Summary
В этой рукописи описывается подробный протокол дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) в функциональные гепатоцитоподобные клетки (HLC) путем непрерывного дополнения Activin A и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE).
Abstract
Потенциальные функции гепатоцитоподобных клеток (ГЛК), полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs), имеют большие перспективы для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь приведен эффективный и воспроизводимый метод дифференциации гЭСК на функциональные КВУ. Создание линии эндодермы является ключевым шагом в дифференциации к КВУ. С помощью нашего метода мы регулировали ключевые сигнальные пути, непрерывно дополняя активин А и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE), за которой следует генерация печеночных клеток-прогениторов и, наконец, HLC с типичной морфологией гепатоцитов поэтапным методом с полностью определенными реагентами. Полученные из hESC HLC, полученные этим методом, экспрессируют специфические для стадии маркеры (включая альбумин, ядерный рецептор HNF4α и котранспортный полипептид таурохолата натрия (NTCP)) и демонстрируют особые характеристики, связанные со зрелыми и функциональными гепатоцитами (включая зеленое окрашивание индоцианином, хранение гликогена, окрашивание гематоксилин-эозина и активность CYP3), и могут обеспечить платформу для разработки приложений на основе HLC в изучении заболеваний печени.
Introduction
Печень является высоко метаболическим органом, который играет несколько ролей, включая раскисление, хранение гликогена, а также секрецию и синтез белков1. Различные возбудители, лекарственные препараты и наследственность могут вызывать патологические изменения в печени и влиять на ее функции2,3. Гепатоциты, как основная функциональная единица печени, играют важную роль в искусственных системах поддержки печени и устранении лекарственной токсичности. Однако ресурс первичных гепатоцитов человека ограничен в клеточной терапии, а также в исследованиях заболеваний печени. Поэтому разработка новых источников функциональных гепатоцитов человека является важным направлением исследований в области регенеративной медицины. С 1998 года, когда были установлены4hESCs, hESCs широко рассматривались исследователями из-за их превосходного дифференцировального потенциала (они могут дифференцироваться в различные ткани в подходящей среде) и высокой степени самовозобновляемости, и, таким образом, обеспечивают идеальные исходные клетки для биоискусственной печени, трансплантации гепатоцитов и даже тканевой инженерии печени5.
В настоящее время эффективность дифференцировки печенки может быть значительно увеличена за счет обогащения энтодермы6. При линейной дифференцировке стволовых клеток в эндодерму ключевыми факторами в узле стадии формирования эндодермы являются уровни трансформировки фактора роста β (TGF-β) и сигнальных путей WNT. Активация высокого уровня TGF-β и сигнализации WNT может способствовать развитию эндодермы7,8. Активин А является цитокином, принадлежащим к надсемейству TGF-β. Поэтому Активин А широко используется в индукции эндодермы индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и hESCs9,10. GSK3 представляет собой серин-треонин протеинкиназу. Исследователи обнаружили, что CHIR99021, специфический ингибитор GSK3β, может стимулировать типичные сигналы WNT и может способствовать дифференцировке стволовых клеток при определенных условиях, предполагая, что CHIR99021 имеет потенциал для индуцирования дифференцировки стволовых клеток в эндодерму 11,12,13.
Здесь мы сообщаем об эффективном и воспроизводимом методе эффективного индуцирования дифференциации hESCs в функциональные HLC. Последовательное добавление активина А и CHIR99021 произвело около 89,7±0,8% SOX17 (DE маркер)-положительных клеток. После дальнейшего созревания in vitroэти клетки экспрессировали печеночные специфические маркеры и проявляли гепатоцитарно-подобную морфологию (основанную на окрашивание гематоксилин-эозином (H & E)) и функции, такие как поглощение индоцианинового зеленого (ICG), хранение гликогена и активность CYP3. Результаты показывают, что hESCs могут быть успешно дифференцированы в зрелые функциональные HLC с помощью этого метода и могут обеспечить основу для исследований, связанных с заболеваниями печени, и скрининга лекарств in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поддержание стволовых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол поддержания клеток, описанный ниже, применяется к клеточной линии hES03, поддерживаемой в адгезивном монослое. Для всех следующих протоколов в этой рукописи клетки должны обрабатываться под шкафом биологической безопасности.
