Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).
Abstract
Les fonctions potentielles des cellules de type hépatocytes (CHN) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont très prometteuses pour les applications de modélisation des maladies et de dépistage des médicaments. Il est fourni ici une méthode efficace et reproductible pour différencier les CSEh en CSH fonctionnels. L’établissement d’une lignée endodermique est une étape clé dans la différenciation aux HLCs. Par notre méthode, nous régulons les voies de signalisation clés en complétant continuellement l’Activine A et le CHIR99021 lors de la différenciation hESC en endoderme définitif (DE), suivie de la génération de cellules progénitrices hépatiques, et enfin des CHN avec une morphologie hépatocytes typique dans une méthode par étapes avec des réactifs complètement définis. Les HNC dérivés du hESC produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques au stade (y compris l’albumine, le récepteur nucléaire HNF4α et le polypeptide de cotransport du taurocholate de sodium (NTCP)), et présentent des caractéristiques particulières liées aux hépatocytes matures et fonctionnels (y compris la coloration verte à l’indocyanine, le stockage du glycogène, la coloration à l’hématoxyline-éosine et l’activité CYP3), et peuvent fournir une plate-forme pour le développement d’applications à base de HLC dans l’étude des maladies du foie.
Introduction
Le foie est un organe hautement métabolique qui joue plusieurs rôles, notamment la désoxydation, le stockage du glycogène, la sécrétion et la synthèse des protéines1. Divers agents pathogènes, médicaments et hérédité peuvent provoquer des changements pathologiques dans le foie et affecter ses fonctions2,3. Les hépatocytes, en tant que principale unité fonctionnelle du foie, jouent un rôle important dans les systèmes artificiels de soutien du foie et l’élimination de la toxicité des médicaments. Cependant, la ressource en hépatocytes humains primaires est limitée dans la thérapie cellulaire, ainsi que dans la recherche sur les maladies du foie. Par conséquent, le développement de nouvelles sources d’hépatocytes humains fonctionnels est une direction de recherche importante dans le domaine de la médecine régénérative. Depuis 1998, date à laquelle les CSEh ont étéétablies, 4, les CSEh ont été largement prises en compte par les chercheurs en raison de leur potentiel de différenciation supérieur (ils peuvent se différencier en divers tissus dans un environnement approprié) et de leur haut degré d’autorenouvrabilité, et fournissent ainsi des cellules sources idéales pour les foies bioartificiels, la transplantation d’hépatocytes et même l’ingénierie tissulaire hépatique5.
Actuellement, l’efficacité de la différenciation hépatique peut être considérablement augmentée en enrichissant l’endoderme6. Dans la différenciation de la lignée des cellules souches en endoderme, les niveaux de la signalisation du facteur de croissance transformant β (TGF-β) et des voies de signalisation WNT sont les facteurs clés dans le nœud de l’étape de formation de l’endoderme. L’activation d’un haut niveau de signalisation TGF-β et WNT peut favoriser le développement de l’endoderme7,8. L’activine A est une cytokine appartenant à la superfamille TGF-β. Par conséquent, l’activine A est largement utilisée dans l’induction endodermique de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) et decsh 9,10. GSK3 est une protéine kinase sérine-thréonine. Les chercheurs ont constaté que CHIR99021, un inhibiteur spécifique de GSK3β, peut stimuler les signaux WNT typiques, et peut promouvoir la différenciation des cellules souches dans certaines conditions, ce qui suggère que CHIR99021 a le potentiel d’induire la différenciation des cellules souches dans l’endoderme 11,12,13.
