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Immunology and Infection

बड़े पशु मॉडल में प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए सेल स्टैक में एडेनो-एसोसिएटेड वायरस वैक्टर का उत्पादन

Published: June 30, 2021 doi: 10.3791/62727
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम कोशिका ढेर और आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण में उगाई जाने वाली अनुयायी एचईके 293 कोशिकाओं का उपयोग करके अनुसंधान-ग्रेड एएवी वैक्टर के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल लगातार >1 x 1013 वेक्टर जीनोम/एमएल की पैदावार करता है, जो बड़े पशु अध्ययनों के लिए उपयुक्त वेक्टर मात्रा प्रदान करता है ।

Abstract

Adeno से जुड़े वायरस (AAV) वैक्टर सबसे चिकित्सकीय उन्नत जीन थेरेपी वैक्टर के बीच में हैं, तीन AAV जीन मनुष्यों के लिए मंजूरी दे दी चिकित्सा के साथ । एएवी के लिए उपन्यास अनुप्रयोगों की नैदानिक उन्नति में छोटे पशु मॉडलों से संक्रमण शामिल है, जैसे चूहों, कुत्तों, भेड़ और अमानवीय वानरों सहित बड़े पशु मॉडल में। बड़े जानवरों के लिए एएवी प्रशासन की सीमाओं में से एक उच्च टाइटर वायरस की बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता है । जबकि निलंबन सेल संस्कृति एएवी वेक्टर उत्पादन के लिए एक स्केलेबल विधि है, कुछ शोध प्रयोगशालाओं में उपकरण (जैसे, बायोरिएक्टर) हैं या जानते हैं कि इस तरीके से एएवी का उत्पादन कैसे किया जाए। इसके अलावा, एएवी टाइटर्स अक्सर काफी कम होते हैं जब अनुयायी HEK293 कोशिकाओं की तुलना में निलंबन HEK 293 कोशिकाओं में उत्पादित होता है। यहां वर्णित सेल स्टैक का उपयोग करके बड़ी मात्रा में उच्च-टाइटर एएवी का उत्पादन करने के लिए एक विधि है। एएवी के साथ-साथ वेक्टर शुद्धता को मान्य करने के तरीकों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल भी वर्णित किया गया है। अंत में, एक भेड़ मॉडल में एएवी-मध्यस्थता ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं। अनुयायी कोशिकाओं में एएवी वैक्टर के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए यह अनुकूलित प्रोटोकॉल आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं को बड़े पशु मॉडलों में अपने उपन्यास एएवी चिकित्सा के परीक्षण को आगे बढ़ाने में सक्षम बनाएगा।

Introduction

एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर का उपयोग करने वाली जीन थेरेपी ने पिछले तीन दशकों में भारी प्रगति की है1,2। जन्मजात अंधापन, हीमोफीलिया, और मस्कुलोस्केलेटल और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रोगों सहित आनुवंशिक रोगों की एक विविध श्रृंखला में सुधार का प्रदर्शन किया, नैदानिक अनुसंधान3,4में सबसे आगे AAV जीन थेरेपी लाया है । 2012 में, यूरोपीय दवाएं एजेंसी (ईएमए) ने एलपीएल की कमी के उपचार के लिए लिपोप्रोटीन लिपेज (एलपीएल) व्यक्त करते हुए एक AAV1 वेक्टर ग्लाइबेरा को मंजूरी दी, जिससे यह यूरोप या संयुक्त राज्य अमेरिका5में जीन थेरेपी उपचार के लिए पहला विपणन प्राधिकरण बन गया। तब से, दो अतिरिक्त एएवी जीन चिकित्सा, लक्सटर्ना6 और Zolgensma7,एफडीए अनुमोदन प्राप्त हुआ है, और बाजार के रूप में कई के रूप में 10-20 जीन चिकित्सा २०२५8से उंमीद के साथ अगले 5 वर्षों में जल्दी से विस्तार की उंमीद है । उपलब्ध नैदानिक डेटा से संकेत मिलता है कि एएवी जीन थेरेपी एक सुरक्षित, अच्छी तरह से सहन की गई और प्रभावोत्पादक तौर-तरीके हैं जो इसे सबसे होनहार वायरल वैक्टर में से एक बनाते हैं, जिसमें ClinicalTrials.gov के साथ पंजीकृत एवीवी से जुड़े 244 नैदानिक परीक्षण शामिल हैं। एएवी वैक्टर से जुड़े नैदानिक अनुप्रयोगों में बढ़ती रुचि के लिए बड़े पशु मॉडलों में एएवी चिकित्सा के मूल्यांकन को सुविधाजनक बनाने के लिए मजबूत और स्केलेबल उत्पादन विधियों की आवश्यकता होती है, क्योंकि यह ट्रांसलेशनल पाइपलाइन9में एक महत्वपूर्ण कदम है।

एएवी वेक्टर उत्पादन के लिए, दो मुख्य आवश्यकताएं एएवी जीनोम और कैप्सिड हैं। जंगली प्रकार (wt) का जीनोम-एएवी एकल-फंसे डीएनए है जो लंबाई10में लगभग 4.7 किब है। डब्ल्यूटी-एएवी जीनोम में जीनोम के दोनों सिरों पर पाए जाने वाले उल्टे टर्मिनल रिपीट्स (आईटीआर) शामिल हैं, जो पैकेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं, और निरसित और कैप जीन11। प्रतिनिधि और टोपी जीन, जीनोम प्रतिकृति के लिए आवश्यक, वायरल कैप्सिड की असेंबली, और वायरल कैप्सिड में जीनोम के encapsulation, वायरल जीनोम से हटा दिया जाता है और एएवी वेक्टर उत्पादन12के लिए ट्रांस में प्रदान की जाती है । वायरल जीनोम से इन जीनों को हटाने से चिकित्सीय ट्रांसजीन और प्रमोटर और पॉलीए सिग्नल सहित सभी आवश्यक नियामक तत्वों के लिए जगह प्रदान की जाती है । आईटीआर वेक्टर जीनोम में बने हुए हैं ताकि जीनोम की उचित प्रतिकृति और वायरल एनकैप्सुलेशन13,14को सुनिश्चित किया जा सके । ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की गतिज में सुधार करने के लिए, एएवी वेक्टर जीनोम को आत्म-पूरक होने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, जो एएवी जीनोम प्रतिकृति के दौरान एकल-फंसे डीएनए रूपांतरण से रूपांतरण की आवश्यकता को कम करता है, लेकिन कोडिंग क्षमता को ~ 2.4 केबी15तक कम कर देता है।

एएवी जीनोम डिजाइन से परे, कैप्सिड सेरोटाइप चयन वीवो2में एएवी वेक्टर के ऊतक और सेल ट्रॉपिज्म को निर्धारित करता है। ऊतक ट्रॉपिज्म के अलावा, विभिन्न एएवी सीरोटाइप को विभिन्न जीन अभिव्यक्ति काइनेटिक्स16प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, जिंकरेली एट अल17 ने विभिन्न एएवी सेरोटाइप्राइप को कम अभिव्यक्ति सेरोटाइप (एएवी 2, 3, 4, 5), मॉडरेट एक्सप्रेशन सेरोटाइप (एएवी 1, 6, 8) और उच्च अभिव्यक्ति सेरोटाइप्स (एएवी7 और 9) में वर्गीकृत किया। उन्होंने एएवी सेरोटाइप को धीमी शुरुआत वाली अभिव्यक्ति (एएवी 2, 3, 4, 5) या रैपिड-शुरुआत अभिव्यक्ति (AAV1, 6, 7, 8, और 9) में भी वर्गीकृत किया। ये भिन्न ट्रॉपिज्म और जीन अभिव्यक्ति गतिज कैप्सिड प्रोटीन, कैप्सिड प्रोटीन संरचनाओं में अमीनो एसिड विविधताओं और मेजबान सेल रिसेप्टर्स/सह-रिसेप्टर्स18के साथ बातचीत के कारण हैं । कुछ एएवी कैप्सिड में अतिरिक्त लाभकारी विशेषताएं होती हैं जैसे कि इंट्रावैस्कुलर एडमिनिस्ट्रेशन (एएवी9) के बाद रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने की क्षमता या टिकाऊ ट्रांसजीन अभिव्यक्ति (एएवी 6, 6.2 एफएफ, 8, और 9)19,20के लिए लंबे समय तक रहने वाली मांसपेशियों की कोशिकाओं में रहते हैं।

