Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى خلايا وظيفية تشبه خلايا الكبد (HLCs) من خلال استكمال أكتيفين A وCHIR99021 باستمرار أثناء التمايز hESC إلى بطانة الرحم النهائية (DE).
Abstract
الوظائف المحتملة للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية (HLCs) المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تبشر بالكثير لنمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية. 10- إن هذه الطريقة هي طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتمايز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى مركبات سداسية الهكربون الوظيفية. ويعتبر إنشاء سلالة من الاندوديرم خطوة رئيسية في التمايز بين المراكز العليا. من خلال طريقتنا، ونحن تنظيم مسارات الإشارات الرئيسية من خلال استكمال مستمر أكتيفين A وCHIR99021 خلال التمايز hESC إلى endoderm نهائي (DE)، تليها جيل من خلايا السلف الكبدي، وأخيرا HLCs مع مورفولوجيا خلايا الكبد نموذجية في طريقة حكمية مع الكواشف محددة تماما. وHESC المشتقة من HLCs التي تنتجها هذه الطريقة التعبير عن علامات مرحلة محددة (بما في ذلك الألبومين، مستقبلات HNF4α النووية، وتوروشولات الصوديوم cotransporting polypeptide (NTCP))، وتظهر خصائص خاصة تتعلق خلايا الكبد ناضجة والوظيفية (بما في ذلك تلطيخ الأخضر إيندوكيانين، تخزين الجليكوجين، تلطيخ hematoxylin-eosin والنشاط CYP3)، ويمكن أن توفر منصة لتطوير التطبيقات القائمة على HLC في دراسة أمراض الكبد.
Introduction
الكبد هو جهاز الأيضية للغاية التي تلعب عدة أدوار, بما في ذلك السمية, تخزين الجليكوجين, وإفراز وتوليف البروتينات1. مسببات الأمراض المختلفة والأدوية والوراثة يمكن أن يسبب تغيرات مرضية في الكبد وتؤثر على وظائفه2،3. تلعب خلايا الكبد ، باعتبارها الوحدة الوظيفية الرئيسية للكبد ، دورا مهما في أنظمة دعم الكبد الاصطناعي والقضاء على سمية الدواء. ومع ذلك ، فإن مورد خلايا الكبد البشرية الأولية محدود في العلاج القائم على الخلايا ، وكذلك في أبحاث أمراض الكبد. لذلك ، فإن تطوير مصادر جديدة للخلايا الكبدية البشرية الوظيفية هو اتجاه بحثي مهم في مجال الطب التجديدي. منذ عام 1998 عندما تم إنشاء hESCs4، وقد تم النظر على نطاق واسع hESCs من قبل الباحثين بسبب إمكاناتها التمايز متفوقة (أنها يمكن أن تفرق في أنسجة مختلفة في بيئة مناسبة) ودرجة عالية من التجديد الذاتي، وبالتالي توفير خلايا المصدر المثالي للكبد الاصطناعي الحيوي، وزرع خلايا الكبد وحتىهندسة أنسجةالكبد 5 .
حاليا، يمكن زيادة كفاءة التمايز الكبدي بشكل كبير من خلال إثراء اندوديرم6. في تمايز النسب من الخلايا الجذعية إلى بطانة الرحم، ومستويات عامل النمو تحويل β (TGF-β) الإشارات ومسارات الإشارات WNT هي العوامل الرئيسية في عقدة مرحلة تشكيل بطانة الرحم. تفعيل مستوى عال من TGF-β وWNT الإشارات يمكن أن تعزز تطوير endoderm7,8. أكتيفين A هو السيتوكين تنتمي إلى عائلة فائقة TGF-β. لذلك ، يستخدم Activin A على نطاق واسع في تحريض الإندوديرم للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) وhESCs9،10. GSK3 هو بروتين سيرين ثريونين كيناز. وقد وجد الباحثون أن CHIR99021، مثبط محدد من GSK3β، يمكن أن تحفز إشارات WNT نموذجية، ويمكن أن تعزز تمايز الخلايا الجذعية في ظل ظروف معينة، مما يشير إلى أن CHIR99021 لديه القدرة على تحفيز تمايز الخلايا الجذعية في endoderm 11،12،13.