- Приготовьте 1x среду для культивирования стволовых клеток mTesR путем разбавления 5x дополнительной среды до основной среды mTesR.
- Приготовьте 30-кратную 30-кратную hESC-квалифицированную среду Matrigel, разбавляя 5 мл матричеля, сертифицированного hESC, 5 мл DMEM/F12 на льду. Хранить при -20 °C.
- Приготовьте 1 среду Matrigel, сертифицированную hESC, путем разбавления 33,3 мкл 30-кратного Матрикеля, сертифицированного hESC, 1 мл DMEM/F12.
- Покрывайте стерильным 6 хорошо, обработанные культурой тканей пластины 1 мл 1x hESC-квалифицированным Матригелем в каждой скважине заранее и храните при 4 °C в течение ночи. Оставить при комнатной температуре (RT) не менее чем на 30 мин перед использованием.
- Разморозьте криоконсервированную гЭСК на водяной бане 37 °C в течение 3 мин без встряхивания. Затем немедленно перенесите клетки путем пипетки в 15 мл центрифужной трубки, содержащей 4 мл предварительно выровненной среды 37 °C mTesR, пипеткой вверх и вниз осторожно 2 раза.
- Центрифугировать гЭСК при 200 х г в течение 2 мин при РТ.
- Аспирировать супернатант и осторожно повторно суспендировать клетки в 1 мл среды mTesR.
- Аспирировать среду DMEM/F12 из пластины и засеять клетки в колодец из 6-скважинной пластины с плотностью 1 х10 5 клеток в 2 мл mTesR.
- Инкубируют в 5% CO2 инкубаторе и поддерживают клетки, заменяя их предварительно нагретой средой mTesR ежедневно. Прохождение клеток примерно при 70-80% слиянии или когда колонии клеток начинают контактировать.
2. Прохождение и дифференцировка стволовых клеток
- Для пассирования клеток аспирируют среду и инкубируют клетки с 1 мл на скважину раствора фермента (например, Аккутазы в течение 5 мин при 37 °C). Затем перенесите ячейки путем пипетки в центрифужную трубку 15 мл, содержащую 4 мл ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ВЫЖОГЕННОГО DMEM/F12 до 37 °C.
- Центрифугировать ячейки при 200 х г при РТ в течение 2 мин.
- Аспирировать среду и осторожно повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл среды mTesR.
- Заранее подготовьте плиты из 24 скважин, покрыв 250 мкл 1-кратной среды Matrigel, сертифицированной hESC. Семенные гЭСК, как описано выше, при плотности 1 - 1,5 х 105 клеток на скважину в 500 мкл среды mTesR.
- Дайте клеткам инкубироваться в течение 24 ч при 37 °C в инкубатореCO2.
3. Формирование DE
- Готовят стоковые растворы 100 мкг/мл Активина А с DPBS, содержащие 0,2% BSA и 3 мМ CHIR99021 с DMSO.
- Подготовьте базовую среду дифференциации стадии I, дополнив среду RPMI 1x B27.
- Добавьте Активин А к конечной концентрации 100 нг/мл и CHIR99021 к конечной концентрации 3 мкМ в соответствующем объеме предварительно нагретой основной среды дифференцировки стадии I.
- Аспиратную среду mTesR из клеток и заменить дифференцировочной средой стадии I, содержащей дополнительные факторы дифференцировки (например, 0,5 мл на скважину 24-скважинной пластины).
- Дайте клеткам инкубироваться в течение 3 дней при 37 °C в инкубаторе CO2, ежедневно заменяя жиму стадии I свеженачисляемыми факторами дифференцировки (дни 0-2).
ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать маркеры DE-клеток, таких как FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 и FOXA1 (минимум 80% SOX17, необходимых для продолжения).
4. Дифференцировка печеночных клеток-прогениторов
- Подготовка основных сред дифференцировки II стадии путем растворения нокаутирующего сывороточного заменителя (KOSR) до конечной концентрации 20% в Knock Out DMEM.
