Summary
Här tillhandahåller vi ett detaljerat förfarande för storskalig produktion av AAV-vektorer av forskningskvalitet med hjälp av vidhäftande HEK 293-celler odlade i cellstackar och affinitetskromatografirening. Detta protokoll ger konsekvent >1 x 1013 vektorgenom/ml, vilket ger vektorkvantiteter som är lämpliga för stora djurstudier.
Abstract
Adeno-associerade virus (AAV) vektorer är bland de mest kliniskt avancerade genterapi vektorer, med tre AAV genterapier godkända för människor. Klinisk utveckling av nya tillämpningar för AAV innebär övergång från små djurmodeller, såsom möss, till större djurmodeller, inklusive hundar, får och icke-mänskliga primater. En av begränsningarna med att administrera AAV till större djur är kravet på stora mängder högtitervirus. Medan suspension cell kultur är en skalbar metod för AAV vektorproduktion, har få forskningslaboratorier utrustningen (t.ex. bioreaktorer) eller vet hur man producerar AAV på detta sätt. Dessutom är AAV-titers ofta betydligt lägre när de produceras i suspension HEK 293 celler jämfört med vidhäftande HEK293 celler. Beskrivs här är en metod för att producera stora mängder hög-titer AAV med hjälp av cellstackar. Ett detaljerat protokoll för titering AAV samt metoder för validering av vektor renhet beskrivs också. Slutligen presenteras representativa resultat av AAV-medierade transgene uttryck i en fårmodell. Detta optimerade protokoll för storskalig produktion av AAV-vektorer i vidhäftande celler kommer att göra det möjligt för molekylärbiologiska laboratorier att främja testningen av sina nya AAV-terapier i större djurmodeller.
Introduction
Genterapi med hjälp av adenoassocierade virusvektorer (AAV) har gjort stora framsteg under de senaste tre decennierna1,2. Visade förbättringar i ett brett spektrum av genetiska sjukdomar, inklusive medfödd blindhet, hemofili och sjukdomar i muskuloskeletala och centrala nervsystemet, har fört AAV-genterapi till framkanten av klinisk forskning3,4. År 2012 godkände Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) Glybera, en AAV1-vektor som uttrycker lipoproteinlilätas (LPL) för behandling av LPL-brist, vilket gör det till det första godkännandet för försäljning för en genterapibehandling i antingen Europa eller USA5. Sedan dess har ytterligare två AAV-genterapier, Luxturna6 och Zolgensma7, fått FDA-godkännande, och marknaden förväntas expandera snabbt under de kommande 5 åren med så många som 10-20 genterapier som förväntas 20258. Tillgängliga kliniska data tyder på att AAV genterapi är en säker, väl tolererad och effektiv modalitet vilket gör det till en av de mest lovande virala vektorerna, med över 244 kliniska prövningar med AAV registrerade med ClinicalTrials.gov. Det ökande intresset för kliniska tillämpningar som involverar AAV-vektorer kräver robusta och skalbara produktionsmetoder för att underlätta utvärderingen av AAV-terapier i stora djurmodeller, eftersom detta är ett kritiskt steg i translationell pipeline9.
För AAV-vektorproduktion är de två huvudkraven AAV-genomet och kapsiden. Genomet av vildtyp (wt)-AAV är enkelsträngat DNA som är ungefär 4,7 kb i längd10. Wt-AAV-genomet består av inverterade terminalrepetitioner (ITR) som finns i båda ändarna av genomet, som är viktiga för förpackningen, och rep- och capgenerna 11. Rep- och kapsegenerna, som är nödvändiga för genomreplikering, montering av viruskapslar och inkapsling av genomet i viruskapsiden, avlägsnas från virusgenomet och tillhandahålls i trans för AAV-vektorproduktion12. Avlägsnandet av dessa gener från virusgenomet ger utrymme för terapeutiska transgener och alla nödvändiga regulatoriska element, inklusive promotorn och polyA-signalen. ITR:erna finns kvar i vektorgenomet för att säkerställa korrekt genomreplikation och viral inkapsling13,14. För att förbättra kinetiken hos transgeneuttryck kan AAV-vektorgenom konstrueras för att vara självkompilerande, vilket minskar behovet av konvertering från enkelsträngad till dubbelsträngad DNA-konvertering under AAV-genomreplikering, men minskar kodningskapaciteten till ~ 2,4 kb15.
Utöver AAV-genomdesign bestämmer capsid serotypval vävnaden och celltropismen hos AAV-vektorn in vivo2. Förutom vävnadstropism har olika AAV-serotyper visat sig visa olika genuttryck kinetik16. Till exempel klassificerade Zincarelli et al.17 olika AAV-serotyper i serotyper med lågt uttryck (AAV2, 3, 4, 5), serotyper med måttliga uttryck (AAV1, 6, 8) och serotyper med högt uttryck (AAV7 och 9). De kategoriserade också AAV serotyper i långsam-debut uttryck (AAV2, 3, 4, 5) eller snabb-debut uttryck (AAV1, 6, 7, 8 och 9). Dessa divergerande tromatismer och genuttryckskinetik beror på aminosyravariationer i kapsidproteinerna, kapsidproteinformationer och interaktioner med värdcellreceptorer/co-receptorer18. Vissa AAV-kapsysider har ytterligare fördelaktiga egenskaper som förmågan att korsa blod - hjärnbarriären efter intravaskulär administrering (AAV9) eller bor i långvariga muskelceller för hållbart transgenuttryck (AAV6, 6.2FF, 8 och 9)19,20.
