Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) in functionele hepatocyt-achtige cellen (HCC's) door continu Activine A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE).
Abstract
De potentiële functies van hepatocyt-achtige cellen (HLC's) afkomstig van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) zijn veelbelovend voor ziektemodellering en geneesmiddelenscreeningtoepassingen. Hier wordt een efficiënte en reproduceerbare methode voor differentiatie van hESC's in functionele HCC's gegeven. De oprichting van een endoderm-afstamming is een belangrijke stap in de differentiatie naar HCC's. Met onze methode reguleren we de belangrijkste signaleringsroutes door continu Activin A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE), gevolgd door het genereren van hepatische voorlopercellen, en ten slotte HCC's met typische hepatocytmorfologie in een stapsgewijze methode met volledig gedefinieerde reagentia. De hESC-afgeleide HCC's die door deze methode worden geproduceerd, drukken stadiumspecifieke markers uit (waaronder albumine, HNF4α nucleaire receptor en natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide (NTCP)), en vertonen speciale kenmerken met betrekking tot volwassen en functionele hepatocyten (waaronder indocyaninegroene kleuring, glycogeenopslag, hematoxyline-eosinekleuring en CYP3-activiteit), en kunnen een platform bieden voor de ontwikkeling van HLC-gebaseerde toepassingen in de studie van leverziekten.
Introduction
De lever is een zeer metabolisch orgaan dat verschillende rollen speelt, waaronder deoxidatie, opslag van glycogeen en afscheiding en synthese van eiwitten1. Verschillende pathogenen, geneesmiddelen en ertstrouw kunnen pathologische veranderingen in de lever veroorzaken en de functies ervan beïnvloeden2,3. Hepatocyten, als de belangrijkste functionele eenheid van de lever, spelen een belangrijke rol in kunstmatige leverondersteunende systemen en eliminatie van geneesmiddelentoxiciteit. De bron van primaire menselijke hepatocyten is echter beperkt in celgebaseerde therapie, evenals in onderzoek naar leverziekten. Daarom is het ontwikkelen van nieuwe bronnen van functionele menselijke hepatocyten een belangrijke onderzoeksrichting op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Sinds 1998, toen hESC's4werden vastgesteld, zijn hESC's door onderzoekers op grote schaal overwogen vanwege hun superieure differentiatiepotentieel (ze kunnen differentiëren in verschillende weefsels in een geschikte omgeving) en hoge mate van zelfvernieuwbaarheid, en bieden zo ideale broncellen voor bioartificiële levers, hepatocyttransplantatie en zelfs leverweefseltechnologie5.
Momenteel kan de efficiëntie van de leverdifferentiatie sterk worden verhoogd door het endoderm te verrijken6. In de afstammingsdifferentiatie van stamcellen in endoderm zijn niveaus van de transformerende groeifactor β (TGF-β) signalerings- en WNT-signaleringsroutes de belangrijkste factoren in de knoop van de endodermvormingsfase. Activering van een hoog niveau van TGF-β en WNT-signalering kan de ontwikkeling van endoderm7,8bevorderen . Activine A is een cytokine behorend tot de TGF-β superfamilie. Daarom wordt Activine A veel gebruikt bij endoderm inductie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en hESC's9,10. GSK3 is een serine-threonine eiwitkinase. Onderzoekers hebben ontdekt dat CHIR99021, een specifieke remmer van GSK3β, typische WNT-signalen kan stimuleren en stamceldifferentiatie onder bepaalde omstandigheden kan bevorderen, wat suggereert dat CHIR99021 potentieel heeft voor het induceren van stamceldifferentiatie in endoderm 11,12,13.
