسة الترحيل المنطقة المستهدفة وكانت تقع فوق منطقة لا توجد بها خلايا مصابة. (ج1) مثال آخر على الفشل. في هذا الفأر ، على الرغم من ملاحظة العديد من الخلايا المستديرة ، لم يلاحظ أي عابر مضان أثناء الطلاء الأساسي (بعد ثلاثة أسابيع من الحضانة وأثناء تخدير / تخدير الفأر). علاوة على ذلك ، لم يتم تقديم أي عابرات مضان عند إجراء الطلاء الأساسي مرة أخرى (في الأسبوع الخامس من الحضانة) أو حتى عندما كان الحيوان يتصرف بحرية. تم الحصول على الصورة أثناء الطلاء الأساسي في الأسبوع الخامس من الحضانة (انظر أيضا الفيديو التكميلي S5). (C2 و C3) غاب عدسة الترحيل عن الطبقة الهرمية للقرن آمون البطني. النقاط الزرقاء هي نوى ملطخة ب DAPI. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| مشكلة | السبب المحتمل | حل | ||
| كان التصوير جيدا عند الطلاء الأساسي ولكن خارج التركيز تماما في اليوم التالي | تغير الحجم عند معالجة الأسمنت السني بين جمجمة الشخص وصفيحة الأساس | تابع "الطلاء الأساسي الوهمي" بعد إجراء زرع العدسة كما هو مقترح في هذا التقرير. اختر أسمنت الأسنان الذي يحتوي على تغيير أقل في الحجم. | ||
| يحتوي على مناطق بيضاء / رمادية متجانسة بدون أي شكل يشبه الخلية أثناء الطلاء الأساسي (انظر أيضا الفيديو التكميلي S4) | A. أخطأت عدسة التتابع المنطقة المستهدفة B. التعبير السيئ لمؤشر التألق C. ننسى تثبيت عدسة موضوعية أسفل المنظار الصغير حيث يتم التعبير عن مؤشر التألق فعليا | أ. استخدام العدسات الوهمية لممارسة العمليات الجراحية. تحقق من إحداثيات العدسة الوهمية بعد ممارسة الزرع B. ابحث عن عيار فيروسي مثالي لتجارب تصوير الكالسيوم (المشار إليه Resendez et al. 2016). إذا تعذر إجراء الاختبار المسبق لسبب ما ، فإننا نوصي المبتدئين بتجربة عيار أعلى أولا. (انظر قسم Disscusion للحصول على التفاصيل) C. المسمار على عدسة GRIN موضوعية (~ 0.25 الملعب. على سبيل المثال: إدموند البصريات. الأسهم # 64-519) في الجزء السفلي من miniscope. | ||
| مراقبة العديد من الخلايا ولكن لا توجد ديناميكيات مضان أثناء الطلاء الأساسي | أ. الخلايا العصبية غير الصحية أو الخلايا العصبية الميتة ب. نوع الغرامة المتناثرة من الخلايا العصبية ج. حالة التخدير العميق | ج: كن حذرا في كل عملية جراحية. استخدم إبرة حقنة جديدة تشبه قطر عدسة الترحيل لقطع مسار التسريب / الزرع أولا لتحرير الضغط عن طريق زرع العدسة. غرس الفيروس ببطء وزرع العدسة ببطء. ب. انتظر لفترة أطول لمراقبة أنشطة الخلايا العصبية أو قرصة الذيل قليلا لتحفيز الماوس. C. Baseplating ليس إجراء الغازية ، والحيوان يحتاج فقط إلى التخدير. لذلك ، فإن الحفاظ على 1.2 ~ 0.8٪ إيزوفلوران يكفي ، طالما أن الحيوان غير قادر على التحرك على الإطار المجسم. | ||
الجدول 1: مخطط استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