Detta dokument syftar till att beskriva en kostnadseffektiv metod för att producera hög renhet, hög-titer, forskningsklass AAV vektorer för användning i prekliniska stora djurmodeller. Produktion av AAV med hjälp av detta protokoll uppnås med hjälp av dual-plasmid transfection till vidhäftande mänskliga embryonala njurar (HEK)293 celler odlade i cell stackar. Dessutom beskriver studien ett protokoll för heparinsulfat affinitetskromatografirening, som kan användas för AAV-serotyper som innehåller heparinbindande domäner, inklusive AAV2, 3, 6, 6,2FF, 13 och DJ21,22.
Ett antal förpackningssystem finns tillgängliga för produktion av AAV-vektorer. Bland dessa har användningen av ett tvåplasmid-co-transfection-system, där Rep- och Cap-generna och Ad helper-generna (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 och VA RNA) finns i en plasmid (pHelper), vissa praktiska fördelar jämfört med den gemensamma treplasmidtransfektionsmetoden, inklusive minskad kostnad för plasmidproduktion23,24 . AAV-genomplasmiden som innehåller transgeneuttryckskassetten (pTransgene) får flankeras av ITR och får inte överstiga ~4,7 kb i längd. Vektortiter och renhet kan påverkas av transgenet på grund av potentiella cytotoxiska effekter under transfektion. Bedömning av vektor renhet beskrivs häri. Vektorer som produceras med denna metod, som ger en 1 x 1013 vg/mL för varje, utvärderades i möss, hamstrar och fårdjur modeller.
Tabell 1: Sammansättning av nödvändiga lösningar. Nödvändig information, inklusive procentsatser och volymer, av komponenter som behövs för olika lösningar i hela protokollet. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dubbel plasmidtransfektion av HEK293-celler i cellstaplar
- Tina en kryoflaska hek293 celler i ett pärlbad som är inställt på 37 °C.
OBS: Förvärmd komplett DMEM till 37 °C medan cellerna tinar för att säkerställa att den kalla temperaturen inte chockar cellerna vid plätering. Se till att cellerna har ett lågt passagenummer, helst mindre än 20, för att säkerställa optimal tillväxt och transfekteringseffektivitet. Se till att cellerna är certifierade för att vara mykoplasmafria. - Överför innehållet i kryoflaskan droppvis till ett koniskt rör på 15 ml som innehåller 10 ml förvärmt komplett DMEM och centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min.
- Aspirera media och sedan återanvända HEK293-cellerna i 20 ml förvärmd komplett DMEM. Frö cellerna i en 15 cm tallrik och inkubera vid 37 °C, med 5% CO2.
- Dela cellerna från en 15 cm platta i tre för sådd i cellodlingskammaren.
- När cellerna är 80% sammanflöde, aspirera media och tvätta försiktigt plattan med 3 ml PBS för att inte störa monolagret. Sedan aspirera PBS och tillsätt 3 ml trypsin.
- Inkubera i 2 min vid 37 °C tills cellerna lyfter från plattan och neutralisera sedan trypsin genom att tillsätta 7 ml komplett DMEM till plattan.
- Samla alla medier och celler i ett 15 ml-rör och pellet cellerna genom att centrifugera vid 500 x g i 5 min.
- Aspirera supernatanten från 15 ml röret och återanvända cellpelleten i 3 ml komplett DMEM. Tillsätt 1 ml till varje 15 cm platta som innehåller 20 ml komplett DMEM; vagga försiktigt plattorna för att fördela cellerna jämnt och inkubera vid 37 °C, med 5% CO2.
- När cellerna är 80% sammanflöde, upprepa steg 1.4.1 och 1.4.2. Samla supernatanten i 50 ml koniska rör och vänd försiktigt röret för att säkerställa att cellerna är homogena.
- Bestäm celltätheten genom att blanda 10 μL av cellproverna med 10 μL trypanblått och tillsätta blandningen i en cellräkningsbild för analys i cellräknaren.
- Blanda 1 L förvärmd komplett DMEM med den cellupphängning som behövs för att så cellodlingskammaren (yta på 6360 cm2) med 1 x 104 celler/cm2. Häll cellblandningen i cellodlingskammaren och rotera försiktigt för att fördela cellerna jämnt över varje monoskikt(figur 1) och inkubera vid 37 °C, med 5% CO2.
- Förutom cellodlingskammaren, plätera en 15 cm platta med 1 x 104 celler/cm2 som referens för sammanflöde.
- Efter ~65-h inkubation, kontrollera referensplattan för confluency-helst ~80%-90% confluent.
OBS: Förvärmd komplett DMEM för tillsats i cellodlingskammaren vid 37 °C.
Bild 1: Manövrering av cellstapel för cellutsäde och transfektering. För såddcellstapel, börja med att ta bort en av ventilationslocken och hälla i 1 L förvärmd komplett DMEM med nödvändig mängd HEK293-celler (A). Fördela celler och media jämnt genom att dra åt båda ventilationslocken och föra alla medier till hörnet av cellstacken med en av ventilationslocken och placera den i det hörnet (B), placera cellstapeln på sidan (C) och vrid sedan cellstapeln 90 °( D) så att ventilationsportarna är upp (E). Sänk försiktigt cellstapeln till dess normala horisontella läge och se till att alla kamrarna i cellstacken är helt täckta av media (F). Vid transfecting, skruva av båda ventilationslocken och häll långsamt ut gamla medier i en avfallssteril avfallsbehållare för att ens flöda för att inte störa cellernas monoskikt (G). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Förbered polyeteneimin (PEI)/DNA-blandning vid ett koncentrationsförhållande på 3:1 (w/w).
