Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) till funktionella hepatocytliknande celler (HLCs) genom att kontinuerligt komplettera Activin A och CHIR99021 under hESC-differentiering till slutgiltig endokderm (DE).
Abstract
De potentiella funktionerna hos hepatocytliknande celler (HLC) som härrör från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) håller stora löften om sjukdomsmodellering och läkemedelsscreeningsapplikationer. Här tillhandahålls en effektiv och reproducerbar metod för differentiering av hESC:er till funktionella HLC:er. Upprättandet av en endoderm-härstamning är ett viktigt steg i differentieringen till HLCs. Med vår metod reglerar vi de viktigaste signalvägarna genom att kontinuerligt komplettera Activin A och CHIR99021 under hESC differentiering till slutgiltig endokderm (DE), följt av generering av lever stamceller, och slutligen HLCs med typiska hepatocyt morfologi i ett stegvis metod med helt definierade reagenser. HESC-härledda HLC som produceras med denna metod uttrycker scenspecifika markörer (inklusive albumin, HNF4α nukleär receptor och natriumtaurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), och visa särskilda egenskaper relaterade till mogna och funktionella hepatocyter (inklusive indocyanin grön färgning, glykogen lagring, hematoxylin-eosin färgning och CYP3 verksamhet), och kan ge en plattform för utveckling av HLC-baserade tillämpningar i studien av leversjukdomar.
Introduction
Levern är ett mycket metaboliskt organ som spelar flera roller, inklusive deoxidation, lagring av glykogen och utsöndring och syntes avproteiner 1. Olika patogener, droger och äreditet kan orsaka patologiska förändringar i levern och påverka dess funktioner2,3. Hepatocyter, som leverns huvudsakliga funktionella enhet, spelar en viktig roll i artificiella leverstödsystem och läkemedelstoxicitet eliminering. Resursen för primära mänskliga hepatocyter är dock begränsad i cellbaserad terapi, liksom i leversjukdomsforskning. Därför är utveckling av nya källor till funktionella mänskliga hepatocyter en viktig forskningsriktning inom regenerativ medicin. Sedan 1998 när hESCs har etablerats4, hESCs har allmänt övervägts av forskare på grund av deras överlägsna differentiering potential (de kan differentiera i olika vävnader i en lämplig miljö) och hög grad av självförnyelse, och därmed ge idealiska källceller för bioartificial lever, hepatocyt transplantation och även levervävnadsteknik5.
För närvarande kan leverdifferenseffektiviteten ökas kraftigt genom att berika endodermen6. I härstamning differentiering av stamceller till endoderm, nivåer av den transformerande tillväxtfaktorn β (TGF-β) signalering och WNT signalering vägar är de viktigaste faktorerna i noden i endoderm bildandet steg. Aktivering av en hög nivå av TGF-β och WNT signalering kan främja utvecklingen av endoderm7,8. Activin A är en cytokin som tillhör TGF-β superfamilj. Därför används Activin A ofta vid induktion av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och hESCs9,10. GSK3 är ett serin-treoninproteinkinas. Forskare har funnit att CHIR99021, en specifik hämmare av GSK3β, kan stimulera typiska WNT-signaler och kan främja stamcellsdifferimering under vissa förhållanden, vilket tyder på att CHIR99021 har potential att inducera stamcells differentiering till endoderm 11,12,13.
Här rapporterar vi en effektiv och reproducerbar metod för att effektivt inducera differentiering av hESCs till funktionella HLCs. Den sekventiella tillsatsen av Activin A och CHIR99021 producerade cirka 89,7±0,8% SOX17 (DE-markör)-positiva celler. Efter att ha mognat in vitrouttryckte dessa celler leverspecifika markörer och utövade hepatocytliknande morfologi (baserat på hematoxylin-eosinfärgning (H & E)) och funktioner, såsom upptag av indocyaningrön (ICG), glykogenlagring och CYP3-aktivitet. Resultaten visar att hESCs framgångsrikt kan differentieras till mogna funktionella HLCs med denna metod och kan ge en grund för leversjukdomsrelaterad forskning och in vitro-läkemedelsscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av stamceller
OBS: Cellunderhållsprotokollet som beskrivs nedan gäller för hES03-cellinjen som upprätthålls i ett vidhäftande monoskikt. För alla följande protokoll i detta manuskript bör celler hanteras under ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Förbered 1x mTesR stamcellskulturmedium genom att späda ut 5x extra medium till mTesR basmedium.
