Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידול של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים (HLCs) על ידי השלמת Activin A ו- CHIR99021 באופן רציף במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE).
Abstract
הפונקציות הפוטנציאליות של תאים דמויי hepatocyte (HLCs) נגזר תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לקיים הבטחה גדולה עבור מידול מחלות ויישומי סינון תרופות. בתנאי שכאן היא שיטה יעילה הניתנת לשחזור לבידול של hESCs לתוך HLCs פונקציונליים. הקמת שושלת אנדודרם היא צעד מפתח בהבחנה ל- HLCs. בשיטה שלנו, אנו מווסתים את מסלולי האיתות העיקריים על ידי שכשהם רציף Activin A ו- CHIR99021 במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE), ואחריו דור של תאי אב כבד, ולבסוף HLCs עם מורפולוגיה hepatocyte טיפוסי בשיטה stagewise עם ריאגנטים מוגדרים לחלוטין. ה- HLCs הנגזרים מ- hESC המיוצרים על-ידי שיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לבמה (כולל אלבומין, קולטן גרעיני HNF4α, ונתרן טאורוכולאט cotransporting פוליפפטיד (NTCP)), ולהראות מאפיינים מיוחדים הקשורים hepatocytes בוגרת ותפקודית (כולל כתמים ירוקים אינדוקיאנין, אחסון גליקוגן, כתמי המטוקסילין-אאוסין ופעילות CYP3), והוא יכול לספק פלטפורמה לפיתוח יישומים מבוססי HLC במחקר של מחלות כבד.
Introduction
הכבד הוא איבר מטבולי מאוד זה ממלא מספר תפקידים, כולל deoxidation, אחסון גליקוגן, הפרשת סינתזה של חלבונים1. פתוגנים שונים, תרופות ותושיות יכולים לגרום לשינויים פתולוגיים בכבד ולהשפיע על תפקודיו2,3. Hepatocytes, כיחידה הפונקציונלית העיקרית של הכבד, לשחק תפקיד חשוב במערכות תמיכה בכבד מלאכותי חיסול רעילות סמים. עם זאת, המשאב של hepatocytes אנושי ראשוני מוגבל בטיפול מבוסס תאים, כמו גם במחקר מחלות כבד. לכן, פיתוח מקורות חדשים של hepatocytes אנושי תפקודי הוא כיוון מחקר חשוב בתחום הרפואה רגנרטיבית. מאז 1998 כאשר hESCs הוקמו4, hESCs נחשבו נרחב על ידי חוקרים בגלל פוטנציאל הבידול המעולה שלהם (הם יכולים להבדיל לרקמות שונות בסביבה מתאימה) ודרגה גבוהה של חידוש עצמי, ובכך לספק תאי מקור אידיאליים לכבדים ביו-אפיים, השתלת hepatocyte ואפילו הנדסת רקמת כבד5.
נכון לעכשיו, יעילות בידול הכבד ניתן להגדיל מאוד על ידי העשרת endoderm6. בהבחנה שושלת של תאי גזע לתוך endoderm, רמות של גורם הגדילה טרנספורמציה β (TGF-β) איתות מסלולי איתות WNT הם הגורמים העיקריים בצומת של שלב היווצרות endoderm. הפעלה של רמה גבוהה של TGF-β ו WNT איתות יכול לקדם את הפיתוח של endoderm7,8. Activin A הוא ציטוקינים השייכים למשפחה העל TGF-β. לכן, Activin A נמצא בשימוש נרחב אינדוקציה endoderm של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה אנושי (hiPSCs) ו hESCs9,10. GSK3 הוא קינאז חלבון סרין-טרונין. חוקרים מצאו כי CHIR99021, מעכב ספציפי של GSK3β, יכול לעורר אותות WNT טיפוסי, והוא יכול לקדם בידול תאי גזע בתנאים מסוימים, מה שמרמז כי CHIR99021 יש פוטנציאל לגרימת התמיינות תאי גזע לתוך endoderm 11,12,13.
