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Immunology and Infection

मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से निर्देशित हेपेटोसिटे-लाइक सेल इंडक्शन के लिए एक कुशल विधि

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62654
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि निश्चित एंडोडर्म (डीई) में एचएससी भेदभाव के दौरान सक्रियता ए और चिर 9 9 021 को लगातार पूरक करके कार्यात्मक हेपेटोसिट जैसी कोशिकाओं (एचएलसी) में मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (एचईसी) के भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।

Abstract

मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) से प्राप्त हेपेटोसिटे जैसी कोशिकाओं (एचएलसी) के संभावित कार्य रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए महान वादा रखते हैं। यहां प्रदान की गई कार्यात्मक एचएलसी में एचईसी के भेदभाव के लिए एक कुशल और प्रजनन योग्य विधि है। एक एंडोडर्म वंश की स्थापना एचएलसी के लिए भेदभाव में एक महत्वपूर्ण कदम है। हमारी विधि से, हम एचईएससी भेदभाव के दौरान सक्रियता ए और CHIR99021 को निश्चित एंडोडर्म (डीई) में लगातार पूरक करके प्रमुख सिग्नलिंग रास्तों को विनियमित करते हैं, जिसके बाद हेपेटिक जनक कोशिकाओं की पीढ़ी, और अंत में पूरी तरह से परिभाषित अभिजेंटों के साथ एक चरणवार विधि में ठेठ हेपेटोसाइट आकृति विज्ञान के साथ एचएलसी। इस विधि द्वारा उत्पादित एचईएससी-व्युत्पन्न एचएलसी चरण-विशिष्ट मार्कर (एल्बुमिन सहित, एचएनएफ 4α परमाणु रिसेप्टर, और सोडियम टैरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड (एनटीसीपी)), और परिपक्व और कार्यात्मक हेपेटोसाइट्स (इंडोसायनीन ग्रीन स्टेनिंग, ग्लाइकोजन स्टोरेज, हेमटॉक्सीलिन-ईओसिन स्टेनिंग और एसआईपी 3 गतिविधि सहित) से संबंधित विशेष विशेषताओं को दिखाते हैं, और यकृत रोगों के अध्ययन में एचएलसी आधारित अनुप्रयोगों के विकास के लिए एक मंच प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

जिगर एक अत्यधिक मेटाबोलिक अंग है जो कई भूमिकाएं निभाता है, जिसमें देवक्सिडेशन, ग्लाइकोजन का भंडारण, और प्रोटीन का स्राव और संश्लेषण शामिल है1। विभिन्न रोगजनकों, दवाओं और वंशागतता जिगर में रोग परिवर्तन पैदा कर सकता है और इसके कार्यों को प्रभावित कर सकता है2,3। हेपेटोसाइट्स, जिगर की मुख्य कार्यात्मक इकाई के रूप में, कृत्रिम यकृत समर्थन प्रणाली और दवा विषाक्तता उन्मूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स का संसाधन सेल-आधारित चिकित्सा के साथ-साथ यकृत रोग अनुसंधान में सीमित है। इसलिए, कार्यात्मक मानव हेपेटोसाइट्स के नए स्रोतों का विकास पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अनुसंधान दिशा है। 1 99 8 से जब एचईएससी की स्थापना की गई है4,एचएससी को शोधकर्ताओं द्वारा उनकी बेहतर भेदभाव क्षमता (वे उपयुक्त वातावरण में विभिन्न ऊतकों में अंतर कर सकते हैं) और उच्च स्तर के आत्म-नवीनीकरण के कारण व्यापक रूप से विचार किया गया है, और इस प्रकार बायोआर्टिशियल लिवर, हेपेटोसिटे प्रत्यारोपण और यहां तक कि यकृत ऊतक इंजीनियरिंग5के लिए आदर्श स्रोत कोशिकाएं प्रदान करते हैं।

वर्तमान में, एंडोडर्म6को समृद्ध करके हेपेटिक भेदभाव दक्षता को बहुत बढ़ाया जा सकता है। एंडोडर्म में स्टेम सेल के वंश भेदभाव में, परिवर्तन विकास कारक β (टीजीएफ-β) सिग्नलिंग और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग रास्ते के स्तर एंडोडर्म गठन चरण के नोड में प्रमुख कारक हैं। टीजीएफ-β और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के उच्च स्तर के सक्रियण से एंडोडर्म7,8के विकास को बढ़ावा मिल सकता है। एक्टिविन ए टीजीएफ-β सुपरफैमिली से संबंधित एक साइटोकिन है। इसलिए, एक्टिविन ए का व्यापक रूप से मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) और एचएसएससी9,10के एंडोडर्म प्रेरण में उपयोग किया जाता है। जीएसके3 एक सेरीन-थ्रेनिन प्रोटीन काइनेज है। शोधकर्ताओं ने पाया है कि GSK3ο के एक विशिष्ट अवरोधक CHIR99021, विशिष्ट WNT संकेतों को प्रोत्साहित कर सकते हैं, और कुछ शर्तों के तहत स्टेम सेल भेदभाव को बढ़ावा दे सकते हैं, सुझाव है कि CHIR99021 endoderm 11,12,13में स्टेम सेल भेदभाव उत्प्रेरण के लिए क्षमता है ।

