Summary
La contracción del cemento dental durante el curado desplaza la placa base. Este protocolo minimiza el problema al crear una base inicial del cemento dental que deja espacio para cementar la placa base. Semanas más tarde, la placa base se puede cementar en posición en este andamio con poco cemento nuevo, reduciendo así la contracción.
Abstract
Los neurocientíficos usan microscopios en miniatura (miniscopios) para observar la actividad neuronal en animales que se comportan libremente. El equipo de Miniscopios de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA) proporciona recursos abiertos para que los investigadores construyan miniscopios ellos mismos. El V3 UCLA Miniscope es uno de los miniscopios de código abierto más populares actualmente en uso. Permite obtener imágenes de los transitorios de fluorescencia emitidos por neuronas modificadas genéticamente a través de una lente objetiva implantada en la corteza superficial (un sistema de una lente), o en áreas cerebrales profundas a través de una combinación de una lente de relé implantada en el cerebro profundo y una lente objetiva que está preanclada en el miniscopio para observar la imagen transmitida (un sistema de dos lentes). Incluso en condiciones óptimas (cuando las neuronas expresan indicadores de fluorescencia y la lente del relé se ha implantado correctamente), un cambio de volumen del cemento dental entre la placa base y su unión al cráneo tras el curado con cemento puede causar una desalineación con una distancia alterada entre el objetivo y las lentes del relé, lo que resulta en una mala calidad de imagen. Una placa base es una placa que ayuda a montar el miniscopio en el cráneo y fija la distancia de trabajo entre el objetivo y las lentes del relé. Por lo tanto, los cambios en el volumen del cemento dental alrededor de la placa base alteran la distancia entre las lentes. El presente protocolo tiene como objetivo minimizar el problema de desalineación causado por los cambios de volumen en el cemento dental. El protocolo reduce la desalineación mediante la construcción de una base inicial de cemento dental durante la implantación de lentes de relé. El tiempo de convalecencia después de la implantación es suficiente para que la base del cemento dental cure completamente la placa base, por lo que la placa base se puede cementar en este andamio utilizando la menor cantidad de cemento nuevo posible. En el presente artículo, describimos estrategias para el recubrimiento de base en ratones para permitir la obtención de imágenes de la actividad neuronal con una lente objetiva anclada en el miniscopio.
Introduction
Los reporteros de actividad fluorescente son ideales para obtener imágenes de la actividad neuronal porque son sensibles y tienen grandes rangos dinámicos 1,2,3. Por lo tanto, un número creciente de experimentos están utilizando microscopía de fluorescencia para observar directamente la actividad neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. El primer microscopio de fluorescencia miniaturizado de un fotón (miniscopio) fue diseñado en 2011 por Mark Schnitzer et al.5. Este miniscopio permite a los investigadores monitorear la dinámica de fluorescencia de las células cerebelosas en animales que se comportan libremente5 (es decir, sin ninguna restricción física, restricción de la cabeza, sedación o anestesia para los animales). Actualmente, la técnica se puede aplicar para monitorear áreas cerebrales superficiales como la corteza 6,8,15,16; áreas subcorticales como el hipocampo dorsal 8,11,13,14 y el cuerpo estriado 6,17; y áreas cerebrales profundas como el hipocampo ventral 14, la amígdala 10,18 y el hipotálamo 8,12.
En los últimos años, se han desarrollado varios miniscopios de código abierto.4,5,6,7,11,13,17,19. El miniscopio puede ser ensamblado económicamente por los investigadores si siguen las pautas paso a paso proporcionadas por el equipo de Miniscopio de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA).4,7,11,13. Porque el monitoreo óptico de la actividad neuronal está restringido por las limitaciones de la transmisión de la luz7 hacia y desde la población neuronal de interés, se diseñó un miniscopio que requiere que una lente de índice de refracción de gradiente objetivo (GRIN) (o lente objetiva) se ancle previamente en la parte inferior del miniscopio para ampliar el campo de visión que se transmite desde una lente GRIN de relé (o lente de relé)6,7,8,10,16,17. Esta lente de relé se implanta en la región del cerebro objetivo de tal manera que la actividad de fluorescencia de la región del cerebro objetivo se transmite a la superficie de la lente de relé.6,7,8,10,16,17. Aproximadamente 1/4 de un período sinusoidal completo de luz viaja a través de la lente GRIN del objetivo (~ 0.25 tono) (Figura 1A1), lo que da como resultado una imagen de fluorescencia ampliada6,7. La lente del objetivo no siempre se fija en la parte inferior del miniscopio ni es necesaria la implantación de la lente del relé6,7,11,13,15. Específicamente, hay dos configuraciones: una con una lente de objetivo fijo en el miniscopio y una lente de relé implantada en el cerebro.8,10,12,14,16 (Figura 1B1) y otro con solo una lente de objetivo extraíble6,7,11,13,15 (Figura 1B2). En el diseño basado en el objetivo fijo y la combinación de lente de relé implantada, las señales de fluorescencia del cerebro se llevan a la superficie superior de la lente de relé (Figura 1A1)7,8,10,12,14,16. Posteriormente, la lente del objetivo puede ampliar y transmitir el campo visual desde la superficie superior de la lente del relé (Figura 1A2). Por otro lado, el diseño de la lente GRIN de objetivo extraíble es más flexible, lo que significa que la preimplantación de una lente de relé en el cerebro no es obligatoria (Figura 1B2)6,7,11,13,15. Cuando se usa un miniscopio basado en un diseño de lente objetivo extraíble, los investigadores aún necesitan implantar una lente en la región del cerebro objetivo, pero pueden implantar una lente objetiva.6,7,11,13,15 o una lente de relé en el cerebro6,7. La elección de un objetivo o una lente de relé para la implantación determina la configuración del miniscopio que el investigador debe utilizar. Por ejemplo, el V3 UCLA Miniscope se basa en un diseño de lente GRIN objetivo extraíble. Los investigadores pueden elegir entre implantar directamente una lente objetiva en la región del cerebro de interés y montar el miniscopio "vacío" en la lente del objetivo.6,7,11,13,15 (un sistema de una lente; Figura 1B2) o para implantar una lente de relé en el cerebro y montar un miniscopio que está preanclado con una lente objetiva6,7 (un sistema de dos lentes; Figura 1B1). El miniscopio luego funciona como una cámara de fluorescencia para capturar imágenes en vivo de la fluorescencia neuronal producida por un indicador de calcio codificado genéticamente.1,2,3. Después de conectar el miniscopio a una computadora, estas imágenes de fluorescencia se pueden transferir a la computadora y guardar como videoclips. Los investigadores pueden estudiar la actividad neuronal analizando los cambios relativos en la fluorescencia con algunos paquetes de análisis.20,21 o escribir sus códigos para futuros análisis.