כאן אנו מדווחים על שיטה יעילה הניתנת לשחזור לגרימת הבידול היעיל של hESCs לתוך HLCs פונקציונליים. התוספת הרציפה של Activin A ו- CHIR99021 ייצרה כ 89.7±0.8% SOX17 (DE סמן)-תאים חיוביים. לאחר התבגרות נוספת במבחנה, תאים אלה הביעו סמנים ספציפיים בכבד ומורפולוגיה דמוית hepatocyte מופעל (מבוסס על כתמי המטוקסילין-אאוסין (H &E)) ופונקציות, כגון ספיגת ירוק אינדוקיאנין (ICG), אחסון גליקוגן ופעילות CYP3. התוצאות מראות כי hESCs ניתן להבדיל בהצלחה לתוך HLCs תפקודית בוגרת בשיטה זו והוא יכול לספק בסיס למחקר הקשורות למחלות כבד הקרנת תרופות במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחזוקת תאי גזע
הערה: פרוטוקול תחזוקת התא המתואר להלן חל על קו התא hES03 המתוחזק בשכבה מונוטלת תואמת. עבור כל הפרוטוקולים הבאים בכתב יד זה, יש לטפל בתאים תחת ארון בטיחות ביולוגי.
- הכינו מדיום תרבית תאי גזע 1x mTesR על ידי דילול מדיום משלים 5x למדיום בסיסי mTesR.
- הכינו מדיום Matrigel מוסמך 30x hESC על ידי דילול 5 מ"ל של Matrigel מוסמך HESC עם 5 מ"ל של DMEM / F12 על הקרח. יש לאחסן ב-20°C.
- הכן מדיום Matrigel מוסמך 1x hESC על ידי דילול 33.3 μL של מטריגל 30x hESC מוסמך עם 1 מ"ל של DMEM / F12.
- מעיל סטרילי 6 גם, רקמות תרבות מטופלים צלחות עם 1 מ"ל של 1x hESC מוסמך Matrigel בכל באר מראש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לילה. השאירו בטמפרטורת החדר (RT) לפחות 30 דקות לפני השימוש.
- להפשיר את hESCs cryopreserved באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות בלי לרעוד. לאחר מכן להעביר מיד את התאים על ידי pipetting לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל מראש 37 °C MTesR בינוני, צינור למעלה ולמטה בעדינות 2 פעמים.
- צנטריפוגה hESCs ב 200 x g במשך 2 דקות ב RT.
- לשאוף את supernatant בעדינות resuspend התאים ב 1 מ"ל של מדיום mTesR.
- לשאוף את המדיום DMEM/F12 מהצלחת ולזרע את התאים לתוך באר של צלחת 6-באר בצפיפות של 1 x 105 תאים ב 2 מ"ל של mTesR.
- דגירה באינקובטור 5% CO2 ולשמור על התאים על ידי החלפת עם מדיום mTesR שחומם מראש מדי יום. מעבר התאים בערך 70-80% מפגש או כאשר מושבות התא מתחילים ליצור קשר.
2. מעבר תאי גזע ובידול
- עבור תאים חולפים, לשאוף את המדיום ואת הדגירה התאים עם 1 מ"ל לכל באר של פתרון אנזים (למשל, Accutase במשך 5 דקות ב 37 °C (69 °F). לאחר מכן להעביר את התאים על ידי pipetting לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של DMEM / F12 מראש לחממה ל 37 °C (60 °F).
- צנטריפוגה התאים ב 200 x g ב RT במשך 2 דקות.
- לשאוף את המדיום בעדינות resuspend גלולת התא ב 1 מ"ל של מדיום mTesR.
- הכן צלחות 24-באר על ידי ציפוי עם 250 μL של 1x hESC מוסמך Matrigel בינוני מראש. זרעי hESCs כמתואר לעיל בצפיפות של 1 - 1.5 x 105 תאים לבאר ב 500 μL של מדיום mTesR.
- אפשר לתאים לדגר במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F) באינקובטור CO2.
3. היווצרות DE
- הכן פתרונות מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל Activin A עם DPBS המכיל 0.2% BSA ו 3 מ"מ CHIR99021 עם DMSO.
- הכן שלב I בידול בינוני בסיסי על ידי השלמת מדיום RPMI עם 1x B27.
- הוסף Activin A לריכוז הסופי של 100 ng/mL ו CHIR99021 לריכוז הסופי של 3 מיקרומטר בנפח המתאים של שלב מחומם מראש אני בידול בינוני בסיסי.
- לשאוף mTesR בינוני מהתאים ולהחליף עם שלב I בידול מדיה המכילה גורמי בידול הוסיף (למשל, 0.5 מ"ל לכל באר של צלחת 24-well).
- אפשר לתאים לדגור במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2, החלפת מדיה שלב I מדי יום עם גורמי בידול הוסיף טרי (ימים 0-2).