هنا نبلغ عن طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتحفيز التمايز الفعال للمركبات الهيدروفلورية إلى مركبات إتش إل سي وظيفية. أنتجت الإضافة المتتابعة ل Activin A و CHIR99021 حوالي 89.7±0.8٪ SOX17 (DE marker) خلايا إيجابية. بعد أن نضجت هذه الخلايا في المختبر، عبرت عن علامات محددة كبدية ومارست مورفولوجيا تشبه الخلايا الكبدية (استنادا إلى تلطيخ الهيماتوكسيلين -إيوزين (H و E)) ووظائف ، مثل امتصاص الأخضر الإندوسيانين (ICG) وتخزين الجليكوجين ونشاط CYP3. وتبين النتائج أن hESCs يمكن تمييزها بنجاح إلى HLCs وظيفية ناضجة بهذه الطريقة ويمكن أن توفر أساسا للبحوث المتعلقة بأمراض الكبد وفحص الأدوية في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. صيانة الخلايا الجذعية
ملاحظة: بروتوكول صيانة الخلية الموضحة أدناه ينطبق على خط الخلية hES03 الاحتفاظ بها في أحادية تابعة. بالنسبة لجميع البروتوكولات التالية في هذه المخطوطة، يجب التعامل مع الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.
- إعداد 1x mTesR الخلايا الجذعية ثقافة المتوسطة عن طريق تخفيف 5x المتوسطة التكميلية إلى mTesR المتوسطة الأساسية.
- إعداد 30x hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة عن طريق تمييع 5 مل من ماتريجل hESC المؤهلين مع 5 مل من DMEM/F12 على الجليد. يخزن عند -20 درجة مئوية.
- إعداد 1x hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة عن طريق تخفيف 33.3 ميكروغرام من 30x hESC المؤهلين Matrigel مع 1 مل من DMEM/F12.
- معطف معقم 6 جيدا، لوحات الأنسجة المعالجة بزراعة مع 1 مل من 1x hESC المؤهلين Matrigel في كل بئر مقدما وتخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اتركيه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
- إذابة hESCs المبردة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق دون اهتزاز. ثم نقل الخلايا فورا عن طريق الأنابيب في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 4 مل prewarmed 37 °C mTesR المتوسطة، pipet صعودا وهبوطا بلطف 2 مرات.
- أجهزة الطرد المركزي hESCs في 200 × ز لمدة 2 دقيقة في RT.
- يستنشق supernatant وإعادة إنفاق الخلايا بلطف في 1 مل من المتوسط mTesR.
- يستنشق المتوسط DMEM/F12 من لوحة والبذور الخلايا في بئر من لوحة 6-جيدا في كثافة 1 × 105 خلايا في 2 مل من mTesR.
- احتضان في حاضنة 5٪ CO2 والحفاظ على الخلايا عن طريق استبدال مع mTesR المتوسطة مسخن يوميا. مرور الخلايا في التقاء ما يقرب من 70-80٪ أو عندما تبدأ مستعمرات الخلية لإجراء اتصال.
2. مرور الخلايا الجذعية والتمايز
- بالنسبة للخلايا الممرة، يستنشق الوسط ويحتضن الخلايا ب 1 مل لكل بئر من محلول الإنزيم (على سبيل المثال، أكوتاسي لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية). ثم نقل الخلايا عن طريق الأنابيب إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 4 مل من DMEM/F12 prewarmed إلى 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز في RT لمدة 2 دقيقة.
- يستنشق المتوسطة وإعادة بلطف بيليه الخلية في 1 مل من المتوسط mTesR.
- إعداد لوحات 24 جيدا عن طريق طلاء مع 250 ميكروغرام من 1x hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة مقدما. البذور hESCs كما هو موضح أعلاه في كثافة 1-1.5 × 105 خلايا لكل بئر في 500 ميكرولتر من المتوسط mTesR.
- السماح للخلايا باحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون.
3. تشكيل دي
- إعداد حلول المخزون من 100 ميكروغرام / مل أكتيفين A مع DPBS تحتوي على 0.2٪ BSA و 3 M CHIR99021 مع DMSO.
- إعداد المرحلة الأولى التمايز المتوسطة الأساسية عن طريق استكمال RPMI المتوسطة مع B27 1x.
- إضافة أكتيفين ألف إلى تركيز نهائي من 100 نانوغرام / مل وCHIR99021 إلى تركيز نهائي قدره 3 ميكرومتر في حجم مناسب من المرحلة الأولى مسخن التمايز المتوسطة الأساسية.
- أسبيرات mTesR المتوسطة من الخلايا واستبدال المرحلة الأولى وسائل الإعلام التمايز التي تحتوي على عوامل التمايز المضافة (على سبيل المثال، 0.5 مل لكل بئر من لوحة 24 جيدا).
- السماح للخلايا باحتضان لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون، واستبدال المرحلة الأولى من الوسائط يوميا بعوامل تمايز مضافة حديثا (الأيام من 0 إلى 2).
ملاحظة: بعد 3 أيام من التمايز، يجب أن تعبر الخلايا المتمايزة عن علامات خلايا DE، مثل FOXA2 و SOX17 و GATA4 و CRCR4 و FOXA1 (الحد الأدنى 80٪ من SOX17 اللازمة للمضي قدما).