Hier rapporteren we een efficiënte en reproduceerbare methode om de differentiatie van hESC's in functionele HCC's effectief te induceren. De sequentiële toevoeging van Activin A en CHIR99021 produceerde ongeveer 89,7±0,8% SOX17 (DE marker)-positieve cellen. Na verder gerijpt te zijn in vitro, drukten deze cellen leverspecifieke markers uit en oefenden hepatocyt-achtige morfologie uit (gebaseerd op hematoxyline-eosinekleuring (H & E)) en functies, zoals opname van indocyaninegroen (ICG), glycogeenopslag en CYP3-activiteit. De resultaten tonen aan dat hESC's met succes kunnen worden gedifferentieerd in volwassen functionele HLC's door deze methode en een basis kunnen vormen voor leverziektegerelateerd onderzoek en in vitro geneesmiddelenscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stamcelonderhoud
OPMERKING: Het hieronder beschreven celonderhoudsprotocol is van toepassing op de hES03-cellijn die in een aanhangend monolaag wordt onderhouden. Voor alle volgende protocollen in dit manuscript moeten cellen worden behandeld onder een biologische veiligheidskast.
- Bereid 1x mTesR stamcelkweekmedium voor door 5x aanvullend medium te verdunnen tot mTesR basismedium.
- Bereid 30x hESC-gekwalificeerd Matrigel medium voor door 5 ml hESC-gekwalificeerde Matrigel met 5 ml DMEM/F12 op het ijs te verdunnen. Bewaren bij -20 °C.
- Bereid 1x hESC-gekwalificeerd Matrigel-medium voor door 33,3 μL 30x hESC-gekwalificeerde Matrigel te verdunnen met 1 ml DMEM/F12.
- Verlaag steriele 6 goed, met weefselkweek behandelde platen met 1 ml 1x hESC-gekwalificeerde Matrigel ruim van tevoren en bewaar 's nachts bij 4 °C. Laat voor gebruik minstens 30 minuten op kamertemperatuur (RT) staan.
- Ontdooi de cryopreserved hESCs in een 37 °C waterbad gedurende 3 minuten zonder te schudden. Breng vervolgens onmiddellijk de cellen over door ze in een centrifugebuis van 15 ml te gieten met een voorverwarmd 37 °C mTesR-medium van 4 ml, 2 keer zachtjes op en neer.
- Centrifugeer de hESC's bij RT op 200 x g gedurende 2 min.
- Aspireer het supernatant en resuspend de cellen voorzichtig in 1 ml mL mTesR-medium.
- Aspireer het DMEM/F12-medium uit de plaat en zaai de cellen in een put van 6-putplaat met een dichtheid van 1 x 105 cellen in 2 ml mTesR.
- Incubeer in een CO2-incubator van 5% en onderhoud de cellen door dagelijks te vervangen door voorverwarmd mTesR-medium. Passage de cellen op ongeveer 70-80% samenvloeiing of wanneer de celkolonies contact beginnen te maken.
2. Stamcelpassage en differentiatie
- Voor passagingcellen het medium aspireren en de cellen incuberen met 1 ml per put enzymoplossing (bijv. Accutase gedurende 5 minuten bij 37 °C. Breng vervolgens de cellen over door ze te pipetten naar een centrifugebuis van 15 ml met 4 ml DMEM/F12 voorverwarmd tot 37 °C.
- Centrifugeer de cellen bij RT gedurende 2 min op 200 x g.
- Aspireer het medium en resuspend de celkorrel voorzichtig in 1 ml mL mTesR-medium.
- Bereid 24-put platen voor door vooraf te coaten met 250 μL 1x hESC-gekwalificeerd Matrigel medium. Zaad hESC's zoals hierboven beschreven bij een dichtheid van 1 - 1,5 x 105 cellen per put in 500 μL mTesR medium.
- Laat cellen 24 uur incuberen bij 37 °C in een CO2-incubator.
3. DE-formatie
- Bereid voorraadoplossingen voor van 100 μg/ml Activine A met DPBS die 0,2% BSA en 3 mM CHIR99021 met DMSO bevatten.
- Bereid fase I differentiatie basismedium voor door RPMI-medium aan te vullen met 1x B27.
- Voeg Activine A toe aan een eindconcentratie van 100 ng/ml en CHIR99021 aan een eindconcentratie van 3 μM in een geschikt volume voorverwarmd basismedium voor differentiatiefase I.
- Aspireer mTesR-medium uit de cellen en vervang door fase I-differentiatiemedia met toegevoegde differentiatiefactoren (bijv. 0,5 ml per put van een plaat met 24 put).