الفيديو التكميلي S1: اختبار حجم الأسمنت السني. تم قياس الفرق بين الحجم في بداية تحضير الأسمنت السني وأن الحجم بعد تجفيف الأسمنت. تم اختبار علامتين تجاريتين من أسمنت الأسنان (على سبيل المثال ، Tempron و Tokuso Curefast). لاختبار حجم الأسمنت السني بعد تجفيفه ، تم وزن 0.5 غرام من كل مسحوق أسمنت أسنان وخلطه بمحلوله المناسب (1 مل). بعد ذلك ، تم تحميل أطراف ماصة 0.1-10 ميكرولتر ب 2.5 ميكرولتر من خليط الأسمنت السني ومختومة بغراء علاج خفيف. بعد ذلك ، تم وضع النصائح على رف ، وتم تمييز أسطح مخاليط الأسمنت السني ، وتصويرها بالفيديو لمدة 40 دقيقة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو تكميلي S2: عروض توضيحية لإجراء الطلاء الأساسي. تم ضبط الزاوية بين سطح العدسة الشيئية وعدسة التتابع عن طريق تدوير قضيب الأذن أو قضيب الأسنان أو الطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام على المحور z. ظهر هامش عدسة التتابع كدائرة رمادية تشبه القمر على الشاشة. يجب أن يكشف التعبير الفيروسي الناجح وزرع العدسة عن ديناميكية مضان واحدة على الأقل (أسهم) أثناء الطلاء الأساسي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو تكميلي S3: عروض ديناميكيات التألق في الفئران التي تتصرف بحرية. عابرات مضان من الفئران # 3 و # 4 و # 5. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الفيديو التكميلي S4: مثال على الفشل. ظهرت خلفية موحدة أثناء إجراء الطلاء الأساسي. يرجى ملاحظة أن التغيير في السطوع لم يكن بسبب العابرين الفلوريين للخلايا الفردية. كان سببه إجراء البحث. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو تكميلي S5: عرض توضيحي لمثال فشل آخر. حدث نقص في العابرين الفلوريين أثناء إجراء الطلاء الأساسي ، لكن بعض هوامش الخلايا المستديرة كانت لا تزال مرئية. يرجى ملاحظة أن التغيير في السطوع لم يكن ناتجا عن العابرين الفلوريين للخلايا الفردية. كان سببه إجراء البحث. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا التقرير بروتوكولا تجريبيا مفصلا للباحثين الذين يستخدمون نظام UCLA Miniscope ثنائي العدسات. الأدوات المصممة في بروتوكولنا ميسورة التكلفة نسبيا لأي مختبر يرغب في تجربة تصوير الكالسيوم في الجسم الحي. يمكن أيضا استخدام بعض البروتوكولات ، مثل الحقن الفيروسي ، وزرع العدسة ، والطلاء الأساسي الوهمي ، والطلاء الأساسي ، لإصدارات أخرى من نظام miniscope لتحسين معدل نجاح تصوير الكالسيوم. بخلاف المشاكل العامة المتعلقة بالحقن الفيروسي ، وزرع العدسة التي تحتاج إلى إصلاح بغض النظر عن إصدار miniscope ، قد يتسبب هيكل صفيحة UCLA في حدوث تحول موضعي ، مما قد يؤدي إلى مسافات عمل غير متطابقة بين الهدف وعدسات الترحيل (الشكل 1C). تم تطوير بروتوكول تجريبي معدل لتقليل التحول الموضعي للعدستين (الشكل 2 ، الشكل 4 ، الشكل 5). يمكن تحقيق تصوير الكالسيوم الناجح من خلال مزيج من التعبير الفيروسي الناجح وزرع العدسة وإجراءات الطلاء الأساسي (الشكل 5C). يتطلب استخدام نظام ثنائي العدسة لمراقبة مناطق الدماغ العميقة مستوى عال من الدقة في إجراءات الطلاء الأساسي لأن المواضع النسبية لعدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية تحتاج أيضا إلى أن تكون دقيقة. لا يقدم هذا التقرير بروتوكولا يحل مشكلات الطلاء الأساسي فحسب ، بل يناقش أيضا بعض النصائح للحقن الفيروسي وزرع العدسات. أدناه ، نناقش إجراءات الطلاء الأساسي أولا ، تليها الحقن الفيروسي ، وإجراءات زرع العدسة ، ونصف بعض الأمثلة على الفشل (الشكل 6).
