Summary
硬化中の歯科用セメントの収縮は、ベースプレートを変位させます。このプロトコルは、ベースプレートをセメントで固めるスペースを残す歯科用セメントの初期基礎を作成することにより、問題を最小限に抑えます。数週間後、ベースプレートは、ほとんど新しいセメントを使用してこの足場の所定の位置にセメントで固定できるため、収縮が減少します。
Abstract
神経科学者は、小型顕微鏡(ミニスコープ)を使用して、自由に行動する動物の神経活動を観察します。カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームは、研究者が自分でミニスコープを構築するためのオープンリソースを提供しています。V3 UCLAミニスコープは、現在使用されている最も人気のあるオープンソースミニスコープの1つです。表在皮質に埋め込まれた対物レンズ(1レンズシステム)を介して遺伝子組み換えニューロンから放出される蛍光トランジェントのイメージング、または脳深部に埋め込まれたリレーレンズとミニスコープに事前に固定された対物レンズの組み合わせ(2レンズシステム)を介して、脳深部領域のイメージングを可能にします。最適な条件下(ニューロンが蛍光インジケーターを発現し、リレーレンズが適切に埋め込まれている場合)でも、セメント硬化時にベースプレートと頭蓋骨への付着との間の歯科用セメントの体積変化により、対物レンズとリレーレンズの間の距離が変化してずれ、画質が低下する可能性があります。ベースプレートは、ミニスコープを頭蓋骨に取り付け、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離を固定するのに役立つプレートです。したがって、ベースプレートの周りの歯科用セメントの体積の変化は、レンズ間の距離を変化させる。本プロトコルは、歯科用セメントの体積変化によって引き起こされるミスアライメントの問題を最小限に抑えることを目的としています。このプロトコルは、リレーレンズの埋め込み中に歯科用セメントの初期基礎を構築することにより、ミスアライメントを低減します。移植後の回復時間は、歯科用セメントの基礎がベースプレートを完全に硬化させるのに十分であるため、できるだけ少ない新しいセメントを使用して、ベースプレートをこの足場にセメントで固定できます。本稿では、ミニスコープに固定された対物レンズで神経活動のイメージングを可能にするマウスのベースプレーティング戦略について説明します。
Introduction
蛍光活性レポーターは、感度が高く、ダイナミックレンジが大きいため、ニューロン活動のイメージングに最適です1,2,3。そのため、蛍光顕微鏡を使用して神経活動を直接観察する実験が増えています1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。最初の小型化された一光子蛍光顕微鏡(ミニスコープ)は、2011年にMark Schnitzerらによって設計されました5。このミニスコープにより、研究者は自由に行動する動物5の小脳細胞の蛍光ダイナミクスをモニターできます(つまり、動物への身体的拘束、頭部拘束、鎮静、または麻酔なし)。現在、この技術は、皮質6,8,15,16などの表在脳領域を監視するために適用することができる。背海馬8,11,13,14および線条体6,17などの皮質下領域。腹側海馬14、扁桃体10,18、視床下部8,12などの脳深部領域。
近年、いくつかのオープンソースのミニスコープが開発されています4,5,6,7,11,13,17,19.ミニスコープは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームが提供する段階的なガイドラインに従っていれば、研究者が経済的に組み立てることができます。4,7,11,13.神経活動の光学的モニタリングは光透過の限界によって制限されるため7 関心のあるニューロン集団との間で、リレーGRINレンズ(またはリレーレンズ)から中継される視野を拡大するために、対物レンズ勾配屈折率(GRIN)レンズ(または対物レンズ)をミニスコープの下部に事前に固定する必要があるミニスコープが設計されました。6,7,8,10,16,17.このリレーレンズは、標的脳領域の蛍光活動がリレーレンズの表面に中継されるように、標的脳領域に埋め込まれる。6,7,8,10,16,17.正弦波周期の約1/4の光が対物レンズ(~0.25ピッチ)を通過します(図 1A1)、拡大蛍光画像が得られます6,7.対物レンズは必ずしもミニスコープの下部に固定されているわけではなく、リレーレンズの埋め込みも必要ありません。6,7,11,13,15.具体的には、ミニスコープに固定された対物レンズと脳に埋め込まれたリレーレンズの2つの構成があります。8,10,12,14,16 (図 1B1)と取り外し可能な対物レンズだけの別のレンズ6,7,11,13,15 (図 1B2).固定対物レンズと埋め込み型リレーレンズの組み合わせに基づく設計では、脳からの蛍光信号がリレーレンズの上面に運ばれます(図 1A1)7,8,10,12,14,16.その後、対物レンズは、リレーレンズの上面から視野を拡大して透過させることができます(図 1A2).一方、取り外し可能な対物レンズGRINレンズの設計はより柔軟であるため、脳へのリレーレンズの事前埋め込みは必須ではありません(図 1B2)6,7,11,13,15.取り外し可能な対物レンズ設計に基づくミニスコープを使用する場合、研究者はターゲットの脳領域にレンズを埋め込む必要がありますが、対物レンズを埋め込むこともできます6,7,11,13,15 または脳内のリレーレンズ6,7.移植用の対物レンズまたはリレーレンズの選択によって、研究者が使用しなければならないミニスコープの構成が決まります。たとえば、V3 UCLAミニスコープは、取り外し可能な対物レンズGRINレンズ設計に基づいています。研究者は、関心のある脳領域に対物レンズを直接埋め込み、「空の」ミニスコープを対物レンズに取り付けるかを選択できます。6,7,11,13,15 (一眼システム; 図 1B2)または、脳にリレーレンズを埋め込み、対物レンズで事前に固定されたミニスコープを取り付ける6,7 (2レンズシステム; 図 1B1).次に、ミニスコープは蛍光カメラとして機能し、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターによって生成されたニューロン蛍光のライブストリーム画像をキャプチャします1,2,3.ミニスコープをコンピュータに接続すると、これらの蛍光画像をコンピュータに転送し、ビデオクリップとして保存できます。研究者は、いくつかの分析パッケージで蛍光の相対的な変化を分析することにより、ニューロン活動を研究できます20,21 または、将来の分析のためにコードを記述します。
V3 UCLAミニスコープは、ユーザーが1レンズまたは2レンズシステムでニューロン活動を画像化するかどうかを決定できる柔軟性を提供します7。記録システムの選択は、ターゲット脳領域の深さとサイズに基づいています。簡単に言うと、1レンズシステムは、メーカーが特定のサイズの対物レンズしか製造していないため、表面的(深さ約2.5 mm未満)で比較的大きい(約1.8 x 1.8 mm2より大きい)領域しか撮像できません。対照的に、2レンズシステムは、任意のターゲット脳領域に適用できます。しかし、地板を接着するための歯科用セメントは、対物レンズとリレーレンズの距離が変わるとズレが発生しやすく、画質が低下します。2レンズシステムを使用する場合、最適な画像品質を達成するために、2つの作動距離を正確にターゲットにする必要があります(図1A)。これらの2つの臨界作動距離は、ニューロンとリレーレンズの底面の間、およびリレーレンズの上面と対物レンズの底面の間です(図1A1)。レンズの位置がずれたり、作動距離外にずれたりすると、イメージングに失敗します(図1C2)。対照的に、ワンレンズシステムは1つの正確な作動距離しか必要としません。しかし、対物レンズのサイズは、脳深部領域のモニタリングへの用途を制限します(ミニスコープに適合する対物レンズは約1.8~2.0mmです6,11,13,15)。したがって、マウス11、13における皮質6、15および背角アンモニス1(CA1)などの表面および比較的大きな脳領域の観察のための対物レンズの移植は制限される。さらに、背側CA1を標的とするために皮質の広い領域を吸引する必要があります11,13。脳深部領域のイメージングを妨げる1レンズ構成の制限により、市販のミニスコープシステムは対物レンズ/リレーレンズ(2レンズ)を組み合わせた設計のみを提供します。一方、V3 UCLAミニスコープは、対物レンズが取り外し可能であるため、1レンズまたは2レンズのいずれかのシステムに変更することができます6,11,13,15。つまり、V3 UCLAミニスコープのユーザーは、脳の表面観察(深さ2.5 mm未満)を含む実験を行うときに、脳に埋め込む(ワンレンズシステムを作成する)、またはミニスコープに事前に固定してリレーレンズを脳に埋め込む(2レンズシステムを作成する)ことで、取り外し可能なレンズを利用できます。 脳深部観察を含む実験を行う場合。2レンズシステムは脳の表面観察にも適用できますが、研究者は対物レンズとリレーレンズの間の正確な作動距離を知っている必要があります。1レンズシステムの主な利点は、2レンズシステムで最適な画像品質を達成するために正確にターゲットを絞る必要がある2つの作動距離があることを考えると、2レンズシステムよりも作動距離を逃す可能性が低いことです(図1A)。したがって、表面的な脳の観察にはワンレンズシステムを使用することをお勧めします。ただし、実験で脳深部でのイメージングが必要な場合、研究者は2つのレンズのずれを回避することを学ぶ必要があります。
