Summary
Krympningen av tandcement under härdning förskjuter basplattan. Detta protokoll minimerar problemet genom att skapa en första grund av dentalcementet som lämnar utrymme för att cementera basplattan. Veckor senare kan basplattan cementeras på plats på denna ställning med lite ny cement, vilket minskar krympningen.
Abstract
Neuroforskare använder miniatyrmikroskop (miniskop) för att observera neuronal aktivitet hos fritt betande djur. University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet tillhandahåller öppna resurser för forskare att bygga miniskop själva. V3 UCLA Miniscope är ett av de mest populära miniskopen med öppen källkod som för närvarande används. Det tillåter avbildning av fluorescenstransienter som emitteras från genetiskt modifierade neuroner genom en objektivlins implanterad på ytliga cortex (ett enlinssystem) eller i djupa hjärnområden genom en kombination av en relälins implanterad i den djupa hjärnan och en objektivlins som är förförankrad i miniskopet för att observera den vidarebefordrade bilden (ett tvålinssystem). Även under optimala förhållanden (när neuroner uttrycker fluorescensindikatorer och relälinsen har implanterats ordentligt) kan en volymförändring av tandcementet mellan basplattan och dess fastsättning på skallen vid cementhärdning orsaka felinriktning med ett förändrat avstånd mellan objektiv- och relälinserna, vilket resulterar i dålig bildkvalitet. En basplatta är en platta som hjälper till att montera miniskopet på skallen och fixerar arbetsavståndet mellan objektiv- och relälinserna. Således förändrar förändringar i volymen av tandcement runt basplattan avståndet mellan linserna. Det nuvarande protokollet syftar till att minimera feljusteringsproblemet som orsakas av volymförändringar i dentalcementet. Protokollet minskar felinriktningen genom att bygga en första grund av tandcement under relälinsimplantation. Konvalescenstiden efter implantation är tillräcklig för att grunden av dentalcement ska härda basplattan helt, så basplattan kan cementeras på denna ställning med så lite ny cement som möjligt. I den här artikeln beskriver vi strategier för basplätering hos möss för att möjliggöra avbildning av neuronal aktivitet med en objektiv lins förankrad i miniskopet.
Introduction
Fluorescerande aktivitetsreportrar är idealiska för avbildning av neuronaktiviteten eftersom de är känsliga och har stora dynamiska områden 1,2,3. Därför använder ett ökande antal experiment fluorescensmikroskopi för att direkt observera neuronal aktivitet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Det första miniatyriserade enfotonfluorescensmikroskopet (miniskop) designades 2011 av Mark Schnitzer et al.5. Detta miniskop gör det möjligt för forskare att övervaka fluorescensdynamiken hos cerebellära celler i fritt betande djur5 (dvs utan fysisk fasthållning, nackstöd, sedering eller anestesi till djuren). För närvarande kan tekniken tillämpas för att övervaka ytliga hjärnområden som cortex 6,8,15,16; subkortikala områden såsom dorsal hippocampus 8,11,13,14 och striatum 6,17; och djupa hjärnområden som ventral hippocampus 14, amygdala 10,18 och hypotalamus 8,12.
Under de senaste åren har flera miniskop med öppen källkod utvecklats4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskopet kan monteras ekonomiskt av forskare om de följer steg-för-steg-riktlinjerna från University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet4,7,11,13. Eftersom optisk övervakning av neural aktivitet begränsas av begränsningarna för ljusöverföring7 till och från den neuronala populationen av intresse utformades ett miniskop som kräver att en objektiv gradientbrytningsindex (GRIN) lins (eller objektivlins) förankras längst ner i miniskopet för att förstora synfältet som vidarebefordras från ett relä GRIN-objektiv (eller relälins)6,7,8,10,16,17. Denna relälins implanteras i målhjärnregionen så att fluorescensaktiviteten i målhjärnregionen vidarebefordras på ytan av relälinsen6,7,8,10,16,17. Ungefär 1/4 av en hel sinusformad ljusperiod färdas genom objektivet GRIN-linsen (~ 0,25 tonhöjd) (Figur 1A1), vilket resulterar i en förstorad fluorescensbild6,7. Objektivlinsen är inte alltid fixerad längst ner i miniskopet och det är inte heller nödvändigt att implantera relälinsen6,7,11,13,15. Specifikt finns det två konfigurationer: en med en fast objektivlins i miniskopet och en relälins implanterad i hjärnan8,10,12,14,16 (Figur 1B1) och en annan med bara en avtagbar objektivlins6,7,11,13,15 (Figur 1B2). I konstruktionen baserad på kombinationen fast objektiv och implanterad relälins förs fluorescenssignalerna från hjärnan till relälinsens övre yta (Figur 1A1)7,8,10,12,14,16. Därefter kan objektivlinsen förstora och överföra synfältet från relälinsens övre yta (Figur 1A2). Å andra sidan är den avtagbara objektiva GRIN-linsdesignen mer flexibel, vilket innebär att preimplantation av en relälins i hjärnan inte är obligatorisk (Figur 1B2)6,7,11,13,15. När man använder ett miniskop baserat på en avtagbar objektivlinsdesign behöver forskare fortfarande implantera en lins i målhjärnregionen men de kan antingen implantera en objektivlins6,7,11,13,15 eller en relälins i hjärnan6,7. Valet av ett objektiv eller ett relälins för implantation bestämmer miniskopkonfigurationen som forskaren måste använda. Till exempel är V3 UCLA Miniscope baserat på en avtagbar objektiv GRIN-linsdesign. Forskare kan välja att antingen direkt implantera en objektivlins i hjärnregionen av intresse och montera det "tomma" miniskopet på objektivlinsen6,7,11,13,15 (ett system med en lins; Figur 1B2) eller att implantera en relälins i hjärnan och montera ett miniskop som är förförankrat med en objektivlins6,7 (ett system med två linser; Figur 1B1). Miniskopet fungerar sedan som en fluorescenskamera för att fånga liveströmbilder av neuronal fluorescens producerad av en genetiskt kodad kalciumindikator1,2,3. När miniskopet är anslutet till en dator kan dessa fluorescensbilder överföras till datorn och sparas som videoklipp. Forskare kan studera neuronaktivitet genom att analysera de relativa förändringarna i fluorescens med vissa analyspaket20,21 eller skriva sina koder för framtida analys.
