Summary
本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。
Abstract
ヒト胚性幹細胞(hESC)由来の肝細胞様細胞(HLC)の潜在的な機能は、疾患のモデル化および薬物スクリーニング用途に大きな約束を果たしています。ここでは、機能性 Hfc に hESC を分化するための効率的で再現可能な方法を提供します。内胚葉系統の確立は、HLFc との差別化の重要なステップです。我々の方法により、hESC分化中のアクチビンAおよびCHIR99021を確実な内因(DE)に連続的に補い、続いて肝前駆細胞の生成、そして最後に完全に定義された試薬を用いた段階的な方法で典型的な肝細胞形態を有するHLCを補うことによって、主要なシグナル伝達経路を調節する。この方法によって生成されるhESC由来のHFCは、ステージ固有のマーカー(アルブミンを含む) HNF4α核受容体、及びタウロコール酸共輸送ポリペプチド(NTCP)と、成熟および機能的肝細胞(中毒性の緑染色、グリコーゲン保存、ヘマトキシリン-エオシン染色およびCYP3活性を含む)に関する特別な特徴を示し、肝疾患の研究におけるHLCベースの応用の開発のためのプラットフォームを提供することができる。
Introduction
肝臓は、脱酸化、グリコーゲンの貯蔵、タンパク質の分泌と合成など、いくつかの役割を果たす高度に代謝性の高い器官である1。様々な病原体、薬物および遺伝は肝臓の病理学的変化を引き起こし、その機能に影響を及ぼす2,3.肝細胞は、肝臓の主要な機能単位として、人工肝支援システムおよび薬物毒性除去において重要な役割を果たす。しかし、原発性ヒト肝細胞の資源は、細胞ベースの治療だけでなく、肝臓病の研究において限られている。したがって、ヒト肝細胞の機能性を新たに開発することは、再生医療分野における重要な研究の方向性である。hESCが確立された1998年から、hESCは優れた分化能力(適切な環境で様々な組織に分化することができる)と高度な自己更新性のために研究者によって広く検討され、バイオ人工肝、肝細胞移植、さらには肝組織工学5に理想的なソース細胞を提供する。
現在、肝分化効率は、内胚葉6を充実させることにより大きく高めることができる。幹細胞の内胚葉への系統分化において、変容成長因子β(TGF-β)シグナル伝達およびWNTシグナル伝達経路のレベルは、内胚形成段階のノードにおける重要な因子である。高レベルのTGF-βおよびWNTシグナル伝達の活性化は、endoderm7,8の開発を促進することができる。アクチビンAは、TGF βスーパーファミリーに属するサイトカインである。従って、アクチビンAは、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)及びhESC9,10の内胚葉誘導に広く用いられている。GSK3はセリンスレオンニンプロテインキナーゼです。研究者は、GSK3βの特定の阻害剤であるCHIR99021が典型的なWNTシグナルを刺激し、特定の条件下で幹細胞分化を促進できることを発見し、CHIR99021がエンドドーム11、12、13に幹細胞分化を誘導する可能性があることを示唆している。
ここでは、hESCの機能的なHCへの分化を効果的に誘導するための効率的で再現可能な方法を報告します。アクチビンAおよびCHIR99021の順次添加により、約89.7±0.8%SOX17(DEマーカー)陽性細胞が産生された。さらに 体質化された細胞は、肝特異的マーカーを発現し、肝細胞様形態(ヘマトキシリン-エオシン染色(H&E)に基づく)およびインドシアニングリーン(ICG)の取り込み、グリコーゲン貯蔵およびCYP3活性の取り込みなどの機能を発揮した。この結果は、hESCがこの方法によって成熟した機能的なHlCに正常に分化され、肝疾患関連の研究と インビトロ 薬物スクリーニングの基礎を提供できることを示している。
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Protocol
1. 幹細胞のメンテナンス
注: 以下に説明するセル維持プロトコルは、接着単層で維持される hES03 細胞株に適用されます。この原稿の次のプロトコルすべてについて、細胞は生物学的安全キャビネットの下で扱われるべきである。
- 5x補充培地をmTesR塩基性培地に希釈して1x mTesR幹細胞培地を調製した。
- 氷の上に5 mLのDMEM/F12でhESC修飾マトリゲルの5 mLを希釈することによって30x hESC修飾マトリゲル培地を準備する。-20°Cで保管してください。
- DMEM/F12の1 mLで30x hESC修飾マトリゲルの33.3 μLを希釈することによって1x hESC修飾マトリゲル培地を準備する。
- 滅菌6ウェルをコートし、各ウェルに1xhESC修飾マトリゲルの1mLを有する組織培養処理プレートを事前に、4°Cで一晩保存する。室温(RT)で使用する前に30分以上放置してください。