- Laat cellen 3 dagen incuberen bij 37 °C in een CO2-incubator, waarbij fase I-media dagelijks worden vervangen door vers toegevoegde differentiatiefactoren (dag 0-2).
OPMERKING: Na 3 dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen markers van DE-cellen uitdrukken, zoals FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 en FOXA1 (minimaal 80% van SOX17 nodig om door te gaan).
4. Differentiatie van leverprogenitorcellen
- Bereid fase II differentiatie basismedia voor door knock-out serumvervanging (KOSR) op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 20% in Knock Out DMEM.
- Bereid fase II differentiatiemedium met 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x niet-essentiële aminozuuroplossing (NEAA), 100 μM 2-mercaptoethanol en 1x penicilline/streptomycine (P/S) voor op het juiste volume KOSR/knock-out DMEM.
- Op dag 3 van differentiatie het medium aspireren en vervangen door stadium II-medium (bijv. 0,5 ml per put van een plaat van 24 put). Incubeer vervolgens gedurende 24 uur.
- Op dag 4 van differentiatie het medium aspireren en vervangen door stadium II-medium (bijv. 1 ml per put van een plaat met 24 put).
- Vervang het medium om de andere dag (vervang medium op dag 6).
OPMERKING: Na 8 dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen geschikte markers van leverprogenitorcellen uitdrukken, zoals HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimaal 80% van HNF4α nodig om verder te gaan).
5. Hepatocyt differentiatie
- Bereid 10 μg/ml hepatocytgroeifactor (HGF), 20 μg/ml Oncostatine (OSM) voorraadoplossingen met DBPS (met 0,2% BSA) en filter met een filtermembraan van 0,22 μm.
- Bereid fase III differentiatie basismedium (HepatoZYME-SFM (HZM) medium aangevuld met 10 μM hydrocortison-21-hemisuccinaat en 1x P/S).
- Voeg HGF toe aan een eindconcentratie van 10 ng/ml en OSM aan een eindconcentratie van 20 ng/ml aan het juiste volume voorverwarmd fase III differentiatiemedium.
- Op dag 8 van differentiatie, aspireer fase II medium uit cellen en vervang door stadium III medium (bijv. 1 ml per put van een 24 put plaat).
- Laat cellen 10 dagen incuberen bij 37 °C in een CO2-incubator en verander de media van fase III om de andere dag met vers toegevoegde differentiatiefactoren (dag 8-18).
OPMERKING: Na 18 dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen karakteristieke markers van hepatocyten uitdrukken, zoals AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Het percentage albuminepositieve cellen is meestal meer dan 90%.
6. RNA-isolatie, cDNA-synthese en RT-qPCR-analyse
- Aspireer medium uit cellen en voeg de juiste hoeveelheid RNAiso Plus reagens toe (bijv. 0,3 ml per put van een plaat van 24 well). Verzamel het supernatant in een buis van 1,5 ml en laat 5 minuten bij RT staan.
- Voeg 60 μL chloroformreagens toe en laat het 5 minuten bij RT staan. Centrifugeer vervolgens op 12.000 x g gedurende 15 min.
- Verzamel het supernatant van 125 μL en breng het over naar een andere centrifugebuis. Voeg 160 μL isopropanol toe, meng goed en ga 10 minuten bij RT staan.
- Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 10 min.
- Verwijder het supernatant, voeg 75% ethanol toe aan het neergeslagene en centrifugeer gedurende 5 minuten op 7.500 x g.
- Voeg na het drogen bij RT 40 μL MET DEPC behandeld water toe om op te lossen. Voor qPCR, reverse transcriberen 2 μg van totale RNA met een omgekeerde transcriptie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Voer RT-qPCR uit met behulp van een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Normaliseer genexpressie ten opzichte van niet-geïnduceerde stamcellen en bepaal de vouwvariatie na normalisatie naar GAPDH.
7. Immunofluorescentievalidatie van differentiatie
- Bereid 1x PBST wasbuffer voor door 0,1% Tween-20 aan PBS toe te voegen.
- Aspireer medium uit aanhangcellen en was kort met PBS bij RT op een shaker.