V3 UCLA Miniscope ger flexibilitet för användare att avgöra om de ska avbilda neuronal aktivitet med ett en- eller tvålinssystem7. Valet av inspelningssystem baseras på djupet och storleken på målhjärnområdet. Kort sagt, ett enlinssystem kan bara avbilda ett område som är ytligt (mindre än cirka 2,5 mm djupt) och relativt stort (större än cirka 1,8 x 1,8 mm2) eftersom tillverkarna bara producerar en viss storlek på objektivlinsen. Däremot kan ett tvålinssystem appliceras på vilket målhjärnområde som helst. Tandcementet för limning av basplattan tenderar dock att orsaka felinriktning med ett förändrat avstånd mellan objektiv- och relälinserna, vilket resulterar i en dålig bildkvalitet. Om systemet med två linser används måste två arbetsavstånd riktas exakt för att uppnå optimal bildkvalitet (figur 1A). Dessa två kritiska arbetsavstånd är mellan neuronerna och relälinsens bottenyta och mellan relälinsens övre yta och objektivlinsens nedre yta (figur 1A1). Varje felinriktning eller felplacering av linsen utanför arbetsavståndet resulterar i bildfel (figur 1C2). Däremot kräver enlinssystemet bara ett exakt arbetsavstånd. Objektivlinsens storlek begränsar dock dess tillämpning för övervakning av djupa hjärnregioner (objektivlinsen som passar miniskopet är ungefär 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Därför är implantation av en objektivlins begränsad för observation av ytan och relativt stora hjärnregioner, såsom cortex 6,15 och dorsal cornu ammonis 1 (CA1) hos möss11,13 . Dessutom måste ett stort område av cortex aspireras för att rikta in sig på dorsal CA111,13. På grund av begränsningen av enlinskonfigurationen som förhindrar avbildning av djupa hjärnregioner, erbjuder kommersiella miniskopsystem endast en kombinerad objektiv / relälins (två linser) design. Å andra sidan kan V3 UCLA-miniskopet modifieras till antingen ett enlins- eller tvålinssystem eftersom dess objektivlins är avtagbar 6,11,13,15. Med andra ord kan V3 UCLA-miniskopanvändare dra nytta av den avtagbara linsen genom att implantera den i hjärnan (skapa ett enlinssystem), när de utför experiment med ytliga hjärnobservationer (mindre än 2,5 mm djupa) eller genom att förförankra den i miniskopet och implantera en relälins i hjärnan (skapa ett tvålinssystem), när man utför experiment som involverar djupa hjärnobservationer. Tvålinssystemet kan också användas för att ytligt observera hjärnan, men forskaren måste känna till de exakta arbetsavstånden mellan objektivlinsen och relälinsen. Den största fördelen med enlinssystemet är att det finns en minskad chans att missa arbetsavstånden än med ett tvålinssystem, med tanke på att det finns två arbetsavstånd som måste riktas exakt för att uppnå optimal bildkvalitet i tvålinssystemet (figur 1A). Därför rekommenderar vi att du använder ett enlinssystem för ytliga hjärnobservationer. Men om experimentet kräver avbildning i det djupa hjärnområdet måste forskaren lära sig att undvika felinriktning av de två linserna.
Det grundläggande protokollet för konfiguration med två linser av miniskop för experiment inkluderar linsimplantation och basplätering 8,10,16,17. Baseplating är limning av en basplatta på ett djurs huvud så att miniskopet så småningom kan monteras ovanpå djuret och videoband fluorescenssignalerna från neuroner (figur 1B). Denna procedur innebär att man använder tandcement för att limma basplattan på skallen (figur 1C), men krympning av tandcement kan orsaka oacceptabla förändringar i avståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen 8,17. Om det förskjutna avståndet mellan de två linserna är för stort kan cellerna inte sättas i fokus.
Detaljerade protokoll för kalciumavbildningsexperiment i djupa hjärnor med miniskop har redan publicerats8,10,16,17. Författarna till dessa protokoll har använt Inscopix-systemet8,10,16 eller andra anpassade mönster17 och har beskrivit de experimentella procedurerna för virusselektion, kirurgi och basplattfästning. Deras protokoll kan dock inte exakt tillämpas på andra system med öppen källkod, såsom V3 UCLA Miniscope-systemet, NINscope6och Finchscope19. Feljustering av de två linserna kan uppstå under inspelningen i en konfiguration med två linser med ett UCLA Miniscope på grund av den typ av tandcement som används för att cementera basplattan till skallen8,17 (Figur 1C). Det nuvarande protokollet behövs eftersom avståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen är benägen att förskjutas på grund av oönskad krympning av tandcement under baspläteringsproceduren. Under baspläteringen måste det optimala arbetsavståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen hittas genom att justera avståndet mellan miniskopet och toppen av relälinsen, och basplattan ska sedan limmas på denna idealiska plats. När det korrekta avståndet mellan objektivlinsen och den implanterade relälinsen har ställts in kan longitudinella mätningar erhållas med cellulär upplösning (Figur 1B; in vivo inspelning). Eftersom det optimala arbetsavståndet för ett reläobjektiv är litet (50 - 350 μm)4,8kan överdriven cementkrympning under härdning göra det svårt att hålla objektivlinsen och den implanterade relälinsen inom lämpligt intervall. Det övergripande målet med denna rapport är att tillhandahålla ett protokoll för att minska krympningsproblemen8,17 som inträffar under baspläteringsproceduren och för att öka framgångsgraden för miniskopinspelningar av fluorescenssignaler i en konfiguration med två linser. Framgångsrik miniskopinspelning definieras som inspelning av en liveström av märkbara relativa förändringar i fluorescensen hos enskilda neuroner i ett fritt uppträdande djur. Även om olika märken av tandcement har olika krympningshastigheter kan forskare välja ett märke som tidigare har testats6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Men inte alla märken är lätta att få i vissa länder / regioner på grund av importreglerna för medicinska material. Därför har vi utvecklat metoder för att testa krympningshastigheten för tillgängliga dentala cement och, viktigare, tillhandahålla ett alternativt protokoll som minimerar krympningsproblemet. Fördelen jämfört med det nuvarande baspläteringsprotokollet är en ökning av framgångsgraden för kalciumavbildning med verktyg och cement som lätt kan erhållas i laboratorier. UCLA-miniskopet används som ett exempel, men protokollet är också tillämpligt på andra miniskop. I denna rapport beskriver vi en optimerad baspläteringsprocedur och rekommenderar också några strategier för montering av UCLA-miniskopsystemet med två linser (Figur 2A). Både exempel på lyckad implantation (n = 3 möss) och exempel på misslyckad implantation (n = 2 möss) för tvålinskonfigurationen med UCLA-miniskopet presenteras tillsammans med diskussionerna om orsakerna till framgångar och misslyckanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som utfördes i denna studie godkändes av National Taiwan University Animal Care and Use Committee (godkännandenr: NTU-109-EL-00029 och NTU-108-EL-00158).
1. Bedömning av volymförändringen av dentalcement
OBS: Förändringar i volymen av tandcement inträffar under härdningsprocessen. Testa volymförändringarna av tandcement före implantation och basplätering. Forskare kan testa alla märken av tandcement och använda varumärket med den lägsta volymförändringen för att cementera basplattan. Ett exempel visas i figur 3.
- Väg upp 0,5 g av varje tandcementpulver och blanda det med lämplig lösning (1 ml).
OBS: Det rekommenderade förhållandet mellan pulver och vätska i tandcementinstruktionerna är 0,5 g pulver till 0,25 ml av lösningen för att erhålla en fast form. Detta testprotokoll späder förhållandet till 0,5 g / ml så att blandningen kan aspireras i flytande form för att mäta volymförändringen i pipettspetsarna. - Använd 0,1-10 μL pipettspetsar för att avlägsna 2,5 μL av dentalcementblandningen och försegla sedan pipettspetsen med ett lätt härdande lim.
- Placera spetsarna på ett ställ, markera de översta nivåerna av dentalcementblandningen och mät nivån på dentalcementblandningen efter 40 minuter (kompletterande video S1).
- Förutom att övervaka nivåförändringarna under tandcementhärdningen i spetsarna, mät den återstående torra dentala cementdensiteten. För att beräkna densiteten, mäta vikten av dentalcementet och mäta volymen med Archimedes princip.
- Kort sagt, placera den återstående torra tandcementen i en kopp fylld med vatten och väg vattnet som överflödar.
- Använd tandcementet med minst krympning för alla protokoll som beskrivs nedan.
2. Anestesi, kirurgisk implantation, virusinjektion och dummy baseplating
- Anestesi
OBS: Denna rapport syftar till att optimera kirurgi och baspläteringsproceduren för UCLA-miniskopet; Därför antogs att den optimala virala titern för infektion av målhjärnregionerna var känd. Metoderna för att hitta den optimala virala titern finns i steg 1 till 5 i Resendez et al.8. När virusutspädningen har optimerats kan kirurgisk implantation initieras.- Placera musen i en induktionsbehållare och ge syre (100 % vid ett luftflöde på 0,2 l/min). Preoxygenera musen i 5 till 10 minuter.