4. التفريق بين خلايا السلف الكبدي
- إعداد المرحلة الثانية التمايز وسائل الإعلام الأساسية عن طريق حل استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR) إلى تركيز النهائي من 20٪ في Knock Out DMEM.
- إعداد المرحلة الثانية وسيطة التمايز التي تحتوي على 1٪ DMSO، 1x GlutaMAX، 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) الحل، 100 ميكرومتر 2-ميركابتوثانول و1x البنسلين / العقدية (P / S) إلى الحجم المناسب من KOSR / خروج المغلوب DMEM.
- في اليوم الثالث من التمايز، قم بترطيب الوسط واستبداله بالمرحلة الثانية المتوسطة (على سبيل المثال، 0.5 مل لكل بئر من لوحة بئر 24). ثم احتضان لمدة 24 ساعة.
- في اليوم الرابع من التمايز، قم بترطيب الوسط واستبداله بالمرحلة الثانية المتوسطة (على سبيل المثال، 1 مل لكل بئر من لوحة بئر 24).
- تغيير المتوسطة كل يومين (استبدال المتوسطة في اليوم 6).
ملاحظة: بعد 8 أيام من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن العلامات المناسبة لخلايا السلف الكبدية، مثل HNF4α، AFP، TBX3، TTR، ALB، NTCP، CEBPA (الحد الأدنى 80٪ من HNF4α اللازمة للمضي قدما).
5. تمايز خلايا الكبد
- إعداد 10 ميكروغرام / مل عامل نمو خلايا الكبد (HGF)، 20 ميكروغرام / مل أونكوستاتين (OSM) حلول الأسهم مع DBPS (التي تحتوي على 0.2٪ BSA) ومرشح مع غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر.
- إعداد المرحلة الثالثة التمايز المتوسطة الأساسية (HepatoZYME-SFM (HZM) المتوسطة تكملها مع 10 ميكرومتر هيدروكورتيزون-21-hemisuccinate و 1x P /S).
- إضافة HGF إلى تركيز نهائي من 10 نانوغرام / مل وOSM إلى تركيز نهائي من 20 نانوغرام / مل إلى الحجم المناسب من المرحلة الثالثة مسخن وسيطة التمايز.
- في اليوم الثامن من التمايز، يستنشق المرحلة الثانية المتوسطة من الخلايا ويستبدل بالمرحلة الثالثة المتوسطة (على سبيل المثال، 1 مل لكل بئر من لوحة بئر 24).
- السماح للخلايا باحتضان لمدة 10 أيام عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون، وتغيير وسائط المرحلة الثالثة كل يومين مع عوامل تمايز مضافة حديثا (الأيام 8-18).
ملاحظة: بعد 18 يوما من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن علامات مميزة للخلايا الكبدية، مثل AAT، ALB، TTR، HNF4α، NTCP، ASGR1، CYP3A4. النسبة المئوية للخلايا الإيجابية الألبومين عادة ما تكون أكثر من 90٪.
6. عزل الحمض النووي الريبي، توليف cDNA وتحليل RT-qPCR
- أسبيرات المتوسطة من الخلايا وإضافة كمية مناسبة من كاشف RNAiso Plus، (على سبيل المثال، 0.3 مل لكل بئر من لوحة 24 بئرا). جمع supernatant في أنبوب 1.5 مل والسماح للوقوف في RT لمدة 5 دقائق.
- أضف 60 ميكرولتر من كاشف الكلوروفورم واتركه في RT لمدة 5 دقائق. ثم الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة.
- جمع 125 ميكرولتر supernatant ونقله إلى أنبوب آخر الطرد المركزي. إضافة 160 ميكرولتر من ايزوبروبانول، مزيج جيدا، والوقوف في RT لمدة 10 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي عند 12,000 x g لمدة 10 دقائق.
- إزالة supernatant، إضافة الإيثانول 75٪ إلى عجلت، والطرد المركزي في 7500 × ز لمدة 5 دقائق.
- بعد التجفيف في RT، أضف 40 ميكرولتر من المياه المعالجة ب DEPC لتذوب. بالنسبة إلى qPCR، عكس نسخ 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي مع عدة النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- قم بإجراء RT-qPCR باستخدام مجموعة أدوات تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تطبيع التعبير الجيني بالنسبة للخلايا الجذعية غير المستحثة وتحديد تباين الطي بعد التطبيع إلى GAPDH.
7. التحقق من المناعة من التمايز
- إعداد 1x مخزن الغسيل PBST بإضافة 0.1٪ توين-20 إلى برنامج تلفزيوني.