- Förbered DNA-blandningen i ett koniskt rör på 50 ml genom att tillsätta 475 μg pTrangene och 1425 μg pHelper till 40 ml reducerat serummedium för att skapa ett 3:1-förhållande av pHelper:pTrangene.
OBS: PEI/DNA-blandningskalkylatorn kan hittas med tabell 2. - Tillsätt 5,7 ml PEI (1 g/L) till det reducerade serummediet och DNA-blandningen droppvis. Virvel kort och inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
OBS: När PEI/DNA inkuberar vid rumstemperatur blir det något grumligt.
- Förbered DNA-blandningen i ett koniskt rör på 50 ml genom att tillsätta 475 μg pTrangene och 1425 μg pHelper till 40 ml reducerat serummedium för att skapa ett 3:1-förhållande av pHelper:pTrangene.
- Efter 8 minuters PEI/DNA-inkubation, ta bort mediet från cellodlingskammaren.
OBS: Se till att lossa båda orange locken för att upprätthålla ett jämnt flöde av media för att undvika att cellerna lossnar. - Tillsätt PEI/DNA till 1 L förvärmd komplett DMEM och häll långsamt blandningen i cellens odlingskammareport. Fördela vätskan jämnt till alla rader(figur 1) och inkubera i 72 timmar vid 37 °C, med 5% CO2.
2 Skörd av AAV och kemisk lys av de transfekterade HEK293-cellerna
- Skaka cellodlingskammaren kraftigt för att lossa cellerna tills mediet verkar grumligt från lossade celler och häll i fyra 500 ml centrifugrör.
- Centrifugera rören vid 18 000 x g i 30 min vid 4 °C för att pelletera cellerna. Häll det klarnade supernatanten i 1 L polyetentereftalatkolyserarflaska (PETG).
OBS: Om man inte har tillgång till en höghastighetscentrifuger, centrifugera vid 12 000 x g i 40 min. De pelleterade cellerna kanske inte är fasta med denna hastighet och kommer att glida som häller ut supernatant. - Återanvänd cellpelletsen i 500 ml centrifugrör med 50 ml lysbuffert och inkubera i 60 min vid 37 °C.
- Centrifugera rören vid 18 000 x g i 30 minuter och överför sedan supernatanten till samma 1 L PETG-flaska. Kassera det pelleterade cellskräpet.
OBS: Rena den klarnade supernatanten omedelbart och förvara vid 4 °C i upp till 72 timmar. För långtidsförvaring, förvara vid -80 °C. Förvara inte vid -20 °C.
3 AAV Vektorrening med hjälp av heparin affinitetskromatografi
- Ta bort rå lysat från -80 °C och låt vid 4 °C över natten tina. När du har tinat, använd ett 0,22 μM-filter för att filtrera den råa lysat.
- För att passivera centrifugalkoncentratorn, tillsätt 4 ml filterförbehandlingsbuffert till en centrifugalkoncentrator för varje heparin sepharose kolonn som används. Passivera centrifugalkoncentratorn vid rumstemperatur i 2-8 timmar. Ställ in passivering omedelbart före reningsstegen.
- Ställ in slangen och pumpen (bild 2).
- Placera slangen i en peristaltisk pump och kör 20 ml 1 M NaOH. Kör sedan 50 ml molekylärt vatten och kör sedan 50 ml basal DMEM.
- Fäst 5 mL heparin sepharose kolonn på slangar och kör 25 ml basal DMEM för att ta bort konserveringsmedlet.
- Kör 0,2 μM av den filtrerade råa lysat genom kolonnen med en flödeshastighet på 1-2 droppar/s.
Bild 2: Ställ in för peristaltisk pump för AAV-rening. Kör slangen från den råa lysat, genom den peristaltiska pumpen och in i heparinmatriskolonnen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
OBS: Se till att inte införa bubblor eller låt kolonnen torka, eftersom detta kommer att äventyra kolonnen och förhindra elution av AAV. Kassera kolonnen om den blir torr och använd en ny kolumn för resten av rå lysat.
- Ladda all rå lysate på heparinkolonnen och använd följande lösningar för att tvätta kolonnen.
- Tvätta med 50 ml 1x Hanks balanserade saltlösningar (HBSS) utan Mg2+ och Ca2+.
- Tvätta med 15 ml 0,5 % N-Lauroylsarcosin i HBSS utan Mg2+ och Ca2+.
- Tvätta med 50 ml HBSS utan Mg2+ och Ca2+.
- Tvätta med 50 ml HBSS med Mg2+ och Ca2+
- Tvätta med 50 ml 200 mM NaCl/HBSS med Mg2+ och Ca2+.
- Elute 5 x 5 mL (25 mL totalt) med 300 mM NaCl/HBSS med Mg2+ och Ca2+ och märk elutionerna som E1-E5 (varje elution är på 5 mL).
- Koncentrera viruset med hjälp av en centrifugalkoncentrator
- Snurra centrifugalkoncentratorn som innehåller förbehandlingsbufferten vid 900 x g i 2 min. Kassera genomströmningen.
- Tvätta centrifugalkoncentratorfiltret med 4 ml HBSS med Mg2+ och Ca2+ och centrifugera vid 1000 x g i 2 min; kassera genomströmningen.
- Tillsätt elution E2 i centrifugalkoncentratorn. Snurra vid 1000 x g i 5 minuter och kassera genomflödet.
- Tillsätt E2 och tillsätt sedan E3 i centrifugalkoncentratorn och snurra vid 1000 x g i 5 minuter tills det koncentrerade viruset är cirka 1 ml.