El V3 UCLA Miniscope proporciona flexibilidad para que los usuarios determinen si desean obtener imágenes de la actividad neuronal con un sistema de una o dos lentes7. La elección del sistema de grabación se basa en la profundidad y el tamaño del área del cerebro objetivo. En resumen, un sistema de una lente solo puede obtener imágenes de un área superficial (menos de aproximadamente 2.5 mm de profundidad) y relativamente grande (más grande que aproximadamente 1.8 x 1.8 mm2) porque los fabricantes solo producen un cierto tamaño de lente objetiva. Por el contrario, se puede aplicar un sistema de dos lentes a cualquier área del cerebro objetivo. Sin embargo, el cemento dental para pegar la placa base tiende a causar desalineación con una distancia alterada entre el objetivo y las lentes del relé, lo que resulta en una mala calidad de imagen. Si se utiliza el sistema de dos lentes, es necesario orientar con precisión dos distancias de trabajo para lograr la calidad de imagen óptima (Figura 1A). Estas dos distancias críticas de trabajo son entre las neuronas y la superficie inferior de la lente del relé, y entre la superficie superior de la lente del relé y la superficie inferior de la lente del objetivo (Figura 1A1). Cualquier desalineación o colocación incorrecta de la lente fuera de la distancia de trabajo da como resultado una falla de imagen (Figura 1C2). Por el contrario, el sistema de una lente requiere solo una distancia de trabajo precisa. Sin embargo, el tamaño de la lente del objetivo limita su aplicación para el monitoreo de regiones cerebrales profundas (la lente del objetivo que se ajusta al miniscopio es aproximadamente 1.8 ~ 2.0 mm 6,11,13,15). Por lo tanto, la implantación de una lente objetiva es limitada para la observación de la superficie y regiones cerebrales relativamente grandes, como la corteza 6,15 y la cornu ammonis dorsal 1 (CA1) en ratones11,13 . Además, se debe aspirar una gran área de la corteza para apuntar al CA1 dorsal11,13. Debido a la limitación de la configuración de una lente que impide la obtención de imágenes de regiones cerebrales profundas, los sistemas de miniscopio comerciales ofrecen solo un diseño combinado de lente / lente de relé objetivo (dos lentes). Por otro lado, el miniscopio V3 UCLA se puede modificar en un sistema de una o dos lentes porque su lente objetivo es extraíble 6,11,13,15. En otras palabras, los usuarios del miniscopio V3 UCLA pueden aprovechar la lente extraíble implantándola en el cerebro (creando un sistema de una lente), al realizar experimentos que involucran observaciones cerebrales superficiales (menos de 2.5 mm de profundidad), o preanclarla en el miniscopio e implantar una lente de relé en el cerebro (creando un sistema de dos lentes), al realizar experimentos que involucran observaciones cerebrales profundas. El sistema de dos lentes también se puede aplicar para observar superficialmente el cerebro, pero el investigador debe conocer las distancias de trabajo precisas entre la lente del objetivo y la lente del relé. La principal ventaja del sistema de una lente es que hay una menor probabilidad de perder las distancias de trabajo que con un sistema de dos lentes, dado que hay dos distancias de trabajo que deben orientarse con precisión para lograr una calidad de imagen óptima en el sistema de dos lentes (Figura 1A). Por lo tanto, recomendamos usar un sistema de una lente para observaciones cerebrales superficiales. Sin embargo, si el experimento requiere imágenes en el área profunda del cerebro, el investigador debe aprender a evitar la desalineación de las dos lentes.
El protocolo básico para la configuración de dos lentes de miniscopios para experimentos incluye la implantación de lentes y el revestimiento base 8,10,16,17. El recubrimiento base es el pegado de una placa base en la cabeza de un animal para que el miniscopio pueda montarse eventualmente en la parte superior del animal y grabar en video las señales de fluorescencia de las neuronas (Figura 1B). Este procedimiento implica el uso de cemento dental para pegar la placa base en el cráneo (Figura 1C), pero la contracción del cemento dental puede causar cambios inaceptables en la distancia entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo 8,17. Si la distancia desplazada entre las dos lentes es demasiado grande, las células no se pueden enfocar.
Ya se han publicado protocolos detallados para experimentos de imágenes profundas de calcio cerebral utilizando miniscopios8,10,16,17. Los autores de estos protocolos han utilizado el sistema Inscopix8,10,16 u otros diseños personalizados17 y han descrito los procedimientos experimentales para la selección viral, la cirugía y la fijación de la placa base. Sin embargo, sus protocolos no se pueden aplicar con precisión a otros sistemas de código abierto, como el sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope.6, y Finchscope19. La desalineación de las dos lentes puede ocurrir durante la grabación en una configuración de dos lentes con un miniscopio UCLA debido al tipo de cemento dental que se utiliza para cementar la placa base al cráneo.8,17 (Figura 1C). El protocolo actual es necesario porque la distancia entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo es propensa a cambiar debido a la contracción indeseable del cemento dental durante el procedimiento de recubrimiento base. Durante el recubrimiento base, la distancia de trabajo óptima entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo debe encontrarse ajustando la distancia entre el miniscopio y la parte superior de la lente del relé, y la placa base debe pegarse en esta ubicación ideal. Después de ajustar la distancia correcta entre la lente del objetivo y la lente de relé implantada, se pueden obtener mediciones longitudinales a resolución celular (Figura 1B; in vivo grabación). Dado que el rango óptimo de distancias de trabajo de una lente de relé es pequeño (50 - 350 μm)4,8, la contracción excesiva del cemento durante el curado puede dificultar mantener la lente del objetivo y la lente de relé implantada dentro del rango apropiado. El objetivo general de este informe es proporcionar un protocolo para reducir los problemas de contracción.8,17 que ocurren durante el procedimiento de recubrimiento base y para aumentar la tasa de éxito de las grabaciones de miniscopio de señales de fluorescencia en una configuración de dos lentes. La grabación exitosa de miniscopios se define como la grabación de una transmisión en vivo de cambios relativos notables en la fluorescencia de neuronas individuales en un animal que se comporta libremente. Aunque las diferentes marcas de cemento dental tienen diferentes tasas de contracción, los investigadores pueden seleccionar una marca que haya sido probada previamente.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Sin embargo, no todas las marcas son fáciles de obtener en algunos países / regiones debido a las regulaciones de importación de materiales médicos. Por lo tanto, hemos desarrollado métodos para probar las tasas de contracción de los cementos dentales disponibles y, lo que es más importante, proporcionar un protocolo alternativo que minimice el problema de contracción. La ventaja sobre el protocolo de recubrimiento base actual es un aumento en la tasa de éxito de las imágenes de calcio con herramientas y cemento que se pueden obtener fácilmente en los laboratorios. El miniscopio UCLA se utiliza como ejemplo, pero el protocolo también es aplicable a otros miniscopios. En este informe, describimos un procedimiento de revestimiento base optimizado y también recomendamos algunas estrategias para ajustar el sistema de dos lentes del miniscopio UCLA (Figura 2A). Tanto los ejemplos de implantación exitosa (n = 3 ratones) como los ejemplos de implantación fallida (n = 2 ratones) para la configuración de dos lentes con el miniscopio UCLA se presentan junto con las discusiones sobre las razones de los éxitos y fracasos.
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Protocol
Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Taiwán (Nº de aprobación: NTU-109-EL-00029 y NTU-108-EL-00158).
1. Evaluación de la alteración volumétrica del cemento dental
NOTA: Los cambios en el volumen de cemento dental ocurren durante el proceso de curado. Pruebe los cambios de volumen del cemento dental antes de la implantación y el revestimiento base. Los investigadores pueden probar cualquier marca de cemento dental y usar la marca con el cambio de volumen más bajo para cementar la placa base. En la figura 3 se muestra un ejemplo.
- Pesar 0,5 g de cada polvo de cemento dental y mezclarlo con su solución adecuada (1 ml).
NOTA: La proporción de polvo / líquido recomendada en las instrucciones del cemento dental es de 0,5 g de polvo a 0,25 ml de la solución para obtener una forma sólida. Este protocolo de prueba diluye la proporción a 0,5 g / ml para que la mezcla pueda aspirarse en forma líquida para medir el cambio de volumen en las puntas de las pipetas. - Use puntas de pipeta de 0.1-10 μL para eliminar 2.5 μL de la mezcla de cemento dental y luego selle la punta de la pipeta con un pegamento de curado ligero.
- Coloque las puntas en una rejilla, marque los niveles superiores de la mezcla de cemento dental y mida el nivel de la mezcla de cemento dental después de 40 minutos (video complementario S1).
- Además de monitorear los cambios de nivel durante el curado del cemento dental en las puntas, mida la densidad restante del cemento dental seco. Para calcular la densidad, mida el peso del cemento dental y mida el volumen con el principio de Arquímedes.
- En resumen, coloque el cemento dental seco restante en una taza llena de agua y pese el agua que se desborda.
- Utilice el cemento dental con la menor contracción para todos los protocolos detallados a continuación.
2. Anestesia, implantación quirúrgica, inyección viral y recubrimiento base ficticio
- Anestesia
NOTA: El presente informe tiene como objetivo optimizar la cirugía y el procedimiento de placa base para el miniscopio de UCLA; Por lo tanto, se asumió que se conocía el título viral óptimo para infectar las regiones cerebrales objetivo. Los métodos para encontrar el título viral óptimo se pueden encontrar en los pasos 1 a 5 de Resendez et al.8. Una vez optimizada la dilución viral, se puede iniciar la implantación quirúrgica.- Coloque el ratón en un recipiente de inducción y proporcione oxígeno (100% a una tasa de flujo de aire de 0,2 L / min). Preoxigenar el ratón durante 5 a 10 min.