- يستنشق المتوسطة من الخلايا الملتصقة ويغسل لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني في RT على شاكر.
- اسبيرات برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع 500 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة لكل بئر من لوحة 24 جيدا لإصلاح الخلايا في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إزالة الميثانول وغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني على شاكر لمدة 10 دقيقة في كل مرة في RT.
- كتلة الخلايا مع 500 ميكرولتر من 5٪ BSA أعدت في برنامج تلفزيوني لمدة 1-2 ساعة في RT على شاكر.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في 1: 200 في نفس الحل المستخدم لمنع.
- احتضان الخلايا الثابتة في 300 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر.
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وغسل الخلايا 3 مرات مع PBST لمدة 10 دقيقة في كل مرة في RT على شاكر.
- إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في حل حظر في 1:1000.
- احتضان في 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المحمية من الضوء لمدة 1 ساعة في RT على شاكر.
- يستنشق حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الخلايا 3 مرات مع PBST لمدة 10 دقائق في كل مرة في RT على شاكر.
- احتضان الخلايا مع 300 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل DAPI لمدة 3-5 دقائق، ومن ثم يغسل مرتين مع PBST.
- بعد التجسس PBST، إضافة كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني لالتقاط الصور تحت المجهر مضان.
8. تحليل لطخة الغربية
- إعداد مخزن غسيل TBST 1x بإضافة 0.1٪ Tween-20 إلى المالحة ذات المخزن المؤقت Tris (TBS).
- إعداد المخزن المؤقت للكهربائية SDS-PAGE وحاجز النقل الغربي باستخدام عدة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- حل بروتين الخلية الكلي (40 ميكروغرام) على 10٪ الصوديوم دودسيل كبريتات هلام البولي أكريلاميد وتشغيلها في SDS-PAGE العازلة الكهربائي في التيار المستمر 15 ما لحوالي 2 ساعة.
- نقل الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد متعدد الفينيل (PVDF) في تيار ثابت 300 mA لمدة 2 ساعة في درجة حرارة منخفضة.
ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل ووقت النقل حسب المعدات المستخدمة ونوع الجل ونسبته المئوية. - كتلة الغشاء مع 3٪ BSA أعدت في TBST لمدة 1 ساعة في RT على شاكر.
- احتضان في حل الأجسام المضادة الأولية (1:1000 التخفيف) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر.
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها، غسل غشاء النشاف 3 مرات مع TBST لمدة 15 دقيقة في المرة الواحدة في RT على شاكر.
- احتضان في حل الأجسام المضادة الثانوية (1:2000 التخفيف) لمدة 2 ساعة في RT على شاكر.
- تجاهل محلول الأجسام المضادة الثانوية وغسل الغشاء 3 مرات مع TBST، لمدة 15 دقيقة في كل مرة، في RT على شاكر.
- تصور العصابات المناعية باستخدام كاشف chemiluminescence تليها الأشعة الذاتية. استخدم β-actin كعنصر تحكم التحميل.
9. إندوسياناين امتصاص الأخضر
- إعداد 200 ملغ / مل indocyanine حل الأسهم الخضراء في DMSO.
- إعداد حل العمل عن طريق استكمال المرحلة الثالثة التمايز المتوسطة مع محلول أخضر indocyanine إلى تركيز النهائي من 1 ملغم / مل.
- احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 1-2 ساعة.
- يستنشق المتوسطة وغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- صورة تحت المجهر.
10. دوري حمض شيف (PAS) تلطيخ وهيماتوكسيلين-إيوزين (H &؛ E) تلطيخ
- يستنشق المتوسطة من الخلايا الملتصقة وغسل لفترة وجيزة مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- لتثبيت الخلايا، يستنشق برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع الميثانول الجليد الباردة في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تصور تخزين الجليكوجين بواسطة PAS تلطيخ ومراقبة الخلايا الثنائية بواسطة H &؛ E تلطيخ باستخدام عدة اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- التقاط الصور مع المجهر مضان.
11. المقايسة لنشاط CYP
- قياس نشاط CYP450 باستخدام المقايسات المستندة إلى الخلايا المتاحة تجاريا (P450-Glo Assays) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- استخدم ثلاث تكرارات مستقلة للاختبار. يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرسم التخطيطي لحث HLC من hESCs والصور التمثيلية ذات المجال الساطع لكل مرحلة تمايز تظهر في الشكل 1. في المرحلة الأولى، تمت إضافة أكتيفين A وCHIR99021 لمدة 3 أيام لحث الخلايا الجذعية على تشكيل خلايا إندوديرم. في المرحلة الثانية ، تمايزت خلايا بطانة الرحم إلى خلايا سلف كبدية بعد علاجها بوسط تمايز لمدة 5 أيام. في المرحلة الثالثة، نضجت خلايا الكبد المبكرة وتباينت في HLCs بعد 10 أيام في HGF وOSM(الشكل 1A). في المرحلة النهائية من التمايز، أظهرت الخلايا النمط الظاهري الكبدي النموذجي (الخلايا مضلعة وتوزع بالتساوي وبانتظام)(الشكل 1B).
