Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).
Abstract
Die potenziellen Funktionen von Hepatozyten-ähnlichen Zellen (HLCs), die aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) gewonnen werden, sind vielversprechend für die Krankheitsmodellierung und Das Screening von Medikamenten. Hier steht eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs zur Verfügung. Die Etablierung einer Endoderm-Linie ist ein wichtiger Schritt bei der Differenzierung zu HLCs. Mit unserer Methode regulieren wir die wichtigsten Signalwege, indem wir Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung kontinuierlich in definitives Endoderm (DE) ergänzen, gefolgt von der Generierung von hepatischen Vorläuferzellen und schließlich HLCs mit typischer Hepatozytenmorphologie in einer stufenweisen Methode mit vollständig definierten Reagenzien. Die mit dieser Methode hergestellten hESC-abgeleiteten HLCs exprimieren stadiumsspezifische Marker (einschließlich Albumin, HNF4α-Kernrezeptor und Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid (NTCP)) und zeigen besondere Eigenschaften im Zusammenhang mit reifen und funktionellen Hepatozyten (einschließlich Indocyanin-Grünfärbung, Glykogenspeicherung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und CYP3-Aktivität) und können eine Plattform für die Entwicklung von HLC-basierten Anwendungen in der Untersuchung von Lebererkrankungen bieten.
Introduction
Die Leber ist ein stark metabolisches Organ, das mehrere Rollen spielt, einschließlich Desoxidation, Speicherung von Glykogen und Sekretion und Synthese von Proteinen1. Verschiedene Krankheitserreger, Medikamente und Vererbung können pathologische Veränderungen in der Leber verursachen und ihre Funktionen beeinflussen2,3. Hepatozyten als Hauptfunktionseinheit der Leber spielen eine wichtige Rolle bei künstlichen Leberunterstützungssystemen und der Eliminierung der Arzneimitteltoxizität. Die Ressource primärer humaner Hepatozyten ist jedoch sowohl in der zellbasierten Therapie als auch in der Lebererkrankungsforschung begrenzt. Daher ist die Entwicklung neuer Quellen funktioneller menschlicher Hepatozyten eine wichtige Forschungsrichtung im Bereich der regenerativen Medizin. Seit 1998, als hESCs etabliert wurden4, wurden hESCs von Forschern wegen ihres überlegenen Differenzierungspotenzials (sie können sich in einer geeigneten Umgebung in verschiedene Gewebe differenzieren) und eines hohen Grades an Selbsterneuerbarkeit weithin in Betracht gezogen und bieten somit ideale Quellzellen für biokünstliche Lebern, Hepatozytentransplantation und sogar Lebergewebe-Engineering5.
Derzeit kann die hepatische Differenzierungseffizienz durch Anreicherung des Endoderms6stark erhöht werden. Bei der Liniendifferenzierung von Stammzellen in Endoderm sind ebenen des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) Signalwege und WNT-Signalwege die Schlüsselfaktoren im Knoten des Endodermbildungsstadiums. Die Aktivierung eines hohen TGF-β- und WNT-Signals kann die Entwicklung von Endoderm7,8fördern. Activin A ist ein Zytokin, das zur TGF-β-Superfamilie gehört. Daher wird Activin A häufig in der Endoderminduktion von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und hESCs9,10verwendet. GSK3 ist eine Serin-Threonin-Proteinkinase. Forscher haben herausgefunden, dass CHIR99021, ein spezifischer Inhibitor von GSK3β, typische WNT-Signale stimulieren und unter bestimmten Bedingungen die Stammzelldifferenzierung fördern kann, was darauf hindeutet, dass CHIR99021 das Potenzial hat, die Stammzelldifferenzierung in Endoderm 11,12,13zu induzieren.
Hier berichten wir über eine effiziente und reproduzierbare Methode, um die Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs effektiv zu induzieren. Die sequentielle Zugabe von Activin A und CHIR99021 erzeugte etwa 89,7±0,8% SOX17 (DE-Marker)-positive Zellen. Nach der weiteren Reifung in vitroexprimierten diese Zellen leberspezifische Marker und übten eine hepatozytenähnliche Morphologie (basierend auf Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H & E)) und Funktionen wie die Aufnahme von Indocyaningrün (ICG), Glykogenspeicherung und CYP3-Aktivität aus. Die Ergebnisse zeigen, dass hESCs mit dieser Methode erfolgreich in reife funktionelle HLCs differenziert werden können und eine Grundlage für leberkrankheitsbezogene Forschung und In-vitro-Wirkstoffscreening bieten können.