इस पेपर का उद्देश्य प्रीक्लिनिकल बड़े पशु मॉडलों में उपयोग के लिए उच्च शुद्धता, उच्च-टाइटर, अनुसंधान ग्रेड एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए लागत प्रभावी विधि का विस्तार करना है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एएवी का उत्पादन कोशिका के ढेर में उगाए जाने वाले अनुयायी मानव भ्रूणीय गुर्दे (एचईके) 293 कोशिकाओं में दोहरी-प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इसके अलावा, अध्ययन हेपरिन सल्फेट आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जिसका उपयोग एएवी सेरोटाइप के लिए किया जा सकता है जिसमें हेपरिन-बाध्यकारी डोमेन होते हैं, जिनमें एएवी2, 3, 6, 6.2 एफएफ, 13 और डीजे21,22शामिल हैं।

एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए कई पैकेजिंग सिस्टम उपलब्ध हैं। इनमें से, दो-प्लाज्मिड सह-ट्रांसफैक्शन सिस्टम का उपयोग, जिसमें प्रतिनिधि और कैप जीन और विज्ञापन सहायक जीन (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6, और VA RNA) एक प्लाज्मिड (pHelper) के भीतर निहित हैं, आम तीन प्लाज्मिड (ट्रिपल) ट्रांसफेक्शन विधि पर कुछ व्यावहारिक लाभ है, प्लाज्मिड उत्पादन के लिए कम लागत सहित23,24 . ट्रांसजीन एक्सप्रेशन कैसेट (pTransgene) युक्त एएवी जीनोम प्लाज्मिड, आईटीआर द्वारा घिरा होना चाहिए, और लंबाई में ~ 4.7 किलो से अधिक नहीं होना चाहिए। ट्रांसफैक्शन के दौरान संभावित साइटोटॉक्सिक प्रभावों के कारण ट्रांसजीन द्वारा वेक्टर टाइटर और शुद्धता प्रभावित हो सकती है। वेक्टर शुद्धता का आकलन यहां वर्णित है। इस विधि का उपयोग करके उत्पादित वैक्टर, जो प्रत्येक के लिए 1 x 1013 वीजी/एमएल उपज, चूहों, हम्सटर और ओवाइन पशु मॉडल में मूल्यांकन किया गया था।

तालिका 1: आवश्यक समाधानों की संरचना। प्रोटोकॉल के दौरान विभिन्न समाधानों के लिए आवश्यक घटकों के प्रतिशत और मात्रा सहित आवश्यक जानकारी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

1. सेल स्टैक में HEK293 कोशिकाओं का डबल प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक मनका स्नान में HEK293 कोशिकाओं की एक क्रायो-शीशी गल।
    नोट: पूर्व गर्म पूरा DMEM ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए, जबकि कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए ठंड तापमान चढ़ाना जब कोशिकाओं को झटका नहीं है विगलन रहे हैं । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं की कम मार्ग संख्या है, आदर्श रूप से 20 से कम, इष्टतम विकास और ट्रांसफैक्शन दक्षता सुनिश्चित करने के लिए। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को माइकोप्लाज्मा मुक्त होने के लिए प्रमाणित कर रहे हैं।
  2. क्रायो-शीशी ड्रॉपवाइज की सामग्री को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल पूर्व-गर्म पूर्ण डीएमईएम और 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
  3. मीडिया को एएसपिरेट करें, और फिर पूर्व-गर्म पूर्ण डीएमईएम के 20 एमएल में HEK293 कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को 15 सेमी प्लेट में बीज और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ 2 केसाथ।
  4. कोशिका संस्कृति कक्ष में सीडिंग के लिए कोशिकाओं को एक 15 सेमी प्लेट से तीन में विभाजित करें।
    1. एक बार कोशिकाओं को ८०% संकुचित कर रहे हैं, मीडिया आकांक्षी और धीरे PBS के 3 एमएल के साथ थाली धोने के लिए मोनोलेयर बाधित नहीं है । फिर, पीबीएस को एस्पिरेट करें और ट्राइपसिन के 3 एमएल जोड़ें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट जब तक कोशिकाओं प्लेट से उठा, और फिर थाली में पूरा DMEM के 7 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन बेअसर ।
    3. सभी मीडिया और कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में ले लीजिए और 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्री करके कोशिकाओं को गोली दें।
    4. 15 एमएल ट्यूब से सुपरनेट को एस्पिरेट करें और पूरी डीएमईएम के 3 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें। पूर्ण डीएमईएम के 20 एमएल युक्त प्रत्येक 15 सेमी प्लेट में 1 एमएल जोड़ें; धीरे-धीरे प्लेटों को समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए रॉक करें, और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. एक बार कोशिकाओं को 80% ढुलमुल होते हैं, तो 1.4.1 और 1.4.2 चरणों को दोहराएं। 50 एमएल शंकु नलियों में सुपरनेट लीजिए, और धीरे-धीरे ट्यूब को उलटा करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं सजातीय हैं।
  6. कोशिकाओं के नमूनों के 10 माइक्रोन को ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन के साथ मिलाकर सेल घनत्व का निर्धारण करें और सेल काउंटर में विश्लेषण के लिए मिश्रण को सेल काउंटिंग स्लाइड में जोड़ें।
  7. 1 x 10 4 कोशिकाओं/सेमी 2 के साथ सेल कल्चर चैंबर (6360 सेमी2का सतह क्षेत्र) बीजकरने के लिए आवश्यक सेल निलंबन के साथ पूर्व-गरम पूर्ण डीएमईएम के1 एल मिलाएं। सेल कल्चर चैंबर में सेल मिश्रण डालो और धीरे से प्रत्येक मोनोलेयर(चित्रा 1)भर में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए बारी से और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ 2 केसाथ।
  8. सेल कल्चर चैंबर के अलावा, 1 x 10 4 कोशिकाओं/सेमी2 के साथ एक15 सेमी प्लेट को उदारता के संदर्भ के रूप में प्लेट करें ।
  9. ~ 65-h इनक्यूबेशन के बाद, उदारता के लिए संदर्भ प्लेट की जांच करें-आदर्श ~80%-90% ढुलमुल ।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर चैंबर में जोड़ने के लिए प्री-वार्म पूर्ण डीएमईएम।

Figure 1
चित्रा 1:सेल सीडिंग और ट्रांसफैक्शन के लिए सेल स्टैक का पैंतरेबाज़ी। सीडिंग सेल स्टैक के लिए, वेंट कैप्स में से एक को हटाकर शुरू करें और HEK293 कोशिकाओं(ए)की आवश्यक मात्रा के साथ पूर्व-गर्म पूर्ण डीएमईएम के 1 एल में डालना शुरू करें। समान रूप से दोनों वेंट टोपियां कस कर कोशिकाओं और मीडिया को वितरित करें और सभी मीडिया को वेंट कैप में से एक के साथ सेल स्टैक के कोने में लाएं और इसे उस कोने(बी)में रखें, सेल स्टैक को अपनी तरफ(सी)रखें, और फिर सेल स्टैक 90 डिग्री(डी)को चालू करें ताकि वेंट पोर्ट(ई)ऊपर हों। धीरे से अपनी सामान्य क्षैतिज स्थिति के लिए सेल स्टैक कम और सुनिश्चित करें कि सेल स्टैक के सभी कक्ष पूरी तरह से मीडिया(एफ)में कवर कर रहे हैं । जब अतिक्रमण, दोनों वेंट टोपियां unscrew और धीरे-धीरे एक बेकार बाँझ अपशिष्ट कंटेनर में पुराने मीडिया डालना भी प्रवाह के लिए कोशिकाओं(जी)के मोनोलेयर परेशान नहीं है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. 3:1 (w/w) के एकाग्रता अनुपात में पॉलीथीलीनीमाइन (पीई)/डीएनए मिश्रण तैयार करें ।
    1. 50 एमएल शंकुदाता में डीएनए मिश्रण को 575 माइक्रोनजी और 1425 माइक्रोन को कम-सीरम माध्यम के 40 एमएल में जोड़कर 50 एमएल शंकु नली में तैयार करें ताकि फीपर का 3:1 अनुपात बनाया जा सके: pTrangene।
      नोट: पी/डीएनए मिश्रण कैलकुलेटर तालिका 2का उपयोग कर पाया जा सकता है ।
    2. कम सीरम माध्यम और डीएनए मिश्रण ड्रॉपवाइज करने के लिए पीई (1 जी/एल) के 5.7 एमएल जोड़ें। फिर, भंवर संक्षेप में और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
      नोट: कमरे के तापमान पर पी/डीएनए इनक्यूबेट के रूप में, यह थोड़ा बादल हो जाएगा ।
  2. पीई/डीएनए इनक्यूबेशन के 8 मिनट के बाद, सेल कल्चर चैंबर से मीडिया को हटा दें ।
    नोट: कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने से बचने के लिए मीडिया के एक चिकनी प्रवाह को बनाए रखने के लिए दोनों नारंगी टोपियां ढीला करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  3. पूर्व गर्म पूर्ण DMEM के 1 एल करने के लिए पी/डीएनए जोड़ें, और धीरे से सेल संस्कृति चैंबर बंदरगाह में मिश्रण डालना । तरल को सभी पंक्तियों(चित्रा 1)में समान रूप से वितरित करें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर72घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