- 37°Cの水浴で凍結保存されたhESCを3分間振らずに解凍します。次いで、4 mLプリウォームした37°C mTesR培地を含む15mL遠心管にピペットして細胞を直ちに移し、上下に2回ピペットします。
- 200 x g の hESC を RT で 2 分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、細胞を1mLのmTesR培地で穏やかに再懸濁する。
- DMEM/F12培地をプレートから吸引し、2 mLのmTesRで1 x105 細胞の密度で6ウェルプレートのウェルに細胞を播種します。
- 5%CO2インキュベーターでインキュベートし、毎日予熱されたmTesR培地に置き換えることによって細胞を維持する。約70〜80%の合流で、または細胞コロニーが接触し始めると、細胞を通過させる。
2. 幹細胞の通過と分化
- 細胞を通過させる場合、培地を吸引し、酵素溶液のウェル当たり1mLで細胞をインキュベートする(例えば、アキュターゼは37°Cで5分間。 次に、4 mLのDMEM/F12を含む15 mL遠心分離管にピペットして細胞を37°Cに予熱した。
- 2分間RTで200 x g で細胞を遠心分離する。
- 培地を吸引し、細胞ペレットを1mLのmTesR培地に静かに再懸濁させる。
- 24ウェルプレートを250 μLの1x hESC認定マトリゲル培地でコーティングして事前に準備します。上記のように、500 μLのmTesR培地中のウェル当たり1〜1.5 x105 細胞の密度で、上記のようにhESCをシードする。
- 細胞がCO2インキュベーターで37°Cで24 時間インキュベートすることを可能にする。
3. DE形成
- DMSOで0.2%BSAと3 mM CHIR99021を含むDPBSを備えた100 μg/mLアクティビンAのストックソリューションを準備します。
- 1x B27でRPMI培地を補うことによってステージI分化基本培地を準備する。
- アクチビンAを100 ng/mLの最終濃度に加え、CHIR99021を適切な体積の予熱ステージI分化基本培地で3μMの最終濃度に加えます。
- 細胞から吸引mTesR培地を、付加分化因子(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり0.5 mL)を含むステージI分化培地に置き換える。
- 細胞がCO2 インキュベーターで37°Cで3日間インキュベートすることを可能にし、毎日ステージI培地を新たに添加した分化因子に置き換える(Days 0-2)。
注:分化の3日後、分化細胞は、例えばFOXA2、SOX17、GATA4、CRCR4、およびFOXA1(進行に必要なSOX17の最低80%)のようなDE細胞のマーカーを表す必要があります。
4. 肝前駆細胞の分化
- ノックアウトDMEMで20%の最終濃度にノックアウト血清置換(KOSR)を溶解することにより、ステージII分化基本培地を調製します。
- 1%DMSO、1xグルタマックス、1x非必須アミノ酸(NEAA)溶液、100 μM 2-メルカプトエタノールおよび1xペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含むステージII分化培地を適切な量のKOSR/ノックアウトDMEMに調製する。
- 分化の3日目に、培地を吸引し、ステージII培地(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり0.5 mL)に置き換える。その後、24時間インキュベートする。
- 分化の4日目に、培地を吸引し、ステージII培地(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり1mL)に置き換える。
- 1 日おきにメディアを変更します (6 日目にメディアを交換します)。
注:分化の8日後、分化細胞は、HNF4α、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPA(進行に必要なHNF4αの最低80%)のような肝前駆細胞の適切なマーカーを発現するべきである。
5. 肝細胞分化
- 10 μg/mL 肝細胞成長因子 (HGF)、20 μg/mL オンコスタチン(OSM)ストックソリューションを DBPS (0.2% BSA を含む) とフィルター 0.22 μm フィルター膜で準備します。
- ステージIII分化基本培地(ヘパトザイム-SFM(HZM)培地を10 μMヒドロコルチゾン-21-半球化および1x P/Sで補う。
- HGFを最終濃度の10 ng/mLに加え、最終濃度の20 ng/mLを適切な濃度のステージIII分化培地に加えます。
- 分化の8日目に、細胞からステージII培地を吸引し、ステージIII培地(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり1mL)に置き換える。