הערה: לאחר 3 ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים של תאי DE, כגון FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 ו- FOXA1 (מינימום 80% מ- SOX17 הדרושים להליך).
4. בידול של תאי אב בכבד
- הכן שלב II בידול מדיה בסיסית על ידי המסת החלפת סרום נוקאאוט (KOSR) לריכוז הסופי של 20% ב- DMEM נוקאאוט.
- הכן מדיום בידול שלב II המכיל 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x פתרון חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 100 מיקרומטר 2-מרקפתנול ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) לנפח המתאים של KOSR / נוקאאוט DMEM.
- ביום 3 של בידול, לשאוף את המדיום ולהחליף עם שלב II בינוני (למשל, 0.5 מ"ל לכל באר של צלחת 24 גם). ואז דגירה במשך 24 שעות.
- ביום 4 של בידול, לשאוף את המדיום ולהחליף עם שלב II בינוני (למשל, 1 מ"ל לכל באר של צלחת 24 באר).
- לשנות את המדיום כל יומיים (להחליף בינוני ביום 6).
הערה: לאחר 8 ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים מתאימים של תאי אב בכבד, כגון HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (מינימום 80% של HNF4α הדרושים להליך).
5. בידול הפטוציטים
- הכן 10 מיקרוגרם / מ"ל גורם גדילה hepatocyte (HGF), 20 מיקרוגרם / מ"ל Oncostatin (OSM) פתרונות מלאי עם DBPS (המכיל 0.2% BSA) ומסנן עם קרום מסנן 0.22 מיקרומטר.
- הכן שלב III בידול בסיסי בינוני (HepatoZYME-SFM (HZM) בינוני בתוספת 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון-21-hemisuccinate ו 1x P/S).
- הוסף HGF לריכוז הסופי של 10 ng/mL ו OSM לריכוז הסופי של 20 ng/mL לנפח המתאים של מדיום בידול שלב III שחומם מראש.
- ביום 8 של בידול, לשאוף שלב II בינוני מתאים ולהחליף עם שלב III בינוני (למשל, 1 מ"ל לכל באר של צלחת 24 גם).
- אפשר לתאים לדגור במשך 10 ימים ב 37 °C (69 °F) באינקובטור CO2, שינוי מדיה שלב III כל יומיים עם גורמי בידול הוסיף טרי (ימים 8-18).
הערה: לאחר 18 ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים אופייניים של hepatocytes, כגון AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. אחוז התאים החיוביים של אלבומין הוא בדרך כלל יותר מ-90%.
6. בידוד RNA, סינתזת cDNA וניתוח RT-qPCR
- לשאוף מדיום מתאים ולהוסיף את הכמות הנכונה של ריאגנט RNAiso Plus, (למשל, 0.3 מ"ל לכל באר של צלחת 24-באר). לאסוף את supernatant בצינור 1.5 מ"ל ולתת לעמוד ב RT במשך 5 דקות.
- הוסף 60 μL של מגיב כלורופורם ולהשאיר אותו RT במשך 5 דקות. ואז צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 15 דקות.
- לאסוף את 125 μL supernatant ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה אחר. מוסיפים 160 μL של isopropanol, מערבבים היטב, ועומדים ב- RT במשך 10 דקות.
- צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 10 דקות.
- הסר את supernatant, להוסיף 75% אתנול לזרז, וצנטריפוגה ב 7,500 x g במשך 5 דקות.
- לאחר ייבוש ב RT, להוסיף 40 μL של מים שטופלו DEPC להתמוסס. עבור qPCR, לתמלל לאחור 2 מיקרוגרם של RNA הכולל עם ערכת שעתוק הפוכה על פי פרוטוקול היצרן.
- בצע RT-qPCR באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- לנרמל ביטוי גנים יחסית לתאי גזע שאינם המושרה ולקבוע וריאציה לקפל לאחר נורמליזציה GAPDH.
7. אימות כשל חיסוני של בידול
- הכן מאגר כביסה 1x PBST על-ידי הוספת 0.1% Tween-20 ל- PBS.
- לשאוף מדיום מתאים חסידיים ולשטוף בקצרה עם PBS ב RT על שייקר.
- לשאוף PBS ותאי דגירה עם 500 μL של מתנול קר כקרח לכל באר של צלחת 24-well לתקן את התאים ב -20 מעלות צלזיוס לילה.
- הסר את מתנול ולשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS על שייקר במשך 10 דקות בכל פעם ב RT.