ولزيادة تأكيد التمايز الكبدي، استخدمت RT-qPCR وتلطيخ الفلورسينس المناعي والنشاف الغربي للكشف عن علامات خلايا الإندوديرم وخلايا السلف الكبدية والخلايا الكبدية الناضجة(الشكل 2). وأظهرت الخلايا المتمايزة مستويات عالية من التعبير عن الجينات والبروتينات المرتبطة بالتمايز في كل مرحلة، مثل علامات الاندودرم SOX17 (89.7± 0.8٪) في اليوم الثالث، علامة السلف الكبدي HNF4α (81.3±2.9٪) في اليوم 8، وكالة الصحافة الفرنسية (86.6±0.3٪) في اليوم 14، وعلامة خلايا الكبد الناضجة ALB (94.5±1.1٪) في اليوم 18. تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية يتم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول.
من أجل الكشف عما إذا كان HLCs وظائف خلايا الكبد، اكتشفنا امتصاص ICG، تخزين الجليكوجين، ونشاط CYP من HLCs، فضلا عن تنفيذ تلطيخ H &؛ E. كما يمكن أن نرى HLCs أظهرت تلطيخالخضراء (الشكل 3A)واسعة النطاق السيتوبلازمية الدوري حمض شيف تلطيخ (الوردي إلى الأرجواني) لوحظ(الشكل 3B)،وهو ما يتفق مع تخزين الجليكوجين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا أن نرى مورفولوجيا ممثل من خلايا الكبد ثنائية الخلايا نموذجية(الشكل 3C). وأخيرا، تم تأكيد النشاط الأنزيمي من CYP3A4، CYP الأيضية الأكثر أهمية في الكبد، من خلال المقايسة النشاط الأنزيمي(الشكل 3D).
| اسم الكاشف | شركة | رقم الكتالوج | تركيز المخزون | التركيز النهائي |
| 2-ميركابتوثانول | سيغما | M7522 | 50 مليون متر | 100 ميكرومتر |
| 488 وصفت الماعز ضد الماوس IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | إذا: 1:1000 |
| 488 وصفت الماعز ضد الأرنب IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | إذا: 1:1000 |
| أكوتاسي | تقنيات الخلايا الجذعية | 7920 | 1 × | 1 × |
| أكتيفين أ | بيبروتيك | 120-14E | 100 ميكروغرام/مل | 100 نانوغرام/مل |
| مكافحة - الألبومين (ALB) | سيغما ألدريتش | A6684 | - | إذا: 1:200; البنك الدولي:1:1000 |
| مكافحة - الإنسان Oct4 | ايكام | Ab19587 | - | إذا: 1:200 |
| مكافحة - α فيتوبروتين (أ ف ب) | سيغما ألدريتش | A8452 | - | إذا: 1:200; البنك الدولي:1:1000 |
| مكافحة -SOX17 | ايكام | ab224637 | - | إذا: 1:200 |
| العامل النووي المضاد للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α) | سيغما ألدريتش | ساب1412164 | - | إذا: 1:200 |
| ملحق B-27 | جيبكو | 17504-044 | 50 x | 1 × |
| جيش صرب البوسنه | بيوتيم | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | سيغما ألدريتش | SML1046 | 3 مليون متر | 3 ميكرومتر |
| DAPI | بيوتيم | C1006 | - | - |
| DEPC المياه | بيوتيم | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 500 ميكرومتر | 250 مليون متر |
| DMEM/F12 | جيبكو | 11320-033 | 1 × | 1 × |
| DMSO | سيغما ألدريتش | D5879 | 1 × | 1 × |
| DPBS | جيبكو | 14190-144 | 1 × | 1 × |
| الغلوتاماكس | جيبكو | 35050-061 | 100 x | 1 × |
| H &؛ E تلطيخ عدة | بيوتيم | C0105S | - | - |
| عامل نمو خلايا الكبد (HGF) | بيبروتيك | 100-39 | 10 ميكروغرام/مل | 10 نانوغرام/مل |
| هيباتوزيمي-SFM (HZM) | جيبكو | 17705-021 | - | - |
| هيدروكورتيزون-21-هيميسوتشينات | سيغما ألدريتش | H4881 | 1 مليون متر | 10 ميكرومتر |
| إندوسيانين | سانغون للتكنولوجيا الحيوية | A606326 | 200 ملغم/مل | 1 ملغم/مل |
| ضرب DMEM | جيبكو | 10829-018 | 1 × | 1 × |
| ضرب ريال متعدد الأنواع | جيبكو | A31815-02 | - | 20% |
| ماتريغل hESC المؤهلة | كورنينج | 354277 | 60 x | 1 × |
| ميم نيا | جيبكو | 11140-050 | 100 x | 1 × |
| ملحق mTesR 5X | تقنيات الخلايا الجذعية | 85852 | 5 × | 1 × |