- Administrar isoflurano al 5% mezclado con oxígeno al 100% (caudal de aire: 0,2 L/min) hasta que el ratón comience a perder el equilibrio y finalmente sea anestesiado.
- Retirar el ratón de la cámara de inducción e inyectar atropina (0,04 mg/kg; inyección subcutánea), para evitar la acumulación de saliva y buprenorfina (0,03 mg/kg; inyección subcutánea) como analgésico.
- Afeite la cabeza del ratón.
- Use una máscara, bata estéril y guantes. Preparar un espacio estéril e instrumentos quirúrgicos estériles para la cirugía. Estabilizar la cabeza del ratón (mantener la anestesia con isoflurano al 3 a 2,5% durante este paso) en el aparato estereotáxico. Después de los procedimientos analgésicos y anestésicos, asegúrese de que las barras para los oídos estabilicen firmemente la cabeza. Proporcionar soporte térmico.
- Asegúrese de que la cabeza esté en posición recta, esterilice la cabeza afeitada con betadina y luego rocíe la cabeza con xilocaína (10%), un analgésico local.
- Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad.
NOTA: Use ungüento oftálmico para la protección ocular durante todos los eventos anestésicos para prevenir lesiones oculares. - Prueba el reflejo de dolor profundo del animal pellizcando su pata trasera. Una vez que el animal no muestre reflejo de abstinencia de la pata, proceda con los procedimientos quirúrgicos.
- Haga una pequeña incisión a lo largo del plano sagital medio del cráneo (comenzando desde aproximadamente 2 mm anterior al bregma y terminando aproximadamente 6 mm posterior al bregma). Luego, limpie el tejido conectivo en el cráneo y ancle tres tornillos de acero inoxidable en los huesos frontales e interparietales izquierdos.
- En este punto, reduzca el isoflurano al 1-2%. Controle la frecuencia respiratoria durante todo el procedimiento quirúrgico. Si la frecuencia respiratoria es demasiado lenta (aproximadamente 1/s, dependiendo del animal), disminuya la concentración de isoflurano.
- Ejecute una craneotomía para la implantación de la lente del relé bajo un microscopio quirúrgico o estereomicroscopio mediante el uso de un taladro de rebabas con un diámetro de punta de 0,7 mm. Use un microtaladro para agarrar la broca de rebabas y dibuje un contorno del área del círculo prevista (no es necesario penetrar todo el grosor del calvario).
NOTA: La lente de relé utilizada en el presente protocolo tenía un diámetro de 1.0 mm, una longitud ~ 9.0 mm un paso de 1 y un rango de distancia de trabajo de ~100 μm - 300 μm; por lo tanto, la craneotomía tenía un diámetro de 1,2 mm.- Profundice suavemente el contorno hasta que la duramadre quede expuesta.
- Prepare 3 ml de solución salina estéril en una jeringa de 3 ml y enfríela en un cubo de hielo. Enjuague con frecuencia el área expuesta con 0.1 ml de solución salina de la jeringa para enfriar el área y evitar daños por calor y hemorragia.
- Recoge y despega ligeramente la duramadre con una aguja de 27G.
- Coloque una marca en una aguja roma de 27 G a 1 mm de la punta y úsela para aspirar cuidadosamente la corteza cerebral con el fin de crear una ventana para la implantación de lentes 8,11,13,17 (Figura 2B1). Si es necesario, haga una aguja roma moliendo la punta de una aguja de inyección de 27 G con papel de lija. Luego, conecte la aguja a una jeringa, conecte la jeringa a un tubo y conecte el tubo a una fuente de succión para crear un vacío.
NOTA: La lente del relé es roma y comprimirá el tejido cerebral cuando se coloque en el área profunda del cerebro. Por lo tanto, la aspiración de la corteza reduce el daño tisular debido a la implantación de lentes de relé. La corteza tiene aproximadamente 1 mm de espesor en ratones, pero es difícil de visualizar bajo un microscopio estereoscópico. La marca crea un punto de referencia para permitir que la profundidad de la aguja se determine con mayor precisión que con un microscopio estereoscópico solo. Además, se puede determinar si la región de la corteza ha sido alcanzada o pasada dependiendo de la resistencia; La parte superior de la corteza se siente relativamente suave, mientras que la región subcortical se siente densa. Por lo tanto, una vez que la textura comience a sentirse más densa, detenga la aspiración (Figura 2B3). - Prepare 3 ml de solución salina estéril en una jeringa de 3 ml y enfríela en un cubo de hielo. Enjuague el área con solución salina para detener el sangrado y disminuir la posibilidad de edema cerebral.
- Inyección de virus adenoasociado (AAV)
NOTA: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE se utilizó en el presente experimento. jGCaMP7s es un indicador de calcio codificado genéticamente que emite fluorescencia verde3. Debido a que el presente estudio utilizó un ratón de tipo salvaje como sujeto, se necesitó un vector viral para transfectar las neuronas con el gen indicador de calcio verde-fluorescente y permitir la expresión. Los investigadores que utilizan ratones transgénicos que expresan el indicador de calcio verde-fluorescente como sus sujetos pueden omitir el protocolo 2.2.- Monte la aguja interna de un catéter intravenoso (i.v.) de 20 G en el brazo estereotáxico y perfore lentamente (~100 - 200 μm/min) el cerebro en las coordenadas apropiadas (las mismas coordenadas utilizadas durante la implantación de lentes de relé) (Figura 2B3).
- Baje la aguja de microinyección a una velocidad de 100-200 μm/min en el CA1 ventral e infunda (~ 25 nL/min) 200 nL del vector viral en la región diana (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML y -3,50 mm DV desde el bregma).
- Espere 10 minutos para permitir que el virus se difunda y minimizar el flujo de retorno.
- Extraiga (~100-200 μm/min) la aguja de microinyección.
- Implantación de lentes de relé
- Desinfectar la lente del relé con alcohol al 75%10,16 y luego enjuagar con solución salina sin pirógenos. Remoje la lente en solución salina fría sin pirógenos hasta la implantación.
NOTA: Una lente fría minimiza el edema cerebral cuando se coloca en el cerebro. - Sostenga la lente del relé con una abrazadera micro bulldog (Figura 2B3) cuyos dientes hayan sido cubiertos con tubos termorretráctiles.
NOTA: La abrazadera bulldog puede sostener firmemente la lente sin dañarla. Consulte Resendez et al.8 para el método para hacer la abrazadera de bulldog cubierta de tubos. - Coloque lentamente (~100 - 200 μm/min) la lente del relé en la parte superior de la región objetivo (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML y -3,50 mm DV desde el bregma) y estabilícela con cemento dental.
- Desinfectar la lente del relé con alcohol al 75%10,16 y luego enjuagar con solución salina sin pirógenos. Remoje la lente en solución salina fría sin pirógenos hasta la implantación.
- Base ficticia
NOTA: El propósito del "revestimiento base ficticio" durante la cirugía de implantación es crear una base de cemento dental para reducir la cantidad de cemento dental que debe aplicarse durante el procedimiento de recubrimiento base real varias semanas después. De esta manera, se minimiza el riesgo de un cambio en el volumen del cemento dental.- Fije la lente del objetivo en la parte inferior del miniscopio y ensamble la placa base en el miniscopio (en este paso, el ensamblaje de la lente del objetivo anclado, la placa base y el miniscopio aún no se han colocado sobre el cráneo del ratón).
- Envuelva 10 cm de película de parafina alrededor del exterior de la placa base (Figura 4A).
- Sostenga el miniscopio con la sonda de brazo estereotáxica utilizando arcilla adhesiva reutilizable.
- Alinee la lente del objetivo en la parte superior de la lente del relé con el menor espacio posible entre las lentes (Figura 4B).
- Use cemento dental para asegurar la posición de la placa base (de modo que el cemento toque solo la película de parafina).
- Cuando el cemento dental se haya secado, retire la película.
- Retire la placa base y el miniscopio. La base de cemento dental es hueca (Figura 4B).