2 कटाई AAV और संक्रमित HEK293 कोशिकाओं के रासायनिक लाइसिस

  1. कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए सेल संस्कृति कक्ष को सख्ती से हिलाएं जब तक कि मीडिया उखाड़ फेंकने वाली कोशिकाओं से बादल दिखाई देता है और चार 500 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में डाल देता है।
  2. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 18,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। 1 एल पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट कोपॉलिएस्टर (पीईटीजी) बोतल में स्पष्ट सुपरनेट डालें।
    नोट: यदि किसी के पास उच्च गति वाले अपकेंद्रित्र तक पहुंच नहीं है, तो 40 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। पेलेट कोशिकाएं इस गति से ठोस नहीं हो सकती हैं और सुपरनैंट के रूप में स्लाइड करेंगी।
  3. 500 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब्स में सेल छर्रों को 50 एमएल लाइसिस बफर और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर यूज करें।
  4. 30 मिनट के लिए 18,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें, और फिर सुपरनैंट को उसी 1 एल पीईटीजी बोतल में स्थानांतरित करें। पैलेट सेल मलबे को त्यागें।
    नोट: स्पष्ट सुपरनिटेंट को तुरंत शुद्ध करें और 72 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर न करें।

3 एएवी वेक्टर शुद्धिकरण हेपरिन आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

  1. क्रूड को -80 डिग्री सेल्सियस से निकालें और गल जाने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें। एक बार गल जाने के बाद, क्रूड को फ़िल्टर करने के लिए 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करें।
  2. अपकेंद्रित्र सार्टिफिकेटर को पासिवेट करने के लिए, उपयोग किए जा रहे प्रत्येक हेपरिन सेफेरोज कॉलम के लिए एक अपकेंद्रित्र सांट्रेक्टर में फिल्टर प्री-ट्रीटमेंट बफर के 4 एमएल जोड़ें। 2-8 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र ध्यान केंद्रित पासिवेट। शुद्धिकरण चरणों से तुरंत पहले पासिेशन स्थापित करें।
  3. टयूबिंग और पंप(चित्रा 2) कीस्थापना की ।
    1. एक पेरिस्टाल्टिक पंप में टयूबिंग रखें और 1 एम नाओएच के 20 एमएल चलाएं। इसके बाद, आणविक ग्रेड पानी के 50 एमएल चलाएं, और फिर बेसल डीएमईएम के 50 एमएल चलाएं।
    2. परिरक्षक को हटाने के लिए बेसल डीएमईएम के 25 एमएल को टयूबिंग और चलाने के लिए 5 एमएल हेपरिन सेफरोज कॉलम संलग्न करें।
  4. फ़िल्टर किए गए कच्चे तेल का 0.2 माइक्रोन 1-2 बूंदें/एस की प्रवाह दर पर कॉलम के माध्यम से चलाएं।

Figure 2
चित्रा 2:एएवी शुद्धिकरण के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप के लिए स्थापित करें। क्रूड लिएट से ट्यूबिंग, पेरिस्टाल्टिक पंप के माध्यम से, और हेपरिन मैट्रिक्स कॉलम में चलाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: बुलबुले पेश न करें या कॉलम को सूखा चलाने की अनुमति न दें, क्योंकि यह कॉलम से समझौता करेगा और एएवी के उन्मूलन को रोकेगा। यदि यह सूखा चलता है और शेष कच्चे तेल के लिए एक नए कॉलम का उपयोग करता है तो कॉलम को छोड़ दें।

  1. हेपरिन कॉलम पर क्रूड के सभी लोड करें और कॉलम को धोने के लिए निम्नलिखित समाधानों का उपयोग करें।
    1. एमजी 2 + और सीए2 + के बिना 1x हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के50मिलीएल का उपयोग करके धोएं।
    2. एमजी 2 + और सीए2 + के बिना एचबीबीएस में 0.5% एन-लॉरॉयलसरकोसिन के15एमएल का उपयोग करके धोएं।
    3. एमजी2+ औरसीए2 + के बिना एचबीएसएस के 50 एमएल का उपयोग करके धोएं।
    4. एमजी2+ औरसीए 2 + के साथ एचबीएसएस के 50 मिलीएल का उपयोग करके धोएं
    5. एमजी2 + और सीए 2 + के साथ 200 mM NaCl/HBSS के50एमएल का उपयोग कर धोएं।
    6. एल्यूट 5 x 5 एमएल (25 एमएल कुल) एनएसीएल/एचबीएसएस के 300 mm के साथ एमजी2 + और सीए2 + के साथ और ई 1-ई 5 के रूप में एल्यूशन लेबल (प्रत्येक एल्यूशन 5 मिलीएल का है) ।
  2. एक अपकेंद्रित्र सांसेंटर का उपयोग कर वायरस ध्यान केंद्रित
    1. 2 मिनट के लिए 900 x ग्राम पर पूर्व-उपचार बफर युक्त अपकेंद्रित्र ध्यानक को स्पिन करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    2. एचबीएसएस के 4 एमएल के साथ सेंट्रलाइज्ड सेंटिनेटर फिल्टर को एमजी2 + और सीए2 + और सेंट्रलाइज के साथ 2 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर धोएं; प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    3. अपकेंद्रित्र ध्यानक में एल्यूशन E2 जोड़ें। 5 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर स्पिन करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    4. E2 जोड़ना समाप्त करें और फिर केंद्रीकरण के लिए E3 जोड़ें और 5 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर स्पिन करें जब तक कि केंद्रित वायरस लगभग 1 एमएल न हो जाए।
      नोट: वेक्टर को अपकेंद्री करने से बचें ताकि वॉल्यूम फ़िल्टर के स्तर से नीचे हो। अपकेंद्रित्र ध्यान में E1, E4, या E5 ध्यान केंद्रित न करें, क्योंकि उनमें कोई वेक्टर बहुत कम होता है और संदूषक होते हैं।
    5. एक p200 फ़िल्टर टिप का उपयोग कर अपकेंद्रित्र सांद्रता से केंद्रित वायरस निकालें और यह एक बाँझ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह है।
    6. फिल्टर से किसी भी शेष एएवी को उखाड़ फेंकने के लिए एमजी 2 + और सीए 2 + के साथ एचबीएसएस के200 माइक्रोन के साथ अपकेंद्रित्र सांद्रता कुल्ला। किसी भी वायरस को उखाड़ फेंकने के लिए कई बार (~ 30 एस) को उखाड़ फेंकने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में वायरस के शेष के साथ झिल्ली और जगह का पालन किया। नलकूप मिला लें।
    7. डीएनए अर्क के लिए अलीकोट 5 माइक्रोन और -80 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध वेक्टर स्टोर करें।
  3. 2 एम एनएसीएल के 25 एमएल का उपयोग करके कॉलम धोएं। इसके अलावा कॉलम को धोने के लिए 01% ट्राइटन एक्स-100 के 25 एमएल, प्री-गर्म से 37 डिग्री सेल्सियस तक का इस्तेमाल करें। इसके बाद, बाँझ डीएच2ओ के 50 एमएल का उपयोग करके कॉलम धोएं, और फिर 20% इथेनॉल के 25 एमएल का उपयोग करके धोएं।
  4. सुनिश्चित करें कि कॉलम झिल्ली 20% इथेनॉल में पूरी तरह से संतृप्त है, क्योंकि यह भंडारण समाधान है। प्रदान किए गए प्लग के साथ कॉलम को सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 1 एम नाओह में टयूबिंग स्टोर करें।
    नोट: यदि ठीक से साफ किया जाता है, तो हेपरिन सेफारोज कॉलम को पांच बार तक फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।

4 AAV जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण

  1. DNase उपचार के लिए एक पीसीआर ट्यूब में तालिका 3 में उल्लिखित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
घटक आयतन
शुद्ध एएवी वेक्टर 5 माइक्रोन
10x DNase बफर 2 माइक्रोन
DNase 1 माइक्रोल
डीडीएच2ओ 12 माइक्रोल
अंतिम मात्रा 20 माइक्रोन

तालिका 3: DNase उपचार मास्टर मिश्रण फार्मूला। डीएनए निष्कर्षण के दौरान एएवी वायरल वैक्टर के डीएनएस उपचार के लिए आवश्यक अनुशंसित घटक और मात्रा।