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Protocol
1. Stammzellpflege
HINWEIS: Das unten beschriebene Zellwartungsprotokoll gilt für die hES03-Zelllinie, die in einer adhärenten Monoschicht gepflegt wird. Für alle folgenden Protokolle in diesem Manuskript sollten Zellen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank behandelt werden.
- Bereiten Sie 1x mTesR-Stammzellkulturmedium vor, indem Sie 5x Ergänzungsmedium auf mTesR-Basismedium verdünnen.
- Bereiten Sie 30x hESC-qualifiziertes Matrigelmedium vor, indem Sie 5 ml hESC-qualifiziertes Matrigel mit 5 ml DMEM/F12 auf dem Eis verdünnen. Bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie 1x hESC-qualifiziertes Matrigelmedium vor, indem Sie 33,3 μL 30x hESC-qualifiziertes Matrigel mit 1 ml DMEM/F12 verdünnen.
- Sterile 6-Well-, Gewebekultur-behandelte Platten mit jeweils 1 mL 1x hESC-qualifiziertem Matrigel im Voraus beschichten und über Nacht bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch mindestens 30 min bei Raumtemperatur (RT) einräumen.
- Die kryokonservierten hESCs in einem 37 °C Wasserbad für 3 min ohne Schütteln auftauen. Dann werden die Zellen sofort durch Pipettieren in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen mit 4 mL vorgewarmten 37 °C mTesR Medium übertragen, 2 mal sanft auf und ab pipettiert.
- Zentrifugieren Sie die hESCs bei 200 x g für 2 min bei RT.
- Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml mTesR-Medium.
- Saugen Sie das DMEM/F12-Medium von der Platte ab und säen Sie die Zellen in eine Vertiefung aus 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x10 5 Zellen in 2 mL mTesR.
- Inkubieren Sie in einem 5% CO 2-Inkubator und erhalten Sie die Zellen, indem Sie sie täglich durch vorgewärmtes mTesR-Medium ersetzen. Passage der Zellen bei etwa 70-80% Konfluenz oder wenn die Zellkolonien beginnen, Kontakt aufzunehmen.
2. Stammzellpassage und -differenzierung
- Für passagierende Zellen das Medium absaugen und die Zellen mit 1 ml Enzymlösung pro Vertiefung (z. B. Accutase für 5 min bei 37 °C) inkubieren. Anschließend werden die Zellen durch Pipettieren in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 4 ml DMEM/F12 vorgewarmt auf 37 °C übertragen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g bei RT für 2 min.
- Saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 1 ml mTesR-Medium.
- Bereiten Sie 24-Well-Platten vor, indem Sie im Voraus mit 250 μL 1x hESC-qualifiziertem Matrigel-Medium beschichten. Seed hESCs wie oben beschrieben bei einer Dichte von 1 - 1,5 x 105 Zellen pro Vertiefung in 500 μL mTesR-Medium.
- Lassen Sie die Zellen 24 h bei 37 °C in einem CO 2-Inkubatorinkubieren.
3. DE-Bildung
- Bereiten Sie Stammlösungen von 100 μg/ml Activin A mit DPBS vor, die 0,2% BSA und 3 mM CHIR99021 mit DMSO enthalten.
- Bereiten Sie das Basismedium der Stufe I differenzierung vor, indem Sie das RPMI-Medium mit 1x B27 ergänzen.
- Activin A zu einer Endkonzentration von 100 ng/ml und CHIR99021 zu einer Endkonzentration von 3 μM in einem geeigneten Volumen des vorgewärmten Stufe-I-Differenzierungsgrundmediums hinzufügen.
- Saugen Sie mTesR-Medium aus den Zellen ab und ersetzen Sie es durch Differenzierungsmedien der Stufe I, die zusätzliche Differenzierungsfaktoren enthalten (z. B. 0,5 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte).
- Lassen Sie die Zellen 3 Tage lang bei 37 °C ineinem CO 2-Inkubator inkubieren und ersetzen Sie täglich die Medien der Stufe I durch frisch hinzugefügte Differenzierungsfaktoren (Tage 0-2).