- Administrera 5% isofluran blandat med 100% syre (luftflöde: 0,2 l/min) tills musen börjar tappa balansen och så småningom bedövas.
- Ta ut musen ur induktionskammaren och injicera atropin (0,04 mg/kg; subkutan injektion) för att förhindra ansamling av saliv och buprenorfin (0,03 mg/kg; subkutan injektion) som smärtstillande medel.
- Raka musens huvud.
- Använd en mask, steril klänning och handskar. Förbered ett sterilt utrymme och sterila kirurgiska instrument för operation. Stabilisera musens huvud (behåll anestesi med 3 till 2,5% isofluran under detta steg) på den stereotaktiska apparaten. Efter smärtstillande och bedövningsprocedurer, se till att öronstängerna säkert stabiliserar huvudet. Ge termiskt stöd.
- Se till att huvudet är inställt i rakt läge, sterilisera det rakade huvudet med betadin och spraya sedan huvudet med xylokain (10%), ett lokalt smärtstillande medel.
- Applicera veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet.
OBS: Använd oftalmisk salva för ögonskydd under alla narkoshändelser för att förhindra ögonskada. - Testa djurets djupa smärtreflex genom att klämma bakpoten. När djuret inte visar någon tassuttagsreflex, fortsätt med kirurgiska ingrepp.
- Gör ett litet snitt längs skallens mittsagittalplan (från cirka 2 mm framför bregma och slutar cirka 6 mm bakom bregma). Rengör sedan bindväven på skallen och förankra tre rostfria skruvar på vänster front- och interparietalben.
- Reducera vid denna tidpunkt isofluran till 1-2%. Övervaka andningsfrekvensen under hela det kirurgiska ingreppet. Om andningsfrekvensen är för långsam (ca 1/s, beroende på djur), minska koncentrationen av isofluran.
- Utför en kraniotomi för relälinsimplantation under ett kirurgiskt mikroskop eller stereomikroskop genom att använda en gradborr med en 0,7 mm spetsdiameter. Använd en mikroborr för att ta tag i borrkronan och rita en kontur av det avsedda cirkelområdet (kalvariumets fulla tjocklek behöver inte penetreras).
OBS: Relälinsen som användes i detta protokoll hade en diameter på 1,0 mm, en längd ~ 9,0 mm en stigning på 1 och ett arbetsavståndsområde på ~ 100 μm - 300 μm; Därför hade kraniotomin en diameter av 1,2 mm.- Fördjupa försiktigt konturen tills dura exponeras.
- Förbered 3 ml steril saltlösning i en 3 ml spruta och kyl den i en ishink. Skölj ofta det exponerade området med 0,1 ml saltlösning från sprutan för att kyla området och förhindra värmeskador och blödningar.
- Plocka och skala bort dura lätt med en 27G nål.
- Sätt en markering på en 27 G trubbig nål 1 mm från spetsen och använd den för att försiktigt aspirera hjärnans cortex för att skapa ett fönster för linsimplantation 8,11,13,17 (figur 2B1). Gör vid behov en trubbig nål genom att slipa ner spetsen på en 27 G injektionsnål med sandpapper. Anslut sedan nålen till en spruta, anslut sprutan till ett rör och anslut röret till en sugkälla för att skapa vakuum.
OBS: Relälinsen är trubbig och komprimerar hjärnvävnaden när den placeras i det djupa hjärnområdet. Således minskar aspiration av cortex vävnadsskada på grund av relälinsimplantation. Cortex är ungefär 1 mm tjock hos möss men är svår att visualisera under ett stereomikroskop. Märket skapar ett landmärke som gör att nålens djup kan bestämmas mer exakt än med enbart ett stereomikroskop. Dessutom kan man avgöra om cortexregionen har uppnåtts eller passerat beroende på motståndet; Den övre delen av cortex känns relativt mjuk, medan den subkortiska regionen känns tät. Därför, när strukturen börjar kännas tätare, stoppa aspirationen (figur 2B3). - Förbered 3 ml steril saltlösning i en 3 ml spruta och kyl den i en ishink. Skölj området med saltlösning för att stoppa blödningen och minska risken för hjärnödem.
- Adenoassocierat virus (AAV) injektion
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE användes i det aktuella experimentet. jGCaMP7s är en genetiskt kodad kalciumindikator som avger grön fluorescens3. Eftersom den aktuella studien använde en vildtypmus som ämne, behövdes en viral vektor för att transfektera neuronerna med den grönfluorescerande kalciumindikatorgenen och möjliggöra uttrycket. Forskare som använder transgena möss som uttrycker den grönfluorescerande kalciumindikatorn som sina ämnen kan hoppa över protokoll 2.2.- Montera innernålen på en 20 G intravenös (i.v.) kateter på stereotaxarmen och punktera långsamt (~100 - 200 μm/min) hjärnan vid lämpliga koordinater (samma koordinater som används vid implantation av relälinsen) (figur 2B3).
- Sänk ner mikroinjektionsnålen med en hastighet av 100-200 μm/min i ventral CA1 och infusera (~ 25 nL/min) 200 nL av virusvektorn i målområdet (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML och -3,50 mm DV från bregma).
- Vänta i 10 minuter så att viruset kan diffundera och minimera återflödet.
- Dra upp (~100-200 μm/min) mikroinjektionsnålen.
- Relälinsimplantation
- Desinficera relälinsen med 75% alkohol10,16 och skölj sedan med pyrogenfri saltlösning. Blötlägg linsen i kall pyrogenfri saltlösning tills implantation.
OBS: En kall lins minimerar hjärnödem när den placeras i hjärnan. - Håll relälinsen med en mikrobulldoggklämma (figur 2B3) vars tänder har täckts med krympslang.
OBS: Bulldogklämman kan hålla fast linsen utan att skada den. Se Resendez et al.8 för metoden för att göra den slangtäckta bulldoggklämman. - Placera långsamt (~100 - 200 μm/min) relälinsen ovanpå målområdet (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML och -3,50 mm DV från bregma) och stabilisera den med tandcement.
- Desinficera relälinsen med 75% alkohol10,16 och skölj sedan med pyrogenfri saltlösning. Blötlägg linsen i kall pyrogenfri saltlösning tills implantation.
- Baseplätering av provdocka
OBS: Syftet med "dummy baseplating" under implantationsoperationen är att skapa en tandcementbas för att minska mängden tandcement som behöver appliceras under den verkliga baspläteringsproceduren flera veckor senare. På detta sätt minimeras risken för en förändring i tandcementens volym.- Fäst objektivlinsen på miniskopets undersida och montera basplattan på miniskopet (i detta steg har monteringen av den förankrade objektivlinsen, basplattan och miniskopet ännu inte placerats över musens skalle).
- Linda 10 cm paraffinfilm runt basplattans utsida (figur 4A).
- Håll miniskopet med den stereotaxiska armsonden med återanvändbar självhäftande lera.
- Rikta objektivlinsen ovanpå relälinsen med så lite utrymme mellan linserna som möjligt (bild 4B).
- Använd tandcement för att säkra basplattans placering (så att cementet endast berör paraffinfilmen).
- När tandcementet har torkat, ta bort filmen.
- Ta bort basplattan och miniskopet. Dentalcementbasen är ihålig (figur 4B).
- För att skydda relälinsen från dagliga aktiviteter och från att repas av musen, försegla relälinsen med lite gjutsilikongummi tills relälinsen är täckt och täck silikongummit med ett tunt lager tandcement (figur 4B).