実験用ミニスコープの2レンズ構成の基本プロトコルには、レンズの埋め込みとベースメッキが含まれます8,10,16,17。ベースプレーティングとは、ベースプレートを動物の頭に接着して、ミニスコープを最終的に動物の上に取り付け、ニューロンの蛍光信号をビデオテープに収めることです(図1B)。この手順では、歯科用セメントを使用してベースプレートを頭蓋骨に接着しますが(図1C)、歯科用セメントの収縮は、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの間の距離に許容できない変化を引き起こす可能性があります8,17。2つのレンズ間の距離が大きすぎると、セルに焦点を合わせることができません。
ミニスコープを用いた脳深部カルシウムイメージング実験の詳細なプロトコルはすでに公開されています8,10,16,17.これらのプロトコルの作成者は、Inscopixシステムを使用しています8,10,16 または他のカスタマイズされたデザイン17 ウイルスの選択、手術、およびベースプレートの付着に関する実験手順について説明しました。ただし、それらのプロトコルは、V3 UCLAミニスコープシステム、NINscopeなどの他のオープンソースシステムに正確に適用することはできません。6、およびフィンチスコープ19.2つのレンズのミスアライメントは、ベースプレートを頭蓋骨にセメントで固定するために使用される歯科用セメントの種類が原因で、UCLAミニスコープを使用した2レンズ構成での記録中に発生する可能性があります。8,17 (図 1C).本プロトコルが必要なのは、埋込まれたリレーレンズと対物レンズの間の距離が、ベースプレーティング手順中の歯科用セメントの望ましくない収縮のためにシフトする傾向があるためです。ベースプレーティングでは、ミニスコープとリレーレンズの上部の間の距離を調整して、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの間の最適な作動距離を見つける必要があり、この理想的な位置にベースプレートを接着する必要があります。対物レンズと埋め込みリレーレンズの正しい距離を設定すると、セル分解能(図 1B; in vivo 録音)。リレーレンズの作動距離の最適範囲が小さいため(50〜350μm)4,8、硬化中の過度のセメント収縮は、対物レンズと埋め込みリレーレンズを適切な範囲内に保つことを困難にする可能性があります。このレポートの全体的な目標は、収縮の問題を減らすためのプロトコルを提供することです。8,17 ベースプレーティング手順中に発生し、2レンズ構成での蛍光信号のミニスコープ記録の成功率を高めます。成功したミニスコープ記録は、自由に行動する動物における個々のニューロンの蛍光の顕著な相対的変化のライブストリームの記録として定義されます。歯科用セメントのブランドが異なれば収縮率は異なりますが、研究者は以前にテストされたブランドを選択できます6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22.ただし、一部の国/地域では、医療材料の輸入規制により、すべてのブランドを簡単に入手できるわけではありません。したがって、利用可能な歯科用セメントの収縮率をテストする方法を開発し、重要なことに、収縮の問題を最小限に抑える代替プロトコルを提供します。現在のベースプレーティングプロトコルに対する利点は、実験室で簡単に入手できるツールとセメントを使用したカルシウムイメージングの成功率の向上です。例としてUCLAミニスコープが使用されますが、プロトコルは他のミニスコープにも適用できます。このレポートでは、最適化されたベースメッキ手順について説明し、UCLAミニスコープ2レンズシステム(図 2A).UCLAミニスコープを使用した2レンズ構成の移植成功例(n=3匹)と移植失敗例(n=2匹)を、成功と失敗の理由について議論とともに紹介します。
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Protocol
この研究で実施されたすべての手順は、国立台湾大学動物管理使用委員会によって承認されました(承認番号:NTU-109-EL-00029および NTU-108-EL-00158)。
1. 歯科用セメントの体積変化の評価
注意: 歯科用セメントの量の変化は、硬化プロセス中に発生します。移植とベースメッキの前に、歯科用セメントの体積変化をテストします。研究者は、あらゆるブランドの歯科用セメントをテストし、体積変化が最も少ないブランドを使用して地板をセメントで固めることができます。 図 3 に例を示します。
- 各歯科用セメント粉末0.5 gを計量し、適切な溶液(1 mL)と混合します。
注意: 歯科用セメントの説明書で推奨される粉末/液体の比率は、固体の形を得るために0.5 gの粉末と0.25 mLの溶液です。この試験プロトコルは、ピペットチップの容量変化を測定するために混合物を液体の形で吸引できるように、比率を0.5 g/mLに希釈します。 - 0.1〜10 μLのピペットチップを使用して2.5 μLの歯科用セメント混合物を除去し、次にピペットチップを光硬化型接着剤で密封します。
- チップをラックに置き、歯科用セメント混合物の最上位レベルをマークし、40分後に歯科用セメント混合物のレベルを測定します(補足ビデオS1)。
- チップの歯科用セメント硬化中のレベル変化を監視することに加えて、残りの乾燥歯科用セメント密度を測定します。密度を計算するには、歯科用セメントの重量を測定し、アルキメデスの原理で体積を測定します。
- 簡単に言えば、残りの乾いた歯科用セメントを水で満たされたカップに入れ、あふれた水を量ります。
- 以下に詳述するすべてのプロトコルで収縮が最も少ない歯科用セメントを使用してください。
2.麻酔、外科的移植、ウイルス注入、およびダミーベースメッキ
- 麻酔
注:本レポートは、UCLAミニスコープの手術とベースメッキ手順を最適化することを目的としています。したがって、標的脳領域に感染するための最適なウイルス力価が既知であると仮定した。最適なウイルス力価を見出すための方法は、Resendezらのステップ1〜5に見出すことができる。8.ウイルス希釈が最適化されると、外科的移植を開始できます。- マウスを誘導容器に入れ、酸素を供給します(0.2 L / minの空気流量で100%)。マウスを5〜10分間予備酸素化します。
- マウスがバランスを崩し始め、最終的に麻酔されるまで、100%酸素(気流速度:0.2 L / min)と混合した5%イソフルランを投与します。
- マウスを誘導室から取り出し、アトロピン(0.04 mg / kg;皮下注射)を注射して、唾液と鎮痛剤としてのブプレノルフィン(0.03 mg / kg;皮下注射)の蓄積を防ぎます。
- マウスの頭を剃ります。
- マスク、滅菌ガウン、手袋を着用してください。手術用の無菌空間と無菌手術器具を準備します。脳定位固定装置でマウスの頭を安定させます(このステップの間、3〜2.5%のイソフルランで麻酔を維持します)。鎮痛および麻酔処置の後、イヤーバーが頭をしっかりと安定させていることを確認してください。熱サポートを提供します。
- 頭がまっすぐな位置にセットされていることを確認し、剃った頭をベタジンで滅菌してから、局所鎮痛剤であるキシロカイン(10%)を頭にスプレーします。
- 乾燥を防ぐために目に獣医軟膏を塗ります。
注意: 眼の損傷を防ぐために、すべての麻酔イベント中に目の保護のために眼科用軟膏を使用してください。 - 後ろ足をつまんで動物の深い痛みの反射をテストします。動物が足の離脱反射を示さなくなったら、外科的処置に進みます。
- 頭蓋骨の矢状面の中央に沿って小さな切開を行います(ブレグマの約2 mm前方から始まり、ブレグマの約6 mm後方で終わります)。次に、頭蓋骨の結合組織をきれいにし、3本のステンレス鋼のネジを左前頭骨と頭頂間骨に固定します。
- この時点で、イソフルランを1〜2%に減らす。外科手術全体を通して呼吸数を監視します。呼吸数が遅すぎる場合(動物によって異なりますが、約1 / s)、イソフルランの濃度を下げます。.