- 細胞がCO2 インキュベーターで37°Cで10日間インキュベートすることを可能にし、ステージIII培地を1日おきに新たに分化因子を加えて変更する(Days 8-18)。
注:分化の18日後、分化細胞は、AAT、ALB、TTR、HNF4α、NTCP、ASGR1、CYP3A4などの肝細胞の特徴的なマーカーを発現する必要があります。アルブミン陽性細胞の割合は、通常90%以上である。
RNAの単離、cDNA合成およびRT-qPCR分析
- 細胞から培地を吸引し、RNAiso Plus試薬の適切な量を加え、(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり0.3 mL)。上清を1.5mLチューブに集め、RTで5分間放置します。
- 60 μLのクロロホルム試薬を加え、RTで5分間放置します。その後、12,000 x g で遠心分離機を15分間行います。
- 125 μLの上清を集め、別の遠心分離管に移します。イソプロパノールを160μL加え、よく混ぜ、RTで10分間放置します。
- 12,000 x g で10分間の遠心分離機。
- 上清を取り除き、沈殿物に75%エタノールを加え、遠心分離機を7,500xgで5分間加える。
- RTで乾燥した後、40 μLのDEPC処理水を加えて溶解します。qPCRの場合、メーカーのプロトコルに従って逆転写キットを使用して、総RNAの2μgを逆転写します。
- 製造元のプロトコルに従って、市販キットを使用して RT-qPCR を実行します。
- 非誘導幹細胞に対する遺伝子発現を正常化し、GAPDHに対する正常化後のフォールド変動を決定する。
7. 分化の免疫蛍光検証
- 0.1%Tween-20をPBSに加えて1x PBST洗浄バッファーを調製します。
- 付着細胞から培地を吸引し、シェーカーのRTでPBSで短時間洗浄する。
- 吸引PBSと24ウェルプレートのウェルあたり500 μLの氷冷メタノールを含む細胞をインキュベートし、一晩で-20 °Cで細胞を固定します。
- メタノールを取り出し、RTで毎回10分間シェーカーでPBSで3回洗浄します。
- 5%BSAの500 μLのブロック細胞は、シェーカー上のRTで1-2時間PBSで調製した。
- ブロッキングに使用される同じ溶液中の1:200で希薄な一次抗体。
- シェーカー上で4°Cで一晩300μLの一次抗体溶液中の固定細胞をインキュベートします。
- 一晩インキュベーションした後、シェーカー上のRTで毎回10分間PBSTで細胞を3回洗浄する。
- 1:1000でブロッキング溶液中の二次抗体溶液を調製する。
- 300 μL の二次抗体溶液を、シェーカーの RT で 1 時間光から保護します。
- 吸引二次抗体溶液と細胞をシェーカー上のRTで毎回10分間PBSTで3回洗浄する。
- 300 μLの1 μg/mL DAPIを3~5分間インキュベートし、PBSTで2回洗浄します。
- PBSTを吸引した後、蛍光顕微鏡で写真を撮るための適切な量のPBSを加える。
8. ウェスタンブロット分析
- トリスバッファー生理生理(TBS)に 0.1% Tween-20 を加えて、1x TBST 洗浄バッファーを準備します。
- メーカーのプロトコルに従って市販のキットを使用してSDS-PAGE電気泳動バッファーと西部転写バッファーを準備します。
- 10%のドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲルで全細胞タンパク質(40μg)を分解し、約2時間の15mA定電流でSDS-PAGE電気泳動バッファーで動作します。
- ゲルをポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜に、低温で2時間の300mA定電流で移動します。
注:実行時間と転送時間は、使用する機器とゲルの種類と割合によって異なる場合があります。 - シェーカーのRTで1時間TBSTで調製された3%BSAで膜をブロックします。
- シェーカー上で一次抗体溶液(1:1000希釈)を4°Cで一晩インキュベートする。
- 一晩のインキュベーションの後、シェーカーのRTで1時間あたり15分間TBSTで3回ブロット膜を洗浄する。
- 二次抗体溶液(1:2000希釈)で2時間、シェーカー上のRTでインキュベートする。
- 二次抗体溶液を廃棄し、TBSTで膜を3回洗浄し、毎回15分間、シェーカー上でRTで洗浄します。
- 化学発光試薬を用いてオートラジオグラフィーを使用して免疫反応性バンドを可視化します。β-actin をロード制御として使用します。
9. インドシアニングリーンの取り込み
- DMSOで200mg/mLのインドシアニングリーンストック溶液を準備します。
- 1 mg/mL の最終濃度にインドシアニングリーン溶液でステージ III 分化培地を補うことによって作業ソリューションを準備します。.