  1. भंवर पीसीआर ट्यूब मिश्रण और सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए पीसीआर ट्यूब पल्स करने के लिए।
  2. थर्मोसाइकिलर का उपयोग करके, 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और इसके बाद 15 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस द्वारा DNase को निष्क्रिय करने के लिए गर्मी।
  3. प्रोटीनेज के 5 माइक्रोन जोड़ें।
  4. थर्मोसाइकिलर का उपयोग करके, 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीननेस के को गर्म करने के लिए।
  5. संभावित संदूषकों को हटाने के लिए डीएनए क्लीन-अप किट का उपयोग करें।
    नोट: यह कदम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रक्त और ऊतक क्लीन अप किट(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके किया गया था।
    1. DNase/Proteinase K इलाज वेक्टर युक्त पीसीआर ट्यूब के लिए अल बफर (रक्त और ऊतक साफ किट, सामग्री की मेज)के २०० μL जोड़ें ।
    2. भंवर पीसीआर ट्यूब और एक थर्मोसाइकिल में 10 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    3. पीसीआर ट्यूब से तरल को एक संग्रह ट्यूब में बैठे बाँझ स्पिन कॉलम में पिपेट करें।
    4. कॉलम में 100% इथेनॉल का 200 माइक्रोल जोड़ें और भंवर से अच्छी तरह से मिलाएं।
    5. 1 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और प्रवाह को त्यागें।
    6. स्पिन कॉलम में बफर AW1 (रक्त और ऊतक साफ किट, सामग्री की तालिका) के500 μL जोड़ें।
    7. 1 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और प्रवाह को त्यागें।
    8. स्पिन कॉलम में बफर AW2 (रक्त और ऊतक साफ किट, सामग्री की तालिका) के500 μL जोड़ें।
    9. 3 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और प्रवाह को त्यागें।
    10. स्पिन कॉलम को बाँझ 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें और स्पिन कॉलम झिल्ली में सीधे बफर एई (रक्त और ऊतक साफ किट, सामग्री की तालिका) के200 माइक्रोन जोड़ें।
    11. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    12. डीएनए को elute करने के लिए 1 मिनट के लिए 6,000 x ग्रामपर सेंट्रलाइज।
    13. डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

मात्रात्मक पॉलीमरेज चेन रिएक्शन और सिमियन वायरस 40 (एसवी40) जांच का उपयोग करके एएवी वेक्टर जीनोम का 5 टिट्रेशन

नोट: बाहरी डीएनए संदूषण से बचने के लिए फ़िल्टर किए गए पिपेट युक्तियों का उपयोग करके पीसीआर हुड में सभी क्यूपीसीआर कार्य करें। यदि एएवी जीनोम एक SV40 पॉलीए अनुक्रम एन्कोड नहीं करता है, तो कहीं और वर्णित आईटीआर के खिलाफ जांच का उपयोग करें25। मानक के रूप में चयनित प्लाज्मिड डीएनए को सुनिश्चित करें जिसमें SV40 पॉलीए अनुक्रम शामिल है।

  1. स्टॉक मानक तैयारी
    1. स्टॉक प्लाज्मिड डीएनए मानक (PTransgene प्लाज्मिड युक्त SV40 polya अनुक्रम) को 10 μg/μL की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें और 6 माइक्रोन एलिकोट्स में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. निम्नलिखित ऑनलाइन कैलकुलेटर26का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए मानक में मौजूद कॉपी नंबर निर्धारित करें।
      नोट: गुणवत्ता और सही एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए एक वाणिज्यिक विक्रेता द्वारा उत्पादित मानक के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लाज्मिड डीएनए का उपयोग करें। एक नए तैयार मानक में संक्रमण करते समय ब्रिजिंग अध्ययन करने के लिए बड़ी मात्रा में मानक (जैसे, 10 एमएल) तैयार करें।
  2. 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में दोनों नमूनों और मानक के लिए तालिका 4 में उल्लिखित निम्नलिखित रिएजेंट मिश्रण तैयार करें।
    नोट: मास्टर मिश्रण के पर्याप्त ओवरएज तैयार करें। प्राइमर/प्रोब सीक्वेंस के लिए टेबल 5 देखें ।
घटक आयतन
यूनिवर्सल क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स (2X) 10 माइक्रोल
आणविक ग्रेड पानी 4.5 माइक्रोल
40x SV40 पॉलीए प्राइमर/जांच 0.5 माइक्रोन
अंतिम मात्रा 15 माइक्रोन

तालिका 4: एएवी टिटरेशन के लिए क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स। एएवी वायरल वैक्टर से निकाले गए डीएनए के क्यूपीसीआर के लिए आवश्यक अनुशंसित घटक और मात्रा।

घटक अनुक्रम
फॉरवर्ड प्राइमर 5'-AGCAATAGCATCAAATTACAA-3'
रिवर्स प्राइमर 5'-CCAGACATGATGATGATGATGATGATGAGTT-3'
सलाई /56-FAM/AGCATTTTTTT/Zen/TTCACTGCATTAGTTTTTTTTTTTTC/3IABkFQ

तालिका 5: SV40 पॉलीया डीएनए अनुक्रम के खिलाफ प्राइमर अनुक्रम। क्यूपीसीआर टिटरेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर और जांच के दृश्य, जो एएवी वायरल वैक्टर के विशिष्ट क्षेत्रों से बांधते हैं जिनमें एसवी 40 पॉलीए अनुक्रम होते हैं।

  1. पाइपेट मास्टर मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे मिश्रण।
  2. कमजोर पड़ने की थाली सेट करें।
    1. मानक और नमूना कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए एक स्पष्ट 96-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें, कॉलम 1 (कॉलम 1, 3, 5, 7, 9, और 11) से शुरू होने वाले हर दूसरे कॉलम में प्रत्येक अच्छी तरह से आणविक ग्रेड पानी के 45 माइक्रोन जोड़ें।
    2. मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से A1 और पिपेट के लिए मानक के 5 माइक्रोन जोड़ें।
    3. अच्छी तरह से A1 से B1 तक 1/10 कमजोर पड़ने बनाने के लिए एक नए फ़िल्टर पाइपट टिप का उपयोग करें।
    4. G1 तक पहुंचने तक कॉलम के नीचे 10 गुना कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला जारी रखें।
    5. H1 में न जोड़ें, क्योंकि यह नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करेगा।
    6. पहले नमूने (S1) को अच्छी तरह से A3 में जोड़कर लागू करें, एक 1/10 कमजोर पड़ने का गठन । इस मिश्रण को पिपेट करें और 5 माइक्रोन्टो वेल बी 3 को स्थानांतरित करें। इस स्थानांतरण के बाद पिपेट टिप को त्यागें।
    7. एक नए पिपेट टिप के साथ, समाधान को अच्छी तरह से बी 3 में मिलाएं और 1/100 कमजोर पड़ने का रूप दें। इस मिश्रण को अच्छी तरह से C3 में 5 माइक्रोल् स स्थानांतरित करें और स्थानांतरण के बाद टिप को त्याग दें।
    8. एक नया पिपेट टिप के साथ, 1/1000 कमजोर पड़ने के लिए अच्छी तरह से C3 में समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें। टिप को त्याग दें।
    9. कॉलम 2, 4, 6, 8, 10, या 12 में किसी भी नमूने को जोड़ने के बिना नमूनों को कमजोर करना जारी रखें।
    10. एक बार जब सभी नमूनों को पतला कर दिया जाता है, तो कॉलम 1 के कुओं में सामग्री को मिलाएं, और फिर कॉलम 2 में 20 माइक्रोल स्थानांतरित करें।
    11. प्रत्येक मानक और नमूना कमजोर पड़ने की प्रतिकृति बनाने के लिए कॉलम 3, 5, 7, 9 और 11 के लिए इसे दोहराएं। प्लेट लेआउट के लिए चित्रा 3 को देखें।
      नोट: चित्रा 3में प्लेट सेट-अप के बाद, पंक्तियों जी और एच में पतला नमूनों में केवल 1/10 और 1/100 कमजोर पड़ने होंगे ।