| mTesR باسال متوسط | تقنيات الخلايا الجذعية | 85851 | 1 × | 1 × |
| أونكوستاتين (OSM) | بيبروتيك | 300-10 | 20 ميكروغرام/مل | 20 نانوغرام/مل |
| P450 - CYP3A4 (لوسيفيرين - PFBE) | بروميغا | V8901 | - | - |
| PAS تلطيخ عدة | سولاربيو | G1281 | - | - |
| القلم / ستريب | جيبكو | 15140-122 | 100 x | 1 × |
| Peroxidase-مترافق الماعز المضادة للفأر IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | البنك الدولي: 1:2000 |
| الأجسام المضادة الأولية تخفيف العازلة لللطخة الغربية | بيوتيم | P0256 | - | - |
| طقم تردد ترايس qPCR RT | 3 - يوبو | FSQ-101 | - | - |
| RNAISO بلس | تاكارا | 9109 | - | - |
| آر بي إم أي 1640 | جيبكو | 11875093 | 1 × | 1 × |
| الحليب الخالي من الدسم | سانغون للتكنولوجيا الحيوية | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR الأخضر ماجستير ميكس | ثيرمو فيشر العلمية | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 ميكرومتر | 15 nM |
| توين | سيغما ألدريتش | WXBB7485V | - | 0.10% |
الجدول 1: مكونات ثقافة الخلية والوسائط الأساسية للتمايز.
| اسم جين | الاختصارات | تسلسلات التمهيديات (F) | تسلسلات التمهيديات (R) |
| POU الفئة 5 هوم بوكس 1 | OCT4 | أغغااكاغ تاتكاغاك |
تاكاغاك ACACTCGGAC |
| صندوق شوكة الرأس A2 | FOXA2 | GCATTCكاتك تيغاكاكغغا |
مجلس التعاون الخليجيCTTGCAGC كاغاتاكات |
| SRY-مربع عامل النسخ 17 | SOX17 | تاتتغتكتغ كاكتغاكات |
تيغغاكاكات هيئة هيئة ادارة الشؤون الاقتصادية |
| مستقبلات الفئة المجعدة 8 | FZD8 | أكغكتاكا تاكاكتاكاكا |
GTACATGCTGC أكاغاغا |
| C-X-C عزر مستقبلات كيموكين 4 | CXCR4 | CACCGCATCT غاغاكا |
مجلس التعاون الخليجي سي جي جي تاتج تات |
| صندوق شوكة الرأس A1 | FOXA1 | أغكاتاكغا أكاغككتغ |
تاكاكاتج غاتاجيك سي سي |
| صندوق منزل Msh 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA أغاغاكتاك |
مجلس التعاون الخليجي CTTCTCCAG |
| ميسوجينين 1 | MSGN1 | جي سي تيغااتكتا TTCTTCكتCC |
غاغاغكاتاكا تاتغتاجتاك |
| كودال نوع هوم بوكس 1 | CDX1 | أجاججتكات كات تاكاغكجتتاك |
تكتغكتكت TGTTCACTTTG |
| مربع المنزل المتخطي حتى 1 | EVX1 | GCTGTCTCTCTG أكاآاتجكت |
كاتكتككتكتكتكت لجنة مكافحة الإرهاب |
| ميسودرم الخلفي BHLH عامل النسخ 2 | ميسب2 | أغكتغغغغ سي سي تي سي تات |
تسكتكتغا أغاكاكا |
| NK2 هوم بوكس 5 | NKX2.5 | كاجت جي جي جي TCTGCCTTT |
كاكتكتاتكت TTCGGCTCTA |
| ISL ليم هوم بوكس 1 | ISL1 | أغاتاتاتاكاغت تجيكغغاتا |
أكاكاغغا أكاكتكغات |
| الخلايا الكبدية العامل النووي 4 ألفا | HNF4α | أكاتاغاكاتغ مجلس التعاون الخليجي |
CGTTGAGG GTGCCTTCT |
| ألفا فيتوبروتين | برس | أكتغاتكاج أكاكتغكا |
دجكاجتكااتج كاتكتكا |
| T-مربع معامل النسخ 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG كجاججتغا |
أكجتغتغغ غاغاتكتغ |
| ترانسثيرتين | TTR | أغاغاغكتغ CTجاتغاك |
جي تي جي سيتكا غاغاتغ |
| الزلال | القلب | CCCCAAGTGT كاكاتكا |
جي تي سي جياكا كغاتاغ |
| توروتشولات الصوديوم cotransporting متعدد الببتيد | NTCP | كاتاغاتسكغت CCTCAAATCCA |
مجلس التعاون الخليجياكاكتاك أغاغااتغ |
| CCAAT محسن ملزم بروتين ألفا | سيبا | أغاغاغاتغا مجلس التعاون الخليجي |
AGTGCغاتك غاغاكتغاغ |
| سيربين الأسرة عضوا 1 | AAT | أاتغاكتكا CCCACGAT |
أكتاغتغاغاتغ CCCAGT |
| مستقبلات البروتينات الآسيوية 1 | ASGR1 | چاغاككتاغا CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG غاغتكتكت |
| السيتوكروم P450 الأسرة 3 الأسرة الفرعية عضو 4 | CYP3A4 | تي جي تياتاكاتكغ TTGGCGTGGG |
أاتججكاغت كاكاجتغا |
الجدول 2: التسلسلات التمهيدية لتحليل Q-PCR.