- Para proteger la lente del relé de las actividades diarias y de ser rayada por el mouse, selle la lente del relé con un poco de caucho de silicona moldeada hasta que la lente del relé esté cubierta, y cubra la goma de silicona con una capa delgada de cemento dental (Figura 4B).
- Desenganche el ratón de los instrumentos estereotáxicos y colóquelo en una cámara de recuperación.
- Inyecte carprofeno (5 mg/kg; inyección subcutánea) o meloxicam (1 mg/kg; inyección subcutánea) para analgesia y ceftazidima (25 mg/kg; inyección subcutánea) para prevenir la infección.
NOTA: El uso de antibióticos no es una alternativa a una técnica aséptica. Los antibióticos perioperatorios (es decir, ceftazidima) pueden estar indicados en ciertas circunstancias, como cirugías de larga duración o colocación de implantes crónicos. - Observe al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Alojar ratones individualmente e inyectar meloxicam (1 mg/kg; inyección subcutánea; cada 24h) durante una semana para aliviar el dolor posquirúrgico. Revise al animal todos los días después de la cirugía para asegurarse de que está comiendo, bebiendo y defecando normalmente.
- Realice el recubrimiento base después de 3 o más semanas.
3. Revestimiento base
NOTA: Por lo general, el procedimiento de placa base (Figura 5) no se puede realizar dentro de las 2-3 semanas del procedimiento inicial debido al tiempo de recuperación e incubación viral. Los procedimientos de inducción para el recubrimiento de base son similares a los descritos en los pasos 2.1.1 a 2.1.8. Sin embargo, el revestimiento de base no es un procedimiento invasivo, y el animal solo requiere sedación ligera. Por lo tanto, el isoflurano al 0,8-1,2% es suficiente, siempre y cuando el animal no pueda moverse en el marco estereotáxico. Además, la anestesia con isoflurano relativamente ligero también puede ayudar a facilitar la expresión de los transitorios de fluorescencia de las neuronas durante el monitoreo8 (Video suplementario S2).
- Corte cuidadosamente la capa delgada del techo de cemento dental con un rongeur de hueso y retire la goma de silicona. Limpie la superficie de la lente del relé con un 75% de alcohol.
- Sujete un tornillo de ajuste al lado de la placa base para fijarlo a la parte inferior del miniscopio (Figura 5A1).
NOTA: La placa base debe apretarse firmemente debajo de la parte inferior del miniscopio porque la diferencia entre una placa base apretada y ligeramente sujeta puede causar una distancia inconsistente. - Ajuste la diapositiva de enfoque para que esté aproximadamente a 2,7 - 3 mm de la carcasa principal (Figura 5A2).
NOTA: Aunque la longitud se puede ajustar aún más durante el procedimiento de base, fíjela a aproximadamente 2,7 mm, ya que ajustar simultáneamente la longitud del miniscopio y la longitud óptima entre la lente de relé implantada y la lente de objetivo preanclada es muy confuso. - Conecte el miniscopio a la placa de adquisición de datos y conéctelo a un puerto USB 3.0 (o versión superior) en una computadora.
- Ejecutar el software de adquisición de datos desarrollado por el equipo de UCLA.
- Ajuste la exposición a 255, la ganancia a 64x y el LED de excitación al 5%. Estos ajustes se recomiendan para el revestimiento base inicial; La configuración específica variará dependiendo de las regiones cerebrales y los niveles de expresión del indicador de calcio codificado genéticamente.
- Haga clic en el botón Conectar para conectar el miniscopio al software de adquisición de datos y ver la transmisión en vivo.
- Alinee la lente del objetivo del miniscopio con la lente del relé con la mano y comience a buscar las señales de fluorescencia (Figura 5B1).
NOTA: Inicialmente, la búsqueda manual de la señal de fluorescencia facilita los ajustes. Debido a que se utilizó un sistema AAV para expresar el indicador de calcio codificado genéticamente, tanto el tipo promotor como el serotipo AAV afectaron la eficiencia de la transfección23,24. Los investigadores deberían necesitar verificar la expresión del indicador de calcio encontrando neuronas individuales que muestren cambios en la fluorescencia antes de proceder con futuros experimentos. - Perfore el cemento dental en cualquier lugar donde bloquee el miniscopio (opcional).
- Vea la transmisión en vivo del software de adquisición de datos y use el margen de la lente del relé como punto de referencia (video complementario S2). El margen de la lente del relé aparece como un círculo gris similar a una luna en el monitor (Figura 5B1; flechas blancas).
- Una vez que se encuentre la lente del relé, ajuste cuidadosamente los diversos ángulos y distancias del miniscopio hasta que se encuentren las señales de fluorescencia.
NOTA: Las imágenes de las neuronas son más blancas que el fondo. Una forma neuronal precisa indica que las neuronas se encuentran perfectamente en el plano focal de la lente del relé. Las neuronas redondas sugieren que estaban cerca del plano focal. La forma neuronal es diferente en todo el cerebro, aquí se muestra CA1 ventral como ejemplo. - Si ninguna neurona individual muestra cambios en la fluorescencia en función del tiempo, vuelva a sellar la base con caucho de silicona. No se observa fluorescencia porque el período de incubación también depende de la propiedad del virus23,24. Realice los pasos 3.1-3.12 después de una semana adicional. (Esto es opcional).
- Sostenga el miniscopio en la posición óptima y mueva el brazo estereotáxico con una arcilla adhesiva reutilizable hacia el miniscopio (Figura 5B2). Adhiera el miniscopio al brazo estereotáxico con arcilla adhesiva reutilizable.
- Ajuste ligeramente los brazos x, y y z para buscar la mejor vista (video complementario S2). A continuación, ajuste el ángulo entre la superficie de la lente del objetivo y la lente del relé girando la barra del oído, la barra de dientes o la arcilla adhesiva reutilizable en el eje z. La expresión viral y la implantación del cristalino son exitosas cuando al menos una célula muestra transitorios de fluorescencia (Figura 6A; Video suplementario S2) durante el basal (que también depende del área del cerebro, como el CA1).
NOTA: Si el monitor sólo muestra glóbulos blancos pero no transitorios, hay otra causa (consulte la Figura 6B,C, Videos suplementarios S4,S5, la sección Resultados y la sección de solución de problemas). - Cementar la placa base (Figura 5B2) con el cemento dental.
- Controle la región de interés durante la cementación para asegurarse de que la posición óptima no cambie.
- Utilice la menor cantidad posible de cemento mientras pega firmemente la placa base a la base de cemento dental (Figura 5B2). Aplique una segunda y tercera capa de cemento alrededor de la placa base, pero tenga cuidado de no afectar la lente GRIN.
NOTA: La aplicación de cemento a la placa base es más fácil en este paso ya que la base de la placa base se formó durante el procedimiento de chapado ficticio. - Separe cuidadosamente el miniscopio de la placa base cuando el cemento esté curado. Luego, atornille una tapa protectora.
- Mueva al animal a una jaula de recuperación. Observe al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Ratones domésticos individualmente. Asegúrese de que está comiendo, bebiendo y defecando normalmente todos los días. Espere 5 días para que el ratón se recupere completamente y luego verifique las imágenes de calcio.
NOTA: Solo hay una pequeña cantidad de cemento dental que sostiene la placa base. Por lo tanto, si la placa base se ha desplazado considerablemente desde el procedimiento de recubrimiento base, retire el cemento dental con un taladro y realice el procedimiento de recubrimiento base nuevamente. - Anestesiar (mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (87 mg/kg)/xilazina (13 mg/kg)) y perfundir25 al animal cuando se realicen todos los experimentos.