- לחסום תאים עם 500 μL של 5% BSA מוכן PBS עבור 1-2 שעות ב RT על שייקר.
- לדלל את הנוגדן העיקרי ב 1: 200 באותו פתרון המשמש לחסימה.
- דגירה את התאים הקבועים בתמיסת נוגדנים ראשונית μL 300 μL לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.
- לאחר הדגירה לילה, לשטוף תאים 3 פעמים עם PBST במשך 10 דקות בכל פעם ב RT על שייקר.
- הכינו פתרון נוגדנים משני בחסימת הפתרון בשעה 1:1000.
- דגירה ב 300 μL של פתרון נוגדנים משני מוגן מפני אור במשך 1 שעה ב RT על שייקר.
- לשאוף פתרון נוגדנים משני ולשטוף תאים 3 פעמים עם PBST במשך 10 דקות בכל פעם ב RT על שייקר.
- דגירה תאים עם 300 μL של 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI במשך 3-5 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBST.
- לאחר שאיפת PBST, הוסף כמות מתאימה של PBS לצילום תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
8. ניתוח כתמים מערביים
- הכן מאגר כביסה של 1x TBST על-ידי הוספת 0.1% Tween-20 לתמיסת מלח (TBS) עם מאגר Tris.
- הכן מאגר אלקטרופורזה SDS-PAGE ומאגר העברה מערבי באמצעות ערכה מסחרית על פי פרוטוקול היצרן.
- פתור את סך חלבון התא (40 מיקרוגרם) על 10% נתרן דודקיל סולפט פוליאקרילמיד ג'ל ולהפעיל מאגר אלקטרופורזה SDS-PAGE ב 15 mA זרם קבוע במשך כ 2 שעות.
- מעבירים את הג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלוריד (PVDF) בזרם קבוע של 300 mA למשך 2 שעות בטמפרטורה נמוכה.
הערה: זמן הריצה וזמן ההעברה עשויים להשתנות בהתאם לציוד המשמש ולסוג ואחוז הג'ל. - חסום את הממברנה עם 3% BSA מוכן TBST עבור 1 שעה ב RT על שייקר.
- דגירה בתמיסת נוגדנים ראשונית (1:1000 דילול) לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.
- לאחר הדגירה לילה, לשטוף קרום סופג 3 פעמים עם TBST במשך 15 דקות בכל פעם ב RT על שייקר.
- דגירה בתמיסת נוגדנים משנית (1:2000 דילול) במשך 2 שעות ב RT על שייקר.
- השלך פתרון נוגדנים משני ולשטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBST, במשך 15 דקות בכל פעם, ב RT על שייקר.
- דמיינו להקות אימונואקטיביות המשתמשות בריאגנט של chemiluminescence ואחריו אוטורדיוגרפיה. השתמש β-actin כפקד הטעינה.
9. ספיגה ירוקה אינדוקיאנין
- הכן 200 מ"ג / מ"ל אינדוקיאנין ירוק פתרון מלאי DMSO.
- הכן פתרון עבודה על ידי השלמת שלב III בידול בינוני עם פתרון ירוק אינדוקיאנין לריכוז הסופי של 1 מ"ג / מ"ל.
- דגירה ב 37 °C (69 °F), 5% CO2 אינקובטור עבור 1-2 שעות.
- לשאוף בינוני ולשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS.
- תצלום מתחת למיקרוסקופ.
10. כתמי חומצה מחזורית-שיף (PAS) והכתמת המטוקסילין-אאוסין (H&E)
- לשאוף מדיום מתאים חסידיים ולשטוף לזמן קצר פעמיים עם PBS.
- עבור קיבוע תאים, לשאוף PBS ולדגור תאים עם מתנול קר כקרח ב -20 מעלות צלזיוס לילה.
- דמיינו אחסון גליקוגן על ידי כתמי PAS והתבוננו בתאים מנוצלים על ידי כתמי H &E באמצעות ערכה בהתאם להוראות היצרן.
- קח תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
11. מבחנים לפעילות CYP
- מדוד פעילות CYP450 באמצעות מבחנים מסחריים מבוססי תאים (P450-Glo Assays) בהתאם להוראות היצרן.
