Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).
Abstract
Le potenziali funzioni delle cellule simili agli epatociti (HLC) derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) promettono molto per la modellazione delle malattie e le applicazioni di screening farmacologico. Ecco un metodo efficiente e riproducibile per la differenziazione degli hESC in HHC funzionali. L'istituzione di un lignaggio endodermo è un passo fondamentale nella differenziazione agli HLC. Con il nostro metodo, regolamentiamo le vie di segnalazione chiave integrando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE), seguita dalla generazione di cellule progenitrici epatiche e infine HHC con morfologia tipica degli epatociti in un metodo scenico con reagenti completamente definiti. Gli HHLC derivati dall'hESC prodotti con questo metodo esprimono marcatori specifici del palco (tra cui albumina, Il recettore nucleare HNF4α e il polipeptide cotrasportante taurocorato di sodio (NTCP)) e mostrano caratteristiche speciali relative agli epatociti maturi e funzionali (tra cui colorazione verde indocyanina, stoccaggio di glicogeno, colorazione ematossilina-eosina e attività CYP3) e possono fornire una piattaforma per lo sviluppo di applicazioni basate su HLC nello studio delle malattie epatiche.
Introduction
Il fegato è un organo altamente metabolico che svolge diversi ruoli, tra cui la disossidazione, la conservazione del glicogeno e la secrezione e la sintesi delle proteine1. Vari agenti patogeni, farmaci ed eremita possono causare cambiamenti patologici nel fegato e influenzare le suefunzioni 2,3. Gli epatociti, come principale unità funzionale del fegato, svolgono un ruolo importante nei sistemi di supporto epatico artificiale e nell'eliminazione della tossicità dei farmaci. Tuttavia, la risorsa degli epatociti umani primari è limitata nella terapia a base cellulare, così come nella ricerca sulle malattie del fegato. Pertanto, lo sviluppo di nuove fonti di epatociti umani funzionali è un'importante direzione di ricerca nel campo della medicina rigenerativa. Dal 1998, quando gli hESCsono stati istituiti 4, gli hESC sono stati ampiamente considerati dai ricercatori a causa del loro potenziale di differenziazione superiore (possono differenziarsi in vari tessuti in un ambiente adatto) e dell'alto grado di autorela rinnovabilità, e quindi forniscono cellule di origine ideali per epatici bioartifici, trapianto di epatociti e persino ingegneria del tessutoepatico 5.
Attualmente, l'efficienza di differenziazione epatica può essere notevolmente aumentata arricchendo l'endoderma6. Nella differenziazione del lignaggio delle cellule staminali in endoderma, i livelli del fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e le vie di segnalazione WNT sono i fattori chiave nel nodo dello stadio di formazione dell'endoderma. L'attivazione di un alto livello di segnalazione TGF-β e WNT può promuovere lo sviluppo di endoderm7,8. Activin A è una citochina appartenente alla superfamiglia TGF-β. Pertanto, l'attivina A è ampiamente utilizzata nell'induzione endoderma di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) ehESC 9,10. La GSK3 è una proteina chinasi serina-treonina. I ricercatori hanno scoperto che CHIR99021, uno specifico inibitore di GSK3β, può stimolare i tipici segnali WNT e può promuovere la differenziazione delle cellule staminali in determinate condizioni, suggerendo che CHIR99021 ha il potenziale per indurre la differenziazione delle cellule staminali in endoderma 11,12,13.
Qui riferiamo un metodo efficiente e riproducibile per indurre efficacemente la differenziazione degli hESC in HHC funzionali. L'aggiunta sequenziale di Activin A e CHIR99021 ha prodotto circa 89,7±0,8% cellule SOX17 (marcatore DE)positive. Dopo essere state ulteriormente maturate in vitro, queste cellule hanno espresso marcatori specifici epatici e esercitato morfologia epatocitaria (basata sulla colorazione ematossilina-eosina (H & E)) e funzioni, come l'assorbimento di verde indocyanina (ICG), stoccaggio di glicogeno e attività CYP3. I risultati mostrano che gli hESC possono essere differenziati con successo in HHC funzionali maturi con questo metodo e possono fornire una base per la ricerca correlata alle malattie epatiche e lo screening in vitro dei farmaci.