- Aspireer PBS en incubeer cellen met 500 μL ijskoud methanol per put van een 24-put plaat om de cellen 's nachts op -20 °C te fixeren.
- Verwijder de methanol en was de cellen 3 keer met PBS op een shaker gedurende 10 minuten elke keer bij RT.
- Blokkeer cellen met 500 μL van 5% BSA bereid in PBS gedurende 1-2 uur bij RT op een shaker.
- Verdun primair antilichaam om 1: 200 in dezelfde oplossing die wordt gebruikt voor blokkering.
- Incubeer de vaste cellen in 300 μL primaire antilichaamoplossing 's nachts bij 4 °C op een shaker.
- Was de cellen na de nachtelijke incubatie telkens 3 keer met PBST gedurende 10 minuten op RT op een shaker.
- Bereid secundaire antilichaamoplossing voor in blokkeringsoplossing om 1:1000.
- Incubeer in 300 μL secundaire antilichaamoplossing beschermd tegen licht gedurende 1 uur bij RT op een shaker.
- Aspireer secundaire antilichaamoplossing en was cellen 3 keer met PBST gedurende 10 minuten elke keer bij RT op een shaker.
- Incubeer cellen met 300 μL van 1 μg/ml DAPI gedurende 3-5 minuten en was vervolgens tweemaal met PBST.
- Voeg na het aspireren van PBST een geschikte hoeveelheid PBS toe voor het maken van foto's onder een fluorescentiemicroscoop.
8. Westerse vlekanalyse
- Bereid 1x TBST wasbuffer door 0,1% Tween-20 toe te voegen aan Tris-buffered zoutoplossing (TBS).
- Bereid SDS-PAGE elektroforesebuffer en western transferbuffer voor met behulp van een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Los het totale celeiwit (40 μg) op op een polyacrylamidegel van 10% natriumdodecylsulfaat en voer in SDS-PAGE elektroforesebuffer bij een constante stroom van 15 mA gedurende ongeveer 2 uur.
- Breng de gel over op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij een constante stroom van 300 mA gedurende 2 uur bij lage temperatuur.
OPMERKING: De looptijd en overdrachtstijd kunnen variëren, afhankelijk van de gebruikte apparatuur en het type en percentage van de gel. - Blokkeer het membraan met 3% BSA bereid in TBST gedurende 1 uur bij RT op een shaker.
- Incubeer 's nachts bij 4 °C op een shaker in primaire antilichaamoplossing (1:1000 verdunning).
- Was na de nachtelijke incubatie het blaasmembraan 3 keer met TBST gedurende 15 minuten per keer bij RT op een shaker.
- Incubeer in secundaire antilichaamoplossing (1:2000 verdunning) gedurende 2 uur bij RT op een shaker.
- Gooi secundaire antilichaamoplossing weg en was het membraan 3 keer met TBST, telkens gedurende 15 minuten, bij RT op een shaker.
- Visualiseer immunoreactieve banden met behulp van een chemiluminescentiereagens gevolgd door autoradiografie. Gebruik β-actine als beladingsregelaar.
9. Indocyanine groene opname
- Bereid 200 mg/ml indocyanine groene stamoplossing in DMSO.
- Bereid een werkoplossing voor door fase III differentiatiemedium aan te vullen met indocyanine groene oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/ml.
- Incubeer in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 1-2 uur.
- Aspireer medium en was de cellen 3 keer met PBS.
- Fotografeer onder een microscoop.
10. Periodieke Acid-Schiff (PAS) kleuring en Hematoxyline-Eosine (H&E) kleuring
- Aspireer medium uit aanhangcellen en was kort twee keer met PBS.
- Voor celfixatie aspireren PBS en incuberen cellen met ijskoude methanol bij -20 °C 's nachts.
- Visualiseer glycogeenopslag door PAS-kleuring en observeer binucleated cellen door H & E-kleuring met behulp van een kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Maak foto's met een fluorescentiemicroscoop.