- Готовят дифференцирурую стадии II, содержащую 1% ДМСО, 1x GlutaMAX, 1x раствор незамещающих аминокислот (NEAA), 100 мкМ 2-меркаптоэтанола и 1x пенициллина/стрептомицина (P/S) до соответствующего объема KOSR/нокаутирующего DMEM.
- На 3-й день дифференцировки аспирировать среду и заменить средой II стадии (например, 0,5 мл на скважину 24-скважинной пластины). Затем инкубируют в течение 24 ч.
- На 4-й день дифференцировки аспирировать среду и заменить средой II стадии (например, 1 мл на скважину плиты из 24 скважин).
- Меняйте среду через день (заменяйте среду на 6-й день).
ПРИМЕЧАНИЕ: После 8 дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать соответствующие маркеры печеночных клеток-прогениторов, таких как HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (минимум 80% HNF4α, необходимых для продолжения).
5. Дифференцировка гепатоцитов
- Готовят 10 мкг/мл фактора роста гепатоцитов (HGF), 20 мкг/мл растворов онкостатина (OSM) с DBPS (содержащим 0,2% BSA) и фильтр с фильтрующей мембраной 0,22 мкм.
- Готовят iii стадию дифференцировочной среды (гепатоЗИМ-SFM (HZM) среды, дополненной 10 мкМ гидрокортизон-21-гемисукцината и 1x P/S).
- Добавьте HGF к конечной концентрации 10 нг/мл и OSM к конечной концентрации 20 нг/мл к соответствующему объему предварительно нагретой дифференцированной среды стадии III.
- На 8-й день дифференцировки аспирируют среду II стадии из клеток и заменяют средой III стадии (например, 1 мл на скважину 24-й скважинной пластины).
- Дайте клеткам инкубироваться в течение 10 дней при 37 °C в инкубаторе CO2, изменяя жимы стадии III через день со свежеустановительными факторами дифференцировки (дни 8-18).
ПРИМЕЧАНИЕ: После 18 дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать характерные маркеры гепатоцитов, такие как AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Процент альбумин-положительных клеток обычно составляет более 90%.
6. Выделение РНК, синтез кДНК и анализ RT-qPCR
- Аспирировать среду из клеток и добавить необходимое количество реагента РНКайсо Плюс (например, 0,3 мл на скважину 24-скважинной пластины). Соберите супернатант в пробирку 1,5 мл и останьтесь на RT в течение 5 мин.
- Добавьте 60 мкл хлороформного реагента и оставьте его при РТ в течение 5 мин. Затем центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин.
- Соберите супернатант 125 мкл и перенесите его в другую трубку центрифуги. Добавьте 160 мкл изопропанола, хорошо перемешайте и постойте на RT в течение 10 минут.
- Центрифуга при 12 000 х г в течение 10 мин.
- Удалите супернатант, добавьте 75% этанола в осажденный и центрифугировать при 7 500 х г в течение 5 мин.
- После сушки на RT добавьте 40 мкл воды, обработанной DEPC, для растворения. Для qPCR реверсивная транскрибирование 2 мкг общей РНК с помощью набора обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя.
- Выполняйте RT-qPCR с помощью коммерческого комплекта по протоколу производителя.
- Нормализовать экспрессию генов относительно неиндуцированных стволовых клеток и определить вариацию складок после нормализации до GAPDH.
7. Иммунофлуоресцентная валидация дифференцировки
- Подготовьте 1 буфер для промывки PBST, добавив в PBS 0,1% Tween-20.
- Аспирировать среду из адгезивных клеток и ненадолго промыть PBS в RT на шейкере.
- Аспират PBS и инкубировать клетки с 500 мкл ледяного метанола на скважину 24-скважинной пластины для фиксации клеток при -20 °C в течение ночи.
- Удалите метанол и промывайте клетки 3 раза PBS на шейкере в течение 10 мин каждый раз при RT.
- Блокируют клетки с 500 мкл 5% BSA, приготовленные в PBS в течение 1-2 ч при RT на шейкере.
- Развести первичные антитела в 1:200 в том же растворе, который используется для блокировки.
- Инкубируют фиксированные клетки в растворе первичного антитела 300 мкл в течение ночи при 4 °C на шейкере.