HINWEIS: Nach 3 Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen Marker von DE-Zellen wie FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 und FOXA1 exprimieren (mindestens 80% von SOX17 werden für das Fortfahren benötigt).
4. Differenzierung von leberischen Vorläuferzellen
- Vorbereitung von Basismedien der Stufe II der Differenzierung durch Auflösung des Knockout-Serumersatzes (KOSR) auf eine Endkonzentration von 20% in Knock Out DMEM.
- Herstellung eines Differenzierungsmediums der Stufe II mit 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x Lösung einer nicht-essentiellen Aminosäure (NEAA), 100 μM 2-Mercaptoethanol und 1x Penicillin/Streptomycin (P/S) zum entsprechenden Volumen von KOSR/Knockout DMEM.
- An Tag 3 der Differenzierung das Medium absaugen und durch Medium der Stufe II ersetzen (z. B. 0,5 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte). Dann 24 h inkubieren.
- Am Tag 4 der Differenzierung das Medium absaugen und durch Medium der Stufe II ersetzen (z. B. 1 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte).
- Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag (ersetzen Sie das Medium an Tag 6).
HINWEIS: Nach 8 Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen geeignete Marker von hepatischen Vorläuferzellen wie HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA exprimieren (mindestens 80% HNF4α werden für das Weitere Vorgehen benötigt).
5. Hepatozytendifferenzierung
- Bereiten Sie 10 μg/ml Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), 20 μg/ml Oncostatin (OSM) Stammlösungen mit DBPS (mit 0,2% BSA) und Filter mit einer 0,22 μm Filtermembran vor.
- Herstellung des Basismediums der Stufe III (HepatoZYME-SFM (HZM)-Medium, ergänzt mit 10 μM Hydrocortison-21-hemisuccinat und 1x P/S).
- HGF wird zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml und OSM zu einer Endkonzentration von 20 ng/ml zum entsprechenden Volumen des vorgewärmten Differenzierungsmediums der Stufe III gegeben.
- Am Tag 8 der Differenzierung atmpirieren Sie Medium des Stadiums II aus den Zellen und ersetzen Es durch Medium der Stufe III (z. B. 1 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte).
- Lassen Sie die Zellen 10 Tage lang bei 37 °C in einem CO 2-Inkubator inkubieren und wechseln Sie die Medien der Stufe III jeden zweiten Tag mit frisch hinzugefügten Differenzierungsfaktoren (Tage 8-18).
HINWEIS: Nach 18 Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen charakteristische Marker von Hepatozyten wie AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4 exprimieren. Der Anteil der Albumin-positiven Zellen beträgt in der Regel mehr als 90%.
6. RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und RT-qPCR-Analyse
- Saugen Sie Medium aus den Zellen ab und fügen Sie die richtige Menge an RNAiso Plus-Reagenz hinzu (z. B. 0,3 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte). Sammeln Sie den Überstand in einem 1,5 ml Rohr und lassen Sie ihn 5 min bei RT stehen.
- Fügen Sie 60 μL Chloroform-Reagenz hinzu und lassen Sie es bei RT für 5 min. Dann Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min.
- Sammeln Sie den 125 μL Überstand und übertragen Sie ihn in ein anderes Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 160 μL Isopropanol hinzu, mischen Sie gut und stehen Sie 10 Minuten bei RT.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 75% Ethanol zum Gefällten hinzu und zentrifugieren Sie bei 7.500 x g für 5 min.
- Nach dem Trocknen bei RT 40 μL DEPC-behandeltes Wasser zum Auflösen hinzufügen. Für qPCR transkribieren Sie 2 μg der Gesamt-RNA mit einem Reverse-Transkriptionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Führen Sie RT-qPCR mit einem kommerziellen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
- Normalisieren Sie die Genexpression relativ zu nicht induzierten Stammzellen und bestimmen Sie die Faltenvariation nach der Normalisierung auf GAPDH.
7. Immunfluoreszenz-Validierung der Differenzierung
- Bereiten Sie 1x PBST-Waschpuffer vor, indem Sie 0,1% Tween-20 zu PBS hinzufügen.
- Medium aus haftende Zellen absaugen und kurz mit PBS bei RT auf einem Shaker waschen.
- Saugen Sie PBS an und inkubieren Sie Zellen mit 500 μL eiskaltem Methanol pro Vertiefung einer 24-Well-Platte, um die Zellen über Nacht bei -20 °C zu fixieren.