- 手術用顕微鏡または実体顕微鏡下でリレーレンズ移植の開頭術は、先端直径0.7mmのバリドリルを使用して実行します。マイクロドリルを使用してバリドリルビットをつかみ、目的の円領域の輪郭を描きます(頭蓋骨の全厚さを貫通する必要はありません)。
注:本プロトコルで使用されているリレーレンズは、直径1.0 mm、長さ~9.0 mm、ピッチ1、作動距離範囲は~100 μm〜300 μmでした。したがって、開頭術の直径は1.2 mmでした。- 硬膜が露出するまで輪郭をゆっくりと深くします。
- 3 mLシリンジで3 mLの滅菌生理食塩水を調製し、アイスバケットで冷却します。注射器から0.1mLの生理食塩水で露出部分を頻繁にすすぎ、その領域を冷却し、熱による損傷や出血を防ぎます。
- 27Gの針で硬膜を軽く摘み取り、はがします。
- 先端から1mmのところにある27Gの鈍い針にマーキングを付け、それを使用して脳の皮質を注意深く吸引し、水晶体移植用の窓を作成します8,11,13,17(図2B1)。必要に応じて、27 Gの注射針の先端をサンドペーパーで削って鈍い針を作ります。次に、針を注射器に接続し、注射器をチューブに接続し、チューブを吸引源に接続して真空を作ります。
注意: リレーレンズは鈍く、脳深部に配置すると脳組織を圧迫します。したがって、皮質の吸引は、リレーレンズ移植による組織損傷を減少させる。マウスの皮質の厚さは約1 mmですが、実体顕微鏡で視覚化することは困難です。マークは、実体顕微鏡のみの場合よりも正確に針の深さを決定できるランドマークを作成します。さらに、抵抗に応じて皮質領域に到達したか通過したかを判断できます。皮質の上部は比較的柔らかく感じられますが、皮質下領域は密に感じます。したがって、テクスチャが濃く感じられたら、吸引を停止します(図2B3)。 - 3 mLシリンジで3 mLの滅菌生理食塩水を調製し、アイスバケットで冷却します。生理食塩水でその領域をすすぎ、出血を止め、脳浮腫の可能性を減らします。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)注射
注:本実験ではAAV9-syn-jGCaMP7s-WPREを使用しました。jGCaMP7sは、緑色蛍光を発する遺伝的にコードされたカルシウム指示薬です3。本研究では野生型マウスを対象としたため、緑色蛍光カルシウム指標遺伝子をニューロンにトランスフェクトし、発現を可能にするためにウイルスベクターが必要でした。緑色蛍光カルシウムインジケーターを発現するトランスジェニックマウスを被験者として使用する研究者は、プロトコル2.2をスキップできます。- 20 Gの静脈内(i.v.)カテーテルの内側の針を脳固定装置アームに取り付け、適切な座標(リレーレンズ移植時と同じ座標)で脳をゆっくりと穿刺します(~100〜200 μm/分)(図2B3)。
- マイクロインジェクション針を100-200 μm/minの速度で腹側CA1に下げ、200 nLのウイルスベクターを標的領域に注入(~25 nL/分)します(ブレグマから-3.16 mm AP、3.25 mm ML、および-3.50 mm DV)。
- ウイルスが拡散し、逆流を最小限に抑えるまで10分間待ちます。
- マイクロインジェクションニードルを引き抜く(~100-200μm/分)。
- リレーレンズ埋め込み
- リレーレンズを75%アルコール10,16で消毒してから、パイロジェンフリーの生理食塩水ですすいでください。移植されるまで、レンズを冷たいパイロジェンフリーの生理食塩水に浸します。
注:コールドレンズは、脳に入れたときの脳浮腫を最小限に抑えます。 - 歯が熱収縮チューブで覆われているマイクロブルドッグクランプ(図2B3)を使用してリレーレンズを保持します。
注意: ブルドッグクランプは、レンズを損傷することなくしっかりと保持できます。チューブで覆われたブルドッグクランプの作成方法については、Resendezら8 を参照してください。 - リレーレンズをターゲット領域(ブレグマから-3.16 mm AP、3.50 mm ML、-3.50 mm DV)の上にゆっくりと置き(~100 - 200 μm/min)、歯科用セメントで安定させます。
- リレーレンズを75%アルコール10,16で消毒してから、パイロジェンフリーの生理食塩水ですすいでください。移植されるまで、レンズを冷たいパイロジェンフリーの生理食塩水に浸します。
- ダミー下地めっき
注:移植手術中の「ダミーベースメッキ」の目的は、数週間後の実際のベースメッキ手順中に塗布する必要のある歯科用セメントの量を減らすために、歯科用セメントベースを作成することです。このようにして、歯科用セメントの体積の変化のリスクが最小限に抑えられます。- 対物レンズをミニスコープの下部に固定し、ベースプレートをミニスコープに組み立てます(このステップでは、固定された対物レンズ、ベースプレート、およびミニスコープのアセンブリはまだマウスの頭蓋骨の上に配置されていません)。
- 地板の外側に10cmのパラフィンフィルムを巻き付けます(図4A)。
- 再利用可能な接着粘土を使用して、脳定位固定装置アームプローブでミニスコープを保持します。
- 対物レンズをリレーレンズの上に合わせ、レンズ間のスペースをできるだけ小さくします(図4B)。
- 歯科用セメントを使用して、ベースプレートの位置を固定します(セメントがパラフィンフィルムにのみ接触するように)。
- 歯科用セメントが乾いたら、フィルムを取り除きます。
- ベースプレートとミニスコープを取り外します。歯科用セメントベースは中空です(図4B)。
- リレーレンズを日常の活動やマウスによる引っかき傷から保護するために、リレーレンズが覆われるまでリレーレンズを成形シリコーンゴムで密封し、シリコーンゴムを歯科用セメントの薄層で覆います(図4B)。
- マウスを定位固定装置から外し、マウスを回収チャンバーに入れます。
- 鎮痛にはカルプロフェン(5 mg / kg;皮下注射)またはメロキシカム(1 mg / kg;皮下注射)を注射し、感染を防ぐためにセフタジジム(25 mg / kg;皮下注射)を注射します。.