11. Test voor CYP-activiteit
- Meet cyp450-activiteit met behulp van in de handel verkrijgde celgebaseerde assays (P450-Glo-assays) volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik drie onafhankelijke herhalingen om te testen. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schematische diagram van HLC-inductie van hESC 's en representatieve bright-field beelden van elke differentiatiefase zijn weergegeven in figuur 1. In fase I werden Activine A en CHIR99021 gedurende 3 dagen toegevoegd om stamcellen te induceren om endodermcellen te vormen. In fase II differentieerden de endodermcellen zich in hepatische voorlopercellen nadat ze gedurende 5 dagen met differentiatiemedium waren behandeld. In stadium III waren vroege hepatocyten gerijpt en gedifferentieerd in HCC's na 10 dagen in HGF en OSM (figuur 1A). In de laatste fase van differentiatie vertoonden cellen een typisch hepatocytfenotype (De cellen zijn polygoon en gelijkmatig en regelmatig verdeeld) (Figuur 1B).
Om leverdifferentiatie verder te bevestigen, werden RT-qPCR, immunofluorescentiekleuring en westelijke blotting gebruikt om markers van endodermcellen, hepatische voorlopercellen en volwassen hepatocyten te detecteren (figuur 2). De gedifferentieerde cellen vertoonden hoge expressieniveaus van differentiatiegerelateerde genen en eiwitten in elke fase, zoals endoderm markers SOX17 (89,7± 0,8%) op Dag 3, hepatische voorloper marker HNF4α (81,3±2,9%) op Dag 8, AFP (86,6±±0,3%) op Dag 14, en volwassen hepatyt marker ALB(86,6±0,3%) op Dag 14, en volwassen hepatyte marker AL Deze resultaten geven aan dat hepatocyt-achtige cellen worden gegenereerd door dit protocol.
Om te detecteren of HLC's hepatocytfuncties hebben, hebben we icg-opname, glycogeenopslag en CYP-activiteit van HHLC's gedetecteerd, evenals H&E-kleuring uitgevoerd. Zoals te zien is, vertoonden de HLC's groene kleuring (figuur 3A) en werden uitgebreide cytoplasmatische periodieke zuur-Schiff-kleuring (roze tot paars) waargenomen (figuur 3B), wat consistent is met glycogeenopslag. Daarnaast zien we de representatieve morfologie van een typische binucleated hepatocyt (Figuur 3C). Ten slotte werd de enzymatische activiteit van CYP3A4, de belangrijkste metabolische CYP in de lever, bevestigd door enzymatische activiteitstest (figuur 3D).
| Naam van reagens | Bedrijf | Catalogusnummer | Voorraadconcentratie | Definitieve concentratie |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| 488 gelabelde geit tegen muis IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | ALS: 1:1000 |
| 488 gelabelde geit tegen Konijn IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | ALS: 1:1000 |
| Accutase | Stamceltechnologieën | 7920 | 1 x | 1 x |
| Actief A | peproTech | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albumine (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | - | ALS: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Mens Oct4 | Abcam | Ab19587 | - | ALS: 1:200 |
| Anti - α-Fetoproteïne (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | - | ALS: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti-SOX17 | Abcam | Ab224637 | - | ALS: 1:200 |
| Anti-Hepatocyt Nucleaire Factor 4 alfa (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | - | ALS: 1:200 |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| Chir99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12072 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| H&E kleurset | Beyotime | C0105S | - | - |
| Hepatocyt groeifactor (HGF) | peproTech | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Hydrocortison-21-hemisuccinaat | Sigma-Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | 200 mg/ml | 1 mg/ml |
| Knock-out DMEM | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-gekwalificeerd | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| mTesR 5X Supplement | Stamceltechnologieën | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR Basaal Medium | Stamceltechnologieën | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatine (OSM) | peproTech | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferine - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| PAS kleurset | Solarbio | G1281 | - | - |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| Peroxidase-Geconjugeerde Geit anti-Muis IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| Primaire antilichaamverdunningsbuffer voor westelijke vlek | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT-kit | TOYOBO | FSQ-102 | - | - |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Magere melk | Sangon Biotech | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Groene Master Mix | Thermo Fisher Wetenschappelijk | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tabel 1: Componenten van celkweek en differentiatiebasismedia.