- Entfernen Sie das Methanol und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS auf einem Shaker für jeweils 10 min bei RT.
- Blockzellen mit 500 μL 5% BSA, die in PBS für 1-2 h bei RT auf einem Shaker hergestellt werden.
- Verdünnen Sie den primären Antikörper bei 1: 200 in der gleichen Lösung, die zur Blockierung verwendet wird.
- Inkubieren Sie die fixierten Zellen in 300 μL primärer Antikörperlösung über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.
- Nach der Inkubation über Nacht die Zellen 3 mal mit PBST für jeweils 10 min bei RT auf einem Shaker waschen.
- Sekundäre Antikörperlösung in Blockierungslösung bei 1:1000 vorbereiten.
- Inkubieren Sie in 300 μL sekundärer Antikörperlösung, die vor Licht geschützt für 1 h bei RT auf einem Shaker geschützt ist.
- Sekundäre Antikörperlösung absaugen und Zellen 3 mal mit PBST für jeweils 10 min bei RT auf einem Shaker waschen.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 300 μL 1 μg/ml DAPI für 3-5 min und waschen Sie sie dann zweimal mit PBST.
- Fügen Sie nach dem Absaugen von PBST eine angemessene Menge PBS hinzu, um Bilder unter einem Fluoreszenzmikroskop aufzunehmen.
8. Western-Blot-Analyse
- Bereiten Sie 1x TBST Waschpuffer vor, indem Sie 0,1% Tween-20 zu Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) hinzufügen.
- Bereiten Sie den SDS-PAGE-Elektrophoresepuffer und den westlichen Transferpuffer vor, indem Sie ein kommerzielles Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers verwenden.
- Lösen Sie das Gesamtzellprotein (40 μg) auf einem 10% igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel auf und laufen Sie in SDS-PAGE-Elektrophoresepuffer bei 15 mA Konstantstrom für etwa 2 h.
- Übertragen Sie das Gel auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran bei 300 mA Konstantstrom für 2 h bei niedriger Temperatur.
HINWEIS: Die Laufzeit und die Übertragungszeit können je nach verwendetem Gerät und Art und Prozentsatz des Gels variieren. - Blockieren Sie die Membran mit 3% BSA, die in TBST für 1 h bei RT auf einem Shaker vorbereitet wurden.
- Inkubieren Sie in primärer Antikörperlösung (1:1000 Verdünnung) über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.
- Nach der Inkubation über Nacht die Löschmembran 3 mal mit TBST für 15 min pro Zeit bei RT auf einem Shaker waschen.
- Inkubieren Sie in sekundärer Antikörperlösung (1:2000 Verdünnung) für 2 h bei RT auf einem Shaker.
- Verwerfen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Membran 3 Mal mit TBST, jedes Mal für 15 minuten, bei RT auf einem Shaker.
- Visualisieren Sie immunreaktive Banden mit einem Chemilumineszenzreagenz, gefolgt von einer Autoradiographie. Verwenden Sie β-Actin als Ladesteuerung.
9. Indocyanin-Grünaufnahme
- Bereiten Sie 200 mg / ml Indocyanin-Grünbrühlösung in DMSO vor.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung vor, indem Sie das Differenzierungsmedium der Stufe III mit Indocyaningrünlösung auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml ergänzen.
- Inkubieren Sie in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator für 1-2 h.
- Medium absaugen und die Zellen 3 mal mit PBS waschen.
- Fotografieren Sie unter dem Mikroskop.
10. Periodische Säure-Schiff (PAS) Färbung und Hämatoxylin-Eosin (H&E) Färbung
- Saugen Sie Medium aus haftenden Zellen ab und waschen Sie es zweimal kurz mit PBS.
- Zur Zellfixierung PBS absaugen und Zellen über Nacht mit eiskaltem Methanol bei -20 °C inkubieren.
- Visualisieren Sie die Glykogenspeicherung durch PAS-Färbung und beobachten Sie binukleierte Zellen durch H & E-Färbung mit einem Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Machen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop.
11. Assay für CYP-Aktivität
- Messen Sie die CYP450-Aktivität mit handelsüblichen zellbasierten Assays (P450-Glo Assays) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie drei unabhängige Wiederholungen zum Testen. Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt.