الطلاء الأساسي
يعد الإصدار V3 من UCLA Miniscope حاليا التصميم الأكثر استخداما ويمكن طلبه عبر الإنترنت. تتكون الصفيحة الأساسية لهذا الإصدار من حافتين بدون جدران (الشكل 1C1) ، لكن شكلها يمكن أن يتسبب في تحول غير متساو (الشكل 1C1 ، C2) بعد أن يجف الأسمنت السني تماما. تقلل إجراءات الطلاء الأساسي الوهمية في بروتوكولنا (الشكل 4) من مشكلات عدم المحاذاة وتغيير الصفيحة الأساسية لأنها تستخدم فيلم البارافين لتقليل المساحة المتاحة لأسمنت الأسنان أثناء الطلاء الأساسي الحقيقي (الشكل 5 ب). لا تزال المساحة المتبقية كافية للعثور على وضع التصوير الأمثل أثناء إجراء الطلاء الأساسي الحقيقي. لذلك ، يمكن للباحث لصق الصفيحة بأقل قدر ممكن من الأسمنت السني (الشكل 5B2). بالإضافة إلى ذلك ، يستغرق إجراء الطلاء الأساسي الوهمي وقتا قصيرا نسبيا (حوالي 15 إلى 20 دقيقة) لأنه لا يتطلب مسافة مثالية بين العدسة الشيئية وعدسة الترحيل ليتم تحقيقها. ومع ذلك ، فإن الطلاء الأساسي الوهمي هو مجرد واحد من العوامل الرئيسية لتصوير الكالسيوم الناجح. على سبيل المثال ، أثناء مراقبة إشارات التألق ، قد تظهر الخلايا العصبية ضبابية إذا كانت بعيدة قليلا عن مستوى العمل (اعتمادا على مسافة العمل لعدسة الترحيل ؛ غالبا ما تكون حوالي 100 ~ 300 ميكرومتر). القدرة على تحسين مسافة العمل محدودة ، حيث يتم تحديد مسافة عمل الخلايا العصبية مسبقا من خلال إجراء زرع عدسة التتابع. تم إجراء تجربة بدون إجراء الطلاء الأساسي الوهمي وكانت المنطقة محل الاهتمام دائما (في أربعة من كل أربعة فئران) مفقودة بعد الطلاء الأساسي لمرة واحدة. لذلك ، تم وضع هذه الحلول للحد من مشكلة الانكماش. قد تتجنب بعض أسمنت الأسنان خفيف العلاج مشكلة الانكماش أثناء المعالجة لأنها تلتئم بسرعة كبيرة. قد تساعد هذه الأسمنت الباحثين على ضبط المسافة أثناء إجراء الطلاء الأساسي. على الرغم من اختلاف نطاق الأطوال الموجية لإثارة مؤشرات الكالسيوم ومعالجة الأسمنت السني ، إلا أنه يجب منع التبييض الضوئي أثناء إجراء الطلاء الأساسي. من أجل منع التبييض الضوئي ، يجب أن يكون نطاق الأطوال الموجية الناتجة عن مصدر الضوء ضيقا إلى حد ما لتجنب التفاعلات المتقاطعة بين مؤشرات الكالسيوم وأسمنت الأسنان المعالج بالضوء. لذلك ، لا ينصح باستخدام الأسمنت السني المعالج بالضوء لإجراء الطلاء الأساسي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام بعض العلامات التجارية المحددة لأسمنت الأسنان بشكل متكرر للصق الصفائح الأساسية من قبل فرق بحثية أخرى6،7،8،10،11،12،13،14،15،16،22 . قد تحل خصائص الانكماش المنخفض لهذه الأسمنت المشكلة ، لكن لم تتح لنا الفرصة لاختبار هذه العلامات التجارية بسبب الصعوبات في شرائها (استيرادها). قد تخضع المنتجات الطبية للوائح الاستيراد حسب البلد / المنطقة. إذا واجه الباحثون صعوبة في الوصول إلى الأسمنت المذكور في الأدبيات6،7،8،10،11،12،13،14،15،16،22 ، فإن بروتوكولنا سيحل مشكلة انكماش الأسمنت السني.
بالإضافة إلى مشكلة الانكماش ، يمكن أن يحدث التآكل الهيكلي في المنظار الصغير نفسه وعلى الصفيحة الأساسية (خاصة المغناطيس الموجود في الصفيحة الأساسية) على مدار العديد من التجارب. أي فجوة صغيرة ناتجة عن التآكل تقلل من ثبات المسافة بين العدسات. مرة أخرى ، تعد الدقة على المسار البصري بأكمله مفتاحا لتصوير عابري الكالسيوم في الفئران التي تتصرف بحرية باستخدام منظار صغير.