- После ночной инкубации промыть клетки 3 раза ПБСТ в течение 10 мин каждый раз при РТ на шейкере.
- Готовят раствор вторичных антител в блокирующем растворе в 1:1000.
- Инкубировать в 300 мкл раствора вторичного антитела, защищенного от света в течение 1 ч при РТ на шейкере.
- Аспират раствора вторичных антител и промывки клеток 3 раза ПБСТ в течение 10 мин каждый раз при РТ на шейкере.
- Инкубировать клетки с 300 мкл 1 мкг/мл DAPI в течение 3-5 мин, а затем дважды промыть ПБСТ.
- После аспирации PBST добавьте соответствующее количество PBS для съемки под флуоресцентным микроскопом.
8. Анализ вестерн-блот
- Подготовьте 1-кратный буфер промывки TBST, добавив 0,1% Tween-20 в физиологический раствор с трис-буферной буферизацией (TBS).
- Подготовьте буфер электрофореза SDS-PAGE и буфер западной передачи с помощью коммерческого комплекта в соответствии с протоколом производителя.
- Растворяют общий клеточный белок (40 мкг) на 10% полиакриламидном геле додецилсульфата натрия и запускают в буфере электрофореза SDS-PAGE при постоянном токе 15 мА в течение примерно 2 ч.
- Перенесите гель на мембрану поливинилидендифторида (PVDF) при постоянном токе 300 мА в течение 2 ч при низкой температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время работы и время передачи могут варьироваться в зависимости от используемого оборудования, а также типа и процента геля. - Блокируют мембрану с 3% BSA, приготовленным в TBST в течение 1 ч при RT на шейкере.
- Инкубировать в растворе первичных антител (разведение 1:1000) в течение ночи при 4 °C на шейкере.
- После ночной инкубации промыть промокательную мембрану 3 раза ТБСТ в течение 15 мин в раз при РТ на шейкере.
- Инкубировать во вторичном растворе антител (разведение 1:2000) в течение 2 ч при РТ на шейкере.
- Откажитесь от раствора вторичных антител и промыть мембрану 3 раза с TBST, в течение 15 мин каждый раз, в RT на шейкере.
- Визуализируйте иммунореактивные полосы с помощью хемилюминесцентного реагента с последующей ауторадиографией. Используйте β-актин в качестве элемента управления нагрузкой.
9. Поглощение индоцианина зеленым
- Приготовьте 200 мг/мл индоцианина зеленого раствора в ДМСО.
- Готовят рабочий раствор, дополняя среду дифференцировки III стадии зеленым раствором индоцианина до конечной концентрации 1 мг/мл.
- Инкубировать в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 в течение 1-2 ч.
- Аспирировать среду и промыть клетки 3 раза PBS.
- Фотография под микроскопом.
10. Периодическое окрашивание кислотой Шиффа (PAS) и окрашивание гематоксилин-эозин (H&E)
- Аспирировать среду из адгезивных клеток и ненадолго промыть дважды PBS.
- Для фиксации клеток аспирируют PBS и инкубируют клетки ледяным метанолом при -20 °C в течение ночи.
- Визуализируйте хранение гликогена путем окрашивания PAS и наблюдайте за бинуклеированными клетками путем окрашивания H & E с помощью комплекта, следуя инструкциям производителя.
- Снимайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа.
11. Анализ деятельности CYP
- Измерьте активность CYP450 с помощью коммерчески доступных клеточных анализов (P450-Glo Assays) в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте три независимых повтора для тестирования. Данные представляются в виде среднего ± УР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Принципиальная схема индукции ГЛК от гЭСК и репрезентативные изображения яркого поля каждой ступени дифференциации показаны на рисунке 1. На стадии I активин А и CHIR99021 добавляли в течение 3 дней, чтобы индуцировать стволовые клетки к образованию клеток эндодермы. На стадии II клетки эндодермы дифференцировались в печеночные клетки-прогениторы после обработки дифференцировочной средой в течение 5 дней. На стадии III ранние гепатоциты созревали и дифференцировались в HLC через 10 дней в HGF и OSM(рисунок 1A). На заключительном этапе дифференцировки клетки показали типичный фенотип гепатоцитов (Клетки полигональные и распределены равномерно и регулярно)(рисунок 1В).