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Protocol
1. Manutenzione delle cellule staminali
NOTA: Il protocollo di manutenzione delle celle descritto di seguito si applica alla linea cellulare hES03 mantenuta in un monostrato aderente. Per tutti i seguenti protocolli in questo manoscritto, le celle devono essere maneggiate sotto un armadietto di sicurezza biologico.
- Preparare un mezzo di coltura di cellule staminali 1x mTesR diluire 5x mezzo supplementare a mTesR mezzo di base.
- Preparare un supporto Matrigel qualificato 30x hESC diluire 5 mL di Matrigel qualificato hESC con 5 mL di DMEM / F12 sul ghiaccio. Conservare a -20 °C.
- Preparare un supporto Matrigel qualificato 1x hESC diluire 33,3 μL di Matrigel qualificato hESC 30x con 1 mL di DMEM/F12.
- Rivestire sterili 6 piastre trattate con coltura tissutale con 1 mL di Matrigel qualificato hESC in ogni con largo anticipo e conservare a 4 °C durante la notte. Lasciare a temperatura ambiente (RT) per almeno 30 minuti prima dell'uso.
- Scongelare gli hESC crioconservati in un bagno d'acqua a 37 °C per 3 minuti senza tremare. Quindi trasferire immediatamente le celle tubazioni in un tubo di centrifuga da 15 ml contenente 4 mL prebellico mezzo 37 °C mTesR, pipetta su e giù delicatamente 2 volte.
- Centrifugare gli hESC a 200 x g per 2 minuti a RT.
- Aspirare il supernatante e rimescolare delicatamente le cellule in 1 mL di mezzo mTesR.
- Aspirare il mezzo DMEM/F12 dalla piastra e seminare le cellule in un pozzo di piastra a 6 porri ad una densità di 1 x 105 celle in 2 mL di mTesR.
- Incubare in un incubatore di CO2 al 5% e mantenere le cellule sostituendo con mTesR preriscaldato ogni giorno. Passare le cellule a circa il 70-80% di confluenza o quando le colonie cellulari iniziano a prendere contatto.
2. Passaggio e differenziazione delle cellule staminali
- Per le cellule passanti, aspirare il mezzo e incubare le cellule con 1 mL per pozzo di soluzione enzimatica (ad esempio, Accutasi per 5 min a 37 °C. Quindi trasferire le celle con pipettaggio su un tubo di centrifuga da 15 ml contenente 4 ml di DMEM/F12 prebellico a 37 °C.
- Centrifugare le cellule a 200 x g a RT per 2 min.
- Aspirare il mezzo e rimorsi delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di mezzo mTesR.
- Preparare piastre da 24 pozzi rivestendo con 250 μL di 1x hESC qualificato Matrigel medio in anticipo. Seme hESC come descritto sopra ad una densità di 1 - 1,5 x 105 cellule per pozzo in 500 μL di mezzo mTesR.
- Lasciare incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in un incubatore di CO2.
3. Formazione DE
- Preparare soluzioni stock di 100 μg/mL Activin A con DPBS contenente 0,2% BSA e 3 mM CHIR99021 con DMSO.
- Preparare il mezzo di base di differenziazione stage I integrando il mezzo RPMI con 1x B27.
- Aggiungere l'attivina A ad una concentrazione finale di 100 ng/mL e CHIR99021 ad una concentrazione finale di 3 μM in un volume appropriato di mezzo di base di differenziazione preriscaldato di stadio I.
- Aspirare il mezzo mTesR dalle cellule e sostituire con mezzi di differenziazione di fase I contenenti fattori di differenziazione aggiunti (ad esempio, 0,5 mL per pozzo di una piastra da 24 pomp pouf).
- Lasciare che le cellule incubano per 3 giorni a 37 °C in un incubatore di CO2, sostituendo quotidianamente i supporti di fase I con fattori di differenziazione appena aggiunti (giorni 0-2).
NOTA: Dopo 3 giorni di differenziazione, le cellule differenziate devono esprimere marcatori di cellule DE, come FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 e FOXA1 (minimo 80% di SOX17 necessario per procedere).