| Naam van Gene | Afkortingen | primers sequenties(F) | primers sequenties (R) |
| POU Klasse 5 Homeobox 1 | LGO4 | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| Vorkkop Box A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC CAGAATACACATT |
| SRY-Box Transcriptie Factor 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC CACTTGAACAGT |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Frizzled Klasse Receptor 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| C-X-C Motief Chemokine Receptor 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| Vorkkop Vak A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mesogenine 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Caudal Type Homeobox 1 | CDX1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Homeobox 1 met gelijkmatige inhoud | EVX1 | GCTGTCTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCTCACTCT CTCCTCCAAA |
| Mesoderm Posterieure BHLH Transcriptie Factor 2 | MESP2 | AGCTTGGGTG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2.5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTT TTCGGCTCTA |
| ISL LIM Homeobox | ISL1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Hepatocyt Nucleaire Factor 4 Alpha | HNF4α | ACATGGACATG GCCGACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Alfa Fetoproteïne | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| T-Box Transcriptie Factor 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transthyretin | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albumine | ALBE | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide | NTCP | CATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Versterker Binding Eiwit Alpha | CEBPA | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Serpin Familie A Lid 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
ACCTTAGTGATG CCCAGT |
| Asialoglycoproteïne Receptor 1 | ASGR1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Cytochroom P450 Familie 3 Onderfamilie A Lid 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tabel 2: Primersequenties voor q-PCR-analyse.
Figuur 1: Schematisch schema van het protocol voor de specificatie van DE- en HCC's. (A) Schematische presentatie van de 3-traps differentiatiestrategie die in deze studie wordt gebruikt. (B) Morfologie van de gedifferentieerde cellen op dag 0, 3, 8, 14 en 18. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stadiumspecifieke markerexpressie tijdens hESC-differentiatie in HHLC's. (A) mRNA-expressie van stadiumspecifieke genen. (B-C) Eiwitexpressie van stadiumspecifieke genen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Functies van hESC-afgeleide HCC's. (A) HCC's die gedurende 1 uur met 1 mg/ml indocyaninegroen worden behandeld, vertonen de opname zoals beoordeeld door fasemicroscopie. (B) Representatieve PAS-kleuringsafbeeldingen die wijzen op glycogeenopslag. (C) Representatieve HE-kleuringsafbeeldingen met binucleatencellen. (D) Basale niveau activiteit van belangrijke cytochroom P450 enzymen. Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een stapsgewijze methode die HCC's uit hESC's in drie fasen induceert. In de eerste fase werden Activin A en CHIR99021 gebruikt om hESC's te differentiëren in DE. In de tweede fase werden KO-DMEM en DMSO gebruikt om DE te differentiëren in hepatische voorlopercellen. In de derde fase werden HZM plus HGF, OSM en hydrocortison 21-hemisuccinaatnatriumzout gebruikt om leverfappende voorlopercellen te blijven differentiëren in HCC's.
Bij het gebruik van het protocol moet rekening worden gehouden met de volgende kritieke stappen. De initiële differentiatiedichtheid van cellen en de nauwkeurige timing van mediumveranderingen zijn belangrijke factoren voor succesvolle differentiatie. Wanneer we beginnen te differentiëren, moeten we ervoor zorgen dat de initiële zaaidichtheid geschikt is, bij een samenvloeiing van ongeveer 30-40%, wanneer cellen net met elkaar in contact komen, en dat de intercellulaire ruimtes gelijkmatig zijn gerangschikt in een netwerk onder het gezichtsveld. Tijdens differentiatie moet het overeenkomstige differentiatiemedium precies op het aangegeven tijdstip worden gewijzigd, vooral in de eerste fase en het belangrijkste moment van elke vervangingsfase, om ervoor te zorgen dat cellen differentiëren in de modus en het stadium dat het proces van embryonale ontwikkeling imiteert.