Figure 3
चित्रा 3:क्यूपीसीआर एएवी टिटरेशन के लिए प्लेट लेआउट। ब्लू मानक के धारावाहिक कमजोर पड़ने के प्लेसमेंट को इंगित करता है; हरा नकारात्मक नियंत्रण के प्लेसमेंट को इंगित करता है; बैंगनी नमूनों के कमजोर पड़ने के स्थान को इंगित करता है। प्रत्येक मानक, नकारात्मक, या नमूना दोहराने में जोड़ा जाता है। मानक की एकाग्रता के लिए एक उदाहरण मानक की कमजोर पड़ने श्रृंखला दिखाने के लिए जोड़ा गया है, और नमूना कमजोर पड़ने के प्लेसमेंट उनके संबंधित कुओं में जोड़ा गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. SV40 पॉलीए डिटेक्शन-आधारित क्यूपीसीआर द्वारा टिटरेशन
    1. एक सफेद-अर्ध स्कर्ट 96-अच्छी तरह से क्यूपीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं में क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण के 15 माइक्रोन जोड़ें।
    2. स्पष्ट 96-अच्छी तरह से प्लेट से प्रत्येक नमूने के 5 माइक्रोन को सफेद-अर्ध स्कर्ट 96 अच्छी तरह से क्यूपीसीआर प्लेट में स्थानांतरित करें।
    3. क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण और नमूने के पर्याप्त मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
    4. एक सीलिंग फिल्म के साथ प्लेट सील और 30 एस के लिए 1500 x g पर क्यूपीसीआर प्लेट अपकेंद्रित्र।
    5. तालिका 6में सुझाई गई शर्तों का उपयोग करके प्लेट-आधारित वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन और डिटेक्शन इंस्ट्रूमेंट पर क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं।
अनुभाग चक्र समय तापमान वर्णन
प्री-इनक्यूबेशन 1x 5 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस डीएनए डेनैचिंग।
विस्तारण 38x 15 एस 95 डिग्री सेल्सियस डीएनए का प्रवर्धन। यदि विभिन्न एनीलिंग तापमान वाले वैकल्पिक प्राइमर का उपयोग करके सेटिंग्स को संशोधित किया जा सकता है।
60 एस 60 डिग्री सेल्सियस
शीतलन 1x 60 एस 40 डिग्री सेल्सियस प्लेट कूलिंग। रन का अंत।

तालिका 6: हाइड्रोलिसिस जांच आधारित क्यूपीसीआर टिटरेशन के लिए थर्मोसाइकिलर प्रोटोकॉल। डीएनए निकाले गए शुद्ध एएवी वैक्टर के जांच आधारित क्यूपीसीआर टाइटेशन के उपयोग के लिए थर्मोसाइकिलर प्रोटोकॉल की सिफारिश की गई है।

नोट: क्यूपीसीआर एएवी टिटरेशन वर्कशीट के लिए टेबल 7देखें ।

  1. डेटा विश्लेषण AAV जीनोम कॉपी नंबर निर्धारित करने के लिए।
    1. मानक और नमूना कमजोर दोनों के लिए क्यूपीसीआर रन से प्राप्त एकाग्रता मूल्यों के साथ स्प्रेडशीट डेटा कोशिकाओं(तालिका 7A)में भरें।
    2. एक मानक वक्र (टेबल 7बी) का उत्पादन करने के लिए टेबल7Aसे एकाग्रता मूल्यों का उपयोग करें।
      नोट: मानक वक्र को आर2 दक्षता के साथ एक प्राकृतिक लॉगरिथम(वाई = ए एलएन (एक्स)+ बी) के रूप में दिखायाजाएगा। एक मानक वक्र में 100% के करीब दक्षता और आर2 1.0 (≥0.99) के करीब होना चाहिए।
    3. इस ऑनलाइन कैलकुलेटर27में भरकर ढलान दक्षता में भरें ।
      नोट: 90%-110% के बीच एक दक्षता स्वीकार्य है। यदि क्यूपीसीआर की दक्षता इस सीमा से बाहर है, तो क्यूपीसीआर को फिर से चलाएं।
    4. प्रत्येक नमूने के कमजोर पड़ने को औसत करने के लिए तालिका 7A से एकाग्रता मूल्यों का उपयोग करें और प्रत्येक नमूने(तालिका 7C)के मानक विचलन का निर्धारण करें।
      नोट: नमूने के औसत से दूर एक मानक विचलन से दूर हैं कि नमूनों से कमजोर पड़ने को बाहर।
    5. प्रत्येक कमजोर पड़ने की औसत एकाग्रता का उपयोग करना, कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करना, और फिर प्रत्येक नमूने(तालिका 7C)के वेक्टर जीनोम (वीजी) /μL प्राप्त करने के लिए पांच से विभाजित करें।
    6. प्रत्येक नमूने की सांद्रता के मतलब को 80,000(तालिका 7C)द्वारा गुणा करके प्रत्येक नमूने के वीजी/एमएल की गणना करें।
    7. प्रत्येक औसत(तालिका 7C)के अंतिम वीजी/एमएल का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने का औसत Vg/एमएल ।
      नोट: उपयोगकर्ता को वीजी/माइक्रोन में एकाग्रता का उत्पादन करने के लिए क्यूपीसीआर रन के लिए प्रत्येक कुएं में लोड किए गए 5 μL के लिए खाते में एक कारक पांच द्वारा प्रत्येक कमजोर पड़ने की औसत एकाग्रता को विभाजित करना चाहिए। प्रत्येक नमूनों के मतलब एकाग्रता मूल्य से vg/mL के लिए संक्रमण के लिए ८०,० खातों का कारक । सबसे पहले, प्रत्येक नमूने के एकाग्रता मूल्य का मतलब एकल फंसे जीनोम के लिए खाते में 2 से गुणा किया जाना चाहिए, क्योंकि प्राइमर-प्रोब सेट केवल सकारात्मक-भावना, एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) की मात्रा निर्धारित करता है, और एएवी जीनोम सकारात्मक और नकारात्मक-भावना ssDNA 25,28के बीच लगभग1:1अनुपात में मौजूद है । प्रत्येक नमूने के एकाग्रता मूल्य का मतलब x40 को गुणा किया जाना चाहिए ताकि नमूना कमजोर पड़ने के लिए शुद्ध वेक्टर (धारा 4.1) के 5 माइक्रोन से निकाले गए डीएनए (धारा 4.6.12) के 200 माइक्रोन तक हो। अंत में, प्रत्येक नमूने के एकाग्रता मूल्य का मतलब x1000 गुणा किया जाना चाहिए vg/μL से vg/mL में परिवर्तित करने के लिए ।

6 वेक्टर गुणवत्ता और शुद्धता का आकलन

  1. गुणवत्ता नियंत्रण - पश्चिमी दाग
    1. 12% एसडीएस पेज जेल तैयार करें।
    2. पॉलीएक्रीलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस करें।
      नोट: प्रति अच्छी तरह से नमूनों के 6 x10 10 वीजी लोड करें।
    3. प्रोटीन को पॉलीविनाइलिडीन डिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करें।
    4. पीवीडीएफ झिल्ली को अवरुद्ध करना
      1. स्थानांतरण तंत्र से झिल्ली निकालें और ढीले एक्रिलामाइड को हटाने के लिए 0.1% पीबी एस में कुल्ला करें।
      2. कमरे के तापमान पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध करने में झिल्ली रखें।
        नोट: बफर को अवरुद्ध करने के लिए 2% बकरी सीरम के साथ आगे पूरक किया जा सकता है।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन
      1. अवरुद्ध बफर को डिकेंट करें और प्राथमिक एंटीबॉडी, 1:200 कमजोर पड़ने पर एक एंटी-एएवी माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जोड़ें।
      2. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      3. प्राथमिक एंटीबॉडी को डिकेंट करें और आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1% पीबी एसटी के साथ पांच बार धोएं।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन
      1. धोने के समाधान को डिकेंट करें और एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें, बफर को अवरुद्ध करने में 1:7500 पर पतला, और आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      2. माध्यमिक एंटीबॉडी को डिकेंट करें और आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1% पीबी एसटी के साथ पांच बार धोएं।
      3. आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ एक अंतिम धोने प्रदर्शन करते हैं ।
    7. उन्नत रसायनिनेसेंट (ईसीएल) सब्सट्रेट का उपयोग करके प्रोटीन का पता लगाएं।
    8. वायरल प्रोटीन (वीपी 1, वीपी 2, और वीपी 3 उपइकाइट्स)(चित्र 4)की कल्पना करने के लिए जेल की छवि।

Figure 4
चित्रा 4:पश्चिमी दाग एएवी कैप्सिड प्रोटीन दिखा। लेन ए; मेगावाट सीढ़ी, लेन बी; AAV6.2FF-hIgG01, लेन सी; AAV6.2FF-hIgG02, लेन डी; AAV6.2FF-hIgG03, और लेन ई; AAV6.2FF-hIgG04. प्रत्येक AAV6.2FF-hIgG के 6 x10 10 vg उनके संबंधित गलियों में लोड किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. शुद्धता नियंत्रण - एसडीएस पेज और कूमासी दाग
    1. स्टेप 6.1.1 और 6.1.2 से बताए गए एसडीएस-पेज जेल और नमूने तैयार करें।
    2. कोमल आंदोलन के साथ 1 घंटे या रात भर के लिए समाधान फिक्सिंग में जेल को ठीक करें। पहले घंटे के दौरान एक बार फिक्सिंग समाधान बदलें।
    3. कोमल आंदोलन के साथ 2-4 घंटे के लिए धुंधला समाधान में जेल दाग।
    4. एक डिटेनिंग समाधान के साथ जेल को डेगैन करें। जेल की पृष्ठभूमि पूरी तरह से दाग (4-24 एच) तक कई बार डिटेनिंग समाधान की भरपाई करें।
    5. एक भंडारण समाधान में दाग जेल स्टोर करें।
    6. कूमासी धुंधला समाधान द्वारा दाग सभी प्रोटीन की कल्पना करने के लिए जेल छवि।