4. Differenziazione delle cellule progenitrici epatiche
- Preparare i supporti di base di differenziazione stage II sciogliendo la sostituzione del siero knockout (KOSR) a una concentrazione finale del 20% in KNOCK OUT DMEM.
- Preparare il mezzo di differenziazione stadio II contenente 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1 soluzione di amminoacido non essenziale (NEAA), 100 μM 2-mercaptoetanolo e 1x penicillina/streptomicina (P/S) al volume appropriato di KOSR/knockout DMEM.
- Il giorno 3 di differenziazione, aspirare il mezzo e sostituire con il mezzo di stadio II (ad esempio, 0,5 mL per pozzo di una piastra di 24 pozza). Quindi incubare per 24 ore.
- Il giorno 4 di differenziazione, aspirare il mezzo e sostituire con il mezzo di stadio II (ad esempio, 1 mL per pozzo di una piastra di 24 pozza).
- Cambia il mezzo a giorni diversi (sostituisci il mezzo il giorno 6).
NOTA: Dopo 8 giorni di differenziazione, le cellule differenziate devono esprimere marcatori appropriati di cellule progenitrici epatiche, come HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimo 80% di HNF4α necessario per procedere).
5. Differenziazione degli epatociti
- Preparare 10 μg/mL di fattore di crescita epatocito (HGF), 20 μg/mL Di soluzioni stock di oncostatina (OSM) con DBPS (contenente 0,2% di BSA) e filtrare con una membrana filtrante da 0,22 μm.
- Preparare il mezzo di base di differenziazione di fase III (mezzo HepatoZYME-SFM (HZM) integrato con 10 μM idrocortisone-21-emisuccinato e 1x P/S).
- Aggiungere HGF ad una concentrazione finale di 10 ng/mL e OSM ad una concentrazione finale di 20 ng/mL al volume appropriato del mezzo di differenziazione preriscaldato di stadio III.
- Il giorno 8 di differenziazione, aspirare il mezzo di stadio II dalle cellule e sostituire con il mezzo di stadio III (ad esempio, 1 mL per pozzo di una piastra di 24 pozza).
- Lasciare che le cellule incubano per 10 giorni a 37 °C in un incubatore di CO2, cambiando i supporti di fase III a giorni diversi con fattori di differenziazione appena aggiunti (giorni 8-18).
NOTA: Dopo 18 giorni di differenziazione, le cellule differenziate devono esprimere marcatori caratteristici di epatociti, come AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. La percentuale di cellule positive all'albumina di solito è superiore al 90%.
6. Isolamento dell'RNA, sintesi cDNA e analisi RT-qPCR
- Aspirare il mezzo dalle cellule e aggiungere la giusta quantità di reagente RNAiso Plus, (ad esempio, 0,3 mL per pozzo di una piastra da 24 po '). Raccogliere il supernatante in un tubo da 1,5 ml e lasciare riposare a RT per 5 minuti.
- Aggiungere 60 μL di reagente cloroformio e lasciarlo a RT per 5 minuti. Quindi centrifuga a 12.000 x g per 15 minuti.
- Raccogliere il supernatante da 125 μL e trasferirlo in un altro tubo di centrifuga. Aggiungere 160 μL di isopropanolo, mescolare bene e stare a RT per 10 minuti.
- Centrifuga a 12.000 x g per 10 min.
- Rimuovere il supernatante, aggiungere il 75% di etanolo al precipitato e centrifugare a 7.500 x g per 5 min.
- Dopo l'essiccazione a RT, aggiungere 40 μL di acqua trattata con DEPC per dissolversi. Per qPCR, trascrivere inversa 2 μg di RNA totale con un kit di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore.
- Eseguire RT-qPCR utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.
- Normalizzare l'espressione genica rispetto alle cellule staminali non indotte e determinare la variazione di piegatura dopo la normalizzazione a GAPDH.
7. Immunofluorescenza Convalida della differenziazione
- Preparare 1 tampone di lavaggio PBST aggiungendo 0,1% Tween-20 a PBS.
- Aspirare il mezzo dalle cellule aderenti e lavare brevemente con PBS a RT su uno shaker.
- Aspirare pbs e incubare cellule con 500 μL di metanolo ghiacciato per pozzo di una piastra da 24 po 'per fissare le cellule a -20 °C durante la notte.