- Förbered 30x hESC-kvalificerat Matrigel-medium genom att späda ut 5 ml hESC-kvalificerad Matrigel med 5 ml DMEM/F12 på isen. Förvara vid -20 °C.
- Förbered 1x hESC-kvalificerat Matrigelmedium genom att späda ut 33,3 μL 30x hESC-kvalificerad Matrigel med 1 ml DMEM/F12.
- Täck sterila 6 brunn, vävnad kulturbehandlade plattor med 1 ml 1x hESC-kvalificerad Matrigel i varje god tid och lagra vid 4 °C över natten. Låt rummet vara i rumstemperatur (RT) i minst 30 minuter före användning.
- Tina cryopreserved hESCs i ett 37 °C vattenbad i 3 min utan att skaka. Överför sedan omedelbart cellerna genom att pipettera till ett 15 ml centrifugeringsrör som innehåller 4 ml förvärmt 37 °C mTesR medium, rör upp och ner försiktigt 2 gånger.
- Centrifugera hESCs vid 200 x g i 2 min på RT.
- Aspirera supernatanten och återanvänd försiktigt cellerna i 1 ml mTesR-medium.
- Aspirera DMEM/F12-mediet från plattan och så cellerna till en brunn med 6-brunnsplatta med en densitet av 1 x 105 celler i 2 ml mTesR.
- Inkubera i en 5% CO2 inkubator och behåll cellerna genom att ersätta med förvärmda mTesR medium dagligen. Passage cellerna vid ungefär 70-80% sammanflöde eller när cellkolonierna börjar få kontakt.
2. Stamcellspassage och differentiering
- För att passa celler, aspirera mediet och inkubera cellerna med 1 ml per enzymlösningsbrunn (t.ex. Accutas i 5 min vid 37 °C. Överför sedan cellerna genom att pipetting till ett 15 mL centrifugeringsrör som innehåller 4 ml DMEM/F12 förvärmt till 37 °C.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g vid RT i 2 min.
- Aspirera mediet och återanvänd försiktigt cellpelleten i 1 ml mTesR-medium.
- Förbered 24-brunnsplattor genom beläggning med 250 μL 1x hESC-kvalificerat Matrigel-medium i förväg. Frö hESCs enligt beskrivningen ovan med en densitet av 1- 1,5 x 105 celler per brunn i 500 μL mTesR medium.
- Låt cellerna inkubera i 24 timmar vid 37 °C i en CO2-inkubator.
3. DE-formation
- Förbered lagerlösningar på 100 μg/ml Activin A med DPBS som innehåller 0,2% BSA och 3 mM CHIR99021 med DMSO.
- Förbered steg I differentiering grundläggande medium genom att komplettera RPMI medium med 1x B27.
- Tillsätt Activin A till en slutlig koncentration på 100 ng/ml och CHIR99021 till en slutlig koncentration på 3 μM i en lämplig volym förvärmt basmedium i steg I.
- Aspirate mTesR medium från cellerna och ersätt med steg I differentieringsmedier som innehåller tillsatta differentieringsfaktorer (t.ex. 0,5 ml per brunn på en 24-brunnsplatta).
- Låt cellerna inkubera i 3 dagar vid 37 °C i en CO2-inkubator och ersätt steg I-media dagligen med nytillsatta differentieringsfaktorer (dag 0-2).
OBS: Efter 3 dagars differentiering bör differentierade celler uttrycka markörer för DE-celler, såsom FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 och FOXA1 (minst 80% av SOX17 behövs för att fortsätta).
4. Differentiering av lever stamceller
- Förbered steg II differentiering grundläggande medier genom att lösa knockout serum ersättning (KOSR) till en slutlig koncentration på 20% i Knock Out DMEM.