Figure 5
चित्रा 5:कूमासी-दाग जेल। लेन ए; मेगावाट सीढ़ी, लेन बी; AAV6.2FF-hIgG01, लेन सी; AAV6.2FF-hIgG02, लेन डी; AAV6.2FF-hIgG03, लेन ई; AAV6.2FF-hIgG04, लेन एफ; AAV6.2FF-hIgG05, और लेन जी; AAV6.2FF-hIgG06. प्रत्येक AAV6.2FF-higG के 6 x10 10 vg उनके संबंधित गलियों में लोड किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. वैकल्पिक शुद्धता नियंत्रण परख - HEK293 मेजबान सेल प्रोटीन का पता लगाने एलिसा
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलिसा के माध्यम से HEK293 मेजबान सेल प्रोटीन का पता लगाने का प्रदर्शन करें।
      नोट: शुद्ध आरएवी नमूनों के लिए 5 x10 -2 और 1 x10 -3 के कमजोर पड़ने का उपयोग करें। एक बार TMB कुएं में जोड़ा जाता है, प्रकाश से दूर इनक्यूबेट । परिणामों का विश्लेषण करने के लिए रैखिक प्रतिगमन का उपयोग नहीं किया जा सकता है।
    2. अज्ञात लोगों की सांद्रता को इंटरपोलेट करने और मूल नमूना एकाग्रता निर्धारित करने के लिए कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करने के लिए एक बिंदु-से-बिंदु विश्लेषण, घन स्प्लीन, या चार-पैरामीटर लॉजिस्टिक फिट विधि करें।

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Representative Results

छोटे कृंतक मॉडल से बड़े पशु मॉडल और अंततः नैदानिक आवेदन के लिए अनुवाद बड़े जानवरों को स्थानांतरित करने और चिकित्सीय प्रभाव प्राप्त करने के लिए आवश्यक एएवी की बड़ी राशि के कारण एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत करता है। तर्कसंगत रूप से डिजाइन किए गए AAV6.2FF कैप्सिड की ट्रांसडक्शन दक्षता की तुलना करने के लिए, पहले एएवी 63,चूहों, हैमस्टर्स और मेमनों की तुलना में मुरीन मांसपेशियों की कोशिकाओं में ट्रांसडक्शन दक्षता में 101 गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया गया था, और भेड़ के बच्चे सभी को मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एचपीजी) व्यक्त करते हुए AAV6.2FF प्रशासित किया गया था। AAV6.2FF-hIgG-व्यक्त वेक्टर एक CASI प्रमोटर4,एक वुडचक हेपेटाइटिस वायरस के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियामक तत्व (WPRE), और एक SV40 पॉलीए अनुक्रम निहित । छह सप्ताह की मादा BALB/c (n = 4) चूहों इंट्रामस्कुलर (आईएम) ४० μL में AAV6.2FF-higG के 1 x10 11 vg प्रशासित थे, और रक्त 0, 7, 14, 21, और 28 पोस्ट AAV प्रशासन पर HIGG निगरानी के लिए एकत्र किया गया था । चार सप्ताह पुराने सीरियाई hamsters (दो महिलाओं और दो पुरुषों) आईएम ४० μL में AAV6.2FF-hIgG के 1 x10 12 vg प्रशासित किया गया, और रक्त साप्ताहिक एकत्र करने के लिए hIgG अभिव्यक्ति के लिए निगरानी की थी । अंत में, 10 दिन पुराने पुरुष डोरसेट भेड़ के बच्चे (एन = 3) आईएम प्रशासित किया गया 1 x1013 vg/KG AAV6.2FF-hIgG में दो से तीन 1 mL इंजेक्शन में दुम । जुगलबंदी ब्लीडिंग से साप्ताहिक रक्त संग्रह पूरा हुआ और 28 दिनों तक एचआईजी की साप्ताहिक निगरानी की गई। सभी पशु प्रयोगों को गुएल्फ विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

चूहों आईएम प्रशासित 5 x10 12 vg/KG AAV6.2FF-hIgG के 171-237 μg/mL के बीच सीरम में 28 के बाद प्रशासन(चित्रा 6)द्वारा व्यक्त किया । Hamsters आईएम प्रशासित 2 x 1013 vg/KG AAV6.2FF-hIgG चूहों की तुलना में बहुत अधिक स्तर व्यक्त किया, 495-650 μg/mL के सीरम higG स्तर के साथ दिन 28 के बाद प्रशासन । अंत में, भेड़ आईएम प्रशासित 1 x 1013 vg/kg 28 के बाद प्रशासन द्वारा 21-46 μg/mL के सीरम higG स्तर व्यक्त किया । सभी पशु मॉडलों में, वेक्टर किसी भी स्वास्थ्य सूचकांक, जैसे वजन, उत्पादित वैक्टर की सुरक्षा और गुणवत्ता को साबित करने में बाधा नहीं दिखाई दिया । यह सर्वविदित है कि एएवी-मध्यस्थता मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) अभिव्यक्ति प्रजातियों और एमएबी के आधार पर काफी भिन्न होती है। लेखकों के ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, ओवाइन प्रजातियों में एएवी-एमएबी अभिव्यक्ति की कोई रिपोर्ट नहीं है, इस प्रकार, अपेक्षित अभिव्यक्ति के स्तर के लिए कोई बेंचमार्क नहीं है। यह उल्लेखनीय है कि इस अध्ययन में भेड़ 28 दिन के बाद इंजेक्शन अवधि में वजन में दोगुनी हो गई और चित्रा 6 में जानवरों सभी अलग AAV-mAbs के साथ स्थानांतरित किया गया और इस तरह तुलना नहीं की जा सकती है ।

Figure 6
चित्र 6:AAV6.2FF-hIgG की इंट्रामस्कुलर डिलीवरी चूहों, हम्सटर और भेड़ों में निरंतर सीरम एचआईजी अभिव्यक्ति की ओर जाता है। महिला BALB/c चूहों (n = 4) आईएम प्रशासित 5 x 1012 vg/KG AAV6.2FF-higG, सीरियाई hamsters (2 पुरुष, 2 महिला), आईएम प्रशासित किया गया 1 x 1013 vg/kg AAV6.2FF-higG, और 10 दिन पुराने पुरुष डोरसेट भेड़ के बच्चे (n = 3) आईएम प्रशासित 1 x 1013 vg/kg थे । सीरम 28 दिनों की अवधि में higG अभिव्यक्ति के लिए निगरानी की गई थी । डेटा को मानक विचलन के मतलब ± रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सेल कल्चर चैंबर का ट्रांसफेक्शन
प्रोटोकॉल
1. ट्रांसफैक्शन से पहले डीएनए, ऑप्टिमेम और पी को कमरे के तापमान तक गर्म करने की अनुमति दें
2. संक्रमित होने के लिए सेल स्टैक की संख्या इनपुट करें (कोई ओवरएज आवश्यक नहीं है)
3. सुनिश्चित करें कि डीएनए सांद्रता सही है क्योंकि यह आवश्यक मात्रा को बदल देगा
सेल कल्चर चैम्बर्स की संख्या 1
ट्रांसजीन प्लाज्मिड की एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल
pDGM6.2FF प्लाज्मिड की एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल
राशि प्रति सेल संस्कृति कक्ष ट्रांसफेक्शन मास्टरमिक्स
ऑप्टिमेम 48.1 मिलीलीटर 48.1 मिलीलीटर
1:3 अनुपात pTransgene:pHelper पट्रांसजीन 475 माइक्रोग्राम 475 माइक्रोल
फीपर 1425 माइक्रोग्राम 1425 माइक्रोल
4. ऑप्टिमेम और प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यक मात्रा को 50 एमएल शंकु नली में जोड़ें
5. इनवर्ट 10 बार मिश्रण करने के लिए
3:1 पी: डीएनए अनुपात पी मैक्स 5.7 मिलीलीटर 5.7 मिलीलीटर
6. ऑप्टिमेम और प्लाज्मिड डीएनए युक्त 50 एमएल ट्यूब में पी की आवश्यक मात्रा जोड़ें
7. Immeditely 50 मिलीएल ट्यूब और भंवर बंद करें और मिश्रण करने के लिए 3-5 बार उलटा।
8. पी परिसरों के लिए 10 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करने के लिए इनक्यूबेट
9. बीएसएससी में संक्रमित होने के लिए सेल स्टैक को स्थानांतरित करें
10. 10 मिनट के बाद, एक नारंगी बंदरगाह में ट्रासंफ्क्शन मिश्रण डालें।
11. धीरे सेल ढेर भर में तरल मिश्रण
12. प्रत्येक परत पर समान मात्रा सुनिश्चित करने के लिए इनक्यूबेटर के लिए संक्रमित कोशिकाओं ढेर वापस
13. हार्वेस्ट सेल संस्कृति चैंबर 72 घंटे बाद