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Representative Results
Das schematische Diagramm der HLC-Induktion von hESCs und repräsentative Hellfeldbilder jeder Differenzierungsstufe sind in Abbildung 1 dargestellt. Im Stadium I wurden Activin A und CHIR99021 für 3 Tage hinzugefügt, um Stammzellen zur Bildung von Endodermzellen zu induzieren. Im Stadium II differenzierten sich die Endodermzellen nach 5-tägiger Behandlung mit Differenzierungsmedium zu leberförmigen Vorläuferzellen. Im Stadium III waren frühe Hepatozyten nach 10 Tagen in HGF und OSM gereift und zu HLCs differenziert(Abbildung 1A). In der letzten Phase der Differenzierung zeigten die Zellen einen typischen Hepatozytenphänotyp (Die Zellen sind polygonal und gleichmäßig und regelmäßig verteilt) (Abbildung 1B).
Um die hepatische Differenzierung weiter zu bestätigen, wurden RT-qPCR, Immunfluoreszenzfärbung und Western Blotting verwendet, um Marker von Endodermzellen, hepatischen Vorläuferzellen und reifen Hepatozyten nachzuweisen (Abbildung 2). Die differenzierten Zellen zeigten in jedem Stadium hohe Expressionsniveaus an differenzierungsbezogenen Genen und Proteinen, wie die Endodermmarker SOX17 (89,7± 0,8%) an Tag 3, der hepatische Vorläufermarker HNF4α (81,3±2,9%) an Tag 8, AFP (86,6±0,3%) an Tag 14 und der reife Hepatozytenmarker ALB (94,5±1,1%) an Tag 18. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hepatozytenähnliche Zellen durch dieses Protokoll erzeugt werden.
Um festzustellen, ob HLCs Hepatozytenfunktionen haben, haben wir die ICG-Aufnahme, die Glykogenspeicherung und die CYP-Aktivität von HLCs nachgewiesen sowie eine H & E-Färbung durchgeführt. Wie zu sehen ist, wiesen die HLCs eine grüne Färbung auf (Abbildung 3A) und es wurde eine ausgedehnte zytoplasmatische periodische Säure-Schiff-Färbung (rosa bis violett) beobachtet (Abbildung 3B), die mit der Glykogenspeicherung übereinstimmt. Darüber hinaus können wir die repräsentative Morphologie eines typischen binukleierten Hepatozyten sehen (Abbildung 3C). Schließlich wurde die enzymatische Aktivität von CYP3A4, dem wichtigsten metabolischen CYP in der Leber, durch enzymatischen Aktivitätsassay bestätigt (Abbildung 3D).
| Name des Reagens | Firma | Katalognummer | Bestandskonzentration | Endkonzentration |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| 488 markierte Ziege gegen Maus IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | WENN: 1:1000 |
| 488 markierte Ziege gegen Kaninchen IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | WENN: 1:1000 |
| Accutase | Stammzelltechnologien | 7920 | 1 x | 1 x |
| Aktiv A | peproTech | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti-Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | - | WENN: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Mensch Oct4 | Abcam | Ab19587 | - | WENN: 1:200 |
| Anti-α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | - | WENN: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti-SOX17 | Abcam | ab224637 | - | WENN: 1:200 |
| Anti-Hepatozyten-Kernfaktor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | - | WENN: 1:200 |
| B-27 Ergänzung | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| DEPC-Wasser | Beyotime | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| H&E Färbeset | Beyotime | C0105S | - | - |
| Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) | peproTech | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Hydrocortison-21-hemisuccinat | Sigma-Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indocyanin | Sangon Biotech | A606326 | 200 mg/ml | 1 mg/ml |
| DMEM ausschalten | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Schlagen Sie SR Multi-Spezies aus | Gibco | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-qualifiziert | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| mTesR 5X Ergänzung | Stammzelltechnologien | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR Basal Medium | Stammzelltechnologien | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| PAS-Färbeset | Solarbio | G1281 | - | - |
| Stift/Streptokokken | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| Peroxidase-konjugierte Ziege Anti-Maus IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| Primärer Antikörper-Verdünnungspuffer für Western Blot | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | - | - |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Entrahmte Milch | Sangon Biotech | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Wissenschaftlich | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tabelle 1: Komponenten von Zellkultur- und Differenzierungsbasismedien.