De eerste fase van differentiatie van hESC's in DE is bijzonder belangrijk. Er zijn meestal een groot aantal cellen die loskomen en zweven tijdens fase I van differentiatie, wat een kritieke fase is voor het lot van de cel, maar op dit moment behouden de cellen nog steeds het vermogen om zich te verspreiden. Daarom kan de samenvloeiing van cellen ongeveer 90-100% bereiken aan het einde van fase I. Bovendien moet worden opgemerkt dat aan het begin van fase III van differentiatie (d.w.z. dag 8) het cytoplasma van de cellen begint te condenseren, waardoor de cellen geleidelijk een slanke morfologie krijgen. Op dag 10 herstelt het cytoplasma echter geleidelijk en op dag 14 beginnen de cellen de voor de hand liggende polyhedrale morfologie van hepatocyten te vertonen.
In deze studie zijn de verkregen HLC's eigenlijk dichter bij foetale hepatocyten, omdat AFP hoger is uitgedrukt dan ALB op dag 18. Hoewel de gegenereerde HLC's hepatocytkenmerken en -functies uitoefenen, is er nog steeds een kloof tussen HCC's en primaire menselijke hepatocyten, wat aangeeft dat onze gedifferentieerde cellen nog steeds niet functioneel volwassen zijn. Daarom zal het toekomstige werk zich moeten richten op het verder optimaliseren van de differentiatiemethode.
Op dit moment worden groeifactoren en kleine moleculaire verbindingen zoals Activine A9,10,14,Wnt3a15,CHIR16,Torin217 en IDE118,19 vaak gebruikt om DE-differentiatie in verschillende differentiatiesystemen te induceren. De Song-groep gebruikte Activin A om stamcellen te differentiëren in DE en gebruikte FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), BMP2 (Bone morphogenetic protein 2), HGF, KGF (Keratinocyte growth factor), OSM en Dex voor leverspecificatie en HLCs rijping20. De Sullivan-groep veroorzaakte DE door Activin A en Wnt 3a, en veroorzaakte HCC's door β-ME (2-mercaptoethanol), DMSO, Insuline, HGF, OSM21. Het Siller-team gebruikte CHIR99021 voor DE-differentiatie, DMSO, Dihexa (Hepatocyte growth factor receptor agonist N-hexanoic-Tyr) en Dex voor HLC-differentiatie om HLC met leverfunctiekenmerken te verkrijgen16. Sommige van deze methoden gebruiken echter veel recombinante groeifactoren om DE te genereren met hoge kosten en sommige gebruiken slechts kleine moleculen om DE met een lagere efficiëntie te genereren. Activine A is een kritische factor voor DE-generatie. We hebben geprobeerd om Activin A te vervangen door andere kleine moleculen, maar krijgen meestal een lagere efficiëntie. Daarom gebruiken we de methode om Activine A en CHIR99021 toe te voegen als inducerende factoren van DE en detecteren we differentiatiegerelateerde genen in elke fase door q-PCR, immunofluorescentie en westerse blotting.
In de afgelopen jaren is de invoering van een experimenteel systeem voor gerichte HLC-inductie uit hESC's een belangrijke basis voor het modelleren van hepatocytontwikkeling en het screenen van geneesmiddelen op levergerelateerde ziekten. Tegelijkertijd kan het ook een effectieve bron van cellen bieden voor hepatocyttransplantatie, leverweefseltechnologie, bioartificiële levers en ander onderzoek. Er is gemeld dat HLC 's afgeleid van stamcellen zijn gebruikt om verschillende studies uit te voeren naar virale infectie als een drug screening model om hepatotoxische drug-geïnduceerde reacties te voorspellen en om de aangeboren immuunroute en signaleringsroutes van cellen10,22,23,24,25te bestuderen . Over het algemeen introduceert deze methode in detail een efficiënte hepatocyt-achtige celdifferentiatietechniek van hESC's die hESC's met succes kan differentiëren in volwassen functionele hepatocyten. De resultaten bieden een platform voor de ontwikkeling van HLC-gebaseerde applicaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (No. 81870432 and 81570567 to X.L.Z.), (No. 81571994 to P.N.S.); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2020A1515010054 aan P.N.S.), de Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 aan P.N.S.). We willen prof. Stanley Lin van shantou University Medical College bedanken voor nuttig advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