Ici nous rapportons une méthode efficace et reproductible pour induire efficacement la différenciation des cseh en HLCs fonctionnels. L’addition séquentielle de l’Activine A et du CHIR99021 a produit environ 89,7±0,8 % de cellules SOX17 (marqueur DE) positives. Après avoir été encore maturées in vitro,ces cellules ont exprimé des marqueurs spécifiques hépatiques et exercé hépatocytes-comme la morphologie (basée sur la souillure d’hématoxyline-éosine (H &E)) et les fonctions, telles que l’absorption du vert d’indocyanine (ICG), le stockage de glycogène et l’activité CYP3. Les résultats montrent que les CSEh peuvent être différenciés avec succès en CSH fonctionnels matures par cette méthode et peuvent fournir une base pour la recherche liée aux maladies du foie et le dépistage in vitro des médicaments.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maintien des cellules souches
REMARQUE: Le protocole de maintenance cellulaire décrit ci-dessous s’applique à la lignée cellulaire hES03 maintenue dans une monocouche adhérente. Pour tous les protocoles suivants dans ce manuscrit, les cellules doivent être manipulées sous une armoire de sécurité biologique.
- Préparer 1x mTesR de milieu de culture de cellules souches en diluant 5x milieu supplémentaire au milieu de base mTesR.
- Préparer 30x milieu Matrigel qualifié hESC en diluant 5 mL de Matrigel qualifié hESC avec 5 mL de DMEM/F12 sur la glace. Conserver à -20 °C.
- Préparer 1x milieu Matrigel qualifié hESC en diluant 33,3 μL de Matrigel qualifié hESC 30x avec 1 mL de DMEM/F12.
- Enrobez 6 puits stériles, des plaques traitées par culture tissulaire avec 1 mL de 1x Matrigel qualifié hESC dans chaque puits à l’avance et conservez à 4 °C pendant la nuit. Laisser à température ambiante (RT) pendant au moins 30 min avant utilisation.
- Décongeler les CSEh cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C pendant 3 min sans trembler. Ensuite, transférez immédiatement les cellules par pipetage dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 4 mL de milieu pré-retourné à 37 °C mTesR, pipetez doucement de haut en bas 2 fois.
- Centrifuger les CSEh à 200 x g pendant 2 min à TA.
- Aspirer le surnageant et ressusciter doucement les cellules dans 1 mL de milieu mTesR.
- Aspirer le milieu DMEM/F12 de la plaque et ensemencer les cellules dans un puits de plaque de 6 puits à une densité de 1 x 105 cellules dans 2 mL de mTesR.
- Incuber dans un incubateur à 5% deCO2 et maintenir les cellules en les remplaçant quotidiennement par un milieu mTesR préchauffé. Faites passer les cellules à environ 70-80% de confluence ou lorsque les colonies cellulaires commencent à entrer en contact.
2. Passage et différenciation des cellules souches
- Pour les cellules passaging, aspirer le milieu et incuber les cellules avec 1 mL par puits de solution enzymatique (p. ex. Accutase pendant 5 min à 37 °C. Ensuite, transférez les cellules par pipetage dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 4 mL de DMEM / F12 pré-pré-contrecarré à 37 ° C.
- Centrifuger les cellules à 200 x g à RT pendant 2 min.
- Aspirer le milieu et ressusciter doucement le culot cellulaire dans 1 mL de milieu mTesR.
- Préparez à l’avance des plaques de 24 puits en enduisant 250 μL de milieu Matrigel qualifié pour 1x hESC. Semez les CSEh décrits ci-dessus à une densité de 1 à 1,5 x10 5 cellules par puits dans 500 μL de milieu mTesR.
- Laisser les cellules incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur au CO2.
3. Formation de DE
- Préparer des solutions d’origine de 100 μg/mL d’Activine A avec du DPBS contenant 0,2 % de BSA et 3 mM de CHIR99021 avec du DMSO.
- Préparer le milieu de base de différenciation de l’étape I en complétant le milieu RPMI avec 1x B27.
- Ajouter l’activine A à une concentration finale de 100 ng/mL et CHIR99021 à une concentration finale de 3 μM dans un volume approprié de milieu de base de différenciation préchauffé de stade I.
- Aspirer le milieu mTesR des cellules et le remplacer par un milieu de différenciation de stade I contenant des facteurs de différenciation supplémentaires (p. ex., 0,5 mL par puits d’une plaque de 24 puits).
- Laisser les cellules incuber pendant 3 jours à 37 °C dans un incubateur à CO2, en remplaçant quotidiennement les milieux de stade I par des facteurs de différenciation fraîchement ajoutés (Jours 0-2).