- Förbered steg II-differentieringsmedium som innehåller 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x icke-essentiell aminosyralösning (NEAA), 100 μM 2-merkaptoethanol och 1x penicillin/streptomycin (P/S) till lämplig volym KOSR/knockout DMEM.
- På dag 3 av differentiering, aspirera mediet och ersätt med steg II-medium (t.ex. 0,5 ml per brunn på en 24 brunnsplatta). Inkubera sedan i 24 h.
- På dag 4 av differentiering, aspirera mediet och ersätt med steg II-medium (t.ex. 1 ml per brunn på en 24 brunnsplatta).
- Byt medium varannan dag (byt ut medium på dag 6).
OBS: Efter 8 dagars differentiering bör differentierade celler uttrycka lämpliga markörer för leverprogenitorceller, såsom HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minst 80% av HNF4α behövs för att fortsätta).
5. Differentiering av hepatocyter
- Förbered 10 μg/ml hepatocyttillväxtfaktor (HGF), 20 μg/ml Oncostatin (OSM) stamlösningar med DBPS (innehållande 0,2% BSA) och filtrera med ett filtermembran på 0,22 μm.
- Förbered steg III differentiering grundläggande medium (HepatoZYME-SFM (HZM) medium kompletterat med 10 μM hydrokortison-21-hemisuccinate och 1x P/S).
- Tillsätt HGF till en slutlig koncentration på 10 ng/ml och OSM till en slutlig koncentration på 20 ng/ml till lämplig volym förvärmt fas III-differentieringsmedium.
- På dag 8 av differentiering, aspirera steg II medium från celler och ersätta med steg III medium (t.ex. 1 ml per brunn av en 24 brunnsplatta).
- Låt cellerna inkubera i 10 dagar vid 37 °C i en CO2-inkubator och ändra steg III-media varannan dag med nytillsatta differentieringsfaktorer (dag 8-18).
OBS: Efter 18 dagars differentiering bör differentierade celler uttrycka karakteristiska markörer för hepatocyter, såsom AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Andelen Albumin-positiva celler är vanligtvis mer än 90%.
6. RNA-isolering, cDNA-syntes och RT-qPCR-analys
- Aspirera medium från celler och tillsätt rätt mängd RNAiso Plus-reagens (t.ex. 0,3 ml per brunn på en 24-brunnsplatta). Samla supernaten i ett 1,5 ml-rör och låt stå på RT i 5 minuter.
- Tillsätt 60 μL kloroformreagens och lämna det på RT i 5 minuter. Centrifugera sedan vid 12 000 x g i 15 min.
- Samla upp supernaten 125 μL och överför den till ett annat centrifugeringsrör. Tillsätt 160 μL isopropanol, blanda väl och stå vid RT i 10 min.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 10 min.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 75% etanol till den fällda och centrifug vid 7 500 x g i 5 min.
- Efter torkning vid RT, tillsätt 40 μL DEPC-behandlat vatten för att lösa upp. För qPCR, omvänd transkribering 2 μg totalt RNA med ett omvänd transkriptionskit enligt tillverkarens protokoll.
- Utför RT-qPCR med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll.
- Normalisera genuttrycket i förhållande till icke-inducerade stamceller och bestäm vikvariation efter normalisering till GAPDH.
7. Immunofluorescens validering av differentiering
- Förbered 1x PBST tvättbuffert genom att lägga till 0,1% interpolering-20 till PBS.
- Aspirera medium från vidhäftande celler och tvätta kort med PBS på RT på en shaker.
- Aspirera PBS och inkubera celler med 500 μL iskallt metanol per brunn på en 24-brunnsplatta för att fixera cellerna vid -20 °C över natten.
- Ta bort metanolen och tvätta cellerna 3 gånger med PBS på en skakapparat i 10 minuter varje gång på RT.
- Blockera celler med 500 μL 5% BSA beredda i PBS i 1-2 h vid RT på en skakapparat.
- Späd primär antikropp vid 1: 200 i samma lösning som används för blockering.
- Inkubera de fasta cellerna i 300 μL primär antikroppslösning över natten vid 4 °C på en skakapparat.
- Efter inkubation över natten, tvätta cellerna 3 gånger med PBST i 10 min varje gång på RT på en shaker.