| Name des Gens | Abkürzungen | Primersequenzen(F) | Primersequenzen (R) |
| POU Klasse 5 Homeobox 1 | OKT4 | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| Gabelkopfbox A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC CAGAATACACATT |
| SRY-Box Transkriptionsfaktor 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC CACTTGAACAGT |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Frizzled Class Receptor 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| C-X-C Motiv Chemokinrezeptor 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| Gabelkopfbox A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mesogenin 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Kaudale Homeobox 1 | CDX1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Even-Skipped Homeobox 1 | EVX1 | GCTGTCTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCTCACTCT CTCCTCCAAA |
| Mesoderm Posterior BHLH Transkriptionsfaktor 2 | MESP2 | AGCTTGGGTG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2,5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTT TTCGGCTCTA |
| ISL LIM Homeobox 1 | ISL1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Hepatozyten-Kernfaktor 4 Alpha | HNF4α | ACATGGACATG GCCGACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Alpha Fetoprotein | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| T-Box Transkriptionsfaktor 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transthyretin | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albumin | ALBE | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Natriumtaurocholat co-transportierendes Polypeptid | NTCP | CATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Enhancer Bindendes Protein Alpha | CEBPA | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Serpin Familie A Mitglied 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
ACCTTAGTGATG CCCAGT |
| Asialoglykoproteinrezeptor 1 | ASGR1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Cytochrom P450 Familie 3 Unterfamilie A Mitglied 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tabelle 2: Primersequenzen für die q-PCR-Analyse.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls für die Spezifikation von DE und HLCs. (A) Schematische Darstellung der in dieser Studie verwendeten 3-stufigen Differenzierungsstrategie. (B) Morphologie der differenzierten Zellen an den Tagen 0, 3, 8, 14 und 18. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Stufenspezifische Markerexpression während der hESC-Differenzierung in HLCs. (A) mRNA-Expression von stadiumsspezifischen Genen. (B-C) Proteinexpression von stufenspezifischen Genen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Funktionen von hESC-abgeleiteten HLCs. (A) HLCs, die 1 h lang mit 1 mg/ml Indocyaningrün behandelt wurden, zeigen die Aufnahme, wie sie durch Phasenmikroskopie beurteilt wurde. (B) Repräsentative PAS-Färbebilder, die auf eine Glykogenspeicherung hinweisen. (C) Repräsentative HE-Färbebilder, die binukleate Zellen zeigen. (D) Basale Aktivität der wichtigsten Cytochrom P450 Enzyme. Alle Werte werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier stellen wir eine schrittweise Methode vor, die HLCs aus hESCs in drei Stufen induziert. In der ersten Stufe wurden Activin A und CHIR99021 verwendet, um hESCs in DE zu unterscheiden. In der zweiten Stufe wurden KO-DMEM und DMSO verwendet, um DE in hepatische Vorläuferzellen zu differenzieren. In der dritten Stufe wurden HZM plus HGF, OSM und Hydrocortison-21-Hemisuccinat-Natriumsalz verwendet, um die hepatischen Vorläuferzellen weiterhin in HLCs zu differenzieren.
Die folgenden kritischen Schritte müssen bei der Verwendung des Protokolls berücksichtigt werden. Die anfängliche Differenzierungsdichte der Zellen und das genaue Timing von Mediumsänderungen sind wichtige Faktoren für eine erfolgreiche Differenzierung. Wenn wir anfangen zu differenzieren, müssen wir sicherstellen, dass die anfängliche Aussaatdichte bei einem Zusammenfluss von etwa 30-40% angemessen ist, wenn die Zellen gerade erst anfangen, miteinander in Kontakt zu kommen, und dass die Interzellularräume gleichmäßig in einem Netzwerk unter dem Sichtfeld angeordnet sind. Während der Differenzierung muss das entsprechende Differenzierungsmedium genau zum angegebenen Zeitpunkt gewechselt werden, insbesondere in der ersten Stufe und im Schlüsselmoment jeder Ersatzphase, um sicherzustellen, dass sich die Zellen in der Art und im Stadium differenzieren, die den Prozess der Embryonalentwicklung imitieren.