الشكل 1:مخطط تخطيطي للبروتوكول لمواصفات DE وHLCs. (أ)عرض تخطيطي لاستراتيجية التمايز من 3 مراحل المستخدمة في هذه الدراسة. (ب) مورفولوجيا الخلايا المتمايزة في الأيام 0 و 3 و 8 و 14 و 18. مقياس الشريط = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مرحلة محددة علامة التعبير خلال التمايز hESC إلى HLCs. (أ) mRNA التعبير عن الجينات مرحلة محددة. (B-C) التعبير البروتيني عن الجينات الخاصة بالمرحلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:وظائف HESC المشتقة من HLCs. (أ) HLCs تعامل ل 1 ح مع 1 ملغ / مل indocyanine الأخضر إظهار امتصاص كما تم تقييمها من قبل المرحلة المجهر. (ب) ممثل PAS تلطيخ الصور التي تشير إلى تخزين الجليكوجين. (ج) ممثل HE تلطيخ الصور التي تظهر خلايا binucleates. (د) نشاط المستوى القاعدي من الإنزيمات الرئيسية السيتوكروم P450. يتم تقديم جميع القيم على أنها متوسط ± SD. مقياس شريط = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نقدم طريقة تدريجية تحفز HLCs من hESCs على ثلاث مراحل. وفي المرحلة الأولى، استخدمت أكتيفين ألف وCHIR99021 لتمييز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى DE. وفي المرحلة الثانية، استخدمت الخلايا السلفية KO-DMEM وDMSO لتمييز DE إلى خلايا سلف كبدية. وفي المرحلة الثالثة، استخدمت HZM بالإضافة إلى HGF وOSM وهيدروكورتيزون 21-hemisuccinate ملح الصوديوم لمواصلة التمييز بين خلايا السلف الكبدي إلى HLCs.
10- وينبغي أخذ الخطوات الحاسمة التالية في الاعتبار عند استخدام البروتوكول. كثافة التمايز الأولي للخلايا والتوقيت الدقيق للتغيرات المتوسطة هي عوامل مهمة للتمايز الناجح. عندما نبدأ في التفريق ، يجب علينا التأكد من أن كثافة البذر الأولية مناسبة ، عند التقاء حوالي 30-40 ٪ ، عندما تبدأ الخلايا للتو في الاتصال مع بعضها البعض ، وأن يتم ترتيب المساحات بين الخلايا بالتساوي في شبكة تحت مجال الرؤية. أثناء التمايز ، يجب تغيير وسيط التمايز المقابل بدقة في الوقت المحدد ، خاصة في المرحلة الأولى واللحظة الرئيسية لكل مرحلة استبدال ، لضمان أن الخلايا تفرق في الوضع والمرحلة التي تحاكي عملية التطور الجنيني.