- השתמש בשלוש חזרות עצמאיות לבדיקה. הנתונים מיוצגים כ- SD ± הממוצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדיאגרמה הסכימטית של אינדוקציה HLC מ- hESCs ותמונות שדה בהיר מייצגות של כל שלב בידול מוצגות באיור 1. בשלב I, Activin A ו- CHIR99021 נוספו במשך 3 ימים כדי לגרום לתאי גזע ליצור תאי אנדודרם. בשלב II, תאי אנדודרם מובחנים לתאי אב בכבד לאחר שטופלו במדיום בידול במשך 5 ימים. בשלב III, הפטוציטים מוקדמים התבגרו והתבדלו ל- HLCs לאחר 10 ימים ב- HGF וב- OSM (איור 1A). בשלב הסופי של הבידול, התאים הראו פנוטיפ hepatocyte טיפוסי (התאים הם מצולעים ומופצים באופן שווה וקהיל) (איור 1B).
כדי לאשר עוד יותר את הבידול בכבד, RT-qPCR, כתמי כשל חיסוני וכתמים מערביים שימשו לגילוי סמנים של תאי אנדודרם, תאי אב כבד והפטוציטים בוגרים (איור 2). התאים המובחנים הראו רמות ביטוי גבוהות של גנים וחלבונים הקשורים לבידול בכל שלב, כגון סמני אנדודרם SOX17 (89.7± 0.8%) סמן אב כבד HNF4α (81.3±2.9%) ביום 8, AFP (86.6±0.3%) ביום 14, וסמן hepatocyte בוגר ALB (94.5±1.1%) תוצאות אלה מצביעות על כך שתאים דמויי hepatocyte נוצרים על-ידי פרוטוקול זה.
על מנת לזהות אם ל- HLCs יש פונקציות hepatocyte, זיהינו ספיגת ICG, אחסון גליקוגן ופעילות CYP של HLCs, כמו גם כתמי H&E שבוצעו. כפי שניתן לראות, ה-HLCs הציגו כתמים ירוקים (איור 3A)וכתמי חומצה מחזורית ציטופלזמית נרחבים (ורוד לסגול) נצפו (איור 3B), העולה בקנה אחד עם אחסון גליקוגן. בנוסף, אנו יכולים לראות את המורפולוגיה הייצוגית של hepatocyte בינוקלציה טיפוסית (איור 3C). לבסוף, הפעילות האנזימטית של CYP3A4, CYP המטבולי החשוב ביותר בכבד, אושרה על ידי מבחני פעילות אנזימטיים (איור 3D).
| שם ריאגנט | חברה | מספר קטלוג | ריכוז מלאי | ריכוז סופי |
| 2-מרקפטותנול | סיגמא | M7522 | 50 מ"מ | 100 מיקרומטר |
| 488 שכותרתו עז נגד העכבר IgG | ZSGB-ביו | ZF-0512 | - | מספר IF: 1:1000 |
| 488 שכותרתו עז נגד ארנב IgG | ZSGB-ביו | ZF-0516 | - | מספר IF: 1:1000 |
| אצוטאז (אציטאז) | טכנולוגיות תאי גזע | 7920 | 1 x | 1 x |
| אקאטיבין א' | פפרו-טק | 120-14E | 100 מיקרוגרם/מ"ל | 100 ננוגרם/מ"ל |
| אנטי - אלבומין (ALB) | סיגמא-אולדריץ' | A6684 | - | אם: 1:200; WB:1:1000 |
| אנטי - אוקטובר 4 אנושי | א-סאם (פירושונים) | Ab19587 | - | IF: 1:200 |
| אנטי - α-פטופרוטאין (AFP) | סיגמא-אולדריץ' | A8452 | - | אם: 1:200; WB:1:1000 |
| אנטי -SOX17 | א-סאם (פירושונים) | ab224637 | - | IF: 1:200 |
| פקטור גרעיני נגד הפטוסיטים 4 אלפא (HNF4α) | סיגמא-אולדריץ' | SAB1412164 | - | IF: 1:200 |
| תוספת B-27 | גיבקו (נ) | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | זמן ביוטיים | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | סיגמא-אולדריץ' | SML1046 | 3 מ"מ | 3 מיקרומטר |
| DAPI | זמן ביוטיים | C1006 | - | - |
| מים של DEPC | זמן ביוטיים | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE (שם שלי) | HY-12071 | 500 מיקרומטר | 250 ננומטר |
| DMEM/F12 | גיבקו (נ) | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | סיגמא-אולדריץ' | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS (לא כולל) | גיבקו (נ) | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| גלוטמקס | גיבקו (נ) | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| ערכת כתמי H&E | זמן ביוטיים | C0105S | - | - |