注:抗生物質の使用は、無菌技術に代わるものではありません。周術期の抗生物質(すなわち、セフタジジム)は、長期間の手術や慢性インプラントの配置など、特定の状況で適応となる場合があります。. - 胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を観察します。
- マウスを個別に飼育し、メロキシカム(1 mg / kg、皮下注射、q24h)を1週間注射して、術後の痛みを和らげます。手術後、毎日動物をチェックして、正常に食べたり、飲んだり、排便したりしていることを確認してください。
- 3週間以上後にベースプレーティングを行います。
3.ベースメッキ
注:通常、ベースプレーティング手順(図5)は、回収とウイルスのインキュベーション時間のために、最初の手順から2〜3週間以内に実行できません。ベースプレーティングの誘導手順は、手順2.1.1〜2.1.8で説明した手順と同様です。しかしながら、ベースプレーティングは侵襲的な手順ではなく、動物は軽い鎮静のみを必要とする。したがって、動物が定位固定装置フレーム上を移動できない限り、0.8〜1.2%のイソフルランで十分である。加えて、比較的軽いイソフルラン麻酔はまた、モニタリング8 (補足ビデオS2)の間のニューロンの蛍光過渡性の発現を促進するのを助け得る。
- 歯科用セメント屋根の薄層を骨ロンジャーで慎重に切断し、シリコーンゴムを取り除きます。リレーレンズの表面を75%アルコールで清掃します。
- ベースプレートの横にある止めネジを締めて、ミニスコープの下部に固定します(図5A1)。
注意: ベースプレートは、締め付けたベースプレートと軽く固定したベースプレートの違いにより、距離に一貫性がなくなる可能性があるため、ミニスコープの下部の下でしっかりと締める必要があります。 - フォーカススライドをメインハウジングから約2.7〜3mmになるように調整します(図5A2)。
注:ベースメッキ手順中に長さをさらに調整できますが、ミニスコープの長さと、埋め込まれたリレーレンズと事前に固定された対物レンズの間の最適な長さを同時に調整すると非常に混乱するため、約2.7mmに固定してください。 - ミニスコープをデータ収集ボードに接続し、コンピュータのUSB 3.0(またはそれ以降のバージョン)ポートに接続します。
- UCLAチームが開発したデータ集録ソフトウェアを実行します。
- 露出を255に、ゲインを64倍に、励起LEDを5%に調整します。これらの設定は、初期ベースメッキに推奨されます。特定の設定は、脳領域および遺伝的にコードされたカルシウム指標の発現レベルによって異なります。
- [接続]ボタンをクリックして、ミニスコープをデータ収集ソフトウェアに接続し、ライブストリームを視聴します。
- ミニスコープの対物レンズをリレーレンズに手で合わせ、蛍光信号の検索を開始します(図5B1)。
注:最初に、蛍光シグナルを手動で検索すると、調整が容易になります。遺伝的にコードされたカルシウム指標を発現するためにAAVシステムが使用されたため、プロモータータイプとAAV血清型の両方がトランスフェクションの効率に影響を与えました23,24。研究者は、将来の実験に進む前に、蛍光の変化を示す個々のニューロンを見つけることによって、カルシウムインジケーターの発現を確認する必要があります。 - ミニスコープを塞ぐ場所に歯科用セメントをドリルで開けます(オプション)。
- データ収集ソフトウェアのライブストリームを視聴し、リレーレンズの余白を目印として使用します(補足ビデオS2)。リレーレンズの余白は、モニター上で月のような灰色の円として表示されます(図5B1、白い矢印)。
- リレーレンズが見つかったら、蛍光信号が見つかるまでミニスコープのさまざまな角度と距離を慎重に調整します。
注:ニューロンの画像は背景よりも白くなっています。正確なニューロンの形状は、ニューロンがリレーレンズの焦点面に完全に横たわっていることを示します。丸いニューロンは、それらが焦点面の近くにいたことを示唆しています。脳全体で神経細胞の形状が異なるが、ここでは腹側CA1が一例として示されている。 - 個々のニューロンが時間の関数として蛍光の変化を示さない場合は、ベースをシリコーンゴムで再シールします。潜伏期間はウイルス23、24の性質にも依存するため、蛍光は観察されない。さらに1週間後に手順3.1〜3.12を実行します。(これはオプションです)。
- ミニスコープを最適な位置に保持し、再利用可能な接着粘土を備えた定位固定装置アームをミニスコープに向かって動かします(図5B2)。ミニスコープを再利用可能な粘着粘土で定位固定装置アームに接着します。
- x、y、zアームを少し調整して、最適なビューを検索します(補足ビデオS2)。次に、イヤーバー、歯バー、または再利用可能な接着粘土をz軸で回して、対物レンズとリレーレンズの表面間の角度を調整します。ウイルス発現および水晶体移植は、少なくとも1つの細胞が蛍光トランジェントを示す場合に成功する(図6A;補足ビデオS2)ベースプレーティング中(CA1などの脳の領域にも依存する)。
メモ: モニタに白いセルのみが表示され、トランジェントが表示されない場合は、別の原因があります(図6B、C、補足ビデオS4、S5、結果セクション、およびトラブルシューティングセクションを参照)。 - ベースプレート(図5B2)を歯科用セメントでセメントで固めます。
- セメンチング中に関心領域を監視して、最適な位置が変化しないことを確認します。
- ベースプレートを歯科用セメントベースにしっかりと接着しながら、可能な限り最小限の量のセメントを使用します(図5B2)。地板の周りに2層目と3層目のセメントを塗布しますが、GRINレンズに影響を与えないように注意してください。
注意: ダミーメッキ手順中にベースプレートのベースが形成されているため、このステップではベースプレートにセメントを塗布する方が簡単です。 - セメントが硬化したら、ミニスコープをベースプレートから慎重に取り外します。次に、保護キャップをねじ込みます。
- 動物を回復ケージに移動します。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を観察します。
- ハウスマウスを個別に。毎日普通に食べたり、飲んだり、排便したりしていることを確認してください。マウスが完全に回復するまで5日間待ってから、カルシウムイメージングを確認します。
注意: ベースプレートを保持している歯科用セメントはごくわずかです。したがって、ベースメッキ手順以降、ベースプレートが大幅にずれている場合は、ドリルで歯科用セメントを取り除き、再度ベースメッキ手順を実行してください。 - 麻酔をかけ(ケタミン(87 mg / kg)/キシラジン(13 mg / kg)混合物の腹腔内注射による)、すべての実験が完了したら動物に25 を灌流します。.