- Rimuovere il metanolo e lavare le cellule 3 volte con PBS su uno shaker per 10 minuti ogni volta a RT.
- Celle a blocchi con 500 μL di 5% di BSA preparate in PBS per 1-2 h a RT su uno shaker.
- Diluire l'anticorpo primario a 1: 200 nella stessa soluzione utilizzata per il blocco.
- Incubare le cellule fisse in una soluzione di anticorpi primari da 300 μL durante la notte a 4 °C su uno shaker.
- Dopo l'incubazione notturna, lavare le cellule 3 volte con PBST per 10 minuti ogni volta a RT su uno shaker.
- Preparare la soluzione anticorpale secondaria in soluzione di blocco a 1:1000.
- Incubare in 300 μL di soluzione anticorpale secondaria protetta dalla luce per 1 h a RT su uno shaker.
- Aspirare la soluzione di anticorpi secondari e lavare le cellule 3 volte con PBST per 10 minuti ogni volta a RT su uno shaker.
- Incubare le cellule con 300 μL di 1 μg/mL DAPI per 3-5 minuti, quindi lavare due volte con PBST.
- Dopo aver aspirato pbst, aggiungere una quantità appropriata di PBS per scattare foto al microscopio a fluorescenza.
8. Analisi western delle macchie
- Preparare 1 tampone di lavaggio TBST aggiungendo lo 0,1% di Interpol-20 alla soluzione salina tamponata tris (TBS).
- Preparare il buffer di elettroforesi SDS-PAGE e il buffer di trasferimento occidentale utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.
- Risolvere la proteina cellulare totale (40 μg) su un gel di poliacrilammide di solfato di dodecil di sodio al 10% ed eseguire in tampone di elettroforesi SDS-PAGE a corrente costante di 15 mA per circa 2 ore.
- Trasferire il gel su una membrana difluoruro di polivinilidene (PVDF) a corrente costante di 300 mA per 2 ore a bassa temperatura.
NOTA: Il tempo di esecuzione e il tempo di trasferimento possono variare a seconda dell'attrezzatura utilizzata e del tipo e della percentuale del gel. - Bloccare la membrana con il 3% di BSA preparato in TBST per 1 h a RT su uno shaker.
- Incubare in soluzione di anticorpi primari (1:1000 diluizione) durante la notte a 4 °C su uno shaker.
- Dopo l'incubazione notturna, lavare la membrana assorbitrice 3 volte con TBST per 15 minuti alla volta a RT su uno shaker.
- Incubare in soluzione anticorpale secondaria (diluizione 1:2000) per 2 ore a RT su uno shaker.
- Scartare la soluzione anticorpale secondaria e lavare la membrana 3 volte con TBST, per 15 minuti ogni volta, a RT su uno shaker.
- Visualizza le bande immunoreattive usando un reagente di chemiluminescenza seguito dall'autorazione. Utilizzare β-actin come controllo di caricamento.
9. Assorbimento verde indocyanina
- Preparare soluzione di stock verde indocyanina da 200 mg/mL in DMSO.
- Preparare una soluzione di lavoro integrando il mezzo di differenziazione di fase III con soluzione verde indocyanina ad una concentrazione finale di 1 mg/mL.
- Incubare in un incubatore di 37 °C, 5% CO2 per 1-2 h.
- Aspirare il mezzo e lavare le cellule 3 volte con PBS.
- Fotografa al microscopio.
10. Colorazione periodica acido-schiff (PAS) e colorazione ematossilina-eosina (H&E)
- Aspirare il mezzo dalle cellule aderenti e lavare brevemente due volte con PBS.
- Per la fissazione cellulare, aspirare pbs e incubare le cellule con metanolo ghiacciato a -20 °C durante la notte.
- Visualizza lo stoccaggio del glicogeno mediante colorazione PAS e osserva le cellule binucleate mediante colorazione H & E utilizzando un kit seguendo le istruzioni del produttore.
- Scatta immagini con un microscopio a fluorescenza.