| גורם גדילה Hepatocyte (HGF) | פפרו-טק | 100-39 | 10 מיקרוגרם/מ"ל | 10 ng/ml |
| HEPATOZYME-SFM (HZM) | גיבקו (נ) | 17705-021 | - | - |
| הידרוקורטיזון-21-מיסוצ'יניאט | סיגמא-אולדריץ' | H4881 | 1 מ"מ | 10 מיקרומטר |
| אינדוקיאנין (אינדוקיאנין) | סנגון ביוטק | A606326 | 200 מ"ג/מ"ל | 1 מ"ג/מ"ל |
| נוק אאוט DMEM | גיבקו (נ) | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| לדפוק את SR רב מינים | גיבקו (נ) | A31815-02 | - | 20% |
| מטריגל HESC מוסמך | קורנינג | 354277 | 60 x | 1 x |
| מם נAA | גיבקו (נ) | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| תוספת mTesR 5X | טכנולוגיות תאי גזע | 85852 | 5 x | 1 x |
| מדיום בזל mTesR | טכנולוגיות תאי גזע | 85851 | 1 x | 1 x |
| אונקוסטטין (OSM) | פפרו-טק | 300-10 | 20 מיקרוגרם/מ"ל | 20 ננוגרם/מ"ל |
| P450 - CYP3A4 (לוציפרין - PFBE) | פרומגה (נפה) | V8901 | - | - |
| ערכת כתמים PAS | סולרביו (פירושונים) | G1281 | - | - |
| עט/סטרפטוקוקוס | גיבקו (נ) | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| עז מצומדת פרוקסידאז נגד עכבר IgG | ZSGB-ביו | ZB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| מאגר דילול נוגדנים ראשי עבור כתם מערבי | זמן ביוטיים | P0256 | - | - |
| ערכת RPCR RT של ReverTraAce | טויבו (נ) | FSQ-101 | - | - |
| RNאיסו פלוס | טאקארה (1999) | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | גיבקו (נ) | 11875093 | 1 x | 1 x |
| חלב דל שומן | סנגון ביוטק | A600669 | - | 5.00% |
| תערובת מאסטר ירוקה SYBR | תרמו פישר סיינטיפיק | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE (שם שלי) | HY-13002 | 15 מיקרומטר | 15 ננומטר |
| טווין (שם שלי) | סיגמא-אולדריץ' | WXBB7485V | - | 0.10% |
טבלה 1: רכיבים של תרבות תאים ומדיית בסיס בידול.
| שם הגן | קיצורים | רצפי פריימנים(ו) | רצפי פריימנים (R) |
| POU מחלקה 5 הומיאופוקס 1 | OCT4 | AGCGAACCAG טטגאגאק |
טאקאגאקאק אקטק אקטק |
| תיבת ראש מזלג A2 | FOXA2 | גקטקאטקאטק TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC קאגאטקט |
| פקטור שעתוק תיבת SRY 17 | SOX17 | טאטגTCTGC קגטאגאקאגט |
TTGGGACACAT טקאגטגטה |
| קולטן מחלקה מקורזל 8 | FZD8 | אטגקטאקAA צ'טאקאקטקה |
GTAקטגקטגגC אקאגאגאגאה (לאקאגאגה) |
| קולטן כימוקין מוטיב C-X-C 4 | CXCR4 | קק"לקט GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| תיבת ראש מזלג A1 | FOXA1 | אאגקטאקגה אקאגקטג |
טאקאקאצ'טג GTAGTACGCC |
| Msh הומיוקבוקס 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA אגגקטאק |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| מזוגנין 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
טגאגקטאקאקה טטגטאגטCCAC |
| תיבת תיבה בית מסוג קאודל 1 | CDX1 | אאגגטקטקט טקאגגטק גטק |
TGCTGTTTCCT TGTTCACTTTG |
| תיבת הומיובוק 1 בדילוג זוגי | EVX1 | GCTGTCTCTG אקאאאאאטגקט |
קאטקטקטקט CTCCTCCAAA |
| מזוזדרם אחורי BHLH שעתוק פקטור 2 | מספ2 | AGCTTGGGTGG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA אגאקטקה |