استكشاف أخطاء الحقن الفيروسي / زرع العدسة وإصلاحها
قبل غرس الفيروس في منطقة الدماغ ، يوصى بتركيب إبرة جديدة على الذراع المجسمة وثقب الدماغ ببطء عند الإحداثيات المناسبة. نظرا لأن الإبرة الجديدة حادة جدا ، فإن هذا الثقب يعمل كخطوة تحضير لمسح المسار (أو قطع المسار) لإبرة الحقن المجهري الفعلية وعدسة الترحيل ويقلل من تلف الأنسجة ، والذي يمكن أن يحدث بسبب الضغط من إبرة الحقن المجهري أو عدسة الترحيل. تقطع الإبرة الحادة طريقا لعدسة التتابع الحادة ؛ وبالتالي ، يجب خفض طرف الإبرة إلى نفس الإحداثيات مع عدسة التتابع. تم اختيار الإبرة الداخلية لقسطرة 20 G IV لأن قطرها 1 مم ، وهو ما يشبه قطر عدسة الترحيل الخاصة بنا. يمكن استخدام مقياس إبرة مختلف اعتمادا على قطر عدسة التتابع.
على الرغم من أن الدراسة الحالية لم تركز على خصائص وعيار النواقل الفيروسية ، إلا أن هذه العوامل لا تزال حاسمة لنجاح تصوير الكالسيوم (الشكل 5C). من الضروري إجراء اختبار مسبق لجودة التعبير عن الناقل الفيروسي. توفر الخطوات من 1 إلى 5 من بروتوكول Resendez et al. طرقا مفصلة لتحديد عيار فيروسي مثالي لتجارب تصوير الكالسيوم8. إذا تعذر إجراء الاختبار المسبق لسبب ما ، فمن المستحسن أن يجرب المبتدئين عيارا مرتفعا نسبيا أولا. واحدة من عيوب استخدام عيار فيروسي عالي السميةالخلوية 8. تؤدي الخلايا العصبية الميتة إلى التألق الذاتي وتكون مرئية كبقع بيضاء ساطعة تحت المنظار8. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا العصبية الميتة هي معالم جيدة للمبتدئين للعثور على إجراء الطلاء الأساسي وممارسته. من ناحية أخرى ، على الرغم من أن ضخ فيروس منخفض العيار له خطر أقل لقتل الخلايا ، فقد يتم إخفاء التألق بواسطة الخلفية إذا لم تظهر الخلايا أي عابرات مضان أثناء إجراء الطلاء الأساسي. من الصعب تحديد أسباب الفشل لأن الخلايا العصبية المستهدفة قد يتم تفويتها بسبب زرع عدسة التتابع أو بسبب ضعف التعبير من قبل الناقل الفيروسي. تحديد السبب مربك للغاية دون تأكيد نسيجي. لذلك ، يوصى باستخدام فيروسات عالية العيار نسبيا إذا تعذر اختبار النواقل الفيروسية مسبقا.
يوصي Resendez et al. بإدخال إبرة الحقن المجهري 250 ميكرومتر الجانبي والبطني في موضع العدسة. أظهرت ملاحظاتنا أن ضخ الفيروس بنفس عمق عدسة الترحيل يمكن أن يؤدي أيضا إلى التعبير عن إشارات الكالسيوم الجيدة. نقترح أنه نظرا لاحتمال الإصابة والانتشار ، فإن غرس الفيروس بنفس عمق إحداثيات عدسة الترحيل هو الأمثل لتقليل تلف الأنسجة وزيادة دقة المسافة بين الخلايا العصبية المصابة وعدسة الترحيل. يوصي Resendez et al أيضا بإجراء الحقن الفيروسي ، وزرع العدسة أثناء نفس الجراحة نظرا للنطاق الضيق للمسافات العاملة بين الخلايا المستهدفة وعدسة الترحيل8. ومع ذلك ، يتبع بعض الباحثين بروتوكولا يتم فيه إجراء خطوة التسريب الفيروسي وخطوة زرع العدسة لمدة أسبوعين (أو أكثر) بفاصل18,26. إطالة الوقت بين الخطوات يقلل من وقت التشغيل الفردي. ولكن في هذا البروتوكول تم دمج هاتين الخطوتين في جراحة واحدة ، لأنه في بروتوكول الجراحة الواحدة ، يمكن للجراح مراقبة الموضع بين إبرة الحقن المجهري وعدسة الترحيل عند إنزالهما في المنطقة المستهدفة ، مما يقلل من فرصة فشل الاستهداف (الشكل 2B3).