- 37°C、5%CO2インキュベーターで1〜2時間インキュベーターをインキュベートする。
- 培地を吸引し、細胞をPBSで3回洗浄する。
- 顕微鏡で撮影。
10. 周期酸シフ(PAS)染色およびヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色
- 付着細胞から培地を吸引し、PBSで2回短時間洗浄する。
- 細胞固定のために、PBSを吸引し、一晩-20°Cで氷冷メタノールで細胞をインキュベートする。
- PAS染色でグリコーゲン保存を可視化し、メーカーの指示に従ってキットを使用してH&E染色による二核細胞を観察します。
- 蛍光顕微鏡で画像を撮ります。
11. CYP活性のアッセイ
- メーカーの指示に従って市販のセルベースアッセイ(P450-Gloアッセイ)を使用してCYP450活性を測定します。
- テストには 3 つの独立した繰り返しを使用します。データはSDの平均±表現されます。
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Representative Results
hESCからのHLC誘導の概略図と各分化段階の代表的な明視野画像を図1に示す。ステージIでは、殺菌剤AおよびCHIR99021を3日間添加し、幹細胞を誘導して内胚細胞を形成した。ステージIIでは、内胚葉細胞を5日間分化培地で処理した後、肝前駆細胞に分化した。ステージIIIでは、HGFおよびOSMで10日後に初期肝細胞が成熟し、HCに分化していた(図1A)。分化の最終段階では、細胞は典型的な肝細胞表現型(細胞は多角形であり、均等かつ規則的に分布する)を示した(図1B)。
さらに肝分化を確認するために、RT-qPCR、免疫蛍光染色およびウェスタンブロッティングを用いて、内胚葉細胞、肝前駆細胞、および成熟肝細胞のマーカーを検出した(図2)。分化した細胞は、各段階で分化関連遺伝子やタンパク質の発現レベルが高いことを示し、 3日目の内胚葉マーカーSOX17(89.7±0.8%)、8日目の肝前駆細胞マーカーHNF4α(81.3±2.9%)、14日目のAFP(86.6±0.3%)、18日目の成熟肝細胞マーカーALB(94.5±1.1%)など。これらの結果は、肝細胞様細胞がこのプロトコルによって生成されることを示す。
HLCに肝細胞機能があるかどうかを検出するために、HlCのICG取り込み、グリコーゲン貯蔵、CYP活性を検出し、H&E染色を行いました。見られるように、Hlcsは緑色染色(図3A)および広範な細胞質周期的な酸シフ染色(ピンク〜紫)が観察された(図3B)、グリコーゲン貯蔵と一致している。また、典型的な二核肝細胞の代表的な形態を見ることができる(図3C)。最後に、CYP3A4の酵素活性は、肝臓における最も重要な代謝CYPを、酵素活性アッセイによって確認した(図3D)。
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | ストック濃度 | 最終濃度 |
| 2-メルカプトエタノール | シグマ | M7522 | 50mM | 100 μM |
| マウスIgGに対して488ラベル付けヤギ | ZSGB-バイオ | ZF-0512 | - | IF: 1:1000 |
| ウサギIgGに対して488ラベルヤギ | ZSGB-バイオ | ZF-0516 | - | IF: 1:1000 |
| アキュタス | 幹細胞技術 | 7920 | 1 x | 1 x |
| アクティビンA | ペプロテック | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| アンチ - アルブミン(ALB) | シグマ・アルドリッチ | A6684 | - | IF: 1:200;WB:1:1000 |
| アンチ - 人間10月4日 | アブカム | Ab19587 | - | IF: 1:200 |
| 抗 - αフェトプロテイン(AFP) | シグマ・アルドリッチ | A8452 | - | IF: 1:200;WB:1:1000 |
| 反-SOX17 | アブカム | ab224637 | - | IF: 1:200 |
| 抗肝細胞核因子4α(HNF4α) | シグマ・アルドリッチ | SAB1412164 | - | IF: 1:200 |
| B-27 サプリメント | ギブコ | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | ベヨタイム | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | シグマ・アルドリッチ | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| ダピス | ベヨタイム | C1006 | - | - |