OBS: Undvik att centrifugera vektorn så att volymen är under filtrets nivå. Koncentrera inte E1, E4 eller E5 i centrifugalkoncentratorn, eftersom de innehåller mycket lite eller ingen vektor och innehåller föroreningar. - Ta bort det koncentrerade viruset från centrifugalkoncentratorn med en p200-filtrerad spets och placera det i ett sterilt 1,5 ml centrifugrör.
- Skölj centrifugalkoncentratorn med 200 μL HBSS med Mg2+ och Ca2+ för att lossa eventuell kvarvarande AAV från filtret. Pipettera upp och ner kraftigt flera gånger (för ~ 30 s) för att lossa något virus som klibba fast vid membranet och placera i 1,5 ml centrifugrör med resten av viruset. Blanda röret väl.
- Alikvot 5 μL för DNA-extraktioner och förvara den renade vektorn vid -80 °C.
- Tvätta kolonnen med 25 ml 2 M NaCl. Använd vidare 25 ml 0,1% Triton X-100, förvärmd till 37 °C för att tvätta kolonnen. Tvätta sedan kolonnen med 50 ml steril dH2O och tvätta sedan med 25 ml 20% etanol.
- Se till att kolonnmembranet är helt mättat i 20% etanol, eftersom det här är lagringslösningen. Försegla kolonnen med medföljande pluggar och förvara vid 4 °C.
- Förvara slangen i 1 M NaOH.
OBS: Om heparin sepharose kolonner rengörs korrekt kan de återanvändas upp till fem gånger.
4 AAV genomisk DNA-extraktion
- Förbered den reaktionsblandning som nämns i tabell 3 i ett PCR-rör för DNase-behandling.
| Komponent | Volym |
| Renad AAV-vektor | 5 μL |
| 10x DNase-buffert | 2 μL |
| DNase | 1 μL |
| ddH2O | 12 μL |
| Slutlig volym | 20 μL |
Tabell 3: DNase behandling master mix formel. Rekommenderade komponenter och volymer som krävs för DNase-behandling av AAV-virusvektorer under DNA-extraktion.
- Virvel PCR-röret för att blanda och pulsera PCR-röret för att snurra ner innehållet.
- Använd en termocykel och inkubera vid 37 °C i 20 minuter följt av 75 °C i 15 minuter för att värma in DNase.
- Tillsätt 5 μL Proteinase K.
- Använd en termocykel, inkubera vid 50 °C i 60 min och sedan vid 95 °C i 30 minuter för att värma inaktivera Proteinase K.
- Använd ett DNA-rengöringskit för att avlägsna potentiella föroreningar.
OBS: Detta steg utfördes med hjälp av en kommersiellt tillgänglig blod- och vävnadsrensningssats (Table of Materials).- Tillsätt 200 μL AL-buffert (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials)till PCR-röret som innehåller den DNase/Proteinase K-behandlade vektorn.
- Virvel PCR-röret och inkubera vid 56 °C i 10 min i en termocykel.
- Pipettera vätskan från PCR-röret till en steril spinnkolonn som sitter i ett uppsamlingsrör.
- Tillsätt 200 μL 100% etanol i kolonnen och blanda noggrant genom virvel.
- Centrifugera vid 6 000 x g i 1 min och kasta bort flödet genom.
- Tillsätt 500 μL buffert AW1 (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials)till spinnkolonnen.
- Centrifugera vid 6 000 x g i 1 min och kasta bort flödet genom.
- Tillsätt 500 μL buffert AW2 (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials)till spinnkolonnen.
- Centrifugera vid 15 000 x g i 3 minuter och kasta bort flödet genom.
- Placera spinnkolonnen i ett sterilt 1,5 ml centrifugrör och tillsätt 200 μL buffert AE (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials)direkt till spinnkolonnmembranet.
- Inkubera vid rumstemperatur i 1 min.
- Centrifugera vid 6 000 x gi 1 min för att elute DNA.
- Förvara DNA vid -20 °C.
5 Titrering av AAV-vektorgenom med kvantitativ polymeraskedjereaktion och en Simian Virus 40 (SV40) sond
OBS: Utför allt qPCR-arbete i en PCR-huva med filtrerade pipettspetsar för att undvika extern DNA-förorening. Om AAV-genomet inte kodar en SV40 polyA-sekvens använder du en sond mot ITR som beskrivs någon annanstans25. Se till att det plasmid-DNA som valts som standard innehåller SV40 polyA-sekvens.
- Beredning av lagerstandard
- Späd ut beståndets plasmid-DNA-standard (pTransgeneplasmid innehållande SV40 polyA-sekvens) till en slutlig koncentration av 10 μg/μL och förvara vid -20 °C i 6 μL alikvoter.
- Bestäm kopieringsnumret i plasmid-DNA-standarden med hjälp av följande onlinekalkylator26.
OBS: Använd ett plasmid-DNA som används för den standard som produceras av en kommersiell leverantör för att säkerställa kvalitet och korrekt koncentration. Förbered en stor mängd standard (t.ex. 10 ml) för att genomföra överbryggande studier vid övergång till en nyberedd standard.
- Förbered följande reagensblandning som nämns i tabell 4 för både proverna och standarden i ett 1,5 ml centrifugrör.