- Förbered sekundär antikroppslösning vid blockering av lösning kl. 13.1000.
- Inkubera i 300 μL sekundär antikroppslösning skyddad mot ljus i 1 timme vid RT på en skakapparat.
- Aspirera sekundär antikroppslösning och tvätta celler 3 gånger med PBST i 10 min varje gång på RT på en shaker.
- Inkubera celler med 300 μL 1 μg/ml DAPI i 3-5 min och tvätta sedan två gånger med PBST.
- Efter att ha aspirerande PBST, lägg till en lämplig mängd PBS för att ta bilder under ett fluorescensmikroskop.
8. Västerländsk fläckanalys
- Förbered 1x TBST tvättbuffert genom att lägga till 0,1% interpolering-20 till Tris-buffrad saltlösning (TBS).
- Förbered SDS-PAGE elektroforesbuffert och western transferbuffert med hjälp av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll.
- Lös totalt cellprotein (40 μg) på en 10% natriumdidcylsulfatpolyakrylamidgel och kör i SDS-PAGE elektroforesbuffert vid 15 mA konstant ström i ca 2 h.
- Överför gelén till ett polyvinylidendfluoridmembran (PVDF) vid 300 mA konstant ström i 2 timmar vid låg temperatur.
OBS: Körtiden och överföringstiden kan variera beroende på vilken utrustning som används och gelens typ och procentandel. - Blockera membranet med 3% BSA beredd i TBST i 1 timme vid RT på en skakapparat.
- Inkubera i primär antikroppslösning (1:1000 utspädning) över natten vid 4 °C på en skakapparat.
- Efter inkubation över natten, tvätta blottingmembranet 3 gånger med TBST i 15 min per gång vid RT på en skakapparat.
- Inkubera i sekundär antikroppslösning (1:2000 utspädning) i 2 h vid RT på en skakapparat.
- Kassera sekundär antikroppslösning och tvätta membranet 3 gånger med TBST, i 15 minuter varje gång, vid RT på en skakapparat.
- Visualisera immunoreaktiva band med hjälp av en chemiluminescence reagens följt av autoradiography. Använd β-aktin som laddningskontroll.
9. Indocyanin grönt upptag
- Förbered 200 mg/ml indocyaningrön stamlösning i DMSO.
- Bered en arbetslösning genom att komplettera steg III differentieringsmedium med indocyaningrön lösning till en slutlig koncentration på 1 mg/ml.
- Inkubera i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 1-2 h.
- Aspirera medium och tvätta cellerna 3 gånger med PBS.
- Fotografera under ett mikroskop.
10. Periodisk syra-Schiff (PAS) färgning och Hematoxylin-Eosin (H&E) färgning
- Aspirera medium från vidhäftande celler och tvätta kort två gånger med PBS.
- För cellfixering, aspirera PBS och inkubera celler med iskall metanol vid -20 °C över natten.
- Visualisera glykogenlagring genom PAS-färgning och observera binucleated celler genom H & E färgning med hjälp av ett kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Ta bilder med ett fluorescensmikroskop.
11. Analys för CYP-aktivitet
- Mät CYP450-aktivitet med hjälp av kommersiellt tillgängliga cellbaserade analyser (P450-Glo-analyser) enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd tre oberoende repetitioner för testning. Uppgifterna är representerade som det ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det schematiska diagrammet över HLC-induktion från hESCs och representativa ljusfältsbilder av varje differentieringssteg visas i figur 1. I steg I tillsattes Activin A och CHIR99021 i 3 dagar för att inducera stamceller att bilda endodermceller. I steg II differentierade endodermcellerna till lever stamceller efter att ha behandlats med differentiering medium i 5 dagar. I steg III hade tidiga hepatocyter mognat och differentierats till CHLC efter 10 dagar i HGF och OSM(figur 1A). I det sista skedet av differentiering visade cellerna en typisk hepatocytfenotyp (Cellerna är polygon och fördelas jämnt och regelbundet) (Figur 1B).