REMARQUE: Après 3 jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs de cellules DE, telles que FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 et FOXA1 (minimum 80% de SOX17 nécessaire pour continuer).
4. Différenciation des cellules progénitrices hépatiques
- Préparer les milieux de base de différenciation de stade II en dissolvant le remplacement du sérum knockout (KOSR) à une concentration finale de 20% dans le DMEM Knock Out.
- Préparer un milieu de différenciation de stade II contenant 1 % de DMSO, 1x GlutaMAX, 1x solution d’acides aminés non essentiels (NEAA), 100 μM de 2-mercaptoéthanol et 1x de pénicilline/streptomycine (P/S) au volume approprié de KOSR/KNOCKOUT DMEM.
- Le jour 3 de la différenciation, aspirer le milieu et le remplacer par le milieu de stade II (p. ex., 0,5 mL par puits d’une plaque de 24 puits). Puis incuber pendant 24 h.
- Le jour 4 de la différenciation, aspirer le milieu et le remplacer par le milieu de stade II (p. ex., 1 mL par puits d’une plaque de 24 puits).
- Changez le support tous les deux jours (remplacez medium le jour 6).
REMARQUE: Après 8 jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs appropriés des cellules progénitrices hépatiques, telles que HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimum 80% de HNF4α nécessaire pour procéder).
5. Différenciation des hépatocytes
- Préparer des solutions d’origine d’oncostatine (OSM) de 10 μg/mL avec du DBPS (contenant 0,2 % de BSA) et filtrer avec une membrane filtrante de 0,22 μm.
- Préparer le milieu de base de différenciation de stade III (milieu HepatoZYME-SFM (HZM) complété par 10 μM d’hydrocortisone-21-hémisuccinate et 1x P/S).
- Ajouter HGF à une concentration finale de 10 ng/mL et OSM à une concentration finale de 20 ng/mL au volume approprié de milieu de différenciation préchauffé de stade III.
- Le jour 8 de la différenciation, aspirer le milieu de stade II à partir des cellules et le remplacer par le milieu de stade III (p. ex., 1 mL par puits d’une plaque de 24 puits).
- Laisser les cellules incuber pendant 10 jours à 37 °C dans un incubateur de CO2, en changeant de milieu de stade III tous les deux jours avec des facteurs de différenciation fraîchement ajoutés (jours 8-18).
REMARQUE: Après 18 jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs caractéristiques des hépatocytes, tels que AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Le pourcentage de cellules albumines positives est généralement supérieur à 90%.
6. Isolement de l’ARN, synthèse de l’ADNc et analyse rt-qPCR
- Aspirer le milieu à partir des cellules et ajouter la quantité appropriée de réactif RNAiso Plus (p. ex., 0,3 mL par puits d’une plaque de 24 puits). Recueillir le surnageant dans un tube de 1,5 mL et laisser reposer à RT pendant 5 min.
- Ajouter 60 μL de réactif chloroforme et le laisser à TA pendant 5 min. Centrifuger ensuite à 12 000 x g pendant 15 min.
- Prélever le surnageant de 125 μL et le transférer dans un autre tube de centrifugation. Ajouter 160 μL d’isopropanol, bien mélanger et rester à TA pendant 10 min.
- Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min.
- Retirer le surnageant, ajouter 75 % d’éthanol au précipité et centrifuger à 7 500 x g pendant 5 min.
- Après séchage à TA, ajouter 40 μL d’eau traitée au DEPC pour dissoudre. Pour le qPCR, transcrivez 2 μg d’ARN total avec un kit de transcription inverse selon le protocole du fabricant.
- Effectuez rt-qPCR à l’aide d’un kit commercial selon le protocole du fabricant.
- Normaliser l’expression génique par rapport aux cellules souches non induites et déterminer la variation du pli après la normalisation à GAPDH.
7. Validation de la différenciation par immunofluorescence
- Préparez 1x tampon de lavage PBST en ajoutant 0,1 % de Tween-20 au PBS.
- Aspirer le milieu à partir de cellules adhérentes et laver brièvement avec du PBS à TA sur un agitateur.