OBS: Förbered tillräcklig överkörning av huvudblandningen. Se tabell 5 för primer-/sondsekvenser.
| Komponent | Volym |
| Universell qPCR-huvudmix (2X) | 10 μL |
| Vatten av molekylär kvalitet | 4.5 μL |
| 40x SV40 polyA primer/sond | 0,5 μL |
| Slutlig volym | 15 μL |
Tabell 4: qPCR-huvudmix för AAV-titrering. Rekommenderade komponenter och volymer som krävs för qPCR av DNA extraheras från AAV virusvektorer.
| Komponent | Sekvens |
| Framåt primer | 5'-AGCAATAGCATCACAAATTTCACACAA-3' |
| Omvänd primer | 5'-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3' |
| Sond | /56-FAM/AGCATTTTT/Zen/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTTGTC/3IABkFQ |
Tabell 5: Primersekvenser mot SV40 polyA DNA-sekvensen. Sekvenser av primers och sond som används för qPCR titrering, som binder till specifika områden av AAV viral vektorer som innehåller SV40 polyA sekvensen.
- Pipettera huvudmästaren blanda upp och ner för att blanda.
- Ställ upp utspädningsplattan.
- Använd en klar 96-brunnsplatta för att förbereda standard- och provutspädningar, tillsätt 45 μL molekylkvalitetsvatten till varje brunn i varje annan kolumn som börjar med kolumn 1 (kolumnerna 1, 3, 5, 7, 9 och 11).
- Tillsätt 5 μL av standarden till brunn A1 och pipett att blanda.
- Använd en ny filtrerad pipettspets för att skapa en 1/10 utspädning från brunn A1 till B1.
- Fortsätt en serie 10-faldiga utspädningar nedåt i kolonnen tills du når G1.
- Lägg inte till H1, eftersom detta kommer att fungera som en negativ kontroll.
- Applicera det första provet (S1) genom att tillsätta det till brunn A3 och bilda en utspädning på 1/10. Pipettera denna blandning och överför 5 μLto brunn B3. Kassera pipettspetsen efter denna överföring.
- Blanda lösningen i brunn B3 med en ny pipettspets och bilda en utspädning på 1/100. Överför 5 μLof denna blandning till brunn C3 och kassera spetsen efter överföringen.
- Med en ny pipettspets, pipettera upp och ner lösningen i brunn C3 för att göra en 1/1000 utspädning. Kasta tipset.
- Fortsätt att späda ut proverna utan att lägga till några prover i kolumnerna 2, 4, 6, 8, 10 eller 12.
- När alla prover har spädts ut blandar du innehållet i brunnar i kolumn 1 och överför sedan 20 μL till kolumn 2.
- Upprepa detta för kolumnerna 3, 5, 7, 9 och 11 för att skapa replikat av varje standard och provutspädning. Se figur 3 för plåtlayout.
OBS: Vid följande plåtuppsättning i figur 3får proverna som späds ut i raderna G och H endast 1/10 och 1/100 utspädningar.
Bild 3: Plåtlayout för qPCR AAV-titrering. Blått anger placeringen av standardutspädningen av standarden. grönt anger placeringen av den negativa kontrollen; lila anger placeringen av utspädningen av proverna. Varje standard, negativ eller exempel läggs till i replikat. Ett exempel för koncentrationen av standarden har lagts till för att visa standardens utspädningsserie, och placering av provutspädningar har lagts till i deras respektive brunnar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Titrering av SV40 polyA detektionsbaserad qPCR
- Tillsätt 15 μL qPCR-huvudblandning till varje brunn på en vit halvkjolad 96-brunns qPCR-platta.
- Överför 5 μL av varje prov från den klara 96-brunnsplattan till den vit-halvkjolade 96 väl qPCR-plattan.
- Använd en flerkanalspipett för att säkerställa tillräcklig blandning av qPCR-huvudblandningen och provet.
- Försegla plattan med en tätningsfilm och centrifugera qPCR-plattan vid 1500 x g i 30 s.
- Kör qPCR-reaktionen på plattbaserat PCR-förstärknings- och detekteringsinstrument i realtid med hjälp av de föreslagna förhållandena i tabell 6.
| Sektion | Cykler | Tid | Temperatur | Beskrivning |
| Pre-inkubation | 1x | 5 min | 95 °C | DNA-denaturering. |
| Förstärkning | 38x | 15 s | 95 °C | Förstärkning av DNA. Inställningarna kan ändras om du använder alternativa primers med olika glödgningstemperaturer. |
| 60 s | 60 °C | |||
| Kylning | 1x | 60 s | 40 °C | Plåtkylning. Slut på körningen. |
Tabell 6: Termocykelprotokoll för hydrolys sondbaserad qPCR-titrering. Rekommenderat termocykelprotokoll för användning av sondbaserad qPCR-titrering av DNA extraherade renade AAV-vektorer.
Obs: För qPCR AAV titrering kalkylblad se tabell 7.
- Dataanalys för att bestämma AAV-genomkopieringsnummer.
- Fyll i kalkylbladsdatacellerna (tabell 7A) med de koncentrationsvärden som erhålls från qPCR-körningen för både standard- och provutspädningar.
- Använd koncentrationsvärdena från tabell 7A för att skapa en standardkurva(tabell 7B).
OBS: Standardkurvan visas som en naturlig logarithm (y = a ln(x) + b) tillsammans med R2 effektivitet. En standardkurva skall ha en verkningsgrad nära 100 % och R2 nära 1,0 (≥0,99). - Fyll i lutningseffektiviteten genom att fylla i denna onlinekalkylator27.
OBS: En effektivitet mellan 90%-110% är acceptabel. Om effektiviteten för qPCR ligger utanför det här intervallet kör du qPCR igen. - Använd koncentrationsvärdena från tabell 7A för att beräkna utspädningarna för varje prov och fastställa standardavvikelsen för varje prov(tabell 7C).