| デプウォーター | ベヨタイム | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | ギブコ | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | シグマ・アルドリッチ | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | ギブコ | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| グルタマックス | ギブコ | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| H&E染色キット | ベヨタイム | C0105S | - | - |
| 肝細胞増殖因子(HGF) | ペプロテック | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| ヘパトザイム-SFM(HZM) | ギブコ | 17705-021 | - | - |
| ヒドロコルチゾン-21-ヘミコハク酸塩 | シグマ・アルドリッチ | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| インドシアニン | サンゴンバイオテック | A606326 | 200 mg/mL | 1 mg/mL |
| ノックアウト DMEM | ギブコ | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| ノックアウト SR マルチセ種 | ギブコ | A31815-02 | - | 20% |
| マトリゲル hESC 資格 | コーニング | 354277 | 60 x | 1 x |
| メム ネアア | ギブコ | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| mTesR 5X サプリメント | 幹細胞技術 | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR基底媒体 | 幹細胞技術 | 85851 | 1 x | 1 x |
| オンコスタチン(OSM) | ペプロテック | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (ルシフェリン - PFBE) | プロメガ | V8901 | - | - |
| PAS染色キット | ソーラービオ | G1281 | - | - |
| ペン/ストレップ | ギブコ | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスIgG | ZSGB-バイオ | ZB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| ウェスタンブロット用の一次抗体希釈バッファー | ベヨタイム | P0256 | - | - |
| レバートラエース qPCR RT キット | 豊博 | FSQ-101 | - | - |
| RNAアイソプラス | タカラ | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | ギブコ | 11875093 | 1 x | 1 x |
| スキムミルク | サンゴンバイオテック | A600669 | - | 5.00% |
| SYBRグリーンマスターミックス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A25742 | - | - |
| トリン2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| トゥイーン | シグマ・アルドリッチ | WXBB7485V | - | 0.10% |
表1:細胞培養および分化基底培地の成分。
| 遺伝子の名前 | 略語 | プライマーシーケンス(F) | プライマーシーケンス(R) |
| POU クラス 5 ホメオボックス 1 | 10月4日 | アグガアカグ タツガヤック |
タカガート アクトチャク |
| フォークヘッドボックスA2 | フォカ2 | GCATTCCCATC TTGACACGGGA |
GCCCTGCAGC カガアタカサット |
| SRYボックス転写因子17 | SOX17 | タットットクトクテクグ サクトガーカグ |
TTGGGACACAT トカーアマッタガッタ |