- Aspirer le PBS et incuber les cellules avec 500 μL de méthanol glacé par puits d’une plaque de 24 puits pour fixer les cellules à -20 °C pendant la nuit.
- Retirer le méthanol et laver les cellules 3 fois avec du PBS sur un agitateur pendant 10 min à chaque fois à TA.
- Cellules de bloc avec 500 μL de BSA à 5% préparées dans du PBS pendant 1-2 h à RT sur un agitateur.
- Diluer l’anticorps primaire à 1: 200 dans la même solution utilisée pour le blocage.
- Incuber les cellules fixes dans une solution d’anticorps primaires de 300 μL pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur.
- Après une incubation nocturne, laver les cellules 3 fois avec du PBST pendant 10 min à chaque fois à TA sur un shaker.
- Préparer une solution d’anticorps secondaires dans une solution bloquante à 1:1000.
- Incuber dans 300 μL de solution d’anticorps secondaires protégée de la lumière pendant 1 h à TA sur un agitateur.
- Aspirer la solution d’anticorps secondaires et laver les cellules 3 fois avec pbst pendant 10 min à chaque fois à TA sur un shaker.
- Incuber des cellules avec 300 μL de 1 μg/mL de DAPI pendant 3 à 5 min, puis laver deux fois avec du PBST.
- Après avoir aspiré le PBST, ajoutez une quantité appropriée de PBS pour prendre des photos sous un microscope à fluorescence.
8. Analyse par transfert western
- Préparez 1x tampon de lavage TBST en ajoutant 0,1 % de Tween-20 à la solution saline tris tamponnée (TBS).
- Préparez le tampon d’électrophorèse SDS-PAGE et le tampon de transfert occidental à l’aide d’une trousse commerciale selon le protocole du fabricant.
- Résoudre la protéine cellulaire totale (40 μg) sur un gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium à 10 % et fonctionner dans un tampon d’électrophorèse SDS-PAGE à un courant constant de 15 mA pendant environ 2 h.
- Transférer le gel dans une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) à courant constant de 300 mA pendant 2 h à basse température.
REMARQUE: Le temps de fonctionnement et le temps de transfert peuvent varier en fonction de l’équipement utilisé et du type et du pourcentage du gel. - Bloquer la membrane avec 3% de BSA préparé dans TBST pendant 1 h à RT sur un shaker.
- Incuber dans une solution d’anticorps primaires (dilution 1:1000) pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur.
- Après incubation de nuit, laver la membrane buvarde 3 fois avec TBST pendant 15 min par temps à RT sur un shaker.
- Incuber dans une solution d’anticorps secondaires (dilution 1:2000) pendant 2 h à TA sur un agitateur.
- Jeter la solution d’anticorps secondaires et laver la membrane 3 fois avec TBST, pendant 15 min à chaque fois, à TA sur un shaker.
- Visualiser les bandes immunoréactives à l’aide d’un réactif de chimiluminescence suivi d’une autoradiographie. Utilisez β-actine comme contrôle de chargement.
9. Absorption verte de l’indocyanine
- Préparer une solution mère verte d’indocyanine à 200 mg/mL dans du DMSO.
- Préparer une solution de travail en complétant le milieu de différenciation de stade III avec une solution verte d’indocyanine jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL.
- Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5% deCO2 pendant 1-2 h.
- Aspirer le milieu et laver les cellules 3 fois avec du PBS.
- Photographier au microscope.
10. Coloration périodique d’Acide-Schiff (PAS) et coloration d’hématoxyline-éosine (H&E)
- Aspirer le milieu à partir des cellules adhérentes et laver brièvement deux fois avec du PBS.
- Pour la fixation cellulaire, aspirer le PBS et incuber les cellules avec du méthanol glacé à -20 °C pendant la nuit.
- Visualisez le stockage du glycogène par coloration PAS et observez les cellules binucleated par coloration H &E à l’aide d’un kit suivant les instructions du fabricant.
- Prenez des images avec un microscope à fluorescence.