- Koppla bort musen från de stereotaxiska instrumenten och placera musen i en återhämtningskammare.
- Injicera karprofen (5 mg/kg; subkutan injektion) eller meloxikam (1 mg/kg; subkutan injektion) för analgesi och ceftazidim (25 mg/kg; subkutan injektion) för att förhindra infektion.
OBS: Användning av antibiotika är inte ett alternativ till en aseptisk teknik. Perioperativa antibiotika (dvs. ceftazidim) kan indikeras under vissa omständigheter, såsom långvariga operationer eller placering av kroniska implantat. - Titta på djuret tills det återfår tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal liggande.
- Husmöss individuellt och injicera meloxikam (1 mg/kg; subkutan injektion; Q24h) i en vecka för att lindra postoperativ smärta. Kontrollera djuret varje dag efter operationen för att se till att det äter, dricker och bajsar normalt.
- Utför baseplating efter 3 eller fler veckor.
3. Basplätering
OBS: Vanligtvis kan baspläteringsproceduren (figur 5) inte utföras inom 2-3 veckor efter den initiala proceduren på grund av återhämtnings- och virusinkubationstiden. Induktionsprocedurerna för baseplätering liknar dem som beskrivs i steg 2.1.1 till 2.1.8. Basplätering är emellertid inte ett invasivt förfarande, och djuret kräver endast lätt sedering. Därför är 0,8-1,2% isofluran tillräcklig, så länge djuret inte kan röra sig på den stereotaxiska ramen. Dessutom kan relativt lätt isoflurananestesi också hjälpa till att underlätta uttrycket av fluorescenstransienter hos neuroner under övervakning8 (kompletterande video S2).
- Skär försiktigt det tunna lagret av tandcementtaket med en benrongeur och ta bort silikongummit. Rengör ytan på relälinsen med 75% alkohol.
- Fäst en skruv bredvid basplattan för att fästa den på miniskopets botten (figur 5A1).
OBS: Basplattan måste dras åt ordentligt under miniskopets botten eftersom skillnaden mellan en åtdragen och lätt fäst basplatta kan orsaka ett inkonsekvent avstånd. - Justera fokusbilden så att den är ungefär 2,7 - 3 mm från huvudhöljet (figur 5A2).
OBS: Även om längden kan justeras ytterligare under baspläteringsproceduren, fixa den till cirka 2,7 mm, eftersom det samtidigt är mycket förvirrande att justera miniskoplängden och den optimala längden mellan den implanterade relälinsen och den förförankrade objektivlinsen. - Anslut miniskopet till datainsamlingskortet och anslut det till en USB 3.0-port (eller högre version) på en dator.
- Kör datainsamlingsprogramvaran som utvecklats av UCLA-teamet.
- Justera exponeringen till 255, förstärkningen till 64x och excitationslampan till 5%. Dessa inställningar rekommenderas för inledande basplätering. De specifika inställningarna varierar beroende på hjärnregionerna och uttrycksnivåerna för den genetiskt kodade kalciumindikatorn.
- Klicka på knappen Anslut för att ansluta miniskopet till datainsamlingsprogrammet och titta på liveströmmen.
- Rikta in miniskopobjektivet mot relälinsen för hand och börja söka efter fluorescenssignalerna (figur 5B1).
OBS: Inledningsvis underlättar sökning efter fluorescenssignalen manuellt justeringar. Eftersom ett AAV-system användes för att uttrycka den genetiskt kodade kalciumindikatorn påverkade både promotortypen och AAVS-serotypen effektiviteten av transfektion23,24. Forskare bör behöva kontrollera uttrycket av kalciumindikatorn genom att hitta enskilda neuroner som visar förändringar i fluorescens innan de fortsätter med framtida experiment. - Borra tandcementet på något ställe där det blockerar miniskopet (tillval).
- Titta på liveströmmen av datainsamlingsprogramvaran och använd relälinsens marginal som ett landmärke (kompletterande video S2). Relälinsens marginal visas som en månliknande grå cirkel på monitorn (bild 5B1; vita pilar).
- När relälinsen har hittats, justera försiktigt miniskopets olika vinklar och avstånd tills fluorescenssignalerna hittas.
OBS: Bilderna av neuronerna är vitare än bakgrunden. En exakt neuronform indikerar att neuronerna ligger perfekt på relälinsens fokalplan. Runda neuroner tyder på att de var nära fokalplanet. Den neuronala formen är annorlunda över hjärnan, här visas ventral CA1 som ett exempel. - Om ingen enskild neuron visar förändringar i fluorescens som en funktion av tiden, återförsluta basen med silikongummi. Fluorescens observeras inte eftersom inkubationstiden också är beroende av virusets egenskaper23,24. Utför steg 3.1–3.12 efter ytterligare en vecka. (Detta är valfritt).
- Håll miniskopet i optimalt läge och flytta den stereotaxiska armen med en återanvändbar självhäftande lera mot miniskopet (figur 5B2). Fäst miniskopet på den stereotaxiska armen med återanvändbar självhäftande lera.
- Justera x-, y- och z-armarna något för att söka efter den bästa vyn (kompletterande video S2). Justera sedan vinkeln mellan ytan på objektivlinsen och relälinsen genom att vrida öronstången, tandstången eller återanvändbar självhäftande lera på z-axeln. Viralt uttryck och linsimplantation lyckas när minst en cell uppvisar fluorescenstransienter (figur 6A; Kompletterande video S2) under baseplating (vilket också beror på hjärnans område, såsom CA1).
Om monitorn bara visar vita blodkroppar men inga transienter finns det en annan orsak (se figur 6B, C, kompletterande videor S4, S5, avsnittet Resultat och felsökningsavsnittet). - Cementera basplattan (figur 5B2) med tandcementet.
- Övervaka intresseområdet under cementering för att säkerställa att den optimala positionen inte ändras.
- Använd minsta möjliga mängd cement medan du fortfarande limmar fast basplattan på tandcementbasen (figur 5B2). Applicera ett andra och tredje lager cement runt basplattan men var försiktig så att du inte påverkar GRIN-linsen.
OBS: Att applicera cement på basplattan är lättare i detta steg eftersom basplattans bas bildades under provdockans pläteringsprocedur. - Lossa försiktigt miniskopet från basplattan när cementet härdas. Skruva sedan på ett skyddskåpa.
- Flytta djuret till en återhämtningsbur. Titta på djuret tills det återfår tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal liggande.
- Husmöss individuellt. Se till att den äter, dricker och bajsar normalt varje dag. Vänta i 5 dagar tills musen återhämtar sig helt och kontrollera sedan kalciumavbildningen.