Для дальнейшего подтверждения печеничной дифференцировки использовали RT-qPCR, иммунофлуоресцентное окрашивание и западное блоттинг для обнаружения маркеров клеток эндодермы, клеток-прогениторов печенки и зрелых гепатоцитов(рисунок 2). Дифференцированные клетки показали высокие уровни экспрессии генов и белков, связанных с дифференцировкой, на каждой стадии, таких как маркеры эндодермы SOX17 (89,7±0,8%) на 3-й день, печеночно-прогениторный маркер HNF4α (81,3±2,9%) на 8-й день, АФП (86,6±0,3%) на 14-й день и зрелый маркер гепатоцитов ALB (94,5±1,1%) на 18-й день. Эти результаты указывают на то, что гепатоцитоподобные клетки генерируются этим протоколом.
Чтобы определить, имеют ли HLC функции гепатоцитов, мы обнаружили поглощение ICG, хранение гликогена и CYP-активность HLC, а также выполнили окрашивание H&E. Как видно, на ГПК наблюдалось зеленое окрашивание(рисунок 3А)и обширное цитоплазматическое периодическое кислотно-шиффовское окрашивание (от розового до фиолетового)(рисунок 3В),что согласуется с хранением гликогена. Кроме того, мы можем видеть репрезентативную морфологию типичного бинуклеированного гепатоцита(рисунок 3С). Наконец, ферментативная активность CYP3A4, наиболее важного метаболического CYP в печени, была подтверждена анализом ферментативной активности(рисунок 3D).
| Наименование реагента | Компания | Номер в каталоге | Концентрация запасов | Конечная концентрация |
| 2-Меркаптоэтанол | Сигма | М7522 | 50 мМ | 100 мкМ |
| 488 меченый козел против мыши IgG | ЗСГБ-БИО | ZF-0512 | - | ИФ: 1:1000 |
| 488 меченый козел против Кролика IgG | ЗСГБ-БИО | ZF-0516 | - | ИФ: 1:1000 |
| Аккутаза | Технологии стволовых клеток | 7920 | 1 х | 1 х |
| Активин А | пепроТех | 120-14Е | 100 мкг/мл | 100 нг/мл |
| Анти-Альбумин (ALB) | Сигма-Олдрич | А6684 | - | ИФ: 1:200; ВБ:1:1000 |
| Анти - Человек Oct4 | Абкам | Аб19587 | - | ЕСЛИ: 1:200 |
| Анти- α-фетопротеин (АФП) | Сигма-Олдрич | А8452 | - | ИФ: 1:200; ВБ:1:1000 |
| Анти -SOX17 | Абкам | аб224637 | - | ЕСЛИ: 1:200 |
| Антигетацитарный ядерный фактор 4 альфа (HNF4α) | Сигма-Олдрич | САБ1412164 | - | ЕСЛИ: 1:200 |
| B-27 Дополнение | Гибко | 17504-044 | 50 х | 1 х |
| БСА | Бейотиме | СТ023-200г | - | 5.00% |
| ЧИР99021 | Сигма-Олдрич | СМЛ1046 | 3 мМ | 3 мкМ |
| ДАПИ | Бейотиме | Ц1006 | - | - |
| DEPC-вода | Бейотиме | Р0021 | - | - |
| ДМ3189 | МКЭ | HY-12071 | 500 мкМ | 250 нМ |
| ДМЕМ/Ф12 | Гибко | 11320-033 | 1 х | 1 х |
| ДМСО | Сигма-Олдрич | Д5879 | 1 х | 1 х |
| ДПБС | Гибко | 14190-144 | 1 х | 1 х |
| ГлутаМАКС | Гибко | 35050-061 | 100 х | 1 х |
| Комплект для окрашивания H&E | Бейотиме | С0105С | - | - |
| Фактор роста гепатоцитов (HGF) | пепроТех | 100-39 | 10 мкг/мл | 10 нг/мл |
| ГепатоЗИМ-СФМ (ХЗМ) | Гибко | 17705-021 | - | - |
| Гидрокортизон-21-гемисукцинат | Сигма-Олдрич | В4881 | 1 мМ | 10 мкМ |
| Индоцианин | Сангон Биотех | А606326 | 200 мг/мл | 1 мг/мл |