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Representative Results
Evaluación de la alteración del volumen de cemento dental
Dado que el volumen del cemento dental cambia durante el proceso de curado, puede afectar significativamente la calidad de la imagen, dado que la distancia de trabajo de una lente GRIN es de aproximadamente 50 a 350 μm 4,8. Por lo tanto, se probaron dos cementos dentales disponibles comercialmente en este caso, Tempron y Tokuso, antes del procedimiento de implantación y recubrimiento base (Figura 5). Primero se evaluaron los videos para determinar si los cementos se habían reducido y luego se compararon los volúmenes de cementos cuando se secaron por completo. La misma concentración y volúmenes de las mezclas iniciales de cementos dentales se cargaron en puntas de pipeta y se grabaron en vídeo (vídeo complementario S1). El video S1 demostró que ambos cementos se encogieron durante el proceso de secado. Tokuso funcionó mejor que Tempron (es decir, tenía un volumen mayor que Tempron incluso después de reducirse): Figura 3B; volumen medio de Tempron: 0,93 ± 0,07 mL; volumen medio de Tokuso: 1,18 ± 0,07 mL; Prueba T: p = 0,048, t(6) = 2,46, lo que sugiere que se redujo menos. Las densidades de los cementos también se probaron 4 veces después del secado completo. Tokuso tuvo una densidad media más baja que Tempron (densidad media de Tempron: 1.07 ± 0.12 g / mL; densidad media de Tokuso: 0.93 ± 0.08 g / mL; prueba t: p = 0.38, t (6) = -0.94), lo que implica que tenía una tasa de contracción más baja. Por lo tanto, Tokuso se utilizó para los siguientes pasos de implantación y base. El propósito al describir el experimento anterior no es recomendar ninguna marca, sino más bien recordar a los experimentadores que encuentren un cemento dental que no sufra un cambio de volumen considerable al curar.
Medición del desplazamiento de imagen
Simulamos el revestimiento base ficticio y los procedimientos de revestimiento base original en un objeto fijo para investigar si el procedimiento de recubrimiento base ficticio da como resultado un cambio menor en la ubicación de la placa base que el procedimiento original. Se utilizó un adhesivo fotopolimétrico para fijar una aguja de jeringa de 23 G 2,5 cm en el centro de una placa base con 1 cm sobresaliendo de la placa base (Figura 3C). Luego, se simuló el revestimiento base sosteniendo las agujas con el brazo de un instrumento estereotáxico. En lugar de utilizar animales de laboratorio, se colocó una pegatina en la mesa del instrumento estereotáxico. La aguja de la jeringa perforó la pegatina, representando así la ubicación original. Luego, la aguja se elevó 0,5 mm y se iniciaron las cirugías de simulación. En una cirugía que imitaba el procedimiento de recubrimiento base de una sola vez8, se aplicó cemento dental hasta cubrir la placa base, que estaba 1 cm por encima de la etiqueta. Luego, hubo un período de espera de 2 horas para que el cemento se curara antes de empujar suavemente la aguja para perforar la pegatina nuevamente. Dado que el adhesivo fotopolimerizador no estabilizaba completamente la aguja, la aguja podía empujarse más profundamente para crear otro agujero, que representaba la ubicación de la placa base después de que el cemento dental se hubiera secado. La distancia entre el orificio inicial y el segundo orificio se midió para cuantificar el cambio de ubicación de la aguja. Los resultados demostraron que la placa base a 1 cm por encima del cráneo resultó en un cambio de ubicación de 1,76 ± 0,14 mm, pero el revestimiento base ficticio resultó en un desplazamiento de solo 0,75 ± 0,17 mm (Figura 3D; distancia de desplazamiento media del revestimiento base único frente al revestimiento base ficticio; prueba t: p < 0,01, t(8) = 6,03).
Además, teníamos curiosidad sobre si la altura del cemento dental influiría en el cambio. Por lo tanto, probamos aún más una altura más corta (Figura 3E; 0,5 cm arriba) mediante el procedimiento de recubrimiento base de una sola vez. La placa base que estaba anclada 0,5 cm por encima del cráneo se desplazó significativamente menos que la placa base 1 cm por encima del cráneo (Figura 3F; distancia media de desplazamiento: 0,43 ± 0,11 vs 1,76 ± 0,14 mm; prueba t: p < 0,01, t(8) = 9,73). Los datos sugirieron que la altura de la placa base sobre el cráneo y la distancia que la placa base se desplazó se correlacionaron positivamente. Dado que el procedimiento de recubrimiento base ficticio es seguido por un segundo paso de recubrimiento base que utiliza solo una cantidad mínima de cemento dental, estos datos también respaldan la hipótesis de que el recubrimiento base ficticio ayuda a mejorar la precisión del procedimiento de recubrimiento base.
Obtención de imágenes mediante un sistema de miniscopio de dos lentes
Al seguir los protocolos quirúrgicos para infusión viral, placa base ficticia y placa base (Figura 2, Figura 4, Figura 5), observamos transitorios de fluorescencia de neuronas individuales en tres ratones (n = 3/5) (Figura 6A, video suplementario S3) durante el procedimiento de placa base y después del procedimiento de placa base mientras los ratones se movían libremente, confirmando que la distancia de trabajo entre el objetivo y las lentes del relé seguía siendo la misma (Figura 6A1 frente a la figura 6A3, sólo se produjo un ligero cambio de posición) después de que el cemento dental se hubiera secado por completo. Aquí, proporcionamos videos de la placa base de un ratón (video suplementario S2; ratón # 5) y posteriores imágenes de calcio mientras los ratones se movían libremente (video suplementario S3; mouse # 3, # 4, # 5; datos sin procesar). Tenga en cuenta que el software de adquisición de datos para V3 no contiene funciones para la sustracción de fondo, y el contraste del video se puede mejorar mediante el procesamiento sin conexión). Para el video suplementario S2, se realizó una búsqueda manual de las señales de fluorescencia y luego el miniscopio se conectó al brazo estereotáxico para ajustes finos. Se observaron algunos transitorios de fluorescencia durante el sondeo (Video suplementario S2; Figura 6A). Un transitorio es un cambio suave en el brillo en manchas grises o blancas, no un patrón de disparo que se asemeja a una luz intermitente; Las figuras 6A 1 a 6A2 muestran imágenes de transitorios. El video de ratones que se comportan libremente mostró un cambio espacial aceptable en comparación con la región de interés durante el procedimiento de recubrimiento base (video complementario S3). Los márgenes de las células no pudieron mejorarse significativamente en esta etapa porque no pudimos ajustar la distancia entre la parte inferior de la lente del relé y las neuronas activas. En particular, algunos problemas pueden ocurrir con frecuencia durante el procedimiento de base, incluida la ausencia de cualquier cosa excepto un fondo uniforme (Figura 6B; Video complementario S4) o visibilidad de los márgenes de glóbulos blancos sin transitorios de fluorescencia (Figura 6C; Video complementario S5). También se proporcionan dos ejemplos de resultados negativos (n = 2/5) (Figura 6B, C, Videos suplementarios S4, S5). Las posibles razones de los fallos se examinan en la sección Discusión. Los procedimientos quirúrgicos para estos dos ratones se realizaron sin usar una aguja de 1 mm de diámetro para despejar la vía; Por lo tanto, la lente del relé se implantó directamente. Proponemos que en el ratón # 2, la lente del relé puede haber comprimido las neuronas y arrastrado algunas neuronas hacia abajo, lo que resulta en neuronas dañadas. Por lo tanto, no se encontraron transitorios de fluorescencia.