| フリズルクラスレセプター8 | FZD8 | アトクGCタカア カタッカーカ |
グアカトGCTGC アサガガガー |
| C-X-C モチーフ ケモカイン受容体 4 | CXCR4 | カックキャット ガガカアッカ |
グマガットック CGGTGTT |
| フォークヘッドボックスA1 | フォクサ1 | アグカタッカケ アアグサクト |
タカカカクトクトグ グタグタック |
| Msh ホメオボックス 1 | MSX1 | CGCCAAGGカ アガガカサック |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| メソゲニン1 | MSGN1 | GCTGGAATTA TTCTCTCTCC |
TGGAAアグクタアカ タットGTタクカッカ |
| コーダルタイプホメオボックス1 | CDX1 | アガガクトットキャット タタックックタック |
TGCTGTTCTCT TGTTCACTTTG |
| 偶数スキップホメオボックス1 | EVX1 | GCTCTCTCTG アカアアトGCT |
キャットククトクサクト CTCCCCAAAA |
| メソダーム後部BHLH転写因子2 | メスプ2 | アグクトッグググ CCTCCTTAT |
TGCTCCCTGAA アガカカ |
| NK2 ホメオボックス 5 | NKX2.5 | カアクトグGCG TCTGCCTTTT |
カクトクトクトクト TTCGGCCTA |
| ISL LIM ホメオボックス 1 | ISL1 | アガタタットカッグ TGTACGGGATカ |
アカガッチャ アアカクトクアット |
| 肝細胞核因子4アルファ | HNF4α | アカトガキャット GCCGACTAC |
CGTTGAGTG GTGCCTCt |
| アルファフェトプロテイン | AFP | アクガートチャグ アアカクGCA |
TGCAGTCAATG キャットクトルカ |
| T-Box転写因子3 | TBX3 | タクトクハッハッグ CGAGGGTGA |
アクトグッグトッグ ガガクトグ |
| トランスサイレチン | TTR | アガーグクトグ CTガトガック |
GTGCCTTCCA アグターガトツ |
| アルブミン | ALB | CCCCAAGTGT カアクッカ |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| タウロコレート酸ナトリウム共輸送ポリペプチド | NTCP | カタガットククト CCTCAAATCA |
GCCACACTGCAC アラガガアット |
| CCAATエンハンサー結合タンパク質アルファ | セブカ | アガガトガー GCCAAGCCT |
アクトGCGCATC トガアクGCAG |
| セルピンファミリーAメンバー1 | AAT | アアトガアクカ CCCACGAT |
アクトガッタグ CCCAGT |
| アジアロ糖タンパク質受容体1 | アスグラム1 | カガクツガガガ CCCTGAGCAA |
TCCTGCGGGG ガクトクトット |
| シトクロム P450 ファミリー 3 サブファミリー A メンバー 4 | CYP3A4 | TTGTAATCクトグ TTGGCGTGGG |
アトッグGCAAGT カカグッガ |
表2:q-PCR分析用のプライマー配列
図1: DE および HLC の仕様に関するプロトコルの概略図 (A) 本研究で用いた3段階分化戦略の概略的な提示(B)0日目、3日目、8日目、14日目、18日目の分化細胞の形態。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:hESC中のステージ特異的マーカー発現は、HLCsへの分化中に、(A)ステージ特異的遺伝子のmRNA発現を示す。(B-C)ステージ特異的遺伝子のタンパク質発現この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:hESC由来HLCsの機能(A)1mg/mLのインドシアニングリーンで1時間処理されたHLCsは、相顕微鏡で評価された取り込みについて実証する。(B)グリコーゲン貯蔵を示す代表的なPAS染色画像。(C) 代表 HE 染色画像は、細胞の二核を示す。(D) 主要シトクロムP450酵素の基底レベル活性すべての値はSD±平均値として表示されます。
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Discussion
ここでは、hESCからHCSを誘導するステップワイズ方式を3段階で提示する。第1段階では、アクティビンAとCHIR99021を使用して、hESCをDEに区別しました。第2段階では、KO-DMEMおよびDMSOを用いて、DEを肝前駆細胞に分化した。第3段階では、HZMプラスHGF、OSMおよびヒドロコルチゾン21-半ミコミネートナトリウム塩を使用して、肝前駆細胞をHLCsに分化し続けた。