11. Saggio per l'attività cyp
- Misura l'attività cyp450 utilizzando saggi a base cellulare disponibili in commercio (test P450-Glo) secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare tre ripetizioni indipendenti per il test. I dati sono rappresentati come la media ± SD.
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Representative Results
Il diagramma schematico dell'induzione HLC dagli hESC e le immagini rappresentative dei campi luminosi di ogni fase di differenziazione sono mostrati nella figura 1. Nella fase I, l'attivina A e il CHIR99021 sono stati aggiunti per 3 giorni per indurre le cellule staminali a formare cellule endodermiche. Nello stadio II, le cellule endodermiche si differenziano in cellule progenitrici epatiche dopo essere state trattate con mezzo di differenziazione per 5 giorni. Nella terza fase, i primi epatociti erano maturati e differenziati in HLC dopo 10 giorni nell'HGF e nell'OSM(figura 1A). Nella fase finale della differenziazione, le cellule hanno mostrato un tipico fenotipo di epatociti (le cellule sono poligonali e distribuite uniformemente e regolarmente)(Figura 1B).
Per confermare ulteriormente la differenziazione epatica, RT-qPCR, colorazione immunofluorescenza e macchia occidentale sono stati utilizzati per rilevare marcatori di cellule endodermi, cellule progenitrici epatiche ed epatociti maturi (Figura 2). Le cellule differenziate hanno mostrato alti livelli di espressione di geni e proteine correlati alla differenziazione in ogni fase, come i marcatori endodermici SOX17 (89,7± 0,8%) al giorno 3, marcatore progenitore epatico HNF4α (81,3±2,9%) al giorno 8, AFP (86,6±0,3%) al giorno 14 e marcatore epatocitaro maturo ALB (94,5±1,1%) al giorno 18. Questi risultati indicano che cellule simili agli epatociti sono generate da questo protocollo.
Per rilevare se gli HHC hanno funzioni di epatociti, abbiamo rilevato l'assorbimento di ICG, lo stoccaggio di glicogeni e l'attività CYP degli HHC, nonché la colorazione H&E eseguita. Come si può vedere, gli HLC mostravano colorazione verde (Figura 3A) ed è stata osservata un'ampia colorazione periodica citoplasmatica acido-Schiff (dal rosa alviola) (figura 3B), che è coerente con la conservazione del glicogeno. Inoltre, possiamo vedere la morfologia rappresentativa di un tipico epatocita binucleato(Figura 3C). Infine, l'attività enzimatica di CYP3A4, il più importante CYP metabolico nel fegato, è stata confermata da un saggio di attività enzimatica(Figura 3D).
| Nome del Reagente | Società | Numero catalogo | Concentrazione stock | Concentrazione finale |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| 488 capra etichettata contro topo IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | IF: 1:1000 |
| 488 capra etichettata contro Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | IF: 1:1000 |
| Accutasi | Tecnologie delle cellule staminali | 7920 | 1 x | 1 x |
| Activina A | peproTech | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albumina (ALB) | Sigma Aldrich | A6684 | - | IF: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Umano Oct4 | Abcam | Ab19587 | - | IF: 1:200 |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma Aldrich | A8452 | - | IF: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti-SOX17 | Abcam | ab224637 | - | IF: 1:200 |
| Fattore nucleare anti-epatocita 4 alfa (HNF4α) | Sigma Aldrich | SAB1412164 | - | IF: 1:200 |
| Supplemento B-27 | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| Acqua DEPC | Beyotime | R0021 | - | - |
| DM3189 | McE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| Dpbs | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| Kit colorazione H&E | Beyotime | C0105S | - | - |
| Fattore di crescita degli epatociti (HGF) | peproTech | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| EpatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Idrocortisone-21-emisuccinato | Sigma Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indocjanina | Sangon Biotech | A606326 | 200 mg/mL | 1 mg/mL |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC qualificato | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| Supplemento mTesR 5X | Tecnologie delle cellule staminali | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR Supporto basale | Tecnologie delle cellule staminali | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatina (OSM) | peproTech | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferina - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| Kit di colorazione PAS | Solarbio | G1281 | - | - |
| Penna/Strep | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| IgG anti-topo capra coniugata perossidasi | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| Tampone di diluizione degli anticorpi primari per Western Blot | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | Fsq-101 | - | - |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Latte scremato | Sangon Biotech | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | - | - |
| Torin2 | McE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Interpolazione | Sigma Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tabella 1: Componenti della coltura cellulare e dei mezzi di base di differenziazione.