OBS: Exkludera utspädningar från prover som är mer än en standardavvikelse bort från genomsnittet av provutspädningarna. - Använd medelvärdeskoncentrationen för varje utspädning, multiplicera med utspädningsfaktorn och dividera sedan med fem för att få vektorgenomen (vg)/μL för varje prov(tabell 7C).
- Beräkna vg/ml för varje prov genom att multiplicera medelvärdet av varje provs koncentration med 80 000 (tabell 7C).
- Medelvärdet av vg/ml för varje utspädning för att producera den slutliga vg/ml för varje prov(tabell 7C).
OBS: Användaren måste dividera medelkoncentrationen för varje utspädning med en faktor fem för att ta hänsyn till de 5 μL som lastats in i varje brunn för qPCR-körningen för att producera koncentrationen i vg/μL. Faktorn 80 000 står för övergången från varje provs genomsnittliga koncentrationsvärde till vg/ml. För det första måste medelvärdet av varje provs koncentrationsvärde multipliceras med 2 för att ta hänsyn till de enkelsträngade genomen, eftersom primersonduppsättningen endast kvantifierar positivt, enkelsträngat DNA (ssDNA) och AAV-genomet finns i ett ungefärligt 1:1-förhållande mellan positiv och negativ känsla ssDNA25,28. Medelvärdet av varje provs koncentrationsvärde skall multipliceras x40 för att ta hänsyn till provutspädningen från 5 μL renad vektor (avsnitt 4.1) till 200 μL extraherat DNA (avsnitt 4.6.12). Slutligen måste medelvärdet för varje provs koncentrationsvärde multipliceras x1000 för att omvandlas från vg/μL till vg/ml.
6 Bedömning av vektorkvalitet och renhet
- Kvalitetskontroll - Western Blot
- Förbered en 12% SDS PAGE gel.
- Utför polyakrylamid gel elektrofores.
OBS: Ladda 6 x 1010 vg prover per brunn. - Överför proteinerna till polyvinylidendifluorid (PVDF) membran.
- Blockera PVDF-membran
- Ta bort membranet från överföringsapparaten och skölj i 0,1% PBST för att avlägsna lös akrylamid.
- Placera membranet i blockeringslösning i minst 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
OBS: Blockeringsbufferten kan kompletteras ytterligare med 2% getserum.
- Inkubation med primär antikropp
- Dekantera blockeringsbufferten och tillsätt den primära antikroppen, en anti-AAV-musmonoklonal antikropp vid en utspädning 1:200.
- Inkubera över natten vid 4 °C.
- Dekantera den primära antikroppen och tvätta fem gånger med 0,1% PBST i 5 min vid rumstemperatur med omrörning.
- Inkubation med sekundär antikropp
- Dekantera tvättlösningen och tillsätt HRP konjugerad sekundär antikropp, utspädd vid en 1:7500 i blockerande buffert och inkubera i 1 h vid rumstemperatur med agitation.
- Dekantera den sekundära antikroppen och tvätta fem gånger med 0,1% PBST i 5 min vid rumstemperatur med omrörning.
- Utför en sista tvätt med PBS i rumstemperatur med omrörning.
- Detektera proteinerna med hjälp av förbättrat chemiluminescent (ECL) substrat.
- Avbilda gelén för att visualisera de virala proteinerna (VP1, VP2 och VP3-underenheter) (figur 4).
Figur 4: Västerländsk fläck som visar AAV-kapsidproteiner. Körfält A; MW stege, Bana B; AAV6.2FF-hIgG01, Körfält C; AAV6.2FF-hIgG02, Körfält D; AAV6.2FF-hIgG03 och Lane E; AAV6.2FF-hIgG04. 6 x 1010 vg av varje AAV6.2FF-hIgG laddades i sina respektive körfält. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Renhetskontroll - SDS PAGE och Coomassie Stain
- Förbered SDS-PAGE-gel och prover enligt beskrivningen från steg 6.1.1 och 6.1.2.
- Fixera gelén i fixeringslösningen i 1 h eller över natten med mild omrörning. Byt fixeringslösning en gång under den första timmen.
- Färga gelén i färgningslösning i 2-4 timmar med mild omrörning.
- Destain gelén med en avtaininglösning. Fyll på avtaineringslösningen flera gånger tills gelens bakgrund är helt destained (4-24 h).
- Förvara den intorkade gelen i en förvaringslösning.
- Föreställ dig gelén för att visualisera alla proteiner färgade av Coomassie färgning lösning.
Figur 5: Coomassie-betsad gel. Körfält A; MW stege, Bana B; AAV6.2FF-hIgG01, Körfält C; AAV6.2FF-hIgG02, Körfält D; AAV6.2FF-hIgG03, Körfält E; AAV6.2FF-hIgG04, Körfält F; AAV6.2FF-hIgG05 och Lane G; AAV6.2FF-hIgG06. 6 x 1010 vg av varje AAV6.2FF-hIgG lastades in i sina respektive körfält. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Alternativ renhetskontrollanalys - HEK293 värdcellproteindetektering ELISA
- Utför HEK293-värdens cellproteindetektering via ELISA enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Använd utspädningar på 5 x 10-2 och 1 x 10-3 för renade rAAV-prover. När TMB har lagts till brunnen, inkubera bort från ljus. Linjär regression kan inte användas för att analysera resultaten. - Utför en punkt-till-punkt-analys, kubisk spline eller fyraparameter logistisk passformsmetod för att interpolera koncentrationer av okända och multiplicera med utspädningsfaktorn för att bestämma den ursprungliga provkoncentrationen.