För att ytterligare bekräfta lever differentiering, RT-qPCR, immunofluorescens färgning och västra blotting användes för att upptäcka markörer av endoderm celler, lever stamceller och mogna hepatocyter(figur 2). De differentierade cellerna visade höga uttrycksnivåer av differentieringsrelaterade gener och proteiner i varje steg, såsom endodermmarkörer SOX17 (89,7± 0,8%) vid dag 3, Leverprogenitor markör HNF4α (81,3±2,9%) vid dag 8, AFP (86,6±0,3%) vid dag 14 och mogen hepatocyt markör ALB (94,5±1,1%) vid dag 18. Dessa resultat tyder på att hepatocyt-liknande celler genereras av detta protokoll.
För att upptäcka om HLCs har hepatocyt funktioner, upptäckte vi ICG upptag, glykogen lagring och CYP verksamhet av HLCs, samt utförd H&E färgning. Som man kan se uppvisade BFC grön färgning (Figur 3A) och omfattande cytoplasma periodisk periodisk syra-Schiff färgning (rosa till lila) observerades (Figur 3B), vilket överensstämmer med glykogen lagring. Dessutom kan vi se den representativa morfologin hos en typisk binucleated hepatocyt (Figur 3C). Slutligen bekräftades cyp3a4:s enzymatiska aktivitet, den viktigaste metaboliska CYP i levern, genom enzymatisk aktivitetsanalys (figur 3D).
| Reagensnamn | Företag | Katalognummer | Koncentration av lager | Slutlig koncentration |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 (M7522) | 50 mM | 100 μM |
| 488 märkt get mot mus IgG | ZSGB-BIO (olika) | ZF-0512 | - | OM: 1:1000 |
| 488 märkt get mot Rabbit IgG | ZSGB-BIO (olika) | ZF-0516 | - | OM: 1:1000 |
| Accutase (på))accutase | Stamcellsteknik | 7920 | 1 x | 1 x |
| Activin A | peproTech (peproTech) | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich (på sin 1997)1999 | A6684 (på 6684) | - | OM: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Mänsklig Okt4 | Abcam (abcam) | Ab19587 | - | OM: 1:200 |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich (på sin 1997)1999 | A8452 (på 8452) | - | OM: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti -SOX17 | Abcam (abcam) | ab224637 | - | OM: 1:200 |
| Anti-Hepatocyte kärnämne 4 alfa (HNF4α) | Sigma-Aldrich (på sin 1997)1999 | SAB1412164 | - | OM: 1:200 |
| B-27 Tillägg | Gibco (gibco) | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime (på andra) | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich (på sin 1997)1999 | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI (dapi) | Beyotime (på andra) | C1006 (på 1006) | - | - |
| DEPC-vatten | Beyotime (på andra) | R0021 (på 20021) | - | - |
| DM3189 | MCE (olika) | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco (gibco) | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma-Aldrich (på sin 1997)1999 | D5879 (på 5879) | 1 x | 1 x |
| DPBS (DPBS) | Gibco (gibco) | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX (glutamax) | Gibco (gibco) | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| H&E färgningssats | Beyotime (på andra) | C0105S (på 0105) | - | - |
| Hepatocyt tillväxtfaktor (HGF) | peproTech (peproTech) | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco (gibco) | 17705-021 | - | - |
| Hydrokortison-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich (på sin 1997)1999 | H4881 (på 4881) | 1 mM | 10 μM |
| Indocyanin | Sangon Bioteknik | A606326 (på 606326) | 200 mg/ml | 1 mg/ml |
| Slå ut DMEM | Gibco (gibco) | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Slå ut SR Multi-Species | Gibco (gibco) | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-kvalificerad | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco (gibco) | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| mTesR 5X Tillägg | Stamcellsteknik | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR basalt medium | Stamcellsteknik | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatin (OSM) | peproTech (peproTech) | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega (olika betydelser) | V8901 | - | - |
| PAS färgningssats | Solarbio (solenergi) | G1281 (på 1281) | - | - |
| Penna/Strep | Gibco (gibco) | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| Peroxidaskonjugerad get antimus IgG | ZSGB-BIO (olika) | ZB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| Primär antikroppsutspädningsbuffert för western blot | Beyotime (på andra) | P0256 (på 256) | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO (PÅ VÄG) | FSQ-101 | - | - |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco (gibco) | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Skummjölk | Sangon Bioteknik | A600669 (på andra) | - | 5.00% |
| SYBR Grön Master Mix | Thermo Fisher Vetenskapliga | A25742 (på 25742) | - | - |
| Torin2 (på andra) | MCE (olika) | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Interpoleringen | Sigma-Aldrich (på sin 1997)1999 | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tabell 1: Komponenter i cellkultur och differentieringsbasmedier.