| Nome del gene | Abbreviazioni | sequenze primer(F) | sequenze primer (R) |
| POU Classe 5 Homeobox 1 | PTOM4 | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| Scatola fronte A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC CAGAATACACATT |
| Fattore di trascrizione SRY-Box 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC CACTTGAACAGT |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Recettore di classe frizzled 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA Club De CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| Recettore della chemiochina motivo C-X-C 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| Scatola fronte A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mesogenina 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Homeobox caudale tipo 1 | Cdx1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Homeobox 1 con salto uniforme | EVX1 | GCTGTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCTCACTCT CTCCTCCAAA |
| Mesoderm Posterior BHLH Fattore di trascrizione 2 | MESP2 | AGCTTGGGTG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2.5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTT TTCGGCTCTA |
| ISL LIM Homeobox 1 | ISL1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Epatocita Fattore Nucleare 4 Alpha | HNF4α | ACATGGACATG GCCGACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Alfa Fetoproteina | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| Fattore di trascrizione T-Box 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transtiretina | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albumina | CAMICE | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Polipeptide cotrasportante taurocorato di sodio | NTCP | CATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Enhancer Binding Protein Alpha | Cebpa | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Famiglia Serpin Un membro 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
ACCTTAGTGATG CCCAGT |
| Recettore dell'asialoglycoproteina 1 | ASGR1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Citocromo P450 Famiglia 3 Sottofamiglia Un Membro 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tabella 2: Sequenze primer per l'analisi q-PCR.
Figura 1: Schema schematico del protocollo per la specifica dei DE e degli HLC. (A) Presentazione schematica della strategia di differenziazione in 3 fasi utilizzata nel presente studio. (B) Morfologia delle cellule differenziate ai giorni 0, 3, 8, 14 e 18. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Espressione marcatore specifica dello stadio durante la differenziazione hESC in HHC. (A) espressione mRNA di geni specifici dello stadio. (B-C) Espressione proteica di geni specifici dello stadio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le funzioni degli HHLC derivati dall'HESC. (A) Gli HLC trattati per 1 h con 1 mg/mL di verde indocyanina dimostrano l'assorbimento valutato mediante microscopia di fase. (B) Immagini rappresentative di colorazione PAS che indicano la conservazione del glicogeno. (C) Immagini rappresentative della colorazione HE che mostrano le cellule binucleate. (D) Attività a livello basale dei principali enzimi citocromi P450. Tutti i valori sono presentati come ± SD. Barra scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui presentiamo un metodo graduale che induce gli HLC dagli hESC in tre fasi. Nella prima fase, Activin A e CHIR99021 sono stati utilizzati per differenziare gli hESC in DE. Nel secondo stadio, KO-DMEM e DMSO sono stati usati per differenziare DE in cellule progenitrici epatiche. Nel terzo stadio, HZM più HGF, OSM e sale di sodio idrocortisone 21-emisuccinato sono stati usati per continuare a differenziare le cellule progenitrici epatiche in HHC.
Durante l'utilizzo del protocollo è necessario prendere in considerazione i seguenti passaggi critici. La densità di differenziazione iniziale delle cellule e la tempistica accurata dei cambiamenti medi sono fattori importanti per una differenziazione riuscita. Quando iniziamo a differenziarci, dobbiamo garantire che la densità iniziale di semina sia appropriata, ad una confluenza di circa il 30-40%, quando le cellule stanno appena iniziando a entrare in contatto tra loro, e che gli spazi intercellulari siano disposti uniformemente in una rete sotto il campo visivo. Durante la differenziazione, il corrispondente mezzo di differenziazione deve essere modificato precisamente al momento indicato, specialmente nella prima fase e nel momento chiave di ogni fase di sostituzione, per garantire che le cellule si differenziano nel modo e nello stadio imitando il processo di sviluppo embrionale.