11. Analyse de l’activité CYP
- Mesurer l’activité du CYP450 à l’aide de tests cellulaires disponibles dans le commerce (tests P450-Glo) conformément aux instructions du fabricant.
- Utilisez trois répétitions indépendantes pour les tests. Les données sont représentées sous la forme de la moyenne ± et.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le diagramme schématique de l’induction HLC à partir des CSEh et des images représentatives en champ lumineux de chaque étape de différenciation sont illustrés à la figure 1. Au stade I, l’activine A et le CHIR99021 ont été ajoutés pendant 3 jours pour inciter les cellules souches à former des cellules endodermiques. Au stade II, les cellules endodermiques se sont différenciées en cellules progénitrices hépatiques après avoir été traitées avec un milieu de différenciation pendant 5 jours. Au stade III, les hépatocytes précoces avaient mûri et se sont différenciés en HLCs après 10 jours dans HGF et OSM(figure 1A). Dans la dernière étape de la différenciation, les cellules ont montré un phénotype hépatocytaire typique (les cellules sont polygonales et réparties uniformément et régulièrement) (Figure 1B).
Pour confirmer davantage la différenciation hépatique, rt-qPCR, coloration par immunofluorescence et western blotting ont été utilisés pour détecter les marqueurs des cellules endodermiques, des cellules progénitrices hépatiques et des hépatocytes matures(figure 2). Les cellules différenciées ont montré des niveaux d’expression élevés de gènes et de protéines liés à la différenciation à chaque étape, tels que les marqueurs endodermiques SOX17 (89,7± 0,8%) au jour 3, le marqueur progéniteur hépatique HNF4α (81,3±2,9%) au jour 8, l’AFP (86,6±0,3%) au jour 14 et le marqueur hépatocytes mature ALB (94,5±1,1%) au jour 18. Ces résultats indiquent que hepatocyte-comme des cellules sont générées par ce protocole.
Afin de détecter si HLCs ont des fonctions de hepatocyte, nous avons détecté la prise d’ICG, le stockage de glycogène, et l’activité de CYP de HLCs, aussi bien que la souillure exécutée de H&E. Comme on peut le voir, les CHN présentaient une coloration verte (figure 3A) et une coloration cytoplasmique périodique étendue de l’acide-Schiff (rose à violet) a été observée(figure 3B),ce qui est compatible avec le stockage du glycogène. De plus, on peut voir la morphologie représentative d’un hépatocytes binucléé typique(figure 3C). Enfin, l’activité enzymatique du CYP3A4, le CYP métabolique le plus important dans le foie, a été confirmée par un test d’activité enzymatique (Figure 3D).
| Nom du réactif | Compagnie | Numéro de catalogue | Concentration des stocks | Concentration finale |
| 2-mercaptoéthanol | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| 488 chèvre étiquetée contre souris IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | SI : 1:1000 |
| 488 chèvre étiquetée contre les IgG de lapin | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | SI : 1:1000 |
| Accutase | Technologies des cellules souches | 7920 | 1 x | 1 x |
| Activine A | peproTech | 120 à 14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albumine (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | - | SI : 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Humain Oct4 | Abcam | Ab19587 | - | SI : 1:200 |
| Anti - α-fœtoprotéine (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | - | SI : 1:200; WB:1:1000 |
| Anti-SOX17 | Abcam | ab224637 | - | SI : 1:200 |
| Facteur nucléaire anti-hépatocytes 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | BRS1412164 | - | SI : 1:200 |
| Supplément B-27 | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| DEPC-eau | Beyotime | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| Kit de coloration H&E | Beyotime | C0105S | - | - |
| Facteur de croissance des hépatocytes (HGF) | peproTech | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| Hépatose-FMD (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Hydrocortisone-21-hémisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | 200 mg/mL | 1 mg/mL |
| Assommer DMEM | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Knock Out SR Multi-Espèces | Gibco | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-qualifié | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| Supplément mTesR 5X | Technologies des cellules souches | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR Milieu basal | Technologies des cellules souches | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatine (OSM) | peproTech | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciférine - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| Kit de coloration PAS | Solarbio | G1281 | - | - |
| Stylo/Strep | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| IgG anti-souris de chèvre conjuguée à la peroxydase | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | WB : 1:2000 |
| Tampon de dilution d’anticorps primaires pour western Blot | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | - | - |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Lait écrémé | Sangon Biotech | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientifique | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tableau 1 : Composants de la culture cellulaire et des milieux de base de différenciation.