| Genens namn | Förkortningar | primers sekvenser(F) | primers sekvenser (R) |
| POU Klass 5 Homeobox 1 | OKT4 (ULT4) | AGCGAACCAG (på väg) TATCGAGAAC (TATCGAGAAC) |
TTACAGAACC (OLIKA) ACACTCGGAC (acactcggac) |
| Gaffelbox A2 | FOXA2 (RÄVA2) | GCATTCCCAATC (på alla) TTGACACGGTGA (PÅ ANDRA) |
GCCCTTGCAGC (GC) CAGAATACACATT (på andra betydelser) |
| Transkriptionsfaktor för SRY-Box 17 | SOX17 (på 17) | TATTTTGTCTGC (TATTTTGTCTGC) CACTTGAACAGT (KAKTGAACAGT) |
TTGGGACACAT (PÅ ANDRA) TCAAAGCTAGTTA (OLIKA) |
| Frizzled klassreceptor 8 | FZD8 (FZD8) | ATCGGCTACAA (ATCGGCTACAA) CTACACCTACA (på andra) |
GTACATGCTGC (GTACATGCTGC) ACAGGAAGAA (OLIKA) |
| C-X-C-motiv Chemokine receptor 4 | CXCR4 (CXCR4) | CACCGCATCT (caccgcatct) GGAGAACCA (olika) |
GCCCATTTCCT (på alla betydelser) CGGTGTAGTT (på 80000) |
| Gaffelbox A1 | FOXA1 (PÅ 855) | AAGGCATACGA (på alla) ACAGGCACTG (ACAGGCACTG) |
TACACACCTTG (TACACACCTTG) GTAGTACGCC (2019) |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 (på)msx1 | CGCCAAGGCA (CGCCAAGGCA) AAGAGACTAC (olika) |
GCCATCTTCAG (CCATCTTCAG) CTTCTCCAG (cttctccag) |
| Mesogenin 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA (på alla) TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAGCTAACA (på väg) TATTGTAGTCCAC (TATTGTAGTCCAC) |
| Caudal Typ Homeobox 1 | CDX1 (cdx1) | AAGGAGTTTCAT (PÅ ANDRA BETYDELSER) TACAGCCGTTAC (olika) |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG (TGTTCACTTTG) |
| Hemkorg med jämna hopp 1 | EVX1 (evx1) | GCTGTCTCTCTG AACAAAATGCT (på väg) |
CATCTCTCACTCT (KATACTCT) CTCCTCCAAA (ctcctccaaa) |
| Mesoderm Bakre BHLH Transkription Faktor 2 | PARLAMENTSLEDAMOT2 | AGCTTGGGTG (på väg) CCTCCTTATT (CCTCCTTATT) |
TGCTTCCCTGAA (TGCTTCCCTGAA) AGACATCA (på andra) |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2,5 | CAAGTGTGCG (caagtggcg) TCTGCCTTT (TCTGCCTTT) |
CAGCTCTTTCTT (cagctctttctt) TTCGGCTA (eu 1994) |
| ISL LIM Homeobox 1 | ISL1 (isl1) | AGATTATATCAGGT (PÅ 9500)000 TGTACGGGATCA (TGTACGGGATCA) |
ACACAGCGGA (på väg) AACACTCGAT (AACACTCGAT) |
| Hepatocyt nukleär faktor 4 Alfa | HNF4α (engelska) | ACATGGACATG (på alla) GCCGACTAC (CCGACTAC) |
CGTTGAGGTTG (CGTTGAGGTTG) GTGCCTTCT (GTGCCT) |
| Alfa fetoprotein | AFP | ACTGAATCCAG (PÅ 1999) AACACTGCA (AACACTGCA) |
TGCAGTCAATG (TGCAGTCAATG) CATCTTTCA (CATCTTTCA) |
| T-Box Transkriptionsfaktor 3 | TBX3 (TBX3) | TTATGTCCCAG (på andra) CGAGGGTGA (på 5000) |
ACGTGGTGGTG (på alla) GAGATCTTG (på alla) |
| Transthyretin (transthyretin) | TTR | AGAAAGGCTG (AGAAAGGCTG) CTGATGAC (CTGATGAC) |
GTGCCTTCCA (GTGCCTTCCA) GTAAGATTTG (GTAAGATTTG) |
| Albumin | ALB | CCCCAAGTGT (ccccaagtgt) CAACTCCA (CAACTCCA) |
GTTCAGGACCA (GTTCAGGACCA) CGGATAG (på andra) |
| Natriumtaurocholat cotransporting polypeptid | NTCP (ncp) | CATAGGGATCGT (på alla betydelser) CCTCAAATCCA (CCTCAAATCCA) |