Figura 1: Mecanismos del miniscopio y los defectos que generalmente causan fallas de imagen . (A) Diagrama de dibujos animados de la lente de relé y la lente del objetivo que muestra los mecanismos necesarios para la visualización de células fluorescentes en un sistema de dos lentes. Las ondas de señalización de cada lente enfatizan la importancia y el mecanismo involucrado en la búsqueda de una distancia de trabajo para visualizar las células fluorescentes. (A1) La lente GRIN de relé se coloca por encima de las neuronas objetivo dentro de la distancia de trabajo. Dado que el tono de la lente del relé es 0.5 * N (donde N es un número entero), la lente permite la visualización de las neuronas objetivo transmitiendo luz, llevando las señales de fluorescencia originales a la parte superior de la lente del relé. Luego, aproximadamente 1/4 de un período sinusoidal completo de luz viaja a través de la lente GRIN del objetivo (~ 0.25 tono) y da como resultado una imagen ampliada. (A2) La lente del objetivo transmite las imágenes a un sensor complementario de metal-óxido-semiconductor (CMOS) ubicado en la parte superior (la placa verde en el diagrama) del miniscopio. (B) Diagrama de dibujos animados que presenta las diferencias en los procedimientos de implantación de lentes GRIN entre un sistema (B1) de dos lentes y (B2) un sistema de una lente. En general, la principal diferencia es que el sistema de una lente utiliza directamente su lente objetivo para obtener imágenes de la superficie del cerebro; Como resultado, la lente objetivo debe implantarse en la parte superior de las neuronas objetivo. (C) En contraste, en el sistema de dos lentes, en comparación, se implanta una lente de relé adicional en el cerebro y la lente del objetivo se ancla previamente en el miniscopio. (C1) La forma de la placa base para la versión V3 del UCLA Miniscope puede causar un desplazamiento desigual después de que el cemento dental se seque por completo. (C2) Este desplazamiento provoca una desalineación o desviación de la distancia de trabajo entre la lente del relé y la lente del objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Protocolos modificados y protocolos quirúrgicos detallados para mejorar la tasa de éxito del sistema de miniscopio de dos lentes. (A1) Protocolo quirúrgico modificado para el sistema de dos lentes. Se muestran las ubicaciones de la inyección viral y la implantación de la lente GRIN del relé. El basado ficticio permite que la distancia de trabajo abarque con precisión las neuronas de interés y reduce el desplazamiento posicional asociado con el procedimiento de basechaping (A2). Por lo tanto, (A3) aumenta la probabilidad de obtener imágenes de células fluorescentes en ratones que se comportan libremente. (B) Imagen de dibujos animados de los pasos para la inyección viral y la colocación de la lente GRIN del relé. (B1) Primero, marque la aguja de aspiración con un bolígrafo aproximadamente 1 mm (para experimentos con ratones) desde la punta para ayudar en la evaluación de la profundidad de aspiración de la corteza. Luego, aspire el tejido conectivo y la corteza (aproximadamente 1 mm de profundidad en ratones) del cerebro. (B2) Use el hipocampo ventral como el área objetivo para implantar una lente de relé; En particular, el duro cuerpo calloso es el punto de referencia para detener la aspiración de la región cortical. La textura fibrosa del cuerpo calloso se puede ver bajo el microscopio estereoscópico durante la aspiración. (B3) En segundo lugar, perfore el punto de interés con una aguja interna de un catéter de 20 G (aproximadamente 1 mm de diámetro; el diámetro es similar al de la lente del relé) para despejar una vía antes de la infusión viral. Bajo el microscopio estereoscópico, debe ser visible una abolladura (círculo discontinuo en la imagen) creada por la aguja. Baje la aguja de microinyección y la lente del relé en la abolladura (o a solo 250 μm del centro de la abolladura). Finalmente, coloque la lente GRIN del relé (en el presente estudio, utilizamos una lente de relé de 1 mm de diámetro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición del cambio de volumen del cemento dental curado. (A) Un ejemplo con cemento dental curado de dos marcas. Las flechas negras indican los niveles originales después de mezclar el polvo y la solución. Las flechas blancas indican los niveles después de 10, 20 y 40 minutos de curación. Las flechas rojas apuntan a la parte inferior de las puntas, que fueron selladas con pegamento de curado por luz. (B) Volúmenes medios de los cementos dentales restantes después de que se hayan secado completamente. Las barras y barras de error son los medios ± SEMs. * denota significancia (P < 0,05) según lo determinado por la prueba t de Student. (C) Ilustraciones y una fotografía que explique el método utilizado para medir el desplazamiento de ubicación de la placa base. Se pegó una aguja a través de la placa base y se utilizó para simular el procedimiento de placa base original (placa base de un solo paso) y el procedimiento de placa base ficticia. Las flechas rojas y negras representan las ubicaciones de la aguja antes y después de curar el cemento dental. (D) Cambios de distancia media de la punta de la aguja (E) Ilustraciones del método utilizado para medir la relación entre la placa base por encima del nivel del cráneo y el cambio de ubicación. (F) Cambios de distancia media de la punta de la aguja. Las barras y barras de error son los medios ± SEMs. ** denota significancia (P < 0.01) según lo determinado por la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Procedimiento detallado de chapado base ficticio (ejecutado inmediatamente después de la implantación de la lente del relé). (A1) Caricatura de tres pasos de lente objetiva, placa base y ensamblaje de película de parafina en el miniscopio. (A2) Versión fotográfica del montaje. (B1) Caricatura que muestra el procedimiento de chapado base ficticio. Primero, el miniscopio ensamblado está alineado con la lente del relé. La lente del objetivo colocada está lo más cerca posible de la lente del relé. En segundo lugar, se agrega cemento dental a la parapelícula que rodea la placa base y se aplica sobre el cráneo para hacer un molde femenino para futuras placas base. Luego, se retira la placa base, y se agrega caucho de silicona moldeado (rosa) y se remata con cemento dental para proteger el molde hembra y la lente del relé. Luego se permite que el animal se recupere de la anestesia. Después de al menos 3 semanas, se realiza el procedimiento de placa base. (B2) Versión fotográfica de (B1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Pasos para el procedimiento de baseplating. (A1) Coloque la placa base y (A2) ajuste manualmente el control deslizante de enfoque de 2,7 a 3 mm. Un ajuste de 2,7 a 3 mm (en la posición que se muestra en la imagen) parece ser el mejor lugar para comenzar antes de buscar manualmente las células fluorescentes. (B1) El primer diagrama de dibujos animados ilustra la importancia de la longitud entre la lente del objetivo y la lente del relé para la visualización de las células fluorescentes (las células fluorescentes generalmente se observan a una distancia entre 0,5 y 2 mm). Antes de que emerja la célula fluorescente, el investigador debe ver el margen de la lente del relé (flechas en la imagen superior). Es útil ajustar primero manualmente la lente a la posición de visualización óptima porque es más fácil hacer ajustes rápidos a mano. (B2) Coloque arcilla adhesiva reutilizable en la sonda de brazo estereotáxica y luego estabilice el miniscopio adhiriéndolo al brazo con arcilla adhesiva reutilizable. En esta etapa, la región de interés puede haber cambiado, pero esto se puede arreglar fácilmente ajustando ligeramente el brazo estereotáxico y la arcilla adhesiva reutilizable. Después de verificar y encontrar la región óptima de interés, agregue una pequeña cantidad de cemento dental (representado en rojo). Pegue la placa base con la menor cantidad de cemento dental posible. Separe el miniscopio y la placa base después de que el cemento dental se seque. Si la placa base no es lo suficientemente estable, agregue cemento dental adicional. (C) Este diagrama ilustra la importancia de cada paso para lograr el éxito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ejemplos de éxito y fracaso durante el procedimiento de baseplating. (A) Un ejemplo de imágenes exitosas durante el procedimiento de baseplating. La lente de relé se dirigió al hipocampo ventral. Se observaron transitorios de fluorescencia cuando el animal estaba bajo anestesia con isoflurano (ver también Video suplementario S2). (A2) El contraste se incrementó para una mejor visibilidad. Las líneas discontinuas rojas indican vasos sanguíneos. (A3) Transitorios de fluorescencia cinco días después de la placa base cuando el ratón # 5 se comportaba libremente en su jaula doméstica (ver también Video suplementario S3; las imágenes de ratones # 3 y # 4 también se proporcionan en el video suplementario S3). Solo se produjo un ligero cambio de posición. (B1) Un ejemplo de un fracaso. Durante el recubrimiento base, solo se observaron áreas homogéneas blancas / grises que no tenían forma de celda (consulte también el video complementario S4). (B2) La lente del relé perdió el área objetivo y se ubicó sobre una región sin células infectadas. (C1) Otro ejemplo de fracaso. En este ratón, aunque se observaron muchas células redondas, no se observaron transitorios de fluorescencia durante el recubrimiento base (después de tres semanas de incubación y mientras el ratón estaba anestesiado/sedado). Además, no se realizaron transitorios de fluorescencia cuando se realizó de nuevo el procedimiento de recubrimiento de base (en la quinta semana de incubación) o incluso cuando el animal se comportaba libremente. La imagen se obtuvo durante el recubrimiento base en la quinta semana de incubación (véase también el vídeo complementario S5). (C2 y C3) La lente del relé perdió la capa piramidal del hipocampo ventral. Los puntos azules son núcleos que fueron teñidos con DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Problema | Posible causa | Solución | ||
| Tenía buenas imágenes cuando estaba en la base, pero completamente desenfocado al día siguiente | Cambio de volumen al curar el cemento dental entre el cráneo del sujeto y la placa base | Proceda al "recubrimiento base ficticio" después del procedimiento de implantación de lentes, como se sugiere en el presente informe. Elija un cemento dental que tenga menos cambio de volumen. | ||
| Tiene áreas homogéneas blancas / grises sin ninguna forma similar a una celda durante el revestimiento base (también vea el video complementario S4) | Un. La lente del relé perdió el área objetivo B. Mala expresión del indicador de fluorescencia C. Olvídese de instalar una lente objetiva debajo del miniscopio donde se expresa realmente el indicador de fluorescencia | A. Use lentes ficticios para practicar cirugías. Verifique las coordenadas de la lente ficticia después de la implantación práctica B. Encuentre un título viral óptimo para los experimentos de imágenes de calcio (referido a Resendez et al. 2016). Si por alguna razón, no se pueden realizar pruebas previas, recomendamos que los principiantes prueben primero un título más alto. (Consulte la sección Disscusion para obtener más detalles) C. Atornille una lente GRIN objetiva (~ 0.25 pitch. ej: Edmund Optics; Stock #64-519) en la parte inferior del miniscopio. | ||
| Observar muchas células pero sin dinámica de fluorescencia durante el recubrimiento base | A. Neuronas enfermas o neuronas muertas B. Tipo de neuronas con clarificación dispersa C. Estado de anestesia profunda | A. Tenga cuidado con cada procedimiento quirúrgico. Use una aguja de jeringa nueva que sea similar al diámetro de su lente de relé para cortar primero la ruta de infusión / implantación para liberar la presión mediante la implantación de la lente. Infundir lentamente el virus e implantar lentamente la lente. B. Espere más tiempo para monitorear las actividades de las neuronas o pellizque un poco la cola para estimular al ratón. C. El recubrimiento base no es un procedimiento invasivo, y el animal solo necesita sedación. Por lo tanto, mantener 1.2 ~ 0.8% de isoflurano es suficiente, siempre y cuando el animal no pueda moverse en el marco estereotáxico. | ||
Tabla 1: Tabla de solución de problemas.