यहां हम एचईसी के भेदभाव को कार्यात्मक एचएलसी में प्रभावी रूप से प्रेरित करने के लिए एक कुशल और प्रजनन योग्य विधि की रिपोर्ट करते हैं। एक्टिविन ए और CHIR99021 के अनुक्रमिक इसके अलावा लगभग 89.7±.0.8% SOX17 (DE मार्कर) सकारात्मक कोशिकाओं का उत्पादन किया। विट्रो मेंऔर परिपक्व होने के बाद, इन कोशिकाओं ने हेपेटोटिक विशिष्ट मार्कर व्यक्त किए और हेपेटोसाइट जैसी आकृति विज्ञान (हेमटॉक्सीलिन-इओसिन स्टेनिंग (एच एंड ई) पर आधारित) और इंडोसायनाइन ग्रीन (आईसीजी), ग्लाइकोजन स्टोरेज और एसआईपी 3 गतिविधि के तेज जैसे कार्यों को लागू किया। परिणाम बताते हैं कि एचईएससी को इस विधि से परिपक्व कार्यात्मक एचएलसी में सफलतापूर्वक विभेदित किया जा सकता है और यह यकृत रोग से संबंधित अनुसंधान और इन विट्रो दवा स्क्रीनिंग के लिए एक आधार प्रदान कर सकता है।

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Protocol

1. स्टेम सेल रखरखाव

नोट: नीचे वर्णित सेल रखरखाव प्रोटोकॉल एक अनुयायी मोनोलेयर में बनाए गए एचईएस03 सेल लाइन पर लागू होता है। इस पांडुलिपि में सभी निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए, कोशिकाओं को जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत संभाला जाना चाहिए।

  1. 5x सप्लीमेंट्री मीडियम को कमजोर कर के 1x एमटीईएसआर स्टेम सेल कल्चर मीडियम तैयार करें।
  2. बर्फ पर डीएमईएम/एफ12 के 5 एमएल के साथ एचईएससी-क्वालिफाइड मैट्रिगेल के 5 एमएल को कमजोर करके 30x hESC-योग्य मैट्रिक्स माध्यम तैयार करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. डीएमईएम/एफ 12 के 1 एमसीएल के साथ 30x एचईएससी-क्वालिफाइड मैट्रिगेल के 33.3 माइक्रोन को कमजोर करके 1x एचईएससी-क्वालिफाइड मैट्रिक्स माध्यम तैयार करें।
  4. कोट बाँझ 6 अच्छी तरह से, ऊतक संस्कृति-1x hESC के 1 मिलीएल के साथ इलाज प्लेटें-योग्य Matrigel प्रत्येक अच्छी तरह से अग्रिम में और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर । उपयोग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें।
  5. बिना किसी झटकों के 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में क्रायोप्रेवरी एचएससी को 3 मिनट के लिए पिघलाएं। फिर तुरंत कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में पिपिंग करके स्थानांतरित करें जिसमें 4 एमएल प्रीवार्म्ड 37 डिग्री सेल्सियस मीटरआर माध्यम होता है, धीरे-धीरे 2 बार पिपेट अप और डाउन होता है।
  6. आरटी में 2 मिनट के लिए 200 x g पर एचपीसीए को सेंट्रलाइज करें।
  7. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे एमटीईएसआर माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से रीसस्ट करें।
  8. प्लेट से DMEM/F12 माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 2 एमएल में 1 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर 6-अच्छी प्लेट के कुएं में बीज दें ।
  9. एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट और पहले से गरम mTesR माध्यम के साथ दैनिक की जगह से कोशिकाओं को बनाए रखने। लगभग 70-80% संगम पर कोशिकाओं को मार्ग या जब सेल कालोनियों से संपर्क करना शुरू करते हैं।

2. स्टेम सेल मार्ग और भेदभाव

  1. पासिंग कोशिकाओं के लिए, मध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को एंजाइम समाधान के 1 एमएल प्रति कुएं के साथ इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक्यूटास। फिर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed DMEM/F12 के 4 मिलीएल युक्त एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  2. 2 मिनट के लिए आरटी में 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
  3. माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे एमटीईएसआर माध्यम के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसर्स करें।
  4. पहले से 1x hESC-योग्य मातृजेल माध्यम के 250 माइक्रोन के साथ कोटिंग करके 24-अच्छी प्लेटें तैयार करें। बीज एचएससी के रूप में 1 के घनत्व पर ऊपर वर्णित -1.5 x 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से mTesR माध्यम के 500 μL में.
  5. कोशिकाओं को एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।

3. डीई गठन

  1. डीडीपीओ के साथ 0.2% बीएसए और 3 एमएम चिर999021 वाले डीपीबीएस के साथ 100 माइक्रोग्राम/एमएल एक्टिविन ए के स्टॉक सॉल्यूशंस तैयार करें।
  2. 1x B27 के साथ RPMI माध्यम के पूरक द्वारा चरण मैं भेदभाव बुनियादी माध्यम तैयार करें।
  3. पहले से गरम चरण मैं भेदभाव बुनियादी माध्यम की एक उपयुक्त मात्रा में 3 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए १०० एनजी/एमएल और CHIR99021 की अंतिम एकाग्रता के लिए एक्टिविन ए जोड़ें ।
  4. कोशिकाओं से mTesR माध्यम aspirate और एक 24 अच्छी तरह से थाली के अच्छी तरह से जोड़ा भेदभाव कारकों (उदाहरण के लिए, 0.5 एमएल प्रति अच्छी तरह से) युक्त मंच मैं भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
  5. कोशिकाओं को एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, स्टेज I मीडिया की जगह दैनिक हौसले से जोड़े गए भेदभाव कारकों (दिन 0-2) के साथ।
    नोट: भेदभाव के 3 दिनों के बाद, विभेदित कोशिकाओं को डीई कोशिकाओं के मार्कर व्यक्त करने चाहिए, जैसे FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4, और FOXA1 (आगे बढ़ने के लिए आवश्यक SOX17 का न्यूनतम 80%)।