OBS: Det finns bara en liten mängd tandcement som håller basplattan. Därför, om basplattan har förändrats avsevärt sedan baspläteringsproceduren, ta bort dentalcementet med en borr utför baspläteringsproceduren igen. - Bedöva (genom intraperitoneal injektion av en ketamin (87 mg/kg)/xylazin (13 mg/kg) blandning) och perfusera25 djuret när alla försök är gjorda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bedömning av volymförändringen av dentalcement
Eftersom volymen av dentalcement förändras under härdningsprocessen kan det påverka bildkvaliteten avsevärt, med tanke på att arbetsavståndet för en GRIN-lins är cirka 50 till 350 μm 4,8. Därför testades två kommersiellt tillgängliga dentala cement i detta fall, Tempron och Tokuso, före implantations- och baspläteringsproceduren (figur 5). Videor utvärderades först för att avgöra om cementen hade krympt och sedan jämfördes volymerna av cement när de var helt torkade. Samma koncentration och volymer av de ursprungliga blandningarna av dentalcement laddades i pipettspetsar och videofilmades (kompletterande video S1). Video S1 visade att båda cementen krympte under torkningsprocessen. Tokuso presterade bättre än Tempron (dvs. den hade en större volym än Tempron även efter krympning): Figur 3B; genomsnittlig volym av tempron: 0,93 ± 0,07 ml; genomsnittlig volym av Tokuso: 1,18 ± 0,07 ml; t-test: p = 0,048, t (6) = 2,46, vilket tyder på att det krympte mindre. Cementens densiteter testades också 4 gånger efter fullständig torkning. Tokuso hade en lägre genomsnittlig densitet än tempron (genomsnittlig densitet för tempron: 1,07 ± 0,12 g / ml; genomsnittlig densitet för Tokuso: 0,93 ± 0,08 g / ml; t-test: p = 0,38, t (6) = -0,94), vilket innebär att den hade en lägre krympningshastighet. Därför användes Tokuso för följande implantations- och baspläteringssteg. Syftet med att beskriva experimentet ovan är inte att rekommendera några märken utan snarare att påminna experimenter om att hitta en tandcement som inte genomgår en betydande volymförändring vid härdning.
Mätning av bildförskjutning
Vi simulerade provdockans basplätering och ursprungliga baspläteringsprocedurer på ett fast objekt för att undersöka om provdockans baspläteringsprocedur resulterar i en mindre förskjutning av basplattans placering än den ursprungliga proceduren. Ett lätthärdande lim användes för att fixera en 23 G 2,5 cm sprutnål i mitten av en basplatta med 1 cm som sticker ut ur basplattan (figur 3C). Därefter simulerades basplätering genom att hålla nålarna med armen på ett stereotaxiskt instrument. Istället för att använda försöksdjur fästes en klistermärke på bordet på det stereotaktiska instrumentet. Sprutnålen genomborrade klistermärket och representerade därmed den ursprungliga platsen. Därefter höjdes nålen med 0,5 mm och simuleringsoperationerna påbörjades. I en operation som efterliknade engångsbaspläteringsproceduren8 applicerades tandcement tills den täckte basplattan, som var 1 cm ovanför klistermärket. Sedan var det en väntetid på 2 timmar för cementen att härda innan man försiktigt tryckte på nålen för att genomborra klistermärket igen. Eftersom det ljushärdande limet inte stabiliserade nålen helt, kunde nålen skjutas djupare för att skapa ett annat hål, som representerar basplattans placering efter att tandcementet hade torkat. Avståndet mellan det första hålet och det andra hålet mättes för att kvantifiera nålens platsförskjutning. Resultaten visade att basplattan 1 cm ovanför skallen resulterade i en förskjutning på 1,76 ± 0,14 mm, men provdockans basplätering resulterade i en förskjutning på endast 0,75 ± 0,17 mm (figur 3D; genomsnittligt skiftavstånd för engångsbasplätering kontra dummybasplätering; t-test: p < 0,01, t(8) = 6,03).
Dessutom var vi nyfikna på om tandcementens höjd skulle påverka skiftet. Därför testade vi ytterligare en kortare höjd (figur 3E; 0,5 cm ovan) genom att använda engångsbaspläteringsproceduren. Basplattan som var förankrad 0,5 cm ovanför skallen förskjuts betydligt mindre än basplattan 1 cm ovanför skallen (figur 3F; medelskiftavstånd: 0,43 ± 0,11 mot 1,76 ± 0,14 mm; t-test: p < 0,01, t(8) = 9,73). Data föreslog att basplattans höjd ovanför skallen och avståndet som basplattan skiftade var positivt korrelerade. Eftersom provdockans baspläteringsprocedur följs av ett andra baspläteringssteg som endast använder en minimal mängd dentalcement, stöder dessa data också hypotesen att basplätering av provdockor hjälper till att förbättra precisionen i baspläteringsproceduren.
Imaging med ett miniskopsystem med två linser
Genom att följa de kirurgiska protokollen för viral infusion, dummy-basplätering och baseplating (figur 2, figur 4, figur 5) observerade vi fluorescenstransienter av enskilda neuroner i tre möss (n = 3/5) (figur 6A, kompletterande video S3) under baspläteringsproceduren och efter baspläteringsproceduren medan mössen rörde sig fritt, vilket bekräftade att arbetsavståndet mellan objektiv- och relälinserna förblev detsamma (figur 6A1 jämfört med figur 6A3 inträffade endast en liten positionsförskjutning) efter det att tandcementet hade torkat helt. Här tillhandahåller vi videor av basplätering av en mus (kompletterande video S2; mus #5) och efterföljande kalciumavbildning medan möss rörde sig fritt (kompletterande video S3; mus #3, #4, #5; rådata). Observera att datainsamlingsprogramvaran för V3 inte innehåller funktioner för bakgrundssubtraktion, och kontrasten på videon kan förbättras genom offline-bearbetning). För kompletterande video S2 utfördes en manuell sökning efter fluorescenssignalerna och sedan fästes miniskopet på den stereotaxiska armen för finjusteringar. Vissa fluorescenstransienter observerades under sonderingen (kompletterande video S2; Figur 6A). En övergående är en jämn förskjutning i ljusstyrka i grå eller vita fläckar, inte ett avfyrningsmönster som liknar ett blinkande ljus; Figurerna 6A 1 till 6A2 visar bilder av transienter. Videon av möss som beter sig fritt visade en acceptabel rumslig förändring jämfört med det intressanta området under baspläteringsproceduren (kompletterande video S3). Marginalerna på cellerna kunde inte förbättras signifikant i detta skede eftersom vi inte kunde justera avståndet mellan relälinsens botten och de aktiva neuronerna. I synnerhet kan vissa problem ofta uppstå under grundpläteringsförfarandet, inklusive frånvaro av något annat än en enhetlig bakgrund (figur 6B; Kompletterande video S4) eller synlighet av vita blodkroppars marginaler utan fluorescenstransienter (figur 6C; Kompletterande video S5). Två exempel på negativa resultat ges också (n = 2/5) (figur 6B,C, kompletterande videor S4, S5). De möjliga orsakerna till misslyckandena undersöks i avsnittet Diskussion. De kirurgiska ingreppen för dessa två möss utfördes utan att använda en nål med 1 mm diameter för att rensa vägen; Således implanterades relälinsen direkt. Vi föreslår att i mus # 2 kan relälinsen ha komprimerat neuronerna och dragit ner några neuroner, vilket resulterade i skadade neuroner. Därför hittades inte fluorescenstransienter.