| Нокаут DMEM | Гибко | 10829-018 | 1 х | 1 х |
| Нокаутировать SR Многовидовые | Гибко | А31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-квалификация | Корнинг | 354277 | 60 х | 1 х |
| МЕМ НеАА | Гибко | 11140-050 | 100 х | 1 х |
| Дополнение mTesR 5X | Технологии стволовых клеток | 85852 | 5 х | 1 х |
| mTesR Базальная среда | Технологии стволовых клеток | 85851 | 1 х | 1 х |
| Онкостатин (OSM) | пепроТех | 300-10 | 20 мкг/мл | 20 нг/мл |
| P450 - CYP3A4 (Люциферин - PFBE) | Промега | В8901 | - | - |
| Комплект окрашивания PAS | Соларбио | Г1281 | - | - |
| Ручка/Стрептококк | Гибко | 15140-122 | 100 х | 1 х |
| Пероксидаза-конъюгированная коза против мыши IgG | ЗСГБ-БИО | ЗБ-2305 | - | ВБ: 1:2000 |
| Буфер разбавления первичных антител для вестерн-блот | Бейотиме | П0256 | - | - |
| РеверТраАс qPCR RT Комплект | ТОЙОБО | ФСК-101 | - | - |
| РНКайсо Плюс | Такара | 9109 | - | - |
| РПИ 1640 | Гибко | 11875093 | 1 х | 1 х |
| Обезжиренное молоко | Сангон Биотех | А600669 | - | 5.00% |
| SYBR Грин Мастер Микс | Термо Фишер Научный | А25742 | - | - |
| Торин2 | МКЭ | HY-13002 | 15 мкМ | 15 нМ |
| Анимации движения | Сигма-Олдрич | WXBB7485V | - | 0.10% |
Таблица 1: Компоненты клеточной культуры и дифференцировка базовых сред.
| Имя Гена | Сокращения | последовательности праймеров(F) | последовательности праймеров (R) |
| POU Класс 5 Гомеобокс 1 | ОКТ4 | АГКГААККАГ ТАТГЛАГААК |
ТТАКАГААКК ACACTCGGAC |
| Вилочная коробка A2 | ФОКСА2 | ГКАТТКККААТК ТТГАКАГГТГА |
GCCCTTGCAGC КАГААТАКАКАТТ |
| Фактор транскрипции SRY-Box 17 | SOX17 | ТАТТТГТКТГКТГК CACTTGAACAGT |
ТТГГАКАКАТ ТКАААГКТАГТТА |
| Вьющиеся рецепторы класса 8 | ФЖД8 | АТКГГКТАКАА CTACACCTACA |
ГТАКАТГЦ АКАГГААГАА |
| C-X-C Мотив Хемоциновый рецептор 4 | CXCR4 | КАККГКАТКТ ГГАГААККА |
ГКККАТТКТ КГГТГТАГТТ |
| Вилочная коробка A1 | ФОКСА1 | ААГГКАТАГГА ACAGGCACTG |
ТАКАКАКТТГ ГТАГТАЦГКК |
| Мш Гомеобокс 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA ААГАГАКТАК |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Мезогенин 1 | MSGN1 | ГКТГГААТККТА ТТКТТЦТТКТКК |
ТГГАААГКТААКА ТАТТГТАГТККАК |
| Каудальный тип Гомеобокс 1 | CDX1 | ААГГАГТТКАТ ТАКАГЦГГТТАК |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Ровный гомеобокс 1 | ЭВХ1 | ГКТКТКТКТГ ААКААААТГЦТ |
КАТКТКТКТКТ CTCCTCCAAA |
| Мезодерма Задний фактор транскрипции BHLH 2 | МЕСП2 | АГКТГГТГТГ ККТККТТАТТ |
TGCTTCCCTGAA АГАКАТКА |
| NK2 Гомеобокс 5 | НКХ2.5 | КААГТГГКГ ТККТКТТТ |
CAGCTCTTTCTTTT ТТКГГКТКТА |
| ISL LIM Гомеобокс 1 | ISL1 | АГАТТАТАТКАГГТ ТГТАГГГАТКА |
ACACAGCGGA ААКАКТКГАТ |
| Ядерный фактор гепатоцитов 4 альфа | HNF4α | АКАТГГАКАТГ ГКГКГАТАК |
CGTTGAGGTTG ГТГККТТТКТ |
| Альфа-фетопротеин | АФП | АКТГААТККАГ ААКАКТГКА |
TGCAGTCAATG КАТКТТКА |
| T-Box Транскрипционный фактор 3 | ТБХ3 | TTATGTCCCAG ЦГАГГТГА |
ACGTGGTGGTG ГАГАТКТГ |
| Транстиретин | ТТР | АГАААГГКТГ КТГАТГАЦ |
GTGCCTTCCA ГТААГАТТТГ |