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Representative Results
歯科用セメントの体積変化の評価
歯科用セメントの体積は硬化プロセス中に変化するため、GRINレンズの作動距離が約50〜350μmであることを考えると、画像品質に大きな影響を与える可能性があります4,8。したがって、この場合、移植および下地めっき手順の前に、2つの市販の歯科用セメント、テンプロンとトクソがテストされました(図5)。最初にビデオを評価してセメントが収縮したかどうかを確認し、次に完全に乾燥したときのセメントの体積を比較しました。歯科用セメントの初期混合物の同じ濃度および量をピペットチップに装填し、ビデオテープを貼った(補足ビデオS1)。ビデオS1は、両方のセメントが乾燥プロセス中に収縮したことを示しました。特捜はテンプロンよりも優れた性能を発揮しました(つまり、縮小後もテンプロンよりも体積が大きかった):図3B;テンプロンの平均容量:0.93±0.07mL;特装の平均容量:1.18±0.07mL;t検定:p = 0.048、t(6) = 2.46、縮小が少ないことを示唆しています。セメントの密度も、完全に乾燥した後に4回テストされました。特斤はテンプロンよりも平均密度が低く(テンプロンの平均密度:1.07 ± 0.12 g/mL、特於の平均密度:0.93 ± 0.08 g/mL、t検定:p = 0.38、t(6) = -0.94)、収縮率が低かったことが示唆された。そこで、特蒼は以下の注入及び下地めっき工程に用いた。上記の実験を説明する目的は、ブランドを推奨することではなく、硬化時に大きな体積変化を受けない歯科用セメントを見つけるように実験者に思い出させることです。
画像シフトの測定
固定対象物に対してダミー下地めっき手順と元の下地めっき手順をシミュレートして、ダミー下地めっき手順によって、元の手順よりも地板位置のシフトが小さくなるかどうかを調査しました。光硬化型接着剤を使用して、23 G 2.5 cmシリンジ針をベースプレートの中央に固定し、ベースプレートから1 cm突き出しました(図3C)。次に、定位固定装置のアームで針を保持することにより、ベースプレーティングをシミュレートした。実験動物を使用する代わりに、定位固定装置のテーブルにステッカーを貼った。注射針はステッカーを突き刺し、それによって元の場所を表しています。その後、針を0.5mm上昇させ、シミュレーション手術を開始しました。1回限りのベースメッキ手順8を模倣した手術では、ステッカーの1 cm上にあるベースプレートを覆うまで歯科用セメントを塗布しました。次に、セメントが硬化するまで2時間の待機期間を経て、針をそっと押してステッカーを再び突き刺しました。光硬化型接着剤は針を完全に安定させなかったため、針を深く押し込んで、歯科用セメントが乾燥した後の地板の位置を表す別の穴を作成することができました。最初の穴と2番目の穴の間の距離を測定し、針の位置ずれを定量化しました。その結果、頭蓋骨から1 cm上の地板の位置シフトは1.76 ± 0.14 mmでしたが、ダミーのベースプレートでは0.75 ± 0.17 mmのシフトしか得られませんでした(図3D;1回限りのベースメッキとダミーベースメッキの平均シフト距離;t検定:p < 0.01、t(8) = 6.03)。
さらに、歯科用セメントの高さがシフトに影響を与えるかどうかについても興味がありました。したがって、1回限りのベースメッキ手順を使用して、より短い高さ(図3E、0.5 cm上)をさらにテストしました。頭蓋骨の0.5 cm上に固定された地板は、頭蓋骨の1 cm上の地板よりも大幅に小さくシフトしました(図3F;平均シフト距離:0.43 ± 0.11 vs 1.76 ± 0.14 mm;t検定:p < 0.01、t(8) = 9.73)。データは、頭蓋骨上のベースプレートの高さとベースプレートが移動する距離が正の相関があることを示唆しました。ダミー下地めっき手順の後に、最小限の量の歯科用セメントのみを使用する第2の下地めっきステップが続くため、このデータは、ダミー下地めっきが下地めっき手順の精度の向上に役立つという仮説も支持します。
2レンズミニスコープシステムによるイメージング
ウイルス注入、ダミーベースプレーティング、ベースプレーティングの手術プロトコル(図2、図4、図5)に従うことにより、ベースプレーティング手順中およびベースプレーティング手順後にマウスが自由に移動している間に、3匹のマウス(n = 3/5)(図6A、補足ビデオS3)で個々のニューロンの蛍光トランジェントを観察し、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離が同じままであることを確認しました(図6A1 図6A3に対して、歯科用セメントが完全に乾燥した後、位置のわずかなシフトのみが発生しました)。ここでは、1匹のマウスのベースプレーティングの動画(補足動画S2、マウス#5)と、マウスが自由に動いているときのカルシウムイメージング(補足動画S3、マウス#3、#4、#5、生データ)を提供します。なお、V3用のデータ収集ソフトには背景減算の機能は含まれておらず、オフライン処理により映像のコントラストを向上させることができます)。補足ビデオS2では、蛍光シグナルを手動で検索し、ミニスコープを定位固定装置アームに取り付けて微調整しました。プロービング中にいくつかの蛍光過渡現象が観察されました(補足ビデオS2;図6A)。トランジェントは、灰色または白色のスポットの明るさの滑らかなシフトであり、点滅するライトに似た発射パターンではありません。図6A1から図6A2は、トランジェントの画像を示しています。自由に行動するマウスのビデオは、ベースプレーティング手順中に関心領域と比較して許容可能な空間シフトを示しました(補足ビデオS3)。この段階では、リレーレンズの底部と活動ニューロンの間の距離を調整できなかったため、細胞のマージンを大幅に改善することはできませんでした。特に、下地めっき手順中に、均一な背景以外のものが存在しないなど、いくつかの問題が頻繁に発生する可能性があります(図6B;補足ビデオS4)または蛍光過渡現象のない白血球縁の可視性(図6C;補足ビデオS5)。否定的な結果の2つの例も提供される(n = 2/5)(図6B、C、補足ビデオS4、S5)。失敗の考えられる理由は、「ディスカッション」セクションで調べられています。これら2匹のマウスの外科的処置は、経路をクリアするために直径1mmの針を使用せずに行われた。したがって、リレーレンズは直接埋め込まれた。マウス#2では、リレーレンズがニューロンを圧迫し、一部のニューロンを引きずり下ろし、ニューロンが損傷した可能性があることを提案します。したがって、蛍光過渡現象は見出されなかった。
図1:ミニスコープのメカニズムと、通常、イメージングの失敗を引き起こす欠陥 。 (A)2レンズ系における蛍光細胞の可視化に必要なメカニズムを示すリレーレンズと対物レンズの漫画図。各レンズのシグナル伝達波は、蛍光細胞を可視化するための作動距離を見つけることの重要性とメカニズムを強調しています。(A1)リレーGRINレンズは、作動距離内のターゲットニューロンの上に配置されます。リレーレンズのピッチは0.5*N(Nは整数)であるため、光を中継することでターゲットニューロンを可視化し、元の蛍光信号をリレーレンズの上部に届けることができます。すると、正弦波周期の約1/4の光が対物レンズ(~0.25ピッチ)を通過し、拡大画像が得られます。(A2)対物レンズは、ミニスコープの上部(図の緑色のプレート)にある相補型金属酸化膜半導体(CMOS)センサーに画像を送信します。(B)GRINレンズの注入手順の違いを示す漫画図(B1)2レンズシステムと(B2)1レンズシステム。一般に、主な違いは、ワンレンズシステムが対物レンズを直接使用して脳の表面を画像化することです。その結果、対物レンズを標的ニューロンの上に埋め込む必要があります。(C)対照的に、2レンズシステムでは、比較すると、追加のリレーレンズが脳に埋め込まれ、対物レンズがミニスコープに事前に固定されます。