Figur 1: Miniskopets mekanismer och de defekter som vanligtvis orsakar bildfel . (A) Tecknat diagram över relälinsen och objektivlinsen som visar de mekanismer som är nödvändiga för visualisering av fluorescerande celler i ett tvålinssystem. Signalvågorna i varje lins betonar vikten av och mekanismen för att hitta ett arbetsavstånd för att visualisera de fluorescerande cellerna. (A1) Reläet GRIN-linsen placeras ovanför målneuronerna inom arbetsavståndet. Eftersom relälinsens tonhöjd är 0,5 * N (där N är ett heltal), möjliggör linsen visualisering av målneuroner genom att vidarebefordra ljus, vilket ger de ursprungliga fluorescenssignalerna till toppen av relälinsen. Sedan färdas ungefär 1/4 av en hel sinusformad ljusperiod genom objektivets GRIN-lins (~ 0,25 tonhöjd) och resulterar i en förstorad bild. (A2) Objektivlinsen överför bilderna till en komplementär metalloxidhalvledarsensor (CMOS) som finns på toppen (den gröna plattan i diagrammet) i miniskopet. (B) Tecknat diagram som visar skillnaderna i GRIN-linsimplantationsprocedurerna mellan ett (B1) tvålinssystem och (B2) ett enlinssystem. I allmänhet är den största skillnaden att enlinssystemet direkt använder sin objektivlins för att avbilda hjärnans yta; Som ett resultat måste objektivlinsen implanteras ovanpå målneuronerna. (C) I jämförelse implanteras däremot en extra relälins i hjärnan i tvålinssystemet och objektivlinsen är förförankrad i miniskopet. (C1) Formen på basplattan för V3-versionen av UCLA Miniscope kan orsaka en ojämn förskjutning efter att tandcementet torkat helt. (C2) Denna förskjutning orsakar felinriktning eller avvikelse från arbetsavståndet mellan relälinsen och objektivlinsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Modifierade protokoll och detaljerade kirurgiska protokoll för att förbättra framgångsgraden för miniskopsystemet med två linser. (A1) Modifierat kirurgiskt protokoll för tvålinssystemet. Platserna för virusinjektionen och relä GRIN-linsimplantation visas. Basplätering av provdockor gör att arbetsavståndet exakt omfattar neuronerna av intresse och minskar positionsförskjutningen i samband med (A2) baspläteringsproceduren. Därför ökar (A3) sannolikheten för att avbilda fluorescerande celler hos möss som beter sig fritt. (B) Tecknad bild av stegen för virusinjektion och relä GRIN-linsplacering. (B1) Markera först aspirationsnålen med en penna ca 1 mm (för musexperiment) från spetsen för att underlätta bedömningen av cortex aspirationsdjup. Aspirera sedan bindväv och cortex (ca 1 mm djupt i möss) från hjärnan. (B2) Använd ventral hippocampus som målområde för att implantera en relälins; I synnerhet är den tuffa corpus callosum landmärket för att stoppa aspirationen i den kortikala regionen. Den fibrösa strukturen hos corpus callosum kan ses under stereomikroskopet under aspiration. (B3) För det andra, punktera den intressanta punkten med en inre nål av en 20 G kateter (ca 1 mm i diameter; diametern liknar relälinsens) för att rensa en väg före viral infusion. Under stereomikroskopet bör en buckla (streckad cirkel i bilden) som skapas av nålen vara synlig. Sänk mikroinjektionsnålen och relälinsen vid bucklan (eller bara 250 μm från mitten av bucklan). Slutligen placera reläets GRIN-lins (i den aktuella studien använde vi ett reläobjektiv 1 mm i diameter). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mätning av volymförändringen hos det härdade dentala cementet . (A) Ett exempel med härdad dentalcement av två märken. De svarta pilarna anger de ursprungliga nivåerna efter att vi blandat pulvret och lösningen. De vita pilarna indikerar nivåerna efter 10, 20 och 40 minuters härdning. De röda pilarna pekar på botten av spetsarna, som förseglades med ljushärdande lim. b) Genomsnittliga volymer av återstående dentalcement efter fullständig torkning. Staplarna och felstaplarna är medel ± SEM. * betecknar signifikans (P < 0,05) enligt Students t-test. c) Illustrationer och ett fotografi som förklarar den metod som används för att mäta basplattans lägesförskjutning. En nål limmades genom basplattan och användes för att simulera den ursprungliga baspläteringsproceduren (basplätering i ett steg) och provdockans baspläteringsprocedur. De röda och svarta pilarna representerar nålens placering före och efter att tandcementet härdades. D) Genomsnittliga avståndsförändringar för nålspetsen (E) Illustrationer av den metod som används för att mäta förhållandet mellan basplattan ovanför skallenivån och platsförskjutningen. (F) Genomsnittliga avståndsförändringar av nålspetsen. Staplarna och felstaplarna är medel ± SEM. ** betecknar signifikans (P < 0,01) enligt Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Detaljerad provdockalackeringsprocedur (utförd omedelbart efter implantation av relälinsen). (A1) Trestegs tecknad film av objektivlins, basplatta och paraffinfilmmontering på miniskopet. (A2) Fotografiversion av monteringen. (B1) Tecknad film som visar provdockans baspläteringsförfarande. Först är det monterade miniskopet i linje med relälinsen. Den placerade objektivlinsen är så nära relälinsen som möjligt. För det andra tillsätts tandcement till parafilmen som omger basplattan och appliceras på skallen för att göra en kvinnlig form för framtida basplätering. Därefter avlägsnas basplattan och gjutning av kiselgummi (rosa) tillsätts och toppas med tandcement för att skydda honformen och relälinsen. Djuret får sedan återhämta sig från anestesi. Efter minst 3 veckor utförs baspläteringsproceduren. (B2) Fotografisk version av (B1). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Steg för baspläteringsförfarandet. (A1) Fäst basplattan och (A2) justera fokusreglaget manuellt till 2,7 till 3 mm. En inställning på 2,7 till 3 mm (vid den position som visas på bilden) verkar vara det bästa stället att börja innan du manuellt söker efter de fluorescerande cellerna. (B1) Det första tecknade diagrammet illustrerar vikten av längden mellan objektivlinsen och relälinsen för visualisering av de fluorescerande cellerna (fluorescerande celler observeras vanligtvis på ett avstånd mellan 0,5 och 2 mm). Innan den fluorescerande cellen dyker upp bör forskaren se relälinsens marginal (pilar i den övre bilden). Det är bra att först manuellt justera objektivet till den optimala visningspositionen eftersom det är lättare att göra snabba justeringar för hand. (B2) Placera återanvändbar självhäftande lera på den stereotaxiska armsonden och stabilisera sedan miniskopet genom att fästa det på armen med återanvändbar självhäftande lera. I detta skede kan intresseområdet ha förskjutits, men detta kan enkelt fixas genom att justera den stereotaktiska armen och den återanvändbara limleran något. Efter att ha kontrollerat och hittat det optimala området av intresse, tillsätt en liten mängd tandcement (representerad i rött). Limma basplattan med så lite tandcement som möjligt. Separera miniskopet och basplattan efter att tandcementet har torkat. Om basplattan inte är tillräckligt stabil, tillsätt ytterligare tandcement. (C) Detta diagram illustrerar vikten av varje steg för att nå framgång. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Exempel på framgång och misslyckande under baspläteringsförfarandet. (A) Ett exempel på framgångsrik avbildning under baspläteringsproceduren. Relälinsen riktade sig mot den ventrala hippocampus. Fluorescenstransienter noterades när djuret var anestesi med isofluran (se även kompletterande video S2). (A2) Kontrasten ökades för bättre synlighet. De röda streckade linjerna indikerar blodkärl. (A3) Fluorescenstransienter fem dagar efter basplätering när musen (# 5) betedde sig fritt i sin bur (se även kompletterande video S3; bilderna av möss #3 och #4 finns också i tilläggsvideon S3). Endast en liten förändring i position inträffade. (B1) Ett exempel på ett misslyckande. Under baspläteringen noterades endast homogena vita/grå områden som inte var cellliknande i form (se även kompletterande video S4). (B2) Relälinsen missade målområdet och var belägen ovanför ett område utan infekterade celler. (C1) Ett annat exempel på ett misslyckande. Även om många runda celler observerades i denna mus observerades inga fluorescenstransienter under baspläteringen (efter tre veckors inkubation och medan musen bedövades/sederades). Dessutom serverades inga fluorescenstransienter när baspläteringsproceduren utfördes igen (under den femte inkubationsveckan) eller ens när djuret uppförde sig fritt. Bilden togs under basplätering vid den femte inkubationsveckan (se även kompletterande video S5). (C2 och C3) Relälinsen missade pyramidskiktet i ventral hippocampus. De blå prickarna är kärnor som färgades med DAPI. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Problem | Möjlig orsak | Lösning | ||
| Hade bra bildbehandling vid baseplating men helt ur fokus nästa dag | Volymförändring vid härdning av tandcement mellan motivets skalle och basplattan | Fortsätt med "dummy baseplating" efter linsimplantationsproceduren enligt förslaget i denna rapport. Välj en tandcement som har mindre volymförändring. | ||
| Har homogena vita/grå områden utan någon cellliknande form under basplätering (se även kompletterande video S4) | A. Relälinsen missade målområdet B. Dåligt uttryck av fluorescensindikator C. Glöm att installera en objektivlins under miniskopet där fluorescensindikatorn faktiskt uttrycks | A. Använd dummylinser för att öva operationer. Kontrollera koordinaterna för dummylinsen efter den övande implantationen B. Hitta en optimal viral titer för kalciumavbildningsexperiment (hänvisad till Resendez et al. 2016). Om förtestning av någon anledning inte kan utföras rekommenderar vi att nybörjare provar en högre titer först. (Se avsnittet Disscusion för detaljer) C. Skruva på en objektiv GRIN-lins (~ 0,25 tonhöjd. ex: Edmund Optics; Lager #64-519) längst ner i miniskopet. | ||
| Observera många celler men ingen fluorescensdynamik under basplätering | A. Ohälsosamma nervceller eller döda nervceller B. Gles fining typ av nervceller C. Djup anestesi status | A. Var försiktig för varje kirurgiskt ingrepp. Använd en ny sprutnål som liknar diametern på din relälins för att skära infusions-/implantationsvägen först för att frigöra trycket genom linsimplantation. Infusera långsamt viruset och implantera långsamt linsen. B. Vänta en längre tid för att övervaka neurons aktiviteter eller nypa svansen lite för att stimulera musen. C. Basplätering är inte ett invasivt förfarande, och djuret behöver bara sedering. Därför är det tillräckligt att upprätthålla 1,2 ~ 0,8% isofluran, så länge djuret inte kan röra sig på den stereotaxiska ramen. | ||
Tabell 1: Felsökningsdiagram.