तालिका 2: सेल कल्चर चैंबर के लिए ट्रांसफेक्शन कैलकुलेटर। सेल कल्चर चैंबर के ट्रांसफेक्शन के लिए pTransgene, pHelper, और पीई की सही एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इंटरैक्टिव वर्कशीट।

तालिका 7: एएवी टिटरन कैलकुलेटर। इंटरैक्टिव वर्कशीट क्यूपीसीआर से एएवी नमूनों की अंतिम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, vg/mL के रूप में व्यक्त की । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पेपर में वर्णित रिकॉम्बिनेंट एएवी (आरएवी) वैक्टर का उत्पादन आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान प्रयोगशालाओं और सुविधाओं के बहुमत में पाए जाने वाले सामान्य सामग्रियों, अभिकर्णों और उपकरणों का उपयोग करता है। यह पेपर उच्च गुणवत्ता वाले इन विट्रो और वीवो ग्रेड आरएवी में पाठक द्वारा उत्पादित करने की अनुमति देता है। सबसे बड़ी बात यह है कि सीज़ियम क्लोराइड शुद्धिकरण से जुड़े अधिक थकाऊ प्रोटोकॉल की तुलना में आरएवी उत्पादन के लिए यह प्रोटोकॉल कुशल है और अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन के उपयोग से बचता है। एक बार HEK293 कोशिकाओं को संक्रमित किया गया है, शुद्ध AAV 5 कार्य दिवसों के भीतर उपयोग करने के लिए तैयार है ।

आरएवी उत्पादन और शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान, कई कदम वेक्टर की शुद्धता और अंतिम टिटर को प्रभावित कर सकते हैं। पहला और सबसे महत्वपूर्ण कदम HEK293 कोशिकाओं का स्वास्थ्य है, जिसका सीधा प्रभाव वेक्टर टाइटर पर पड़ता है। HEK293 कोशिकाओं का उपयोग अन्य सेल प्रकार या प्रणालियों के विपरीत, जैसे HEK293T कोशिकाओं का उपयोग, यह लाभप्रद है कि HEK293 कोशिकाओं में प्लेटों और कोशिकाओं की प्लास्टिक कोटिंग का पालन करने की अधिक क्षमता होती है जो नित्य कोशिका विकास के लिए मजबूत सेल नेटवर्क बनाते हैं। माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए कोशिकाओं की निगरानी करने और ~ 40 मार्ग पर एचईके 293 कोशिकाओं को पास करने से बचने के लिए या एक बार उनका दोगुना समय धीमा प्रतीत होता है क्योंकि इससे एएवी पैदावार कम हो जाएगी। इसके अलावा, कोशिकाओं की पुष्टि ट्रांसफेक्शन से पहले लगभग 80% संकुचित होती है यह सुनिश्चित करती है कि कोशिकाएं बहुत विरल या अधिक नहीं हैं। ट्रांसफैक्शन घटकों के संबंध में, उच्च गुणवत्ता वाले प्लाज्मिड डीएनए (जैसे, व्यावसायिक रूप से तैयार प्लाज्मिड डीएनए) के उपयोग की अत्यधिक सिफारिश की जाती है ताकि डीएनए को सुनिश्चित किया जा सके और पी जैसे रासायनिक ट्रांसफेक्शन डिलीवरी घटकों के साथ ठीक से बातचीत की जा सके। अंत में, ट्रांसफैक्शन रीएजेंट का आरएवी पैदावार पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। यहां, पी का उपयोग ट्रांसफैक्शन एजेंट के रूप में किया जाता है। पी एक स्थिर cationic बहुलक है जो प्लाज्मिड-बहुलक परिसरों के उत्पादन के माध्यम से कोशिकाओं के नाभिक को बहिर्जात डीएनए प्रदान करता है, जिसे तब कोशिकाओं द्वारा उठाया जाता है और मेजबान-कोशिका प्रक्रियाओं के माध्यम से नाभिक में तस्करी की जाती है29। पी-आधारित ट्रांसफैक्शन डीएनए डिलीवरी के अन्य तरीकों की तुलना में जल्दी और आसान होते हैं, जिनमें कैल्शियम फॉस्फेट या लिपोफेक्टामाइन शामिल हैं। हालांकि, पी के अनुपात: डीएनए को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

पारंपरिक अनुयायी प्लेटों के विरोध में सेल स्टैक का उपयोग आरएवी के उत्पादन के लिए अधिक सुविधाजनक और सुसंगत विधि प्रदान करता है। सेल स्टैक में ट्रांसफैक्शन के दौरान कम तकनीकी हेरफेर शामिल होता है, अनुयायी मोनोलेयर से कोशिकाओं के संभावित विघटन को कम करना, मजबूत सेल नेटवर्क के लिए अनुमति देता है, और आरएवी का बेहतर उत्पादन होता है। ट्रांसफैक्शन के बाद, कोशिकाओं के सुपरनेट और लाइसिस का संग्रह कुशल और सुसंगत है। कोशिकाओं से आरएवी की कटाई के लिए, फ्रीज-विगलन जैसे भौतिक कोशिका लाइसिस विधियां अक्षम और असंगत हैं क्योंकि यह सुनिश्चित करने का कोई तरीका नहीं है कि सभी कोशिकाओं को लाइस किया जाए। यहां केमिकल लाइसिस प्रक्रिया बताई गई है। रासायनिक लाइसिस बफर का उपयोग यह सुनिश्चित करता है कि सभी कोशिकाएं एक विशिष्ट एकाग्रता पर लाइसिस एजेंट के संपर्क में आती हैं, साथ ही कैप्सिड गिरावट को रोकने के लिए प्रोटीज अवरोधक जैसे एडिटिव्स भी। यह विधि आरएवी की अधिक कुशल फसल के लिए अनुमति देने वाली कोशिकाओं को अधिक लगातार lyses करती है। इसके अलावा, सेलुलर मलबे को हटाने और हटाने से कच्चे तेल के ल्युएट से संभावित संदूषक समाप्त हो जाते हैं, जो शुद्धिकरण से पहले lysate को छानने का समय और लागत बढ़ा सकते हैं।

हालांकि आरएवी कच्चे तेल की मात्रा में उच्च मात्रा में मौजूद हो सकता है, लेकिन आरएवी को पकड़ने और साफ करने का कार्य विभिन्न शुद्धिकरण विधियों जैसे सीज़ियम क्लोराइड ग्रेडिएंट्स के बीच भिन्न हो सकता है। यहां हेपरिन सेफरोज एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण का उपयोग वेक्टर शुद्धि के लिए एक तेजी से और आसान तरीका प्रदान करता है जिसके परिणामस्वरूप अल्ट्रापुरे वायरस होता है और इसके लिए ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, सभी एएवी सेरोटाइप में हेपरिन-बाध्यकारी डोमेन नहीं होते हैं, इसलिए उन सेरोटाइप के लिए यह शुद्धिकरण विधि उचित नहीं होगी। उदाहरण के लिए, जबकि AAV2 और AAV6 बांध हेपरिन सल्फेट, AAV4 और AAV530नहीं है । हालांकि यह विधि सार्वभौमिक नहीं है, लेकिन उन कैप्सिड के लिए यह कुशल और आसान है जो हेपरिन सल्फेट को बांधते हैं। iodixanol जैसे अल्ट्रा-अपकेंद्रित्र ग्रेडिएंट के विपरीत, सभी आरएवी कण स्तंभ की झिल्ली से बंधे होते हैं जब तक कि वे उच्च नमक एकाग्रता वॉश का उपयोग नहीं करते हैं, ग्रेडिएंट के मिश्रण और ढाल से अंशों को ठीक करने के लिए आवश्यक कौशल जैसे मुद्दों से बचते हैं। उच्च नमक एकाग्रता वॉश के माध्यम से एल्यूशन वायरस के नियंत्रित और सटीक एल्यूशन को अंशों में अनुमति देता है जिसे आगे केंद्रित किया जा सकता है। केवल eluted वायरस के कुछ अंशों को ध्यान केंद्रित करने से संभावित संदूषकों को हटा दिया जाता है, जबकि >९७% eluted वायरस ठीक हो जाता है । हेपरिन सेफरोज एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण की एक सीमा यह है कि यह खाली और पूर्ण कणों के बीच अंतर नहीं करता है। खाली कैप्सिड31को हटाने के लिए अतिरिक्त विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन चरणों को शामिल करने की आवश्यकता होगी ।