- Utför HEK293-värdens cellproteindetektering via ELISA enligt tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översättning från små gnagare modeller till större djurmodeller och eventuell klinisk tillämpning utgör en betydande utmaning på grund av den stora mängd AAV som krävs för att omvandla större djur och uppnå terapeutiska effekter. För att jämföra transduktionseffektiviteten hos den rationellt utformade AAV6.2FF capsid, tidigare visat en 101-faldig ökning av transduktion effektivitet i murin muskelceller jämfört med AAV63, möss, hamstrar och lamm administrerades alla AAV6.2FF uttrycker en human monoklonal antikropp (hIgG). AAV6.2FF-hIgG-expresserande vektorn innehöll en CASI promotor4, en Woodchuck hepatit virus post-transcriptional regulatory element (WPRE) och en SV40 polyA sekvens. Sex veckor gamla kvinnliga BALB/c (n = 4) möss var intramuskulära (IM) administreras 1 x 1011 vg av AAV6.2FF-hIgG i 40 μL, och blod samlades in dag 0, 7, 14, 21 och 28 post AAV administration för hIgG övervakning. Fyra veckor gamla syriska hamstrar (två honor och två män) var IM administreras 1 x 1012 vg av AAV6.2FF-hIgG i 40 μL, och blod samlades in varje vecka för att övervaka för hIgG uttryck. Slutligen, 10-dagars gamla hane Dorset lamm (n = 3) var IM administreras 1 x1013 vg /kg av AAV6.2FF-hIgG i två till tre 1 mL injektioner i rumpan. Veckovis blod insamling slutfördes av halsblödningar och hIgG övervakades varje vecka i 28 dagar. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care Committee vid University of Guelph.
Möss IM administrerade 5 x 1012 vg/kg AAV6.2FF-hIgG uttryckt mellan 171-237 μg/ml hIgG i serumet dag 28 efter administrering(figur 6). Hams im administrerade 2 x 1013 vg/kg AAV6.2FF-hIgG uttryckt mycket högre nivåer än mössen, med serum hIgG nivåer på 495-650 μg/mL dag 28 efter administrering. Slutligen administrerade får IM 1 x 1013 vg/kg uttryckt serum hIgG nivåer av 21-46 μg/ml dag 28 efter administrering. I alla djurmodeller verkade vektorn inte hindra några hälsoindex, såsom vikt, vilket bevisar säkerheten och kvaliteten på de producerade vektorerna. Det är välkänt att AAV-medierad monoklonal antikropp (mAb) uttryck varierar avsevärt beroende på art och mAb. Såvitt författarna vet finns det inga rapporter om AAV-mAb uttryck i fårarter således finns det inget riktmärke för förväntade uttrycksnivåer. Det är anmärkningsvärt att fåren i denna studie fördubblades i vikt under den 28 dagar långa perioden efter injektionen och att djuren i figur 6 alla omfördes med olika AAV-mAbs och därför inte kan jämföras.
Figur 6: Intramuskulär leverans av AAV6.2FF-hIgG leder till ihållande serum hIgG uttryck hos möss, hamstrar och får. Kvinnliga BALB/c möss (n = 4) var IM administreras 5 x 1012 vg/kg av AAV6.2FF-hIgG, syriska hamstrar (2 manliga, 2 hona), var IM administreras 1 x10 13 vg/kg av AAV6.2FF-hIgG och 10-dagars gamla manliga Dorset lamm (n = 3) var IM administreras 1 x10. Serum övervakades för hIgG uttryck under en period av 28 dagar. Data representeras som medelvärdet ± standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Transfektion av cellkulturkammaren | |||||
| Protokoll | |||||
| 1. Låt DNA, OptiMEM och PEI värmas upp till rumstemperatur före transfektion | |||||
| 2. Mata in antalet cellstackar som ska transfectederas (inget överkörning krävs) | |||||
| 3. Se till att DNA-koncentrationerna är korrekta eftersom detta kommer att ändra de volymer som krävs | |||||
| Antal cellkulturkammare | 1 | ||||
| Koncentration av transgeneplasmid | 1 | mg/mL | |||
| Koncentration av pDGM6.2FF plasmid | 1 | mg/mL | |||
| Mängd per cellkulturkammare | Transfection Mastermix | ||||
| OptiMEM | 48.1 | Ml | 48.1 | Ml | |
| 1:3-förhållande pTransgene:pHelper | pTransgene | 475 | μg | 475 | μL |
| pHelper | 1425 | μg | 1425 | μL | |
| 4. Tillsätt erforderliga volymer av OptiMEM och plasmid-DNA till ett koniskt rör på 50 ml | |||||
| 5. Invertera 10 gånger för att blanda | |||||
| 3:1 PEI:DNA-förhållande | PEI Max | 5.7 | Ml | 5.7 | Ml |
| 6. Tillsätt den erforderliga mängden PEI till 50 ml-röret som innehåller OptiMEM och plasmid-DNA | |||||
| 7. Stäng 50 ml-röret och virveln och vänd 3–5 gånger för att blanda. | |||||
| 8. Ställ in en timer på 10 minuter för PEI-komplexen för att inkubera | |||||
| 9. Flytta cellstackar som ska transfectederas till BSC | |||||
| 10. Häll trasnfectionblandningen i en orange port efter 10 minuter. | |||||
| 11. Blanda försiktigt vätska i hela cellstapeln | |||||
| 12. Sätt tillbaka den transfekterade cellsstacken till inkubatorn och säkerställer lika stor volym på varje lager | |||||
| 13. Skörda cellodlingskammare 72 h senare | |||||
Tabell 2: Transfektkalkylator för cellodlingskammare. Interaktivt kalkylblad för att bestämma korrekt koncentration av pTransgene, pHelper och PEI för transfektion av cellkulturkammare.