| NK2 תיבה ביתית 5 | NKX2.5 | קאגטגטגGCG TCTGCCTTT |
קגקט TTCGGCTCTA |
| ISL LIM הומיובוקס 1 | ISL1 | אגאטאטקאגט טגטאקגאטקה |
אקאגג'גגה אאקקט ג'קאט |
| גורם גרעיני Hepatocyte 4 אלפא | HNF4α | אקטגקטג GCCGACTAC |
CGTTגהגאטג GTGCCTTCT |
| אלפא פטופרוטיין | סוכנות הידיעות הצרפתית | אקטגאטאקאג אאקקטגקה |
TGCAGTCAATG קטקטקה (קטרטקה) |
| פקטור שעתוק T-Box 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG גאגא טגטג |
| טרנסת'ירטין | TTR | אגאגקטג CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAאגאטג |
| אלבומין (שם) | ALB | CCCCAAGTGT קאקטקה (נקז) |
GTTCAGGACCA תג CGGATAG |
| נתרן טאורוכולאט פולט פוליפפטיד | NTCP | קטאגאטג'יט CCTCAAATCCA |
גקאקטג'ק אגאגאטג |
| חלבון מחייב משפר CCAAT אלפא | רו"ח (רו"ח) | אגאגאגאטגה גקאג'קגקט |
AGTGCGCGATC טגאקטגקאג |
| משפחת סרפין חבר 1 | AAT | אאטגאקטקה CCCACGAT |
א.ק.טטגטגאטג CCCAGT |
| קולטן אסיהקוליקופרוטאין 1 | ASGR1 | קגאקקטגה CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG גאגטקטקט |
| ציטוכרום P450 משפחה 3 תת משפחה חבר 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
אאטג'גקאגט קקגטג'ה (לא כולל) |
טבלה 2: רצפי פריימר לניתוח q-PCR.
איור 1: דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול עבור המפרט DE ו- HLCs. (A) הצגה סכמטית של אסטרטגיית הבידול בת 3 השלבים המשמשת במחקר זה. (B) מורפולוגיה של התאים המובחנים בימים 0, 3, 8, 14 ו -18. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
איור 2: ביטוי סמן ספציפי לשלב במהלך בידול hESC לתוך HLCs. (A) ביטוי mRNA של גנים ספציפיים לשלב. (B-C) ביטוי חלבון של גנים ספציפיים לשלב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פונקציות של HLCs שמקורן ב- hESC. (A) HLCs שטופלו במשך שעה אחת עם 1 מ"ג / מ"ל אינדוקיאנין ירוק להפגין ספיגה כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ שלב. (B)נציג PAS מכתים תמונות המצביעות על אחסון גליקוגן. (ג)נציג HE מכתים תמונות המציגות תאים בינוקלאטים. (D)פעילות ברמת הבסיס של אנזימי ציטוכרום P450 עיקריים. כל הערכים מוצגים כמשמעותי ± SD. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה חורגת שגורמת ל- HLCs מ- hESCs בשלושה שלבים. בשלב הראשון, Activin A ו- CHIR99021 שימשו כדי להבדיל HESCs לתוך DE. בשלב השני, KO-DMEM ו- DMSO שימשו כדי להבדיל DE לתאי אב בכבד. בשלב השלישי, HZM בתוספת HGF, OSM והידרוקורטיזון 21-hemisuccinate מלח נתרן שימשו כדי להמשיך להבדיל בין תאי אב בכבד לתוך HLCs.
יש לקחת בחשבון את הצעדים הקריטיים הבאים בעת השימוש בפרוטוקול. צפיפות הבידול הראשונית של התאים והתזמון המדויק של שינויים בינוניים הם גורמים חשובים לבידול מוצלח. כאשר אנו מתחילים להבדיל, עלינו להבטיח כי צפיפות הזריעה הראשונית מתאימה, במפגש של כ 30-40%, כאשר התאים רק מתחילים לבוא במגע אחד עם השני, וכי החללים הבין תאיים מסודרים באופן שווה ברשת תחת שדה הראייה. במהלך הבידול, יש לשנות את מדיום הבידול המתאים דווקא בזמן המצוין, במיוחד בשלב הראשון וברגע המפתח של כל שלב החלפה, כדי להבטיח שהתאים יתבדלו במצב ובשלב המחקים את תהליך ההתפתחות העוברית.