Kompletterande video S1: Volymtest av tandcement. Skillnaden mellan volymen mättes i början av dentalcementpreparatet och att volymen efter att cementet torkat. Två märken av dentalcement (t.ex. Tempron och Tokuso Curefast) testades. För att testa volymen av dentalcement efter att den torkat, vägdes 0,5 g av varje tandcementpulver och blandades med lämplig lösning (1 ml). Därefter laddades 0,1-10 μL pipettspetsar med 2,5 μL av dentalcementblandningen och förseglades med ljushärdande lim. Sedan placerades spetsarna på ett ställ, ytorna på tandcementblandningarna markerades och videofilmades i 40 minuter. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video S2: Demonstrationer av baspläteringsförfarandet. Vinkeln mellan objektivlinsens yta och relälinsen justerades genom att vrida öronstången, tandstången eller återanvändbar självhäftande lera på z-axeln. Relälinsens marginal framträdde som en månliknande grå cirkel på monitorn. Framgångsrikt viralt uttryck och linsimplantation bör avslöja minst en fluorescensdynamik (pilar) under basplätering. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video S3: Demonstrationer av fluorescensdynamik hos möss som beter sig fritt. Fluorescenstransienter från möss #3, #4 och #5. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video S4: Ett exempel på ett fel. En enhetlig bakgrund framträdde under baspläteringsförfarandet. Observera att förändringen i ljusstyrka inte berodde på fluorescenstransienter hos enskilda celler; Det orsakades av sökproceduren. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video S5: Demonstration av ett annat felexempel. Brist på fluorescenstransienter inträffade under baspläteringsproceduren, men vissa runda cellmarginaler var fortfarande synliga. Observera att förändringen i ljusstyrka inte orsakades av fluorescenstransienter hos enskilda celler; Det orsakades av sökproceduren. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport beskriver ett detaljerat experimentellt protokoll för forskare som använder UCLA Miniscope-systemet med två linser. Verktygen som är utformade i vårt protokoll är relativt överkomliga för alla laboratorier som vill prova kalciumavbildning in vivo. Vissa protokoll, såsom viral injektion, linsimplantation, dummy baseplating och baseplating, kan också användas för andra versioner av miniskopsystemet för att förbättra framgångsgraden för kalciumavbildning. Förutom allmänna problem med virusinjektion och linsimplantation som måste åtgärdas oavsett miniskopversion, kan UCLA-basplattans struktur orsaka en positionsförskjutning, vilket kan leda till felaktiga arbetsavstånd mellan objektiv- och relälinserna (figur 1C). Ett modifierat experimentellt protokoll utvecklades för att minimera positionsförskjutningen av de två linserna (figur 2, figur 4, figur 5). Framgångsrik kalciumavbildning kan uppnås genom en kombination av framgångsrikt viralt uttryck, linsimplantation och baspläteringsprocedurer (figur 5C). Att använda ett tvålinssystem för att observera djupa hjärnområden kräver en hög grad av noggrannhet i baspläteringsprocedurerna eftersom de relativa positionerna för den implanterade relälinsen och objektivlinsen också måste vara korrekta. Denna rapport presenterar inte bara ett protokoll som löser baspläteringsproblem utan diskuterar också några tips för virusinjektion och linsimplantation. Nedan diskuterar vi baspläteringsprocedurerna först, följt av virusinjektion och linsimplantationsprocedurer, och vi beskriver några exempel på misslyckanden (figur 6).
Basplätering
V3-versionen av UCLA Miniscope är för närvarande den mest använda designen och kan beställas online. Basplattan i denna version består av två kanter utan väggar (figur 1C1), men dess form kan orsaka en ojämn förskjutning (figur 1C1, C2) efter att tandcementet är helt torrt. Dummybaspläteringsprocedurerna i vårt protokoll (figur 4) minimerar felinriktningen och basplattans skiftningsproblem eftersom den använder paraffinfilm för att minska det tillgängliga utrymmet för tandcementet under verklig basplätering (figur 5B). Det återstående utrymmet är fortfarande tillräckligt för att hitta en optimal bildposition under den verkliga baspläteringsproceduren. Därför kan forskaren limma basplattan med så lite tandcement som möjligt (figur 5B2). Dessutom tar provdockans baspläteringsprocedur relativt lite tid (cirka 15 till 20 minuter) eftersom det inte kräver ett perfekt avstånd mellan objektivlinsen och relälinsen för att uppnås. Dockningsbaserad plätering är dock bara en av nyckelfaktorerna för framgångsrik kalciumavbildning; Till exempel, under övervakning av fluorescenssignaler, kan neuroner verka suddiga om de är något utanför arbetsplanet (beroende på relälinsens arbetsavstånd, ofta cirka 100 ~ 300 μm). Förmågan att förbättra arbetsavståndet är begränsat, eftersom neuronernas arbetsavstånd är förutbestämt av relälinsimplantationsproceduren. Ett experiment utfördes utan dummybaspläteringsproceduren och regionen av intresse missades alltid (hos fyra av fyra möss) efter engångsbasplätering. Därför utformades dessa lösningar för att minska krympningsproblemet. Vissa ljushärdande dentala cement kan undvika problemet med krympning under härdning eftersom de härdar mycket snabbt; Dessa cement kan hjälpa forskare att justera avståndet under baspläteringsproceduren. Även om våglängdsområdet för att spänna kalciumindikatorerna och härda tandcementet är olika, måste fotoblekning under baspläteringsproceduren förhindras. För att förhindra fotoblekning måste våglängdsområdet som genereras av ljuskällan vara ganska smalt för att undvika korsreaktioner mellan kalciumindikatorerna och det ljushärdande tandcementet. Därför rekommenderas inte användning av ljushärdande tandcement för baspläteringsproceduren. Dessutom används vissa specifika märken av dentalcement ofta för limning av basplattor av andra forskargrupper 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . De låga krympningsegenskaperna hos dessa cement kan lösa problemet, men vi hade inte möjlighet att testa dessa märken på grund av svårigheter att köpa (importera) dem. Produkter av medicinsk kvalitet kan omfattas av importbestämmelser beroende på land/region. Om forskare har svårt att komma åt cementen som nämns i litteraturen 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, kommer vårt protokoll att lösa problemet med tandcementkrympning.