| Nom du gène | Abréviations | séquences d’amorces(F) | séquences d’amorces (R) |
| POU Classe 5 Homeobox 1 | 4 octobre | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| Boîte de tête de fourche A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC CAGAATACACATT |
| Facteur de transcription SRY-Box 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC CACTTGAACAGT |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Récepteur de classe crépue 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| C-X-C Motif Chemokine Receptor 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| Boîte de tête de fourche A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mésogénine 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Type caudal Homeobox 1 | CDX1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Homeobox même ignoré 1 | EVX1 | GCTGTCTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCTCACTCT CTCCTCCAAA |
| Facteur de transcription BHLH postérieur mésoderme 2 | MESP2 | AGCTTGGGTG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2.5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTT TTCGGCTCTA |
| ISL LIM Homeobox 1 | LSS1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Facteur nucléaire hépatocytes 4 Alpha | HNF4α | ACATGGACATG GCCGACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Alpha Fetoprotéine | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| Facteur de transcription T-Box 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transthyrétine | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albumine | AUBE | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Polypeptide de cotransport de taurocholate de sodium | NTCP | CATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Enhancer Binding Protein Alpha | CEBPA | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Famille Serpin Membre A 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
ACCTTAGTGATG CCCAGT |
| Récepteur Asialoglycoprotéine 1 | ASGR1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Cytochrome P450 Famille 3 Sous-famille A Membre 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tableau 2 : Séquences d’amorce pour l’analyse q-PCR.
Figure 1: Schéma de principe du protocole pour la spécification des DE et des HLC. (A) Présentation schématique de la stratégie de différenciation en 3 étapes utilisée dans cette étude. (B) Morphologie des cellules différenciées aux Jours 0, 3, 8, 14 et 18. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Expression de marqueurs spécifiques au stade lors dela différenciation du CSEh en CHN( A)expression de gènes spécifiques au stade. (B-C) Expression protéique de gènes spécifiques au stade. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Les fonctions des CHN dérivés du HESC. (A)CHN traités pendant 1 h avec 1 mg/mL d’indocyanine verte démontrent l’absorption telle qu’évaluée par microscopie de phase. (B) Images représentatives de coloration PAS indiquant le stockage de glycogène. (C) Images représentatives de coloration HE montrant des cellules binucléates. (D) Activité de niveau basal des enzymes principales du cytochrome P450. Toutes les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous présentons une méthode par étapes qui induit des CHN à partir de CSEh en trois étapes. Dans la première étape, Activin A et CHIR99021 ont été utilisés pour différencier les CSEh en DE. Dans la deuxième étape, KO-DMEM et DMSO ont été utilisés pour différencier DE en cellules progénitrices hépatiques. Au cours de la troisième étape, le HZM plus HGF, l’OSM et le sel de sodium de l’hydrocortisone 21-hemisuccinate ont été utilisés pour continuer à différencier les cellules progénitrices hépatiques en CHN.
Les étapes critiques suivantes doivent être prises en considération lors de l’utilisation du protocole. La densité initiale de différenciation des cellules et le moment précis des changements moyens sont des facteurs importants pour la différenciation réussie. Lorsque nous commençons à différencier, nous devons nous assurer que la densité d’ensemencement initiale est appropriée, à une confluence d’environ 30-40%, lorsque les cellules commencent tout juste à entrer en contact les unes avec les autres, et que les espaces intercellulaires sont uniformément disposés dans un réseau sous le champ de vision. Au cours de la différenciation, le milieu de différenciation correspondant doit être changé avec précision au moment indiqué, en particulier dans la première étape et le moment clé de chaque étape de remplacement, pour s’assurer que les cellules se différencient dans le mode et l’étape imitant le processus de développement embryonnaire.