La prima fase di differenziazione degli hESC in DE è particolarmente importante. Di solito ci sono un gran numero di cellule che si staccano e galleggiano durante lo stadio I della differenziazione, che è uno stadio critico per il destino cellulare, ma in questo momento le cellule mantengono ancora la capacità di proliferare. Pertanto, la confluenza delle cellule può raggiungere circa il 90-100% alla fine dello stadio I. Inoltre, va notato che all'inizio dello stadio III della differenziazione (cioè il giorno 8), il citoplasma delle cellule inizia a condensarsi, con il risultato che le cellule acquisiscono gradualmente una morfologia snella. Tuttavia, al giorno 10, il citoplasma si riprende gradualmente e al giorno 14, le cellule iniziano a mostrare l'ovvia morfologia poliedrale degli epatociti.
In questo studio, gli HLC ottenuti sono in realtà più vicini agli epatociti fetali in quanto AFP è più alta espressa rispetto all'ALB al giorno 18. Sebbene gli HLC generati esercitino caratteristiche e funzioni degli epatociti, c'è ancora un divario tra gli HLC e gli epatociti umani primari, indicando che le nostre cellule differenziate non sono ancora funzionalmente mature. Pertanto, il lavoro futuro dovrà concentrarsi sull'ulteriore ottimizzazione del metodo di differenziazione.
Attualmente, fattori di crescita e piccoli composti molecolari come Activin A9,10,14,Wnt3a15, CHIR16,Torin217 e IDE118,19 sono comunemente usati per indurre la differenziazione DE in vari sistemi di differenziazione. Il gruppo Song ha utilizzato Activin A per differenziare le cellule staminali in DE e ha utilizzato FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), BMP2 (Bone morphogenetic protein 2), HGF, KGF (Keratinocyte growth factor), OSM e Dex per specifiche epatiche e maturazioneHLCs 20. Il gruppo Sullivan ha indotto DE da Activin A e Wnt 3a, e ha indotto gli HLC da β-ME (2-mercaptoetanolo), DMSO, Insulina, HGF, OSM21. Il team di Siller ha utilizzato CHIR99021 per la differenziazione DE, DMSO, Dihexa (agonista del recettore del fattore di crescita epatocita N-esanoico-Tyr) e Dex per la differenziazione HLC per ottenere HLC con caratteristiche di funzionalitàepatica 16. Tuttavia, alcuni di questi metodi usano molti fattori di crescita ricombinanti per generare DE ad alto costo e alcuni di essi usano solo piccole molecole per generare DE con minore efficienza. L'activina A è un fattore critico per la generazione de. Abbiamo cercato di sostituire l'attivina A con altre piccole molecole, ma di solito otteniamo una minore efficienza. Pertanto, adottiamo il metodo di aggiunta di Activin A e CHIR99021 come fattori induttori di DE e rileviamo geni correlati alla differenziazione in ogni fase da q-PCR, immunofluorescenza e gonfiore occidentale.
Negli ultimi anni, l'istituzione di un sistema sperimentale per l'induzione diretta di HLC da hESC è una base importante per la modellazione dello sviluppo di epatociti e farmaci di screening per malattie legate al fegato. Allo stesso tempo, può anche fornire una fonte efficace di cellule per il trapianto di epatociti, l'ingegneria dei tessuti epatici, i fegati bioartificiali e altre ricerche. È stato riferito che gli HLC derivati da cellule staminali sono stati utilizzati per condurre vari studi sull'infezione virale come modello di screening farmacologico per prevedere le risposte indotte da farmaci epatotossici e per studiare la via immunitaria innata e le vie di segnalazionedelle cellule 10,22,23,24,25. Generalmente, questo metodo introduce in dettaglio un'efficiente tecnica di differenziazione cellulare simile agli epatociti dagli hESC in grado di differenziare con successo gli HESC in epatociti funzionali maturi. I risultati forniscono una piattaforma per lo sviluppo di applicazioni basate su HLC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81870432 e 81570567 to X.L.Z.), (n. 81571994 to P.N.S.); la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong, Cina (n. 2020A1515010054 a P.N.S.), La Fondazione Universitaria Li Ka Shing Shantou (n. L1111 dal 2008 al P.N.S.). Desideriamo ringraziare il Prof. Stanley Lin dello Shantou University Medical College per i consigli utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
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