क्यूपीसीआर एएवी वेक्टर प्रेप में वेक्टर जीनोम की संख्या निर्धारित करने के लिए एक लागत प्रभावी और त्वरित विधि है। हालांकि क्यूपीसीआर एक संवेदनशील मात्राकरण विधि है, लेकिन यह तैयारी में संक्रामक कणों की संख्या के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करता है। इसके अलावा, इस परख की संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप परिवर्तनशीलता हो सकती है क्योंकि पिपटिंग के दौरान तकनीकी त्रुटियां अंतर-परख परिवर्तनशीलता का कारण बन सकती हैं। इस प्रकार, किसी भी प्रयोग के लिए जिसमें विभिन्न एएवी वैक्टर की तुलना करना शामिल है, यह महत्वपूर्ण है कि वैक्टर को एक ही क्यूपीसीआर प्लेट पर टिटर किया जाए। इन सीमाओं के बावजूद, क्यूपीसीआर एएवी को टिटरिंग के लिए विकसित सबसे सटीक तरीका है और वर्तमान में एएवी वैक्टर32के परिमाणीकरण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली और स्वीकार्य विधि है। एक प्राइमर/जांच का उपयोग जो एक आरएवी जीनोम के एसवी 40 पॉलीए से बांधता है, इस तथ्य पर आधारित है कि इस अनुक्रम को प्रयोगशाला में इंजीनियर कई एएवी जीनोम प्लाज्मिड्स में संरक्षित किया जाता है । पाठक के RAAV जीनोम प्लाज्मिड्स के बीच एक संरक्षित अनुक्रम चुनने से परे, qPCR जांच RAAV जीनोम के सभी भागों के लिए डिजाइन किया जा सकता है, सहित, लेकिन सीमित नहीं है, प्रमोटरों, ट्रांसजीन, या पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल कारकों ।

एएवी उत्पाद की शुद्धता और गुणवत्ता का आकलन उत्पादन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग वीपी 1, वीपी 2 और वीपी 3 संरचनात्मक प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है जो एएवी के कैप्सिड के साथ-साथ वीपी के किसी भी परिवर्तित रूप को बनाते हैं। वीपी 1, वीपी 2 और वीपी 3 आमतौर पर 1:1:10 के अनुपात में मौजूद होते हैं, लेकिन सीरोटाइप के आधार पर यह 1:1:5 से 1:1:20 तक भिन्न हो सकता है। इसलिए, प्रत्येक प्रणाली के लिए अनुपात को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से क्योंकि वीपी1 के एन-टर्मिनल क्षेत्र को संक्रमितता और लेनदेन33के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है। SDS-पेज Coomassie धुंधला के साथ मिलकर VP1, VP2, और VP3, साथ ही मेजबान सेल प्रोटीन प्रदूषकों का पता लगाने के लिए एक जगह सरल तरीका है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन दाग जैसे SYPRO रूबी का उपयोग कूमासी की तुलना में मेजबान सेल प्रोटीन संदूषकों की उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने की पेशकश करता है; हालांकि, सभी प्रयोगशालाओं में जेल की कल्पना करने के लिए आवश्यक इमेजिंग उपकरण तक पहुंच नहीं है। अंत में, वाणिज्यिक ELISAs HEK293 कोशिकाओं में उत्पादित AAV वैक्टर में मेजबान सेल प्रोटीन प्रदूषकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यह प्रोटोकॉल सेरोटाइप के लिए उच्च टाइटर, उच्च शुद्धता आरएवी के उत्पादन का गहन अवलोकन प्रदान करता है जो हेपरिन से बांधते हैं। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, विभिन्न प्रकार के पशु मॉडलों में एचआईजी को व्यक्त करते हुए उपन्यास AAV6.2FF का उपयोग वीवो मेंइस आरएवी की सुरक्षा और दक्षता को दर्शाता है। हालांकि AAV6.2FF वेक्टर आईएम प्रशासित किया गया था, इन उच्च गुणवत्ता, उच्च शुद्धता वायरस वीवो मेंविभिन्न मार्गों की एक किस्म के माध्यम से प्रशासित किया जा सकता है, जैसे मेजबान सेल प्रोटीन के रूप में संभव भड़काऊ प्रदूषक, हमारी शुद्धि प्रक्रियाओं के माध्यम से समाप्त कर दिया गया है ।

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Disclosures

सारा के वूटन AAV6.2FF कैप्सिड के लिए एक अमेरिकी पेटेंट US10806802B2 पर एक आविष्कारक है ।

Acknowledgments

अमीरा डी आरघी, ब्रेन्ना ए वाई स्टीवंस, सिल्विया पी थॉमस, और जैकब जी ई येट्स ओंटारियो वेटनरी कॉलेज के छात्र वजीफे के साथ-साथ ओंटारियो ग्रेजुएट स्कॉलरशिप के प्राप्तकर्ता थे । अमीरा डी आरघेई एक Mitacs तेजी लाने के छात्रशिप के प्राप्तकर्ता थे । इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (सीआईएचआर) परियोजना अनुदान (#66009) और एसकेडब्ल्यू को एक सहयोगी स्वास्थ्य अनुसंधान परियोजनाएं (NSERC भागीदारी) अनुदान (#433339) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore Sigma S2GPU05RE
0.25% Trypsin Fisher Scientific SM2001C
1-Butanol Thermo Fisher Scientific A399-4 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
10 chamber cellstack Corning 3271
1L PETG bottle Thermo Fisher Scientific 2019-1000
30% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad 1610158
96-well skirted plate FroggaBio FS-96
Adhesive plate seals Thermo Fisher Scientific 08-408-240
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Blood and Tissue Clean up Kit Qiagen 69506 Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol
Bromophenol blue Fisher Scientific B392-5 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Cell Culture Dishes Greiner bio-one 7000232 15 cm plates
Culture Conical Tube Thermo Fisher Scientific 339650 15 mL conical tube
Culture Conical Tube Fisher Scientific 14955240 50 mL conical tube
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine Cytiva Life Sciences SH30022.01
ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific 32209
Ethanol Greenfield P016EA95 Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30396.03
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-500 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glycine Fisher Scientific BP381-500
HBSS with Mg2+ and Ca2+ Thermo Fisher Scientific SH302268.02
HBSS without Mg2+ and Ca2+ Thermo Fisher Scientific SH30588.02
HEK293 cells American Tissue Culture Collection CRL-1573 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots
HEK293 host cell protein ELISA kit Cygnus Technologies F650S Follow manufacturer’s instructions
Heparin sulfate column Cytiva Life Sciences 17040703
Kimwipe Thermo Fisher Scientific KC34120
 L-glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific SH30034.02
Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion Corning CLS431124 Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions
Large Volume Centrifuge Tubes Corning CLS431123-6EA 500 mL centrifuge tubes
MgCl2  Thermo Fisher Scientific 7791-18-6
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use
Molecular Grade Water Cytiva Life Sciences SH30538.03
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma Aldrich L5125 CAUTION. Wear gloves
NaCl Thermo Fisher Scientific BP35810
Optimem, reduced serum medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D Sterilize prior to use
PBS (10x) Thermo Fisher Scientific 70011044 Dilute to 1x for use on cells
Penicillin-Streptomycin Solution Cytiva Life Sciences SV30010
pHelper plasmid De novo design or obtained from plasmid repository NA
Pipet basin Thermo Fisher Scientific 13-681-502 Purchase sterile pipet basins
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) Thermo Fisher Scientific 9002-93-1 CAUTION. Wear gloves
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 24765-1 Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C
Polypropylene semi-skirted PCR Plate FroggaBio WS-96
Polysorbate 20 (Tween 20) Thermo Fisher Scientific BP337-100 CAUTION. Wear gloves
polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Cytiva Life Sciences 10600023 Use forceps to manipulate. Wear gloves.
Primary antibody Progen 65158
Protein Ladder FroggaBio PM008-0500
Proteinase K Thermo Fisher Scientific AM2546
pTrangene plasmid De novo design or obtained from plasmid repository NA Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0
Pump tubing Cole-Parmer RK-96440-14 Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5
RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer Promega M6101 Use at 10x concentration in protocol from section 4.0
RQ1 Rnase-free Dnase Promega M6101
Sample dilutent Cygnus Technologies I700 Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit
Secondary antibody, HRP Thermo Fisher Scientific G-21040
Skim milk powder Oxoid LP0033B
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific 28312 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Sodium hydroxide (NaOH) Thermo Fisher Scientific SS266-4
SV40 polyA primer probe IDT Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Thermo Fisher Scientific 15524010 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypan blue Bio-Rad 1450021
Ultra-Filter Millipore Sigma UFC810024 Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff
Universal Nuclease for cell lysis Thermo Fisher Scientific 88702
Universal qPCR master mix NEB M3003L
Whatman Paper Millipore Sigma WHA1001325
β-mercaptoethanol Fisher Scientific 21985023 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.

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References

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