השלב הראשון של בידול של hESCs לתוך DE חשוב במיוחד. בדרך כלל יש מספר רב של תאים שמתנתקים וצפים במהלך שלב I של בידול, המהווה שלב קריטי לגורל התא, אך בשלב זה התאים עדיין שומרים על היכולת להתרבות. לכן, המפגש של תאים יכול להגיע על 90-100% בסוף שלב I. בנוסף, יש לציין כי בתחילת שלב III של בידול (כלומר, יום 8), הציטופלסמה של התאים מתחילה להתעבות, וכתוצאה מכך התאים רוכשים בהדרגה מורפולוגיה רזה. עם זאת ביום 10, הציטופלסמה מתאוששת בהדרגה, וביום 14, התאים מתחילים להראות את המורפולוגיה הפוליהדרלית הברורה של hepatocytes.
במחקר זה, HLCs שהושגו הם למעשה קרובים יותר hepatocytes העובר כמו AFP הוא גבוה יותר לידי ביטוי מאשר ALB ביום 18. למרות שה- HLCs שנוצרו מפעילים מאפיינים ופונקציות של hepatocyte, עדיין קיים פער בין HLCs לבין הפטוציטים אנושיים ראשוניים, מה שמצביע על כך שהתאים המובחנים שלנו עדיין אינם בוגרים מבחינה תפקודית. לכן, עבודה עתידית תצטרך להתמקד במיטוב נוסף של שיטת הבידול.
כיום, גורמי גדילה ותרכובות מולקולריות קטנות כגון Activin A9,10,14, Wnt3a15, CHIR16, Torin217 ו- IDE118,19 משמשים בדרך כלל כדי לגרום לבידול DE במערכות בידול שונות. הקבוצה סונג השתמשה Activin A כדי להבדיל תאי גזע לתוך DE, והשתמש FGF4 (פקטורי גדילה פיברובלסט 4), BMP2 (חלבון מורפוגנטי עצם 2), HGF, KGF (גורם גדילה קרטינוציט), OSM ו Dex עבור מפרט הכבד והתבגרות HLCs20. הקבוצה סאליבן המושרה DE על ידי Activin A ו Wnt 3a, ו המושרה HLCs על ידי β-ME (2-mercaptoethanol), DMSO, אינסולין, HGF, OSM21. צוות Siller השתמש CHIR99021 עבור דה בידול, DMSO, Dihexa (האפטוציטים פקטורי גדילה קולטן אגוניסט N-hexanoic-Tyr), ו דקס עבור בידול HLC כדי להשיג HLC עם מאפייני תפקודי כבד16. עם זאת, חלק משיטות אלה להשתמש גורמי גדילה רקומביננטי רבים כדי ליצור DE עם עלות גבוהה וחלקם להשתמש רק מולקולות קטנות כדי ליצור DE עם יעילות נמוכה יותר. Activin A הוא גורם קריטי עבור יצירת DE. ניסינו להחליף Activin A עם מולקולות קטנות אחרות אבל בדרך כלל לקבל יעילות נמוכה יותר. לכן, אנו מאמצים את השיטה של הוספת Activin A ו- CHIR99021 כגורמים מעוררים של DE, ולזהות גנים הקשורים לבידול בכל שלב על ידי q-PCR, immunofluorescence ו blotting המערבי.
בשנים האחרונות, הקמת מערכת ניסיונית לאינדוקציה מכוונת של HLC מ- hESCs היא בסיס חשוב למידול תרופות לפיתוח הפטוציטים וסינון למחלות הקשורות לכבד. במקביל, הוא יכול גם לספק מקור יעיל של תאים להשתלת hepatocyte, הנדסת רקמת כבד, כבדים bioartificial ומחקרים אחרים. דווח כי HLCs שמקורם בתאי גזע שימשו לביצוע מחקרים שונים על זיהום ויראלי כמודל הקרנת סמים כדי לחזות תגובות המושרות על ידי תרופות hepatotoxic וללמוד את המסלול החיסוני המולד ואת מסלולי איתות של תאים10,22,23,24,25. בדרך כלל, שיטה זו מציגה בפירוט טכניקת בידול תאים יעילה דמוית hepatocyte מ- hESCs שיכולה להבדיל בהצלחה hESCs להפטוציטים פונקציונליים בוגרים. התוצאות מספקות פלטפורמה לפיתוח יישומים מבוססי HLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ' 81870432 ו 81570567 X.L.Z.), (מס '81571994 P.N.S.); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מס ' 2020A1515010054 כדי P.N.S.), קרן אוניברסיטת לי קה שינג Shantou (לא. L1111 2008 כדי P.N.S.). ברצוננו להודות לפרופ' סטנלי לין מהמכללה הרפואית של אוניברסיטת שאנטו על ייעוץ שימושי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