GCCACACTGCAC (CCACACTGCAC) AAGAGAATG (olika) |
| CCAAT förstärkare bindande protein alfa | CEBPA (på andra) | AGGAGGATGAA (på alla betydelser) GCCAAGCAGCT (på väg) |
AGTGCGCGATC (PÅ VÄG) TGGAACTGCAG (TGGAACTGCAG) |
| Serpin Familj En medlem 1 | AAT (på alla) | AAATGAACTCA (PÅ ANDRA) CCCACGAT (CCCACGAT) |
ACCTTAGTGATG (PÅ) CCCAGT (cccagt) |
| Asialoglykoprotein Receptor 1 | ASGR1 (PÅ 1) | CAGACCCTGAGA (cagaccctga) CCCTGAGCAA (CCCTGAGCAA) |
TCCTGCAGCTGG (TCCTGCAGCTGG) GAGTCTTTTCT (MUNKAVLE) |
| Cytokrom P450 Familj 3 Underfamilj A Medlem 4 | CYP3A4 (cyp3a4) | TTGTAATCACTG (PÅ) TTGGCGTGGG (på alla) |
AATGGGCAAAGT (på andra) CACAGTGGA (på andra) |
Tabell 2: Primersekvenser för q-PCR-analys.
Figur 1: Schematiskt protokolldiagram för specifikationen av DE- och HLC:er. A)Schematisk presentation av den trestegsstrategi för differentiering som används i denna studie. (B) Morfologi hos de differentierade cellerna vid dagarna 0, 3, 8, 14 och 18. Skalbar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Scenspecifikt marköruttryck under hESC-differentiering i HLCs. (A) mRNA-uttryck av scenspecifika gener. (B-C) Proteinuttryck av scenspecifika gener. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Funktioner hos hESC- härledda HLC. (A) CHLC som behandlats i 1 timme med 1 mg/ml indocyaningrönt visar upptag enligt bedömning genom fasmikroskopi. B)Representativa PAS-färgningsbilder som anger glykogenlagring. C)Representativa HE-färgbilder som visar binukleatceller. (D) Basal nivå aktivitet av stora cytokroma P450 enzymer. Alla värden presenteras som medelvärde ± SD. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en stegvis metod som inducerar HLCs från hESCs i tre steg. I det första steget användes Activin A och CHIR99021 för att differentiera hESC till DE. I den andra etappen användes KO-DMEM och DMSO för att differentiera DE till lever stamceller. I den tredje etappen användes HZM plus HGF, OSM och hydrocortisone 21-hemisuccinate natrium salt för att fortsätta att differentiera lever stamceller i HLCs.
Följande kritiska steg måste beaktas när protokollet används. Cellernas initiala differentieringstäthet och den exakta tidpunkten för medelstora förändringar är viktiga faktorer för framgångsrik differentiering. När vi börjar differentiera måste vi se till att den ursprungliga såddtätheten är lämplig, med ett sammanflöde på cirka 30-40 procent, när celler precis har börjat komma i kontakt med varandra och att de intercellulära utrymmena är jämnt ordnade i ett nätverk under synfältet. Under differentiering måste motsvarande differentieringsmedium ändras exakt vid den angivna tidpunkten, särskilt i det första steget och det viktigaste ögonblicket i varje ersättningssteg, för att säkerställa att cellerna skiljer sig åt i läget och stadiet som imiterar processen för embryonal utveckling.