(C1)UCLAミニスコープのV3バージョンのベースプレートの形状は、歯科用セメントが完全に乾いた後に不均一なシフトを引き起こす可能性があります。(C2)このずれにより、リレーレンズと対物レンズの作動距離がずれたりずれたりします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2レンズミニスコープシステムの成功率を向上させるために変更されたプロトコルと詳細な手術プロトコル。 (A1)2レンズシステムの手術プロトコルを変更しました。ウイルス注入、およびリレーGRINレンズ移植の場所が示されている。ダミーベースプレーティングは、作動距離が対象のニューロンを正確に包含することを可能にし、(A2)ベースプレーティング手順に関連する位置シフトを低減する。したがって、(A3)自由に行動するマウスにおいて蛍光細胞をイメージングする確率が高くなる。(B)ウイルス注入の手順、およびリレーGRINレンズ配置の漫画画像。(B1)まず、吸引針を先端から約1mm(マウス実験用)のペンでマークし、皮質吸引深さの評価に役立てます。次に、結合組織と皮質(マウスでは深さ約1 mm)を脳から吸引します。(B2)腹側海馬をターゲット領域として使用して、リレーレンズを埋め込みます。特に、タフな脳梁は皮質領域の誤嚥を止めるためのランドマークです。脳梁の線維質感は、吸引中に実体顕微鏡下で見ることができます。(B3)次に、20Gカテーテルの内針(直径約1mm、直径はリレーレンズと同程度)で対象点を穿刺し、ウイルス注入前に経路をクリアします。実体顕微鏡の下では、針によって作成されたへこみ(写真の破線の円)が見えるはずです。マイクロインジェクションニードルとリレーレンズをへこみで下げます(またはへこみの中心からわずか250μm離れています)。最後に、リレーGRINレンズを配置します(本研究では、直径1mmのリレーレンズを使用しました)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:歯科用セメント硬化物の体積変化の測定 。 (A)2つのブランドの歯科用セメントを硬化させた例。黒い矢印は、粉末と溶液を混合した後の元のレベルを示しています。白い矢印は、10分、20分、および40分の硬化後のレベルを示しています。赤い矢印は、光硬化接着剤で密封された先端の底を指しています。(B)完全に乾燥した後の残りの歯科用セメントの平均体積。バーとエラーバーはSEM±手段です。*は、スチューデントのt検定によって決定された有意性(P < 0.05)を示します。(C)地板の位置ずれを測定するために用いた方法を説明する図と写真。針を地板に接着し、元の下地めっき手順(ワンステップ下地めっき)とダミー下地めっき手順をシミュレートするために使用されました。赤と黒の矢印は、歯科用セメントが硬化する前後の針の位置を表しています。(D)針先の平均距離変化 (E)頭蓋骨レベルより上の地板と位置移動との関係を測定するために使用される方法の図。(F)針先の平均距離変化。バーとエラーバーはSEM±手段です。**は、スチューデントのt検定によって決定された有意性(P < 0.01)を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:詳細なダミーベースメッキ手順(リレーレンズ埋め込み直後に実行)。 (A1)ミニスコープでの対物レンズ、地板、パラフィンフィルムの組み立ての3段階の漫画。(A2)アセンブリの写真バージョン。(B1)ダミーの下地めっき手順を示す漫画。まず、組み立てられたミニスコープをリレーレンズと位置合わせします。対物レンズはリレーレンズにできるだけ近づけて配置します。次に、地板を囲むパラフィルムに歯科用セメントを追加し、頭蓋骨に塗布して、将来の下地メッキ用の雌型を作成します。次に、ベースプレートを取り外し、成形シリコンゴム(ピンク)を追加し、メスモールドとリレーレンズを保護するために歯科用セメントでトッピングします。その後、動物は麻酔から回復することができます。少なくとも3週間後、ベースメッキ手順が実行されます。(B2)(B1)の写真版。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ベースメッキ手順の手順。 (A1)ベースプレートを取り付け、(A2)フォーカススライダーを手動で2.7〜3mmに調整します。2.7〜3 mmの設定(写真に示されている位置)は、蛍光細胞を手動で検索する前に開始するのに最適な場所のようです。(B1)最初の漫画図は、蛍光細胞を可視化するための対物レンズとリレーレンズの間の長さの重要性を示しています(蛍光細胞は通常0.5〜2 mmの距離で観察されます)。蛍光セルが出現する前に、研究者はリレーレンズのマージンを見る必要があります(上の写真の矢印)。最初にレンズを最適な表示位置に手動で調整すると、手ですばやく調整する方が簡単なので便利です。(B2)再利用可能な接着粘土を固定装置アームプローブに置き、再利用可能な接着粘土でアームに接着してミニスコープを安定させます。この段階では、関心領域がずれている可能性がありますが、これは定位固定アームと再利用可能な接着粘土をわずかに調整することで簡単に修正できます。最適な関心領域を確認して見つけたら、少量の歯科用セメント(赤で表されています)を追加します。ベースプレートをできるだけ少ない歯科用セメントで接着します。歯科用セメントが乾いたら、ミニスコープとベースプレートを分離します。地板が十分に安定していない場合は、歯科用セメントを追加します。(C)この図は、成功を達成するためのすべてのステップの重要性を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ベースメッキ手順の成功例と失敗例。 (A)ベースプレーティング手順中のイメージングの成功例。リレーレンズは腹側の海馬をターゲットにした。動物がイソフルランで麻酔下にあったときに蛍光過渡現象が認められた(補足ビデオS2も参照)。(A2)視認性を高めるためにコントラストが増しました。赤い破線は血管を示しています。(A3)ベースプレーティングの5日後にマウスがホームケージ内で自由に行動していた蛍光過渡現象(補足ビデオS3も参照;マウス#3および#4の画像も補足ビデオS3で提供されている)。位置のわずかなシフトのみが発生しました。(B1)失敗の例。ベースプレーティング中、形状が細胞状ではない均質な白/灰色の領域のみに気づきました(補足ビデオS4も参照)。(B2)リレーレンズはターゲット領域を逃し、感染細胞のない領域の上にありました。(C1)失敗の別の例。このマウスでは、多くの丸い細胞が観察されましたが、ベースプレーティング中(3週間のインキュベーション後、マウスの麻酔/鎮静中)に蛍光トランジェントは観察されませんでした。さらに、ベースプレーティング手順を再度実行したとき(インキュベーションの5週目)、または動物が自由に行動しているときでさえ、蛍光過渡現象はオンサーブされませんでした。画像は、インキュベーションの5週目のベースプレーティング中に取得されました(補足ビデオS5も参照)。(C2 および C3)リレーレンズは腹側海馬のピラミッド層を逃した。青い点はDAPIで染色された核です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 問題 | 考えられる原因 | 解決 | ||
| ベースプレーティング時は良好な画像でしたが、翌日は完全に焦点が合っていませんでした | 被験者の頭蓋骨とベースプレートの間の歯科用セメントを硬化させたときの体積変化 | 本報告で示唆されているように、レンズ埋め込み手順の後に「ダミーベースメッキ」を進めてください。体積変化の少ない歯科用セメントを選択してください。 | ||