4. हेपेटिक जनक कोशिकाओं का भेदभाव

  1. नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR) को नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR) को नॉकआउट डीएमईएम में 20% की अंतिम एकाग्रता में भंग करके चरण II भेदभाव बुनियादी मीडिया तैयार करें।
  2. चरण II भेदभाव माध्यम तैयार करें जिसमें 1% डीएमएसओ, 1x ग्लूटामैक्स, 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए) समाधान, 100 माइक्रोन 2-मर्केप्टोथेन और 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) को कोएसआर/नॉकआउट डीएमईएम की उचित मात्रा में शामिल किया गया है।
  3. भेदभाव के दिन 3 पर, माध्यम को आकांक्षी करें और स्टेज II माध्यम (उदाहरण के लिए, 24 अच्छी प्लेट के प्रति कुएं में 0.5 एमएल) के साथ प्रति प्रकार की प्रति जगह लें। फिर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  4. भेदभाव के दिन 4 पर, माध्यम को एस्पिरेट करें और स्टेज II माध्यम (उदाहरण के लिए, 24 अच्छी प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल) के साथ प्रति स्थापित करें।
  5. हर दूसरे दिन माध्यम बदलें (6 दिन पर मध्यम की जगह) ।
    नोट: भेदभाव के 8 दिनों के बाद, विभेदित कोशिकाओं को एचएनएफ4α, एएफपी, टीबीएक्स3, टीटीआर, एएलबी, एनटीसीपी, सीईबीपीए (आगे बढ़ने के लिए आवश्यक एचएनएफ4α का न्यूनतम 80%) जैसी हेपेटिक जनक कोशिकाओं के उपयुक्त मार्कर व्यक्त करने चाहिए।

5. हेपेटोसाइट भेदभाव

  1. डीबीपीएस (0.2% बीएसए युक्त) के साथ 10 μg/mL hepatocyte विकास कारक (एचजीएफ), 20 μg/mL Oncostatin (OSM) स्टॉक समाधान तैयार करें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली के साथ फ़िल्टर करें।
  2. स्टेज III विभेदन बुनियादी माध्यम (HepatoZYME-SFM (HZM) माध्यम 10 μM हाइड्रोकॉर्टिसोन-21-hemisuccinate और 1x P/S के साथ पूरक तैयार करें ।
  3. एचजीएफ को 10 एनजी/एमएल और ओएसएम की अंतिम एकाग्रता में 20 एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता में प्रीहीटेड स्टेज III भेदभाव माध्यम की उचित मात्रा में जोड़ें ।
  4. भेदभाव के दिन 8 पर, कोशिकाओं से चरण द्वितीय माध्यम को आकांक्षी करें और स्टेज III माध्यम (उदाहरण के लिए, 24 अच्छी प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल) के साथ प्रति स्थान लें।
  5. कोशिकाओं को एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 दिनों के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, हर दूसरे दिन चरण III मीडिया को बदलते हुए हौसले से जोड़े गए भेदभाव कारकों (दिन 8-18) के साथ।
    नोट: भेदभाव के 18 दिनों के बाद, विभेदित कोशिकाओं को एएटी, एएलबी, टीटीआर, एचएनएफ4α, एनटीसीपी, एएसजीआर 1, CYP3A4 जैसे हेपेटोसाइट्स के विशिष्ट मार्कर व्यक्त करने चाहिए। एल्बुमिन-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत आमतौर पर 90% से अधिक होता है।

6. आरएनए अलगाव, सीडीएनए संश्लेषण और आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण

  1. कोशिकाओं से मध्यम एस्पिरेट करें और आरएनएसो प्लस रिएजेंट की उचित मात्रा जोड़ें, (उदाहरण के लिए, 24-अच्छी प्लेट के प्रति कुएं में 0.3 एमएल)। एक 1.5 एमएल ट्यूब में सुपरनैंट ले लीजिए और 5 मिनट के लिए आरटी पर खड़े हो जाओ।
  2. क्लोरोफॉर्म रिएजेंट के 60 माइक्रोल जोड़ें और इसे 5 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें। फिर 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर अपकेंद्रित्र।
  3. 125 माइक्रोन सुपरनेट को इकट्ठा करें और इसे एक और सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। आइसोप्रोपैनॉल के 160 माइक्रोन जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और 10 मिनट के लिए आरटी पर खड़े हो जाओ।
  4. 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  5. सुपरनेट को निकालें, उपजी में 75% इथेनॉल जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 7,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  6. आरटी में सूखने के बाद, डीईपीसी-उपचारित पानी के 40 माइक्रोन को भंग करने के लिए जोड़ें। क्यूपीसीआर के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट के साथ कुल आरएनए के 2 माइक्रोन को रिवर्स टाइप करें।
  7. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके आरटी-क्यूपीसीआर करें।
  8. गैर-प्रेरित स्टेम कोशिकाओं के सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति को सामान्य बनाना और GAPDH को सामान्यीकरण के बाद गुना भिन्नता निर्धारित करना।

7. भेदभाव का इम्यूनोफ्लोरेरेसेंस सत्यापन

  1. पीबीएस में 0.1% ट्वीन-20 जोड़कर 1x पीबीएसटी वाशिंग बफर तैयार करें।
  2. अनुयायी कोशिकाओं से मध्यम आकांक्षी और एक शेखर पर आरटी में PBS के साथ संक्षेप में धोने ।
  3. पीबीएस और इनक्यूबेट कोशिकाओं के साथ 500 माइक्रोन बर्फ के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से ठंड मेथनॉल -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कोशिकाओं को ठीक करने के लिए।
  4. मेथनॉल निकालें और आर टी में हर बार 10 मिनट के लिए एक शेखर पर पीबीएस के साथ 3 बार कोशिकाओं को धोएं ।
  5. एक शेखर पर आरटी में 1-2 घंटे के लिए पीबीएस में तैयार 5% बीएसए के 500 माइक्रोन के साथ ब्लॉक सेल।
  6. 1 पर प्राथमिक एंटीबॉडी पतला: एक ही समाधान में 200 अवरुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया।
  7. एक शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 300 माइक्रोन प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में तय कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, एक शेखर पर आरटी में हर बार 10 मिनट के लिए PBST के साथ 3 बार कोशिकाओं को धोएं ।
  9. 1:1000 पर समाधान अवरुद्ध करने में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
  10. एक शेखर पर आरटी में 1 घंटे के लिए प्रकाश से संरक्षित माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 300 माइक्रोन में इनक्यूबेट।
  11. एक शेखर पर आरटी में हर बार 10 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ 3 बार माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान और वॉश कोशिकाओं को धोएं।
  12. 3-5 मिनट के लिए 1 μg/mL DAPI के 300 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं, और फिर PBST के साथ दो बार धोने।
  13. पीबीएसटी को एस्पिर करने के बाद, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत तस्वीरें लेने के लिए पीबीएस की उचित मात्रा जोड़ें।