プロトコルを使用する際には、次の重要な手順を考慮する必要があります。細胞の初期分化密度と中程度の変化の正確なタイミングは、分化を成功させるための重要な要素です。分化し始めると、細胞が互いに接触し始めたばかりの合流点30~40%で、細胞間空間が視野の下でネットワークに均等に配置されるように、初期シード密度が適切であることを確認する必要があります。分化の間、対応する分化培地は、特に各置換段階の第1段階および重要な瞬間において、細胞が胚発生のプロセスを模倣するモードおよびステージで分化することを確実にするために、指示された時間に正確に変更されなければならない。
特に、デへのhESCの分化の第1段階が重要である。通常、分化のステージIの間に剥離して浮かぶ細胞は多数あり、これは細胞の運命にとって重要な段階ですが、現時点では細胞は増殖する能力を保持しています。したがって、細胞の合流は、ステージIの終わりに約90〜100%に達することができる。また、分化のステージIIIの初め(すなわち、8日目)において、細胞の細胞質が凝縮し始め、細胞が徐々に細い形態を獲得することに留意すべきである。しかし、10日目には細胞質が徐々に回復し、14日目に細胞は肝細胞の明らかな多面体形態を示し始める。
本研究では、AFPが18日目にALBよりも高く発現されるため、得られたHLCは実際には胎児肝細胞に近い。生成されたHLCは肝細胞の特性と機能を発揮しますが、HLCと一次ヒト肝細胞との間にはまだギャップがあり、分化した細胞はまだ機能的に成熟していないことを示しています。したがって、今後の作業では、差別化方法のさらなる最適化に焦点を当てる必要があります。
現在、アクチビンA9、10、14、Wnt3a15、CHIR16、Torin2 17およびIDE118、19などの成長因子および小分子化合物は、様々な分化系においてDE分化を誘導するために一般的に使用されている。このSong群は、アクチビンAを使用して幹細胞をDEに分化し、FGF4(線維芽細胞成長因子4)、BMP2(骨形成タンパク質2)、HGF、KGF(ケラチノサイト増殖因子)、OSMおよびDexを肝仕様およびHLCs成熟20に使用した。サリバン群はアクティビンAおよびWnt 3aによってDEを誘導し、β−ME(2-メルカプトエタノール)によってHFCを誘導し、DMSO、インスリン、HGF、OSM21を誘導した。シラーチームは、CHIR99021をDE分化に用い、DMSO、ジヘキサ(肝細胞増殖因子受容体受容体アゴニストN-ヘキサン酸-Tyr)、およびHLC分化に対してDexを用いて、肝機能特性16を有するHLCを得た。しかし、これらの方法の中には、多くの組換え成長因子を使用して高コストのDEを生成し、一部は低分子のみを使用して低効率でDEを生成します。アクチビンAはDE生成の重要な因子です。私たちはアクティビンAを他の小分子に置き換えようとしましたが、通常は低効率を得ます。そこで、DEの誘導因子としてアクチビンAとCHIR99021を添加する方法を採用し、q-PCR、免疫蛍光、ウェスタンブロッティングにより各段階で分化関連遺伝子を検出します。
近年、hESCからの誘導HLC誘導の実験システムの確立は、肝関連疾患の肝細胞開発およびスクリーニング薬のモデル化の重要な基礎である。同時に、肝細胞移植、肝臓組織工学、生体人工肝臓および他の研究のための効果的な細胞源を提供することもできる。幹細胞由来のHLCは、肝毒性薬物誘導応答を予測し、細胞10、22、23、24、25の自然免疫経路およびシグナル伝達経路を研究する薬物スクリーニングモデルとしてウイルス感染に関する様々な研究を行うために使用されてきたと報告されている。一般に、この方法では、hESCを成熟した機能的肝細胞に正常に分化できるhESCからの効率的な肝細胞様細胞分化技術を詳細に導入しています。この結果は、HLC ベースのアプリケーションの開発プラットフォームとなります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(81870432第1、X.L.Z.への81570567)(81571994からP.N.S.)によって支えられました。中国広東省自然科学財団(2020A1515010054からP.N.S.)、李嘉誠大学財団(No.L1111 2008からP.N.S.へ。シャントゥ大学医科大学のスタンリー・リン教授に有益なアドバイスをいただき、ありがとうございました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
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