| ベースプレーティング中に細胞のような形状のない均質な白/灰色の領域があります(補足ビデオS4も参照してください) | ある。リレーレンズがターゲット領域を逃した B.蛍光インジケーターの発現不良 C.蛍光インジケーターが実際に表現されているミニスコープの下に対物レンズを取り付けるのを忘れた | A.手術の練習にはダミーレンズを使用してください。移植Bの練習後のダミーレンズの座標を確認する。 カルシウムイメージング実験に最適なウイルス力価を見つける(Resendez et al.2016を参照)。何らかの理由で事前テストが実施できない場合は、初心者が最初により高い力価を試すことをお勧めします。(詳細については、「議論」セクションを参照してください) C. 対物レンズをねじ込みます(~0.25ピッチ。 例:エドモンドオプティクス;ストック#64-519)をミニスコープの下部に表示。 | ||
| 多くの細胞を観察できますが、ベースプレーティング中の蛍光ダイナミクスは観察されません | A.不健康なニューロンまたは死んだニューロン B.まばらな清澄タイプのニューロン C.深い麻酔状態 | A.すべての外科的処置に注意してください。リレーレンズの直径に似た新しい注射針を使用して、最初に注入/移植経路を切断し、レンズ埋め込みによる圧力を解放します。ゆっくりとウイルスを注入し、ゆっくりとレンズを埋め込みます。B.ニューロンの活動を監視するためにより長い時間待つか、マウスを刺激するために尾を少しつまみます。C.ベースプレーティングは侵襲的な手順ではなく、動物は鎮静剤のみを必要とします。したがって、動物が定位固定装置フレーム上を移動することができない限り、1.2~0.8%イソフルランを維持すれば十分である。 | ||
表1:トラブルシューティングチャート
補足ビデオS1:歯科用セメント量テスト。 体積の差は、歯科用セメント調製の開始時に測定し、セメントを乾燥させた後の体積を測定した。歯科用セメントの2つのブランド(テンプロンとトクソキュアファストなど)がテストされました。乾燥後の歯科用セメントの容量を試験するために、各歯科用セメント粉末0.5gを秤量し、その適切な溶液(1mL)と混合した。次に、0.1〜10μLのピペットチップに2.5μLの歯科用セメント混合物を装填し、光硬化型接着剤で密封した。次に、チップをラックに置き、歯科用セメント混合物の表面に印を付け、40分間ビデオ撮影しました。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS2:ベースメッキ手順のデモンストレーション。 対物レンズとリレーレンズの表面との角度は、イヤーバー、歯バー、または再利用可能な接着粘土をz軸上で回すことによって調整されました。リレーレンズの余白がモニターに月のような灰色の円として現れました。ウイルス発現およびレンズ移植が成功すると、ベースプレーティング中に少なくとも1つの蛍光ダイナミック(矢印)が明らかになるはずです。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS3:自由に行動するマウスにおける蛍光ダイナミクスのデモンストレーション。 マウス#3、#4、および#5からの蛍光トランジェント。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ S4: 失敗の例。 ベースメッキ手順中に均一な背景が現れました。明るさの変化は、個々の細胞の蛍光過渡現象によるものではないことに注意してください。それは検索手順によって引き起こされました。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS5:別の失敗例のデモンストレーション。 ベースプレーティング手順中に蛍光トランジェントの欠如が発生しましたが、いくつかの丸い細胞マージンがまだ見えました。明るさの変化は、個々の細胞の蛍光過渡によって引き起こされたものではないことに注意してください。それは検索手順によって引き起こされました。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本報告では、2レンズUCLAミニスコープシステムを使用する研究者向けの詳細な実験プロトコルについて説明します。私たちのプロトコルで設計されたツールは、 in vivo カルシウムイメージングを試したい研究室にとって比較的手頃な価格です。ウイルス注入、レンズ埋め込み、ダミーベースメッキ、ベースメッキなどの一部のプロトコルは、カルシウムイメージングの成功率を向上させるために、ミニスコープシステムの他のバージョンにも使用できます。ウイルス注入に関する一般的な問題、およびミニスコープのバージョンに関係なく修正する必要があるレンズ埋め込みの他に、UCLAベースプレートの構造は位置シフトを引き起こす可能性があり、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離の不一致につながる可能性があります(図1C)。2つのレンズの位置シフトを最小限に抑えるために、修正された実験プロトコルが開発されました(図2、図 4、 図5)。カルシウムイメージングの成功は、ウイルス発現の成功、レンズ移植、およびベースプレーティング手順の組み合わせによって達成できます(図5C)。2レンズシステムを使用して脳深部を観察するには、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの相対位置も正確である必要があるため、ベースプレーティング手順で高いレベルの精度が必要です。このレポートでは、ベースプレーティングの問題を解決するプロトコルを提示するだけでなく、ウイルス注入とレンズ埋め込みのヒントについても説明します。以下では、まずベースプレーティングの手順、次にウイルス注入、レンズの埋め込み手順について説明し、いくつかの失敗例について説明します(図6)。
ベースメッキ
UCLAミニスコープのV3バージョンは現在最も一般的に使用されているデザインであり、オンラインで注文することができます。このバージョンの地板は、壁のない2つのエッジで構成されていますが(図1C1)、歯科用セメントが完全に乾いた後、その形状は不均一なシフトを引き起こす可能性があります(図1C1、C2)。私たちのプロトコル(図4)のダミーベースメッキ手順は、実際のベースメッキ中に歯科用セメントに使用可能なスペースを減らすためにパラフィンフィルムを使用するため、ミスアライメントとベースプレートシフトの問題を最小限に抑えます(図5B)。残りのスペースは、実際のベースメッキ手順中に最適なイメージング位置を見つけるのに十分です。したがって、研究者はできるだけ少ない歯科用セメントでベースプレートを接着できます(図5B2)。さらに、ダミーのベースメッキ手順は、対物レンズとリレーレンズの間に完全な距離を必要としないため、比較的短い時間(約15〜20分)で完了します。ただし、ダミーのベースプレーティングは、カルシウムイメージングを成功させるための重要な要素の1つにすぎません。例えば、蛍光シグナルのモニタリング中、ニューロンが作業面からわずかに外れているとぼやけて見えることがあります(リレーレンズの作動距離にもよりますが、多くの場合、約100~300μm)。作動距離を改善する能力は、ニューロンの作動距離がリレーレンズ移植手順によって予め決定されているため、制限される。実験はダミーのベースプレーティング手順なしで行われ、関心領域は常に(4匹のマウスのうち4匹で)1回限りのベースプレーティングの後に見逃されました。したがって、これらの解決策は、収縮の問題を減らすために考案されました。一部の光硬化型歯科用セメントは、非常に迅速に硬化するため、硬化中の収縮の問題を回避できます。これらのセメントは、研究者がベースプレーティング手順中に距離を調整するのに役立つ可能性があります。カルシウムインジケーターの励起と歯科用セメントの硬化の波長範囲は異なりますが、ベースメッキ手順中の光退色を防ぐ必要があります。光退色を防ぐために、カルシウム指示薬と光硬化型歯科用セメントとの間の交差反応を避けるために、光源によって生成される波長の範囲をかなり狭くする必要があります。したがって、ライトキュア歯科用セメントの使用は、ベースメッキ手順には推奨されません。さらに、他の研究チームによるベースプレートの接着に、いくつかの特定のブランドの歯科用セメントが頻繁に使用されています6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 .これらのセメントの低収縮特性は問題を解決するかもしれませんが、購入(輸入)が難しいため、これらのブランドをテストする機会がありませんでした。医療グレードの製品は、国/地域によっては輸入規制の対象となる場合があります。研究者が文献6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22に記載されているセメントにアクセスするのが難しい場合、私たちのプロトコルは歯科用セメントの収縮問題を解決します。