8. पश्चिमी दाग विश्लेषण

  1. 1x टीबीएसटी वाशिंग बफर को 0.1% ट्वीन-20 को ट्रिस-बफर खारा (टीबीएस) में जोड़कर तैयार करें।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके एसडीएस-पेज इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर और वेस्टर्न ट्रांसफर बफर तैयार करें।
  3. कुल सेल प्रोटीन (40 माइक्रोग्राम) को 10% सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट पॉलीएक्रिलेमाइड जेल पर हल करें और एसडीएस-पेज इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर में लगभग 2 घंटे के लिए 15 एमए लगातार वर्तमान में चलाएं।
  4. कम तापमान पर 2 घंटे के लिए 300 एमए लगातार वर्तमान में पॉलीविनाइलाइडन डिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में जेल को स्थानांतरित करें।
    नोट: चलने का समय और हस्तांतरण समय उपयोग किए गए उपकरणों और जेल के प्रकार और प्रतिशत के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  5. एक शेकर पर आरटी में 1 घंटे के लिए टीबीटीएसटी में तैयार 3% बीएसए के साथ झिल्ली को ब्लॉक करें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1:1000 कमजोर पड़ने) में एक शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  7. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, एक शेकर पर आरटी में प्रति समय 15 मिनट के लिए टीबीटीटी के साथ 3 बार ब्लॉटिंग झिल्ली धोएं।
  8. एक शेखर पर आरटी में 2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (1:2000 कमजोर पड़ने) में इनक्यूबेट।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान को त्यागें और एक शेकर पर आरटी में हर बार 15 मिनट के लिए टीबीटीटी के साथ झिल्ली को 3 बार धोएं।
  10. एक रसायनीयनता रिएजेंट का उपयोग करके इम्यूनोरेक्टिव बैंड की कल्पना करें जिसके बाद ऑटोरेडियोग्राफी होती है। लोडिंग कंट्रोल के रूप में β-ऐक्टिन का इस्तेमाल करें।

9. इंडोसायनीन ग्रीन तेज

  1. डीएमएसओ में 200 मिलीग्राम/एमएल इंडोसायनीन ग्रीन स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें।
  2. 1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए इंडोसायनीन ग्रीन सॉल्यूशन के साथ स्टेज III भेदभाव माध्यम को पूरक करके एक कार्य समाधान तैयार करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट, 1-2 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर।
  4. मध्यम एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
  5. एक माइक्रोस्कोप के नीचे फोटोग्राफ।

10. आवधिक एसिड-शिफ (पीए) धुंधला और हेमटॉक्सीलिन-ईओसिन (एचएंडई) धुंधला

  1. अनुयायी कोशिकाओं से मध्यम आकांक्षी और संक्षेप में PBS के साथ दो बार धोने ।
  2. सेल निर्धारण के लिए, पीबीएस को एस्पिरेट करें और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ-ठंडे मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. पीए धुंधला द्वारा ग्लाइकोजन भंडारण की कल्पना करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक किट का उपयोग करके एच और ई द्वारा द्विन्यूलेटेड कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
  4. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ छवियां लें।

11. CYP गतिविधि के लिए परख

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल-आधारित परख (P450-ग्लो परख) का उपयोग करके CYP450 गतिविधि को मापें।
  2. परीक्षण के लिए तीन स्वतंत्र दोहराता का उपयोग करें। डेटा को एसडी के ± मतलब के रूप में दर्शाया जाता है।

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Representative Results

एचईसी से एचएलसी इंडक्शन का योजनाबद्ध आरेख और प्रत्येक भेदभाव चरण के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को चित्र 1में दिखाया गया है। स्टेज I में, एक्टिविन ए और CHIR99021 को 3 दिनों के लिए जोड़ा गया था ताकि स्टेम सेल को एंडोडर्म सेल बनाने के लिए प्रेरित किया जा सके। चरण II में, एंडोडर्म कोशिकाओं को 5 दिनों के लिए विभेदन माध्यम के साथ इलाज करने के बाद हेपेटिक जनक कोशिकाओं में विभेदित किया जाता है। चरण III में, एचजीएफ और ओएसएम(चित्रा1 ए) में 10 दिनों के बाद प्रारंभिक हेपेटोसाइट्स परिपक्व हो गए थे और एचएलसी में विभेदित हो गए थे। भेदभाव के अंतिम चरण में, कोशिकाओं ने एक विशिष्ट हेपेटोसाइट फेनोटाइप दिखाया (कोशिकाएं बहुभुज हैं और समान रूप से और नियमित रूप से वितरित की जाती हैं)(चित्रा 1B)।

आगे हेपेटिक भेदभाव की पुष्टि करने के लिए, आर टी-क्यूपीसीआर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग और पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग एंडोडर्म कोशिकाओं, हेपेटिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं और परिपक्व हेपेटोसाइट्स(चित्रा 2)के मार्कर का पता लगाने के लिए किया गया था। विभेदित कोशिकाओं ने प्रत्येक चरण में भेदभाव से संबंधित जीन और प्रोटीन के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को दिखाया, जैसे कि 3 दिन में एंडोडर्म मार्कर SOX17 (89.7± 0.8%) दिन 14 में हेपेटिक प्रोजेनिटर मार्कर एचएनएफ4 (81.3±2.± 9%±) इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हेपेटोसिट जैसी कोशिकाएं इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न होती हैं।