Det första steget i differentiering av hESC till DE är särskilt viktigt. Det finns vanligtvis ett stort antal celler som lossar och flyter upp under steg I av differentiering, vilket är ett kritiskt steg för cellens öde, men vid denna tidpunkt behåller cellerna fortfarande förmågan att föröka sig. Därför kan sammanflödet av celler nå ca 90-100% i slutet av steg I. Dessutom bör det noteras att i början av steg III av differentiering (dvs. dag 8) börjar cellernas cytoplasma kondensera, vilket resulterar i att cellerna gradvis förvärvar en smal morfologi. Men på dag 10 återhämtar sig cytoplasman gradvis, och på dag 14 börjar cellerna visa hepatocyternas uppenbara polyhedralmorfologi.
I denna studie är de erhållna HLCs faktiskt närmare fetala hepatocyter eftersom AFP är högre uttryckt än ALB vid dag 18. Även om de genererade HLCs utövar hepatocyte egenskaper och funktioner, det finns fortfarande en klyfta mellan HLCs och primära mänskliga hepatocyter, vilket indikerar att våra differentierade celler fortfarande inte är funktionellt mogna. Därför måste det framtida arbetet fokusera på att ytterligare optimera differentieringsmetoden.
För närvarande används tillväxtfaktorer och små molekylära föreningar som Activin A9,10,14, Wnt3a15, CHIR16, Torin217 och IDE118,19 ofta för att inducera DE-differentiering i olika differentieringssystem. Songgruppen använde Activin A för att differentiera stamceller i DE och använde FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), BMP2(Bone morphogenetic protein 2), HGF, KGF (Keratinocyte growth factor), OSM och Dex för leverspecifikation och HLCs mognad20. Sullivangruppen framkallade DE av Activin A och Wnt 3a och inducerade HLCs av β-ME (2-mercaptoethanol), DMSO, Insulin, HGF, OSM21. Siller-teamet använde CHIR99021 för DE-differentiering, DMSO, Dihexa (Hepatocyte tillväxtfaktorreceptor agonist N-hexanoic-Tyr) och Dex för HLC differentiering för att erhålla HLC med leverfunktionsegenskaper16. Vissa av dessa metoder använder dock många rekombinanta tillväxtfaktorer för att generera DE med hög kostnad och vissa av dem använder bara små molekyler för att generera DE med lägre effektivitet. Activin A är en kritisk faktor för DE-generering. Vi har försökt ersätta Activin A med andra små molekyler men får oftast en lägre effektivitet. Därför antar vi metoden att lägga till Activin A och CHIR99021 som inducerande faktorer för DE, och upptäcka differentieringsrelaterade gener i varje steg genom q-PCR, immunofluorescens och western blotting.
Under de senaste åren är inrättandet av ett experimentellt system för riktad HLC-induktion från hESCs en viktig grund för modellering av hepatocytutveckling och screening av läkemedel för leverrelaterade sjukdomar. Samtidigt kan det också ge en effektiv källa till celler för hepatocyttransplantation, levervävnadsteknik, bioartificial lever och annan forskning. Det har rapporterats att HLCs som härrör från stamceller har använts för att genomföra olika studier på virusinfektion som en läkemedelsscreeningsmodell för att förutsäga hepatotoxiska läkemedelsinducerade svar och för att studera den medfödda immunvägen och signalvägarna för celler10,22,23,24,25. I allmänhet introducerar denna metod i detalj en effektiv hepatocytliknande celldifferentieringsteknik från hESCs som framgångsrikt kan skilja hESCs till mogna funktionella hepatocyter. Resultaten ger en plattform för utveckling av HLC-baserade applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81870432 och 81570567 till X.L.Z.), (nr 81571994 till P.N.S.); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2020A1515010054 till P.N.S.), Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 till P.N.S.). Vi vill tacka professor Stanley Lin från Shantou University Medical College för användbar rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