収縮の問題に加えて、多くの実験の過程で、ミニスコープ自体とベースプレート(特にベースプレート内の磁石)に構造摩耗が発生する可能性があります。摩耗による小さな隙間は、2つのレンズ間の距離の安定性を低下させます。繰り返しになりますが、光路全体にわたる精度は、ミニスコープを使用して自由に行動するマウスのカルシウム過渡現象をイメージングするための鍵です。
ウイルス注入/水晶体移植のトラブルシューティング
ウイルスを脳領域に注入する前に、新しい針を脳定位固定装置アームに取り付け、適切な座標で脳をゆっくりと穿刺することをお勧めします。新しい針は非常に鋭いため、この穿刺は、実際のマイクロインジェクションニードルとリレーレンズのパスをクリアする(またはパスをカットする)ための準備ステップとして機能し、マイクロインジェクションニードルまたはリレーレンズからの圧縮によって引き起こされる可能性のある組織の損傷を最小限に抑えます。鋭い針は鈍いリレーレンズの経路を切ります。したがって、針の先端はリレーレンズと同じ座標に下げる必要があります。20GのIVカテーテルの内針は、当社のリレーレンズの直径とほぼ同じ直径1mmであったため、選択されました。リレーレンズの直径に応じて異なる針ゲージを使用できます。
本研究ではウイルスベクターの特性と力価に焦点を当てていませんでしたが、これらの要因はカルシウムイメージングを成功させるために依然として重要です(図5C)。ウイルスベクターの発現品質を事前に試験する必要があります。Resendezらのプロトコルのステップ1〜5は、カルシウムイメージング実験に最適なウイルス力価を同定するための詳細な方法を提供する8。何らかの理由で事前検査ができない場合は、初心者が最初に比較的高い力価を試すことをお勧めします。虚細胞毒性の高いウイルス力価を用いることの欠点の1つは8である。死んだニューロンは自家蛍光を生じ、ミニスコープ8の下に明るい白い斑点として見える。ただし、これらの死んだニューロンは、初心者がベースメッキ手順を見つけて練習するための良いランドマークです。一方、低力価ウイルスの注入は細胞を殺すリスクは低くなりますが、ベースプレーティング手順中に細胞が蛍光過渡性を示さない場合、蛍光はバックグラウンドによってマスクされる可能性があります。リレーレンズの埋め込みやウイルスベクターによる発現不良により標的ニューロンが見逃される可能性があるため、失敗の理由を特定することは困難です。原因を特定することは、組織学的確認なしには非常に混乱します。したがって、ウイルスベクターを事前にテストできない場合は、比較的高力価のウイルスを使用することをお勧めします。
Resendezらは、マイクロインジェクション針をレンズの配置に対して250μmの横方向および腹側に挿入することを推奨しています。私たちの観察は、リレーレンズと同じ深さにウイルスを注入することも良好なカルシウムシグナルの発現につながる可能性があることを示しました。感染・拡散の可能性があるため、リレーレンズの座標と同じ深さにウイルスを注入することが、組織の損傷を軽減し、感染したニューロンとリレーレンズの距離の精度を高めるために最適であると提案します。Resendezらはまた、標的細胞とリレーレンズ8との間の作動距離の範囲が狭いことを考えると、同じ手術中にウイルス注入および水晶体移植を行うことを推奨している。しかしながら、一部の研究者は、ウイルス注入ステップおよび水晶体移植ステップが2週間(またはそれ以上)間隔をあけて実施されるというプロトコルに従う18,26。ステップ間の時間を長くすると、個々の操作時間が短縮されます。しかし、このプロトコルでは、1回の手術プロトコルでは、外科医はマイクロインジェクションニードルとリレーレンズをターゲット領域に下げるときに位置を監視できるため、ターゲティングが失敗する可能性が低くなるため、これら2つのステップが1つの手術に統合されました(図2B3)。
2匹のマウス(マウス#1、#2)では、針を使ってレンズの経路を作ることも省略され、マウス#2では丸い細胞状の灰色の斑点が観察されました(図6C)。しかしながら、蛍光動態(補足ビデオS5)は観察されなかった。この例の脳スライス(図6C2、C3)を調べたところ、リレーレンズが下がっている間にいくつかの細胞を引きずり下ろしたと仮定しました。これらの引きずられたニューロンは不健康であったため、ベースプレーティング手順中または実験中に活動は見られませんでした。
ベースプレーティング手順中に完全に均質な灰色のシグナルを持ち、目に見える細胞様画像を持たない1匹のマウスがいました(図6B1)。マウスを犠牲にした後、その脳のスライスが観察されました。レンズが湾曲したピラミッド層の内側にあることに気づいた。ターゲットエリア(図6B2)は完全に見落とされました。これらの失敗した試みは、手術プロトコルを変更し、最終的に3匹のマウスで成功した重要な経験でした(補足ビデオS3)。
マイクロインジェクションニードル
脳梁は、背側の海馬を覆う丈夫な線維性管です。その剛性のために、それは平らな先端のマイクロインジェクション針による浸透に抵抗する。そのため、先端が斜めのマイクロインジェクション針の使用をおすすめします。このタイプの針は、組織の損傷を減らすだけでなく、近くの繊維による閉塞のためにウイルスを標的領域に注入できない可能性も減らします。上記の問題をトラブルシューティングチャートにまとめました(表1)。
期限
手順全体の時間枠は、日数を単位として 図2Aに要約されています。詳細には、手術部分(ウイルス注入、リレーレンズ埋め込み、ダミーベースプレーティング)は、初心者の場合は3時間、十分に訓練された研究者の場合は1.5時間かかる場合があります。マウスは体サイズが小さく、代謝が速く、大型種よりも麻酔下での長時間によって引き起こされる健康上の問題の影響を受けやすい27。研究者は、手術に費やす時間を3時間未満に保つことを目指す必要があります。実際のベースプレーティングは、カルシウム指示薬発現の3〜6週間後に行うことができます。この手順には1時間かかる場合があります。その後の縦断的カルシウム活性観察は、1ヶ月以上継続することができる。
結論
UCLAミニスコープは、オープンソースの in vivo カルシウムイメージングデバイスです。既製のベースプレートまたはレンズモジュールがプリインストールされていない場合、実験を行う個人は、ベースメッキ手順中に対物レンズとリレーレンズの間の最適な距離を正確に達成できる必要があります。2レンズUCLAミニスコープシステムの使用の難しさの増加は、歯科用セメントの体積変化にあります。元のプロトコルを最適化し、上記の問題によって引き起こされる欠陥を最小限に抑えたため、2レンズUCLAミニスコープシステムによるカルシウムイメージングの成功率が向上しました。
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Disclosures
これは業界が支援する研究ではありません。著者らは、金銭的利益相反は報告していない。
Acknowledgments
この作業は、台湾科学技術部(108-2320-B-002 -074、109-2320-B-002-023-MY2)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
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