यह पता लगाने के लिए कि क्या एचएलसी में हेपेटोसाइट कार्य हैं, हमने एचएलसी के आईसीजी तेज, ग्लाइकोजन स्टोरेज और सीवाईपी गतिविधि का पता लगाया, साथ ही एचएंडई धुंधला प्रदर्शन किया। जैसा कि देखा जा सकता है एचएलसी ने हरे रंग की धुंधला(चित्रा 3 ए)का प्रदर्शन किया और व्यापक साइटोप्लाज्मिक आवधिक एसिड-शिफ स्टेनिंग (गुलाबी सेबैंगनी) (चित्रा 3 बी)देखा गया, जो ग्लाइकोजन भंडारण के अनुरूप है। इसके अलावा, हम एक विशिष्ट द्विन्यूक्लिटेड हेपेटोसाइट(चित्रा 3 सी)के प्रतिनिधि आकृति विज्ञान को देख सकते हैं। अंत में, लिवर में सबसे महत्वपूर्ण मेटाबॉलिक सीईपी, CYP3A4 की एंजाइमेटिक गतिविधि की पुष्टि एंजाइमेटिक गतिविधि परख(चित्रा 3 डी)द्वारा की गई थी।

रिएजेंट का नाम कंपनी सूची संख्या स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता
2-मर्केप्टोथेनॉल सिग्मा M7522 50 एमएमएम 100 माइक्रोन
488 माउस आइजी के खिलाफ बकरी लेबल जेडएसजीबी-बायो जेडएफ-0512 - आईएफ: 1:1000
खरगोश आइजी के खिलाफ 488 लेबल बकरी जेडएसजीबी-बायो जेडएफ-0516 - आईएफ: 1:1000
एक्यूटास स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज 7920 1 x 1 x
एक्टिविन ए पेप्रोटेक 120-14E 100 माइक्रोग्राम/एमएल 100 एनजी/एमएल
विरोधी - एल्बुमिन (एएलबी) सिग्मा-एल्ड्रिच A6684 - यदि: 1:200; पश्चिम बंगाल: 1:1000
विरोधी - मानव Oct4 अबाकम Ab19587 - आईएफ: 1:200
एंटी-α-फेटोप्रोटीन (एएफपी) सिग्मा-एल्ड्रिच A8452 - यदि: 1:200; पश्चिम बंगाल: 1:1000
एंटी-SOX17 अबाकम ab224637 - आईएफ: 1:200
एंटी-हेपेटोसाइट न्यूक्लियर फैक्टर 4 अल्फा (एचएनएफ4α) सिग्मा-एल्ड्रिच सबी1412164 - आईएफ: 1:200
बी-27 पूरक गिब्को 17504-044 50 x 1 x
बीएसए बेयोटाइम ST023-200g - 5.00%
चिरह99021 सिग्मा-एल्ड्रिच एसएमएल1046 3 एमएमएम 3 माइक्रोन
दापी बेयोटाइम C1006 - -
डीईपीसी-पानी बेयोटाइम आर0021 - -
DM3189 एमसीई एचवाई-12071 500 माइक्रोन 250 एनएम
DMEM/F12 गिब्को 11320-033 1 x 1 x
डीएमएसओ सिग्मा-एल्ड्रिच D5879 1 x 1 x
डीपीबीएस गिब्को 14190-144 1 x 1 x
ग्लूटामैक्स गिब्को 35050-061 100 x 1 x
एचएंडई धुंधला किट बेयोटाइम C0105S - -
हेपेटोसिटे ग्रोथ फैक्टर (एचजीएफ) पेप्रोटेक 100-39 10 माइक्रोग्राम/मिलीलीटर 10 एनजी/एमएल
हेपेटोज़िमे-एसएफएम (एचजेडएम) गिब्को 17705-021 - -
हाइड्रोकॉर्टिसोन-21-हेमिस्सिओनेट सिग्मा-एल्ड्रिच H4881 1 mm 10 माइक्रोन
इंडोसाइनिन सांगन बायोटेक A606326 200 मिलीग्राम/एमएल 1 मिलीग्राम/एमएल
नॉक आउट डीएमईएम गिब्को 10829-018 1 x 1 x
नॉक आउट सीनियर मल्टी-स्पीशीज गिब्को A31815-02 - 20%
मातृजेल एचईएससी-योग्य कॉर्निंग 354277 60 x 1 x
एमईएम एनईएए गिब्को 11140-050 100 x 1 x
mTesR 5X पूरक स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज 85852 5 x 1 x
एमटीईएसआर बेसल मीडियम स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज 85851 1 x 1 x
ओन्कोस्टैटिन (ओएसएम) पेप्रोटेक 300-10 20 माइक्रोग्राम/एमएल 20 एनजी/एमएल
P450 - CYP3A4 (लूसिफ़ेरिन - पीएफबीई) प्रोमेगा V8901 - -
पीए धुंधला किट सोलरबायो जी1281 - -
पेन/स्ट्रेप गिब्को 15140-122 100 x 1 x
पेरोक्सिडास-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी जेडएसजीबी-बायो जेडबी-2305 - पश्चिम बंगाल: 1:2000
पश्चिमी दाग के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर बेयोटाइम पी0256 - -
ReverTraAce qPCR आरटी किट टोयोबो एफएसक्यू-101 - -
आरएनएइसो प्लस ताकारा 9109 - -
आरपीएमआई 1640 गिब्को 11875093 1 x 1 x
स्किम दूध सांगन बायोटेक A600669 - 5.00%
SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स थर्मो फिशर वैज्ञानिक A25742 - -
टोरिन2 एमसीई एचवाई-13002 15 माइक्रोन 15 एनएम
बीच सिग्मा-एल्ड्रिच WXBB7485V - 0.10%