وتكريس المرحلة الأولى من التمايز بين مركبات الكربون الهيدروفلورية في نهاية الأمر أهمية خاصة. عادة ما يكون هناك عدد كبير من الخلايا التي تنفصل وتطفو خلال المرحلة الأولى من التمايز ، وهي مرحلة حرجة لمصير الخلية ، ولكن في هذا الوقت لا تزال الخلايا تحتفظ بالقدرة على الانتشار. لذلك ، يمكن أن يصل التقاء الخلايا إلى حوالي 90-100٪ في نهاية المرحلة الأولى. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه في بداية المرحلة الثالثة من التمايز (أي اليوم 8) ، يبدأ السيتوبلازم في الخلايا في التكثيف ، مما يؤدي إلى اكتساب الخلايا تدريجيا مورفولوجيا نحيلة. ولكن في اليوم 10 ، يتعافى السيتوبلازم تدريجيا ، وفي اليوم 14 ، تبدأ الخلايا في إظهار مورفولوجيا متعددة الهدرية الواضحة للخلايا الكبدية.
في هذه الدراسة، فإن HLCs التي تم الحصول عليها هي في الواقع أقرب إلى خلايا الكبد الجنينية حيث أن وكالة الصحافة الفرنسية أعلى من ALB في اليوم 18. على الرغم من أن HLCs المتولدة تمارس خصائص ووظائف خلايا الكبد ، لا تزال هناك فجوة بين HLCs والخلايا الكبدية البشرية الأولية ، مما يشير إلى أن خلايانا المتمايزة لا تزال غير ناضجة وظيفيا. ولذلك، فإن العمل في المستقبل سوف يحتاج إلى التركيز على زيادة تحسين طريقة التمايز.
في الوقت الحاضر، عوامل النمو والمركبات الجزيئية الصغيرة مثل أكتيفين A9،10،14،Wnt3a15،CHIR16،Torin217 و IDE118،19 تستخدم عادة للحث على التمايز DE في مختلف أنظمة التمايز. استخدمت مجموعة سونغ أكتيفين A للتمييز بين الخلايا الجذعية إلى DE ، واستخدمت FGF4 (عامل نمو الخلايا الليفية 4) ، BMP2 (بروتين مورفوجينيتي العظام 2) ، HGF ، KGF (عامل نمو الكيراتينية) ، OSM وديكسي للمواصفات الكبدية ونضوج HLCs20. مجموعة سوليفان المستحثة دي من قبل Activin A و Wnt 3a، وتسبب HLCs من قبل β-ME (2-mercaptoethanol)، DMSO، الأنسولين، HGF، OSM21. استخدم فريق Siller CHIR99021 لتمايز DE ، DMSO ، Dihexa (عامل نمو الكبد ناهض مستقبلات N-hexanoic-Tyr) ، وديكسي لتمايز HLC للحصول على HLC مع خصائص وظائف الكبد16. ومع ذلك، تستخدم بعض هذه الطرق العديد من عوامل النمو المؤتلفة لتوليد DE بتكلفة عالية وبعضها يستخدم جزيئات صغيرة فقط لتوليد DE بكفاءة أقل. أكتيفين A هو عامل حاسم لتوليد DE. لقد حاولنا استبدال أكتيفين A مع جزيئات صغيرة أخرى ولكن عادة ما تحصل على كفاءة أقل. لذلك، نعتمد طريقة إضافة أكتيفين A وCHIR99021 كعوامل محفزة ل DE، والكشف عن الجينات المرتبطة بالتمايز في كل مرحلة عن طريق Q-PCR، وفلورية المناعة والنشاف الغربي.
في السنوات الأخيرة، وإنشاء نظام تجريبي لتوجيه الحث HLC من hESCs هو أساس مهم لنمذجة تطوير خلايا الكبد وفحص الأدوية للأمراض المرتبطة بالكبد. في الوقت نفسه ، يمكن أن توفر أيضا مصدرا فعالا للخلايا لزرع خلايا الكبد ، وهندسة أنسجة الكبد ، والكبد الاصطناعي الحيوي وغيرها من الأبحاث. وقد أفيد أن HLCs المستمدة من الخلايا الجذعية قد استخدمت لإجراء دراسات مختلفة على العدوى الفيروسية كنموذج لفحص المخدرات للتنبؤ الاستجابات الناجمة عن المخدرات الكبدية ودراسة المسار المناعي الفطري ومسارات الإشارات من الخلايا10،22،23،24،25. عموما، هذه الطريقة يدخل بالتفصيل كفاءة تشبه خلايا الكبد تقنية التمايز الخلية من hESCs التي يمكن أن تميز بنجاح hESCs إلى خلايا الكبد وظيفية ناضجة. وتوفر النتائج منصة لتطوير التطبيقات القائمة على HLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81870432 81570567 إلى شركة X.L.Z. (رقم 81571994 إلى شركة P.N.S.)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة غوانغدونغ، الصين (رقم 2020A1515010054 إلى P.N.S.)، مؤسسة جامعة لي كا شينغ شانتو (رقم L1111 2008 إلى P.N.S.). نود أن نشكر البروفيسور ستانلي لين من كلية الطب بجامعة شانتو على المشورة المفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