Video complementario S1: Prueba de volumen de cemento dental. La diferencia entre el volumen se midió al comienzo de la preparación del cemento dental y que el volumen después del cemento se secó. Se probaron dos marcas de cemento dental (por ejemplo, Tempron y Tokuso Curefast). Para probar el volumen del cemento dental después de su secado, se pesaron 0,5 g de cada polvo de cemento dental y se mezclaron con su solución adecuada (1 ml). Luego, las puntas de pipeta de 0.1-10 μL se cargaron con 2.5 μL de la mezcla de cemento dental y se sellaron con pegamento fotocurado. Luego, las puntas se colocaron en una rejilla, se marcaron las superficies de las mezclas de cemento dental y se grabaron en video durante 40 minutos. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario S2: Demostraciones del procedimiento de baseplating. El ángulo entre la superficie de la lente del objetivo y la lente del relé se ajustó girando la barra del oído, la barra de dientes o la arcilla adhesiva reutilizable en el eje z. El margen de la lente del relé apareció como un círculo gris similar a una luna en el monitor. La expresión viral exitosa y la implantación del cristalino deben revelar al menos una dinámica de fluorescencia (flechas) durante el recubrimiento base. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario S3: Demostraciones de la dinámica de fluorescencia en ratones que se comportan libremente. Transitorios de fluorescencia de ratones #3, #4 y #5. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario S4: Un ejemplo de un error. Apareció un fondo uniforme durante el procedimiento de basechapado. Tenga en cuenta que la alteración en el brillo no se debió a los transitorios de fluorescencia de las células individuales; Fue causado por el procedimiento de búsqueda. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario S5: Demostración de otro ejemplo de falla. Una falta de transitorios de fluorescencia ocurrió durante el procedimiento de placa base, pero algunos márgenes de células redondas todavía eran visibles. Tenga en cuenta que la alteración en el brillo no fue causada por los transitorios de fluorescencia de las células individuales; Fue causado por el procedimiento de búsqueda. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
El presente informe describe un protocolo experimental detallado para los investigadores que utilizan el sistema de miniscopio UCLA de dos lentes. Las herramientas diseñadas en nuestro protocolo son relativamente asequibles para cualquier laboratorio que desee probar imágenes de calcio in vivo . Algunos protocolos, como la inyección viral, la implantación de lentes, el recubrimiento base ficticio y el recubrimiento base, también podrían usarse para otras versiones del sistema de miniscopio para mejorar la tasa de éxito de las imágenes de calcio. Aparte de los problemas generales con la inyección viral y la implantación de lentes que deben solucionarse independientemente de la versión del miniscopio, la estructura de la placa base de UCLA puede causar un cambio de posición, lo que puede conducir a distancias de trabajo no coincidentes entre el objetivo y las lentes de relé (Figura 1C). Se desarrolló un protocolo experimental modificado para minimizar el cambio posicional de las dos lentes (Figuras 2, Figura 4, Figura 5). Las imágenes de calcio exitosas se pueden lograr a través de una combinación exitosa de expresión viral, implantación de lentes y procedimientos de recubrimiento base (Figura 5C). El uso de un sistema de dos lentes para observar áreas profundas del cerebro requiere un alto nivel de precisión en los procedimientos de recubrimiento base porque las posiciones relativas de la lente de relé implantada y la lente del objetivo también deben ser precisas. Este informe no solo presenta un protocolo que resuelve los problemas de base, sino que también analiza algunos consejos para la inyección viral y la implantación de lentes. A continuación, discutimos primero los procedimientos de recubrimiento base, seguidos de la inyección viral y los procedimientos de implantación de lentes, y describimos algunos ejemplos de fallas (Figura 6).
Revestimiento base
La versión V3 del UCLA Miniscope es actualmente el diseño más utilizado y se puede pedir en línea. La placa base de esta versión consta de dos bordes sin paredes (Figura 1C1), pero su forma puede causar un desplazamiento desigual (Figura 1C1, C2) después de que el cemento dental esté completamente seco. Los procedimientos de recubrimiento base ficticio en nuestro protocolo (Figura 4) minimizan la desalineación y los problemas de desplazamiento de la placa base porque utiliza una película de parafina para reducir el espacio disponible para el cemento dental durante el recubrimiento base real (Figura 5B). El espacio restante sigue siendo suficiente para encontrar una posición óptima de imagen durante el procedimiento de recubrimiento base real. Por lo tanto, el investigador puede pegar la placa base con la menor cantidad de cemento dental posible (Figura 5B2). Además, el procedimiento de recubrimiento base ficticio lleva relativamente poco tiempo (aproximadamente de 15 a 20 minutos), ya que no requiere una distancia perfecta entre la lente del objetivo y la lente del relé para lograrse. Sin embargo, el recubrimiento base ficticio es solo uno de los factores clave para el éxito de las imágenes de calcio; Por ejemplo, durante el monitoreo de señales de fluorescencia, las neuronas pueden aparecer borrosas si están ligeramente fuera del plano de trabajo (dependiendo de la distancia de trabajo de la lente del relé; a menudo aproximadamente 100 ~ 300 μm). La capacidad de mejorar la distancia de trabajo es limitada, ya que la distancia de trabajo de las neuronas está predeterminada por el procedimiento de implantación de lentes de relé. Se realizó un experimento sin el procedimiento de placa base ficticia y la región de interés siempre se perdió (en cuatro de cada cuatro ratones) después de una sola vez. Por lo tanto, estas soluciones fueron ideadas para reducir el problema de la contracción. Algunos cementos dentales fotocurados pueden evitar el problema de la contracción durante el curado porque se curan muy rápidamente; Estos cementos pueden ayudar a los investigadores a ajustar la distancia durante el procedimiento de base. Aunque el rango de longitudes de onda para excitar los indicadores de calcio y curar el cemento dental es diferente, se debe evitar el fotoblanqueo durante el procedimiento de recubrimiento base. Para evitar el fotoblanqueo, el rango de longitudes de onda generadas por la fuente de luz debe ser bastante estrecho para evitar reacciones cruzadas entre los indicadores de calcio y el cemento dental fotocurado. Por lo tanto, no se recomienda el uso de cemento dental fotocurado para el procedimiento de recubrimiento base. Además, algunas marcas específicas de cementos dentales son utilizadas con frecuencia para pegar placas base por otros equipos de investigación 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . Las propiedades de baja contracción de estos cementos pueden resolver el problema, pero no tuvimos la oportunidad de probar estas marcas debido a las dificultades para comprarlas (importarlas). Los productos de grado médico pueden estar sujetos a regulaciones de importación dependiendo del país / región. Si los investigadores tienen dificultades para acceder a los cementos mencionados en la literatura 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, nuestro protocolo resolverá el problema de contracción del cemento dental.