तालिका 1: सेल संस्कृति और भेदभाव आधार मीडिया के घटक।

जीन का नाम संक्षिप्त रूप प्राइमर सीक्वेंस (एफ) प्राइमर सीक्वेंस (आर)
पीएयू क्लास 5 होमोबॉक्स 1 OCT4 AGCGAACCAG
TATCGAGAAC		 TTACAGAACC
एसीएएआरसीजीएसी
फोर्कहेड बॉक्स A2 FOXA2 जीसीएटीसीसीएटीसी
टीटीजीसीएसीजीजीजीए		 जीसीसीटीटीजीसीएजीसी
सीएजीएसीएकैटट
SRY-Box ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 17 SOX17 टाटटीजीटीसीटीजीसी
CACTTGAACAGT		 टीटीजीजीसीएकैट
TCAAAGCTAGTTA
फ्रिज्ड क्लास रिसेप्टर 8 FZD8 एटीसीजीसीटीसीएए
सीटीएसीसीएसीए		 जीटीएकैटजीसीटीसी
अकाग्गागा
सी-एक्स-सी मोटिफ केमोकिन रिसेप्टर 4 CXCR4 CACCGCATCT
गग्गाका		 जीसीसीसीटीसीटीटी
सीजीजीटीजीटीटीटी
फोर्कहेड बॉक्स A1 FOXA1 AAGGCATACGA
ACAGGCACTG		 TACACACCTTG
GTAGTACGCC
एमएसएच होमबॉक्स 1 एमएसएक्स1 सीजीसीएएजीसीए
AAGAGACTAC		 जीसीकैटक्टाग
सीटीटीसीटीकैग
मेसोजेनिन 1 एमएसजीएन1 जीसीटीजीएटीसीसीटीए
टीटीसीटीसीसीसी		 TGGAAAGCTAACA
ताटगटटसीसीएसी
कौडल टाइप होमबॉक्स 1 सीडीएक्स1 AAGGAGTTTCAT
TACAGCCGTTAC		 टीजीसीटीजीटीटीटीसीटीटी
टीजीटीटीसीएक्टटीजी
यहां तक कि छोड़ दिया होमबॉक्स 1 EVX1 जीसीटीजीटीसीटीसीटीजी
AACAAAATGCT		 कैटटीसीटीसीसीक्ट आईसीटी
सीटीसीसीसीएए
मेसोडर्म पीछे BHLH ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 2 एमईएसपी2 AGCTTGGGTG
सीसीटीसीसीटीटीटी		 टीजीसीटीसीटीसीसीटीसीजीएएए
अगाकैटका
एनके 2 होमबॉक्स 5 एनकेएक्स2.5 CAAGTGTGCG
टीसीटीजीसीसीटी		 सीएजीटीसीटीसीटीटीटी
टीटीसीजीजीसीटीसीटीए
आईएसएल लिम होमबॉक्स 1 आईएसएल1 AGATTATATCAGGT
टीजीटीएसीजीजीजीसीए		 एसीएसीजीजीजीए
AACACTCGAT
हेपेटोसाइट न्यूक्लियर फैक्टर 4 अल्फा एचएनएफ4α ACATGGACATG
जीसीसीजीएक्टैक		 सीजीटीजीजीटीटीजी
जीटीजीसीसीटीटीटी
अल्फा फेटोपोटीन एएफपी एक्टगाएटकैग
AACACTGCA		 TGCAGTCAATG
कैटक्टेका
टी-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 3 टीबीएक्स3 टीटीजीटीसीकैग
सीजीजीजीटीजीए		 एसीजीटीजीजीजीजीजी
गागाकट्टजी
ट्रांसथाइरेटिन टीटीआर AGAAAGGCTG
सीटीजीजीएसी		 जीटीजीसीसीटीसीसीए
जीटीएएगेटीजी
एल्बुमिन एएलबी सीसीसीएएजीटीजीटी
सीएएटीसीसीए		 जीटीकागक्का
सीजीजीएटीजी
सोडियम टैरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड एनटीसीपी कैटागगेटसीजीटी
सीसीटीसीएए		 जीसीसीएक्टागेकैकैक
अगागाटग
CCAAT बढ़ाने के लिए बाध्यकारी प्रोटीन अल्फा सीईबीपीए अगग्गागागा
जीसीसीएजीसीटी		 AGTGCGCGAT
TGGAACTGCAG
सर्पिन परिवार एक सदस्य 1 एएटी AAATGAACTCA
सीसीसीएसीसीएटीटी		 ACCTTAGTGATG
सीसीसीएजीटी
एशियालोग्याकोप्रोटीन रिसेप्टर 1 एएसजीआर1 CAGACCCTGAGA
सीसीसीटीजीसीएए		 TCCTGCAGCTGG
गैगटीसीटी
साइटोक्रोम P450 परिवार 3 उपपरिवार एक सदस्य 4 CYP3A4 टीटीजीएटीसीएटीजी
टीटीजीजी		 AATGGGCAAAGT
CACAGTGGA