| Альбумин | СТИХАРЬ | CCCCAAGTGT КААКТОКА |
ГТТКАГГАККА КГГАТАГ |
| Таурочолат натрия котранспортирует полипептид | НТКП | КАТАГГАГАТТ CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC ААГАГААТГ |
| CCAAT Усилитель связывающий белок Альфа | CEBPA | АГГАГГАТГАА GCCAAGCAGCT |
АГТГГГКГАЦ ТГГААКТГКАГ |
| Член семьи Серпин 1 | ААТ | АААТГААКТКА КЦКАКГАТ |
АККТТАГТГАТГ CCCAGT |
| Азиологликопротеиновый рецептор 1 | АСГР1 | КАГАККТГАГА CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG ГАГТЦТТТТКТ |
| Цитохром P450 Семейство 3 Подсемейство A Член 4 | CYP3A4 | ТТГТААТКАКТГ ТТГГГГТГГГГ |
ААТГГКААААГТ КАКАГТГГА |
Таблица 2: Последовательности праймеров для q-ПЦР-анализа.
Рисунок 1:Принципиальная схема протокола для спецификации DE и CLC. (A)Схематическое представление 3-этапной стратегии дифференциации, используемой в настоящем исследовании. (B)Морфология дифференцированных клеток в дни 0, 3, 8, 14 и 18. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Стадийно-специфическая экспрессия маркера при дифференцировке hESC в HLC. (A)экспрессия мРНК стадий-специфических генов. (B-C) Белковая экспрессия стадий-специфических генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Функции HLC, полученных из hESC. (A)HLC, обработанные в течение 1 ч индоцианином зеленого цвета 1 мг/мл, демонстрируют поглощение, оцениваемое с помощью фазовой микроскопии. (B)Репрезентативные изображения окрашивания PAS, указывающие на хранение гликогена. (C) Репрезентативные изображения окрашивания HE, показывающие клетки бинуклеатов. (D) Базальный уровень активности основных ферментов цитохрома P450. Все значения представлены как среднее ± SD. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем пошаговый метод, который индуцирует HLC из hESCs в три этапа. На первом этапе Activin A и CHIR99021 использовались для дифференциации hESCs в DE. На втором этапе KO-DMEM и DMSO использовали для дифференцировки DE в печеночные клетки-прогениторы. На третьем этапе HZM плюс HGF, OSM и гидрокортизон 21-гемисукцинатная натриевая соль использовались для продолжения дифференцировки печеночных клеток-прогениторов в HLC.
При использовании протокола необходимо учитывать следующие критические шаги. Начальная плотность дифференцировки клеток и точное время изменения среды являются важными факторами для успешной дифференцировки. Когда мы начинаем дифференцироваться, мы должны убедиться, что начальная плотность посева соответствующая, при слиянии около 30-40%, когда клетки только начинают соприкасаться друг с другом, и что межклеточные пространства равномерно расположены в сети под полем зрения. Во время дифференцировки соответствующая среда дифференцировки должна быть изменена точно в указанное время, особенно на первом этапе и в ключевой момент каждой замещающей стадии, чтобы клетки дифференцируются в режиме и стадии, имитирующей процесс эмбрионального развития.