La première étape de la différenciation des CSEh en DE est particulièrement importante. Il y a habituellement un grand nombre de cellules qui se détachent et flottent pendant l’étape I de la différenciation, qui est une étape critique pour le destin cellulaire, mais à ce moment-là les cellules conservent encore la capacité de proliférer. Par conséquent, la confluence des cellules peut atteindre environ 90-100% à la fin de l’étape I. En outre, il convient de noter qu’au début de la phase III de différenciation (c’est-à-dire le jour 8), le cytoplasme des cellules commence à se condenser, ce qui entraîne l’acquisition progressive par les cellules d’une morphologie mince. Cependant, au jour 10, le cytoplasme récupère progressivement, et au jour 14, les cellules commencent à montrer la morphologie polyédrique évidente des hépatocytes.
Dans cette étude, les CHN obtenus sont en fait plus proches des hépatocytes fœtaux, car la PFA est plus élevée que l’ALB au jour 18. Bien que les CHH générés exercent des caractéristiques et des fonctions hépatocytes, il y a encore un écart entre les CHN et les hépatocytes humains primaires, ce qui indique que nos cellules différenciées ne sont toujours pas fonctionnellement matures. Par conséquent, les travaux futurs devront être axés sur l’optimisation de la méthode de différenciation.
À l’heure actuelle, les facteurs de croissance et les petits composés moléculaires tels que l’Activine A9,10, 14,Wnt3a15,CHIR16,Torin217 et IDE118,19 sont couramment utilisés pour induire la différenciation DE dans divers systèmes de différenciation. Le groupe Song a utilisé l’activine A pour différencier les cellules souches en DE, et a utilisé FGF4 (facteur de croissance des fibroblastes 4), BMP2 (protéine morphogénétique osseuse 2), HGF, KGF (facteur de croissance des kératinocytes), OSM et Dex pour la spécification hépatique et la maturation des CHN20. Le groupe de Sullivan induit DE par Activin A et Wnt 3a, et induit HLCs par β-ME (2-mercaptoethanol), DMSO, Insuline, HGF, OSM21. L’équipe de Siller a utilisé CHIR99021 pour la différenciation DE, DMSO, Dihexa (agoniste du récepteur du facteur de croissance hépatocytes N-hexanoic-Tyr), et Dex pour la différenciation HLC pour obtenir HLC avec des caractéristiques de la fonction hépatique16. Cependant, certaines de ces méthodes utilisent de nombreux facteurs de croissance recombinants pour générer de l’ER à un coût élevé et certaines d’entre elles n’utilisent que de petites molécules pour générer de l’ER avec une efficacité moindre. L’activine A est un facteur critique pour la génération de DE. Nous avons essayé de remplacer l’Activine A par d’autres petites molécules, mais nous obtenons généralement une efficacité inférieure. Par conséquent, nous adoptons la méthode d’ajout d’Activine A et de CHIR99021 comme facteurs induisants de DE, et détectons les gènes liés à la différenciation à chaque étape par q-PCR, immunofluorescence et western blotting.
Ces dernières années, l’établissement d’un système expérimental pour l’induction dirigée de HLC de hESCs est une base importante pour la modélisation du développement d’hépatocytes et des médicaments de criblage pour les maladies liées au foie. Dans le même temps, il peut également fournir une source efficace de cellules pour la transplantation d’hépatocytes, l’ingénierie des tissus hépatiques, les foies bioartificiels et d’autres recherches. Il a été rapporté que les CHN dérivés de cellules souches ont été utilisés pour mener diverses études sur l’infection virale comme modèle de dépistage des médicaments afin de prédire les réponses induites par les médicaments hépatotoxiques et d’étudier la voie immunitaire innée et les voies de signalisation des cellules10,22,23,24,25. Généralement, cette méthode introduit en détail une technique efficace de différenciation cellulaire de type hépatocytes des CSEh qui peut différencier avec succès les CSEh en hépatocytes fonctionnels matures. Les résultats fournissent une plate-forme pour le développement d’applications basées sur HLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (n° 81571994 à P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