بالنسبة لفأرين (الفئران # 1 و # 2) ، تم أيضا حذف استخدام إبرة لإنشاء مسار للعدسة ، وفي الفأر # 2 ، لوحظت بقع رمادية مستديرة تشبه الخلية (الشكل 6C). ومع ذلك ، لم يتم ملاحظة ديناميكيات التألق (الفيديو التكميلي S5). عند فحص شريحة الدماغ في هذا المثال (الشكل 6C2 ، C3) ، افترضنا أن عدسة التتابع سحبت بعض الخلايا لأسفل أثناء خفضها. كانت هذه الخلايا العصبية المسحوبة غير صحية ، لذلك لم يلاحظ أي نشاط أثناء إجراء الطلاء الأساسي أو أثناء التجربة.
كان لدينا فأر واحد بإشارة رمادية متجانسة تماما ولا توجد صور مرئية تشبه الخلية أثناء إجراء الطلاء الأساسي (الشكل 6B1). بعد التضحية بالفأر لوحظت شرائح دماغه. لوحظ أن العدسة كانت على الجانب الإنسي من الطبقة الهرمية المنحنية. تم تفويت المنطقة المستهدفة (الشكل 6B2) تماما. كانت هذه المحاولات الفاشلة تجارب حاسمة قادتنا إلى تعديل بروتوكول الجراحة لدينا والنجاح في النهاية مع ثلاثة فئران (الفيديو التكميلي S3).
إبرة الحقن المجهري
الجسم الثفني هو قناة ليفية صلبة تتراكب مع الحصين الظهري. بسبب صلابته ، فإنه يقاوم الاختراق بواسطة إبرة الحقن المجهري ذات الأطراف المسطحة. لذلك ، نوصي باستخدام إبرة الحقن المجهري مع طرف مشطوف. لا يقلل هذا النوع من الإبر من تلف الأنسجة فحسب ، بل يقلل أيضا من احتمال فشل بث الفيروس في المنطقة المستهدفة بسبب انسداد الألياف القريبة. لقد قمنا بتلخيص المشكلات المذكورة أعلاه في مخطط استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 1).
الإطار الزمني
يتم تلخيص الإطار الزمني للإجراء بأكمله في الشكل 2 أ ، مع الأيام كوحدات. بالتفصيل ، قد يستغرق جزء الجراحة (الحقن الفيروسي ، زرع عدسة التتابع ، الطلاء الأساسي الوهمي) 3 ساعات للمبتدئين أو 1.5 ساعة للباحثين المدربين تدريبا كافيا. الفئران لديها حجم جسم صغير والتمثيل الغذائي السريع ، وهي أكثر عرضة للمشاكل الصحية الناجمة عن فترات طويلة تحت التخدير من الأنواع الأكبر27. يجب أن يهدف الباحثون إلى الحفاظ على الوقت الذي يقضيه في الجراحة أقل من 3 ساعات. يمكن إجراء الطلاء الأساسي الحقيقي بعد 3 إلى 6 أسابيع من تعبير مؤشر الكالسيوم. قد يستغرق هذا الإجراء 1 ساعة. يمكن أن تستمر مراقبة نشاط الكالسيوم الطولي اللاحقة لأكثر من 1 شهر.
الاستنتاجات
UCLA Miniscope هو جهاز تصوير الكالسيوم مفتوح المصدر في الجسم الحي . بدون صفيحة أساسية أو وحدة عدسة جاهزة ومثبتة مسبقا ، يجب أن يكون الأفراد الذين يجرون التجارب قادرين على تحقيق المسافة المثلى بدقة بين العدسة الموضوعية وعدسة الترحيل أثناء إجراء الطلاء الأساسي. تكمن الصعوبة المتزايدة في استخدام نظام UCLA Miniscope ثنائي العدسة في تغيير حجم الأسمنت السني. لقد قمنا بتحسين البروتوكولات الأصلية وتقليل العيوب الناجمة عن المشاكل المذكورة أعلاه ، وبالتالي زيادة معدل نجاح تصوير الكالسيوم باستخدام نظام UCLA Miniscope ثنائي العدسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
هذه ليست دراسة مدعومة من الصناعة. لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح المالية.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان (108-2320-B-002 -074 ، 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