तालिका 2: क्यू-पीसीआर विश्लेषण के लिए प्राइमर दृश्य।

Figure 1
चित्रा 1:डीई और एचएलसी के विनिर्देश के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध आरेख। (A)इस अध्ययन में इस्तेमाल की जाने वाली 3 चरण की भेदभाव रणनीति की योजनाबद्ध प्रस्तुति । (ख)0, 3, 8, 14 और 18 दिनों में विभेदित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2:एचएलसी में एचईसी भेदभाव के दौरान चरण-विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति। (ए)चरण-विशिष्ट जीन की एमआरएनए अभिव्यक्ति। (बी-सी) चरण-विशिष्ट जीन की प्रोटीन अभिव्यक्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:एचईसी-व्युत्पन्न एचएलसी के कार्य। (ए)एचएलसी 1 मिलीग्राम/एमएल इंडोसायनीन ग्रीन के साथ 1 घंटे के लिए इलाज चरण माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के रूप में तेज प्रदर्शन करते हैं । (ख)प्रतिनिधि पीए धुंधला छवियां ग्लाइकोजन भंडारण का संकेत देते हैं । (ग)प्रतिनिधि वह बाइन्यूलेट्स कोशिकाओं को दिखाने वाली छवियों को धुंधला कर रहा है । (घ)प्रमुख साइटोक्रोम पी450 एंजाइमों की बेसल स्तर की गतिविधि। सभी मूल्यों को एसडी स्केल बार = 100 माइक्रोन ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हम एक स्टेपवाइज विधि पेश करते हैं जो एचएलसी से एचएलसी को तीन चरणों में प्रेरित करता है। पहले चरण में, एक्टिविन ए और चिर99021 का उपयोग एचईसी को डीई में अंतर करने के लिए किया गया था। दूसरे चरण में, KO-DMEM और DMSO हेपेटिक जनक कोशिकाओं में DE अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया । तीसरे चरण में एचएलसी में हेपेटिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं में अंतर जारी रखने के लिए एचजेडएम प्लस एचजीएफ, ओएसएम और हाइड्रोकॉर्टिसोन 21-हेमिस्सिओनेट सोडियम नमक का इस्तेमाल किया गया ।

प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदमों पर विचार किए जाने की आवश्यकता है । कोशिकाओं का प्रारंभिक भेदभाव घनत्व और मध्यम परिवर्तनों का सटीक समय सफल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। जब हम अंतर करना शुरू करते हैं, तो हमें यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रारंभिक सीडिंग घनत्व उचित हो, लगभग 30-40% के संगम पर, जब कोशिकाएं एक दूसरे के संपर्क में आने लगी हैं, और दृष्टि के क्षेत्र में एक नेटवर्क में अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान समान रूप से व्यवस्थित किए जाते हैं। भेदभाव के दौरान, इसी विभेदन माध्यम को इंगित समय पर ठीक से बदला जाना चाहिए, विशेष रूप से पहले चरण में और प्रत्येक प्रतिस्थापन चरण के महत्वपूर्ण क्षण में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं भ्रूणीय विकास की प्रक्रिया की नकल करने वाले मोड और चरण में अंतर करती हैं।

डीई में एचईसी के भेदभाव का पहला चरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । आमतौर पर बड़ी संख्या में कोशिकाएं होती हैं जो भेदभाव के चरण 1 के दौरान अलग और तैरती हैं, जो कोशिका भाग्य के लिए एक महत्वपूर्ण चरण है, लेकिन इस समय कोशिकाएं अभी भी पैदा करने की क्षमता बनाए रखती हैं। इसलिए, कोशिकाओं का संगम चरण I के अंत में लगभग 90-100% तक पहुंच सकता है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भेदभाव के चरण III (यानी, दिन 8) की शुरुआत में, कोशिकाओं का साइटोप्लाज्म गाढ़ा होना शुरू हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाएं धीरे-धीरे एक पतला आकृति विज्ञान प्राप्त करती हैं। हालांकि 10 दिन में, साइटोप्लाज्म धीरे-धीरे ठीक हो जाता है, और 14 दिन में, कोशिकाएं हेपेटोसाइट्स की स्पष्ट पॉलीहेड्रल आकृति विज्ञान दिखाना शुरू करती हैं।

इस अध्ययन में, प्राप्त HLCs वास्तव में भ्रूण hepatocytes के करीब है के रूप में एएफपी अधिक 18 दिन में ALB से व्यक्त की है । यद्यपि उत्पन्न एचएलसी हेपेटोसिट विशेषताओं और कार्यों को लागू करता है, फिर भी एचएलसी और प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स के बीच एक अंतर है, जो यह दर्शाता है कि हमारी विभेदित कोशिकाएं अभी भी कार्यात्मक रूप से परिपक्व नहीं हैं। इसलिए, भविष्य के काम को भेदभाव विधि को और अधिक अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता होगी।

वर्तमान में, विकास कारकों और छोटे आणविक यौगिकों जैसे एक्टिविन ए9,10,14,WNT3a15,चिर16, टोरिन2 17और आईडीई18, 19 का उपयोग आमतौर पर विभिन्न भेदभाव प्रणालियों में डीई भेदभाव को प्रेरित करने के लिए कियाजाताहै। सांग समूह ने स्टेम कोशिकाओं को डीई में अंतर करने के लिए एक्टिविन ए का उपयोग किया, और FGF4 (फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 4), बीएमपी 2 (बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 2), एचजीएफ, केजीएफ (केराटिनोसिटे ग्रोथ फैक्टर), हेपेटिक स्पेसिफिकेशन और एचएलसी परिपक्वता20के लिए ओएसएम और डेक्स का इस्तेमाल किया । सुलिवान समूह ने एक्टिविन ए और डब्ल्यूएनटी 3ए द्वारा डीई को प्रेरित किया, और β-एमई (2-मर्केप्टोथेनॉल), डीएमएसओ, इंसुलिन, एचजीएफ, ओएसएम21द्वारा एचएलसी को प्रेरित किया। सिलर टीम ने डीई भेदभाव, डीएमएसओ, डिएचएक्सए (हेपेटोसिटे ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर एगोनिस्ट एन-हेक्सानोइक-टायर) के लिए CHIR99021 का उपयोग किया, और एचएलसी भेदभाव के लिए डेक्स को यकृत फ़ंक्शन विशेषताओं16के साथ एचएलसी प्राप्त करने के लिए। हालांकि, इनमें से कुछ विधियां उच्च लागत के साथ डीई उत्पन्न करने के लिए कई पुनर्संयोजन विकास कारकों का उपयोग करती हैं और उनमें से कुछ कम दक्षता के साथ डीई उत्पन्न करने के लिए केवल छोटे अणुओं का उपयोग करते हैं। एक्टिविन ए डीई जनरेशन के लिए महत्वपूर्ण कारक है। हमने एक्टिविन ए को अन्य छोटे अणुओं के साथ बदलने की कोशिश की है लेकिन आमतौर पर कम दक्षता मिलती है। इसलिए, हम डीई के उत्प्रेरण कारकों के रूप में एक्टिविन ए और CHIR99021 जोड़ने की विधि अपनाते हैं, और क्यू-पीसीआर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और पश्चिमी दाग द्वारा प्रत्येक चरण में भेदभाव से संबंधित जीन का पता लगाते हैं।