Förutom krympningsproblemet kan strukturellt slitage uppstå i själva miniskopet och på basplattan (särskilt magneterna i basplattan) under många experiment. Varje litet mellanrum som orsakas av slitage minskar stabiliteten i avståndet mellan de två linserna. Återigen är noggrannhet över hela den optiska vägen nyckeln till avbildning av kalciumtransienter hos fritt betande möss med hjälp av ett miniskop.
Felsökning av viral injektion/linsimplantation
Innan viruset infunderas i hjärnregionen rekommenderas att montera en ny nål på den stereotaxiska armen och långsamt punktera hjärnan vid lämpliga koordinater. Eftersom den nya nålen är mycket vass fungerar denna punktering som ett förberedelsesteg för att rensa banan (eller skära en väg) för den faktiska mikroinjektionsnålen och relälinsen och minimerar vävnadsskador, vilket kan orsakas av kompression från mikroinjektionsnålen eller relälinsen. Den vassa nålen skär en väg för den trubbiga relälinsen; Således bör nålspetsen sänkas till samma koordinater med relälinsen. Den inre nålen på en 20 g IV-kateter valdes eftersom den hade en diameter på 1 mm, vilket liknade diametern på vår relälins. En annan nålmätare kan användas beroende på relälinsens diameter.
Även om den aktuella studien inte fokuserade på egenskaperna och titrarna hos virala vektorer, är dessa faktorer fortfarande kritiska för framgångsrik kalciumavbildning (figur 5C). Det är nödvändigt att förtesta uttryckskvaliteten hos den virala vektorn. Steg 1 till 5 i Resendez et al.s protokoll tillhandahåller detaljerade metoder för identifiering av en optimal viral titer för kalciumavbildningsexperiment8. Om förtestning inte kan utföras av någon anledning rekommenderas att nybörjare provar en relativt hög titer först. En av nackdelarna med att använda en hög viral titer ärcytotoxicitet8. Döda neuroner ger upphov till autofluorescens och är synliga som ljusa vita fläckar under miniskopet8. Dessa döda neuroner är dock bra landmärken för nybörjare att hitta och öva baspläteringsproceduren. Å andra sidan, även om infusion av ett lågtitervirus har en lägre risk att döda celler, kan fluorescensen maskeras av bakgrunden om cellerna inte visar några fluorescenstransienter under baspläteringsproceduren. Det är svårt att fastställa orsakerna till misslyckande eftersom målneuronerna kan missas på grund av relälinsimplantation eller på grund av det dåliga uttrycket av virusvektorn. Att bestämma orsaken är mycket förvirrande utan histologisk bekräftelse. Därför rekommenderas användning av relativt höga titervirus om virusvektorerna inte kan förtestas.
Resendez et al. rekommenderar att du sätter in mikroinjektionsnålen 250 μm lateralt och ventralt till linsens placering. Våra observationer visade att infusion av viruset på samma djup som relälinsen också kan leda till uttryck av goda kalciumsignaler. Vi föreslår att på grund av risken för infektion och spridning är infusion av viruset på samma djup som relälinsens koordinat optimalt för att minska vävnadsskador och öka noggrannheten i avståndet mellan de infekterade neuronerna och relälinsen. Resendez et al rekommenderar också att man utför virusinjektion och linsimplantation under samma operation med tanke på det smala arbetsavståndet mellan målceller och relälinsen8. Vissa forskare följer dock ett protokoll där det virala infusionssteget och linsimplantationssteget utförs med två (eller fler) veckors mellanrum18,26. Förlängning av tiden mellan stegen minskar den individuella operativa tiden. Men i detta protokoll slogs dessa två steg samman till en operation, eftersom kirurgen i protokollet för en operation kan övervaka positionen mellan mikroinjektionsnålen och relälinsen när de sänks ner i målområdet, vilket minskar risken för misslyckad inriktning (figur 2B3).
För två möss (möss #1 och #2) utelämnades också användningen av en nål för att skapa en väg för linsen, och i mus #2 observerades runda cellliknande grå fläckar (figur 6C). Fluorescensdynamik (kompletterande video S5) observerades dock inte. Efter att ha undersökt hjärnskivan i detta exempel (figur 6C2, C3) postulerade vi att relälinsen drog ner några celler medan den sänktes. Dessa släpade neuroner var ohälsosamma, så ingen aktivitet noterades under baspläteringsproceduren eller under experimentet.
Vi hade en mus med en helt homogen grå signal och inga synliga cellliknande bilder under baspläteringsproceduren (figur 6B1). Efter att ha offrat musen observerades dess hjärnskivor. Det märktes att linsen var på den mediala sidan av det krökta pyramidskiktet; målområdet (figur 6B2) missades helt. Dessa misslyckade försök var kritiska erfarenheter som ledde oss att ändra vårt operationsprotokoll och slutligen lyckas med tre möss (kompletterande video S3).
Nål för mikroinjektion
Corpus callosum är ett tufft fibröst område som överlagrar dorsal hippocampus. På grund av sin styvhet motstår den penetration av en platt mikroinjektionsnål. Därför rekommenderar vi att du använder en mikroinjektionsnål med en fasad spets. Denna typ av nål minskar inte bara vävnadsskador utan minskar också risken för misslyckande med att infusera viruset i målområdet på grund av blockering av närliggande fibrer. Vi har sammanfattat ovanstående problem i ett felsökningsdiagram (tabell 1).
Tidsram
Tidsramen för hela proceduren sammanfattas i figur 2A, med dagar som enheter. I detalj kan operationsdelen (viral injektion, relälinsimplantation, dummy baseplating) ta 3 timmar för nybörjare eller 1,5 timmar för tillräckligt utbildade forskare. Möss har en liten kroppsstorlek och snabb ämnesomsättning, och de är mer mottagliga för hälsoproblem orsakade av långa perioder under anestesi än större arter27. Forskare bör sträva efter att hålla tiden i operation under 3 timmar. Verklig basplätering kan utföras efter 3 till 6 veckors kalciumindikatoruttryck. Denna procedur kan ta 1 h. Den efterföljande observationen av longitudinell kalciumaktivitet kan fortsätta i mer än 1 månad.
Slutsatser
UCLA Miniscope är en kalciumavbildningsenhet med öppen källkod in vivo . Utan en färdig, förinstallerad basplatta eller linsmodul måste individer som utför experiment kunna uppnå det optimala avståndet mellan objektivlinsen och relälinsen exakt under baspläteringsproceduren. Den ökade svårigheten att använda UCLA Miniscope-systemet med två linser ligger i volymförändringen av tandcementet. Vi har optimerat de ursprungliga protokollen och minimerat defekterna orsakade av problemen som nämns ovan, vilket ökar framgångsgraden för kalciumavbildning med UCLA Miniscope-systemet med två linser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta är inte en branschstödd studie. Författarna redovisar inga ekonomiska intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