Особенно важен первый этап дифференциации гЭСК в ДЭ. Обычно существует большое количество клеток, которые отсоеживаются и всплывают во время I стадии дифференцировки, которая является критической стадией для судьбы клеток, но в это время клетки все еще сохраняют способность к пролиферации. Поэтому слияние клеток может достигать около 90-100% в конце I стадии. Кроме того, следует отметить, что в начале III стадии дифференцировки (т.е. 8-го дня) цитоплазма клеток начинает конденсироваться, в результате чего клетки постепенно приобретают тонкаю морфологию. Однако на 10 день цитоплазма постепенно восстанавливается, а на 14 день клетки начинают проявлять явную многогранную морфологию гепатоцитов.
В этом исследовании полученные ГЛК на самом деле ближе к фетальным гепатоцитам, поскольку АФП выше экспрессированного, чем АЛБ на 18-й день. Хотя генерируемые ГЛК проявляют характеристики и функции гепатоцитов, все еще существует разрыв между ГЛК и первичными гепатоцитами человека, что указывает на то, что наши дифференцированные клетки все еще не являются функционально зрелыми. Поэтому будущая работа должна быть сосредоточена на дальнейшей оптимизации метода дифференциации.
В настоящее время факторы роста и малые молекулярные соединения, такие как активин А9,10,14,Wnt3a15,CHIR16,Torin217 и IDE118,19, обычно используются для индуцирования дифференцировки DE в различных системах дифференцировки. Группа Сонг использовала активин А для дифференцировки стволовых клеток в DE, а также использовала FGF4 (фактор роста фибробластов 4), BMP2 (костный морфогенетический белок 2), HGF, KGF (фактор роста кератиноцитов), OSM и Dex для печеночной спецификации и созревания HLC20. Группа Салливана индуцировала DE активином A и Wnt 3a, а индуцировала GLC β-ME (2-меркаптоэтанол), DMSO, инсулин, HGF, OSM21. Команда Силлера использовала CHIR99021 для дифференцировки DE, DMSO, Dihexa (агонист рецептора фактора роста гепатоцитов N-гексанового-Tyr) и Dex для дифференцировки HLC для получения HLC с характеристиками функции печени16. Однако некоторые из этих методов используют множество рекомбинантных факторов роста для генерации DE с высокой стоимостью, а некоторые из них используют только небольшие молекулы для генерации DE с более низкой эффективностью. Активин А является критическим фактором для генерации DE. Мы пытались заменить Активин А другими небольшими молекулами, но обычно получаем более низкую эффективность. Поэтому мы принимаем метод добавления Activin A и CHIR99021 в качестве индуцирующие факторы DE и обнаруживаем гены, связанные с дифференцировкой, на каждой стадии с помощью q-PCR, иммунофлуоресценции и западного блоттинга.
В последние годы создание экспериментальной системы направленной индукции ГЛК из гЭСК является важной основой для моделирования развития гепатоцитов и скрининга препаратов для заболеваний, связанных с печенью. В то же время он также может обеспечить эффективный источник клеток для трансплантации гепатоцитов, тканевой инженерии печени, биоискусственной печени и других исследований. Сообщалось, что ГЛК, полученные из стволовых клеток, использовались для проведения различных исследований вирусной инфекции в качестве модели скрининга лекарств для прогнозирования гепатотоксических реакций, вызванных лекарственными средствами, и для изучения врожденного иммунного пути и сигнальных путей клеток10,22,23,24,25. Как правило, этот метод подробно вводит эффективный метод дифференцировки гепатоцитоподобных клеток из hESCs, который может успешно дифференцировать hESCs в зрелые функциональные гепатоциты. Полученные результаты обеспечивают платформу для разработки приложений на основе HLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81870432 и 81570567 X.L.Z.), (No 81571994 P.N.S.); Фонд естественных наук провинции Гуандун, Китай (No 2020A1515010054 для P.N.S.), Фонд Университета Ли Ка Шин Шаньтоу (No. L1111 2008 в P.N.S.). Мы хотели бы поблагодарить профессора Стэнли Лина из Медицинского колледжа Университета Шаньтоу за полезные советы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