हाल के वर्षों में, एचईसी से निर्देशित एचएलसी इंडक्शन के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली की स्थापना हेपेटोसिटे विकास के मॉडलिंग और यकृत से संबंधित रोगों के लिए स्क्रीनिंग दवाओं के लिए एक महत्वपूर्ण आधार है । इसके साथ ही यह हेपेटोसिटे प्रत्यारोपण, लिवर टिश्यू इंजीनियरिंग, बायोआर्टिफिशियल लिवर और अन्य शोध के लिए कोशिकाओं का प्रभावी स्रोत भी प्रदान कर सकता है । यह सूचित किया गया है कि स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त एचएलसी का उपयोग वायरल संक्रमण पर विभिन्न अध्ययनों को ड्रग स्क्रीनिंग मॉडल के रूप में करने के लिए किया गया है ताकि हेपेटोटॉक्सिक दवा-प्रेरित प्रतिक्रियाओं का अनुमान लगाया जा सके और10,22, 23, 24,25कोशिकाओं के जन्मजात प्रतिरक्षा मार्ग और संकेत मार्गों का अध्ययन किया जा सके । आम तौर पर, इस विधि में एचईसी से एक कुशल हेपेटोसिट जैसी सेल विभेदन तकनीक का विस्तार से परिचय होता है जो सफलतापूर्वक एचईसी को परिपक्व कार्यात्मक हेपेटोसाइट्स में अंतर कर सकता है। परिणाम एचएलसी आधारित अनुप्रयोगों के विकास के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 81870432 और एक्स.एल.जेड) 81570567) द्वारा समर्थित किया गया था, (पी.एन.एस.) के लिए 81571994; गुआंगदोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, चीन (नंबर 2020A1515010054 से P.N.S.), ली का शिंग शांतोउ विश्वविद्यालय फाउंडेशन (नहीं । L1111 2008 से P.N.S.) । हम शंतू यूनिवर्सिटी मेडिकल कॉलेज के प्रो स्टेनली लिन को उपयोगी सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma M7522 For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgG ZSGB-BIO ZF-0512 For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For IF,second antibody
Accutase Stem Cell Technologies 7920 For cell passage
Activin A peproTech 120-14E For definitive endoderm formation
Anti - Albumin (ALB) Sigma-Aldrich A6684 For IF and WB, primary antibody
Anti - Human Oct4 Abcam Ab19587 For IF, primary antibody
Anti - α-Fetoprotein (AFP) Sigma-Aldrich A8452 For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17 Abcam ab224637 For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) Sigma-Aldrich SAB1412164 For IF, primary antibody
B-27 Supplement Gibco 17504-044 For definitive endoderm formation
BSA Beyotime ST023-200g For cell blocking
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046 For definitive endoderm formation
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
DEPC-water Beyotime R0021 For RNA dissolution
DM3189 MCE HY-12071 For definitive endoderm formation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 For cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For hepatic progenitor differentiation
DPBS Gibco 14190-144 For cell culture
GlutaMAX Gibco 35050-061 For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kit Beyotime C0105S For H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF) peproTech 100-39 For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM) Gibco 17705-021 For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinate Sigma-Aldrich H4881 For hepatocyte differentiation
Indocyanine Sangon Biotech A606326 For Indocyanine staining
Knock Out DMEM Gibco 10829-018 For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-Species Gibco A31815-02 For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualified Corning 354277 For cell culture
MEM NeAA Gibco 11140-050 For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X Supplement Stem Cell Technologies 85852 For cell culture
mTesR Basal Medium Stem Cell Technologies 85851 For cell culture
Oncostatin (OSM) peproTech 300-10 For hepatocyte differentiation
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) Promega V8901 For CYP450 activity
PAS staining kit Solarbio G1281 For PAS staining
Pen/Strep Gibco 15140-122 For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG ZSGB-BIO ZB-2305 For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot Beyotime P0256 For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT Kit TOYOBO FSQ-101 For cDNA Synthesis
RNAiso Plus TaKaRa 9109 For RNA Isolation
RPMI 1640 Gibco 11875093 For definitive endoderm formation
Skim milk Sangon Biotech A600669 For second antibody preparation
SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742 For RT-PCR Analysis
Torin2 MCE HY-13002 For definitive endoderm formation
Tween Sigma-Aldrich WXBB7485V For washing buffer preparation

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References

  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
  3. Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
  6. Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
  9. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  10. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
  11. Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
  12. Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
  13. Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
  14. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
  15. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
  16. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
  17. Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
  18. Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
  19. Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
  20. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
  21. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
  22. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  23. Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
  24. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  25. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).

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मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से निर्देशित हेपेटोसिटे-लाइक सेल इंडक्शन के लिए एक कुशल विधि
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Zhou, Q., Xie, X., Zhong, Z., Sun, P., Zhou, X. An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62654, doi:10.3791/62654 (2021).

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