Die erste Stufe der Differenzierung von hESCs in DE ist besonders wichtig. Es gibt normalerweise eine große Anzahl von Zellen, die sich während der Phase I der Differenzierung, die ein kritisches Stadium für das Zellschicksal ist, lösen und aufschwimmen, aber zu diesem Zeitpunkt behalten die Zellen immer noch die Fähigkeit, sich zu vermehren. Daher kann der Zusammenfluss von Zellen am Ende von Stadium I etwa 90-100% erreichen. Darüber hinaus sollte beachtet werden, dass zu Beginn des Stadiums III der Differenzierung (dh Tag 8) das Zytoplasma der Zellen zu kondensieren beginnt, was dazu führt, dass die Zellen allmählich eine schlanke Morphologie erhalten. An Tag 10 erholt sich das Zytoplasma jedoch allmählich, und an Tag 14 beginnen die Zellen, die offensichtliche polyedrische Morphologie der Hepatozyten zu zeigen.
In dieser Studie sind die erhaltenen HLCs tatsächlich näher an fetalen Hepatozyten, da AFP am Tag 18 höher exprimiert ist als ALB. Obwohl die erzeugten HLCs Hepatozyteneigenschaften und -funktionen ausüben, gibt es immer noch eine Lücke zwischen HLCs und primären menschlichen Hepatozyten, was darauf hindeutet, dass unsere differenzierten Zellen noch nicht funktionell ausgereift sind. Daher müssen sich die zukünftigen Arbeiten auf die weitere Optimierung der Differenzierungsmethode konzentrieren.
Derzeit werden Wachstumsfaktoren und kleine molekulare Verbindungen wie Activin A9,10,14,Wnt3a 15 , CHIR16, Torin217und IDE118 ,19häufigverwendet, um die DE-Differenzierung in verschiedenen Differenzierungssystemen zu induzieren. Die Song-Gruppe verwendete Activin A, um Stammzellen in DE zu differenzieren, und verwendete FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), BMP2 (Bone morphogenetic protein 2), HGF, KGF (Keratinocyte Growth Factor), OSM und Dex für die hepatische Spezifikation und HLCs-Reifung20. Die Sullivan-Gruppe induzierte DE durch Activin A und Wnt 3a und induzierte HLCs durch β-ME (2-Mercaptoethanol), DMSO, Insulin, HGF, OSM21. Das Siller-Team verwendete CHIR99021 zur DE-Differenzierung, DMSO, Dihexa (Hepatocyte growth factor receptor agonist N-hexanoic-Tyr) und Dex zur HLC-Differenzierung, um HLC mit Leberfunktionsmerkmalen zu erhalten16. Einige dieser Methoden verwenden jedoch viele rekombinante Wachstumsfaktoren, um DE mit hohen Kosten zu erzeugen, und einige von ihnen verwenden nur kleine Moleküle, um DE mit geringerer Effizienz zu erzeugen. Activin A ist ein kritischer Faktor für die DE-Erzeugung. Wir haben versucht, Activin A durch andere kleine Moleküle zu ersetzen, erhalten aber normalerweise eine geringere Effizienz. Daher übernehmen wir die Methode der Zugabe von Activin A und CHIR99021 als induzierende Faktoren von DE und erkennen differenzierungsbezogene Gene in jedem Stadium durch q-PCR, Immunfluoreszenz und Western Blotting.
In den letzten Jahren ist die Etablierung eines experimentellen Systems zur gerichteten HLC-Induktion aus hESCs eine wichtige Grundlage für die Modellierung der Hepatozytenentwicklung und das Screening von Medikamenten auf leberbedingte Erkrankungen. Gleichzeitig kann es auch eine effektive Zellquelle für Hepatozytentransplantationen, Lebergewebe-Engineering, biokünstliche Lebern und andere Forschungen bieten. Es wurde berichtet, dass HLCs, die aus Stammzellen gewonnen wurden, verwendet wurden, um verschiedene Studien über Virusinfektionen als Arzneimittelscreening-Modell durchzuführen, um hepatotoxische arzneimittelinduzierte Reaktionen vorherzusagen und den angeborenen Immunweg und die Signalwege der Zellen10,22,23,24,25zu untersuchen . Im Allgemeinen führt diese Methode im Detail eine effiziente hepatozytenähnliche Zelldifferenzierungstechnik aus hESCs ein, die hESCs erfolgreich in reife funktionelle Hepatozyten differenzieren kann. Die Ergebnisse bieten eine Plattform für die Entwicklung von HLC-basierten Anwendungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 zu X.L.Z.), (Nr. 81571994 zu P.N.S.) unterstützt; die Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Nr. 2020A1515010054 bis P.N.S.), Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für nützliche Ratschläge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
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