Además del problema de contracción, el desgaste estructural puede ocurrir en el propio miniscopio y en la placa base (especialmente los imanes en la placa base) en el transcurso de muchos experimentos. Cualquier pequeño espacio causado por el desgaste reduce la estabilidad de la distancia entre las dos lentes. Una vez más, la precisión en toda la trayectoria óptica es clave para obtener imágenes de transitorios de calcio en ratones que se comportan libremente utilizando un microscopio.
Solución de problemas de inyección viral/implantación de lentes
Antes de infundir el virus en la región del cerebro, se recomienda montar una nueva aguja en el brazo estereotáxico y perforar lentamente el cerebro en las coordenadas apropiadas. Debido a que la nueva aguja es muy afilada, esta punción sirve como un paso de preparación para despejar el camino (o cortar un camino) para la aguja de microinyección real y la lente de relé y minimiza el daño tisular, que puede ser causado por la compresión de la aguja de microinyección o lente de relé. La aguja afilada corta un camino para la lente de relé romo; Por lo tanto, la punta de la aguja debe bajarse a las mismas coordenadas con la lente del relé. Se eligió la aguja interna de un catéter intravenoso de 20 G porque tenía un diámetro de 1 mm, que era similar al diámetro de nuestra lente de relé. Se puede usar un calibre de aguja diferente dependiendo del diámetro de la lente del relé.
Aunque el presente estudio no se centró en las propiedades y títulos de los vectores virales, estos factores siguen siendo críticos para el éxito de las imágenes de calcio (Figura 5C). Es necesario probar previamente la calidad de expresión del vector viral. Los pasos 1 a 5 del protocolo de Resendez et al. proporcionan métodos detallados para la identificación de un título viral óptimo para experimentos de imágenes de calcio8. Si la prueba previa no se puede realizar por alguna razón, se recomienda que los principiantes prueben primero un título relativamente alto. Una de las desventajas de usar un título viral alto es la citotoxicidad8. Las neuronas muertas dan lugar a la autofluorescencia y son visibles como manchas blancas brillantes bajo el miniscopio8. Sin embargo, estas neuronas muertas son buenos puntos de referencia para que los principiantes encuentren y practiquen el procedimiento de placa base. Por otro lado, aunque la infusión de un virus de título bajo tiene un menor riesgo de matar células, la fluorescencia puede estar enmascarada por el fondo si las células no muestran ningún transitorio de fluorescencia durante el procedimiento de base. Es difícil identificar las razones del fracaso porque las neuronas diana pueden perderse debido a la implantación de lentes de relé o debido a la mala expresión del vector viral. Determinar la causa es muy confuso sin confirmación histológica. Por lo tanto, se recomienda el uso de virus de título relativamente alto si los vectores virales no pueden ser probados previamente.
Resendez et al. recomiendan insertar la aguja de microinyección de 250 μm lateral y ventral a la colocación de la lente. Nuestras observaciones demostraron que la infusión del virus a la misma profundidad que la lente del relé también puede conducir a la expresión de buenas señales de calcio. Proponemos que, debido a la posibilidad de infección y propagación, la infusión del virus a la misma profundidad que la coordenada de la lente del relé es óptima para reducir el daño tisular y aumentar la precisión de la distancia entre las neuronas infectadas y la lente del relé. Resendez et al también recomiendan realizar la inyección viral y la implantación de lentes durante la misma cirugía, dado el estrecho rango de distancias de trabajo entre las células diana y la lente de relé8. Sin embargo, algunos investigadores siguen un protocolo en el que el paso de infusión viral y el paso de implantación del cristalino se llevan a cabo con dos (o más) semanas de diferencia18,26. Alargar el tiempo entre pasos reduce el tiempo operatorio individual. Pero en este protocolo, estos dos pasos se fusionaron en una sola cirugía, porque en el protocolo de una sola cirugía, el cirujano puede monitorear la posición entre la aguja de microinyección y la lente del relé al bajarlos al área objetivo, lo que reduce la posibilidad de una orientación fallida (Figura 2B3).
Para dos ratones (ratones # 1 y # 2), también se omitió el uso de una aguja para crear un camino para la lente, y en el ratón # 2, se observaron manchas grises redondas similares a células (Figura 6C). Sin embargo, no se observó dinámica de fluorescencia (video suplementario S5). Al examinar la porción cerebral de este ejemplo (Figura 6C2, C3), postulamos que la lente del relé arrastraba algunas células hacia abajo mientras se bajaba. Estas neuronas arrastradas no eran saludables, por lo que no se notó actividad durante el procedimiento de placa base o durante el experimento.
Tuvimos un ratón con una señal gris completamente homogénea y sin imágenes visibles similares a células durante el procedimiento de recubrimiento base (Figura 6B1). Después de sacrificar al ratón se observaron sus cortes cerebrales. Se notó que la lente estaba en el lado medial de la capa piramidal curvada; el área objetivo (Figura 6B2) se perdió por completo. Estos intentos fallidos fueron experiencias críticas que nos llevaron a modificar nuestro protocolo de cirugía y finalmente tener éxito con tres ratones (Video complementario S3).
Aguja de microinyección
El cuerpo calloso es un tracto fibroso duro que se superpone al hipocampo dorsal. Debido a su rigidez, resiste la penetración de una aguja de microinyección de punta plana. Por lo tanto, recomendamos usar una aguja de microinyección con una punta biselada. Este tipo de aguja no solo reduce el daño tisular, sino que también reduce la posibilidad de que no se infunda el virus en el área objetivo debido al bloqueo de las fibras cercanas. Hemos resumido los problemas mencionados anteriormente en una tabla de solución de problemas (Tabla 1).
Marco temporal
El marco de tiempo para todo el procedimiento se resume en la Figura 2A, con días como unidades. En detalle, la parte de la cirugía (inyección viral, implantación de lentes de relé, placa base ficticia) puede tomar 3 h para principiantes o 1.5 h para investigadores suficientemente capacitados. Los ratones tienen un tamaño corporal pequeño y un metabolismo rápido, y son más susceptibles a los problemas de salud causados por largos períodos bajo anestesia que las especies más grandes27. Los investigadores deben tratar de mantener el tiempo dedicado a la cirugía por debajo de 3 h. El recubrimiento base real se puede realizar después de 3 a 6 semanas de expresión del indicador de calcio. Este procedimiento puede durar 1 h. La posterior observación longitudinal de la actividad del calcio puede continuarse durante más de 1 mes.
Conclusiones
El UCLA Miniscope es un dispositivo de imágenes de calcio in vivo de código abierto. Sin una placa base o módulo de lente preinstalado y listo para usar, las personas que realizan experimentos deben poder alcanzar con precisión la distancia óptima entre la lente del objetivo y la lente del relé durante el procedimiento de recubrimiento base. La mayor dificultad de usar el sistema UCLA Miniscope de dos lentes radica en el cambio de volumen del cemento dental. Hemos optimizado los protocolos originales y minimizado los defectos causados por los problemas mencionados anteriormente, aumentando así la tasa de éxito de las imágenes de calcio con el sistema UCLA Miniscope de dos lentes.
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Disclosures
Este no es un estudio respaldado por la industria. Los autores no reportan conflictos de intereses financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
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