Tabell 7: AAV Titreringskalkylator. Interaktivt kalkylblad för att bestämma den slutliga koncentrationen av AAV-prover från qPCR, uttryckt som vg/mL. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Produktionen av rekombinanta AAV (rAAV) vektorer som beskrivs i detta dokument använder vanliga material, reagenser och utrustning som finns i majoriteten av molekylärbiologiska forskningslaboratorier och anläggningar. Detta dokument gör det möjligt att producera högkvalitativ in vitro och in vivo grade rAAV av läsaren. Framför allt är detta protokoll för rAAV-produktion, jämfört med mer tråkiga protokoll som involverar cesiumkloridrening, effektivt och undviker användning av ultracentrifugation. När HEK293-celler har transfected är renad AAV klar att användas inom 5 arbetsdagar.
Under rAAV-produktion och reningsprocess kan många steg påverka vektorns renhet och slutliga titer. Det första och mest kritiska steget är hälsan hos HEK293-cellerna, vilket har en direkt effekt på vektortitern. Användningen av HEK293-celler i motsats till andra celltyper eller system, såsom HEK293T-celler, är fördelaktig eftersom HEK293-celler har en större förmåga att hålla fast vid plastbeläggningen av plattor och celler som skapar robusta cellnätverk för kontinuerlig celltillväxt. Det rekommenderas att övervaka celler för mykoplasmakontaminering och för att undvika att passa hek293-celler förbi ~ 40 passager eller när deras fördubblingstid verkar sakta ner eftersom detta kommer att leda till lägre AAV-utbyten. Dessutom säkerställer bekräftande celler cirka 80% sammanflöde före transfektion att cellerna inte är för glesa eller övervuxna. När det gäller transfekteringskomponenterna rekommenderas starkt användning av högkvalitativt plasmid-DNA (t.ex. kommersiellt förberett plasmid-DNA) för att säkerställa att DNA förblir i lösning och interagerar korrekt med kemiska transfekteringskomponenter, såsom PEI. Slutligen har reagenset för transfekt en betydande inverkan på avkastningen på rAAV. Här används PEI som transfekteringsmedel. PEI är en stabil katjonpolymer som levererar exogent DNA till cellernas kärna genom produktion av plasmidpolymerkomplex, som sedan tas upp av celler och smugglas till kärnan genom värdcellsprocesser29. PEI-baserade transfektioner är snabba och enkla i jämförelse med andra metoder för DNA-leverans, inklusive kalciumfosfat eller lipofectamin. Förhållandet mellan PEI:DNA måste dock optimeras.
Användningen av cellstackar som strider mot traditionella vidhäftande plattor ger en mer bekväm och konsekvent metod för produktion av rAAV. Cell stackar innebär mindre teknisk manipulering under transfektion, mildrar eventuell förskjutning av celler från den vidhäftande monolagret, vilket möjliggör starkare cellnätverk och bättre produktion av rAAV. Efter transfektion är insamlingen av supernatant och lys av celler effektiv och konsekvent. För att skörda rAAV från celler är fysiska celllysmetoder som frysupptining ineffektiva och inkonsekventa eftersom det inte finns något sätt att säkerställa att alla celler är lysda. Här beskrivs en kemisk lysprocedur. Användningen av kemisk lysbuffert säkerställer att alla celler exponeras för lysmedlet vid en specifik koncentration, liksom tillsatser som proteashämmare för att förhindra kapsidnedbrytning. Denna metod lyses mer konsekvent celler vilket möjliggör en effektivare skörd av rAAV. Dessutom eliminerar pelletering och avlägsnande av cellulärt skräp möjliga föroreningar från rålykten, vilket kan öka tiden och kostnaden för filtrering av lysate före rening.
Även om rAAV kan finnas i stora mängder i rå lysat, kan handlingen att fånga och rengöra rAAV skilja sig åt mellan olika reningsmetoder, såsom cesiumkloridgradienter. Här ger användningen av heparin sepharose affinitetskromatografi rening en snabb och enkel metod för vektorrening som resulterar i ultrapure virus och kräver inte gradient ultracentrifugation. Alla AAV-serotyper innehåller dock inte heparinbindande domäner, så för dessa serotyper skulle denna reningsmetod inte vara lämplig. Till exempel, medan AAV2 och AAV6 binder heparinsulfat, gör AAV4 och AAV5 inte30. Även om denna metod inte är universell, är det effektivt och enkelt för de kapsyler som binder heparinsulfat. Till skillnad från ultracentrifugeringsgradienter som iodixanol är alla rAAV-partiklar bundna till kolonnens membran tills de eltas med hjälp av hög saltkoncentrationstvättar, vilket undviker problem som blandning av gradienter och skicklighet som behövs för att återvinna fraktioner från gradienten. Elution genom hög saltkoncentration tvättar möjliggör kontrollerad och exakt elution av viruset till fraktioner som kan koncentreras ytterligare. Endast koncentration av vissa delar av det eluterade viruset tar ytterligare bort potentiella föroreningar samtidigt som >97% av det eluterade viruset. En begränsning av heparin sepharose affinitetskromatografi rening är att det inte skiljer mellan tomma och fulla partiklar. Ytterligare analytiska ultracentrifugationssteg skulle behöva införlivas för att avlägsna tomma kapsyler31.
qPCR är en kostnadseffektiv och snabb metod för att bestämma antalet vektorgenom i en AAV-vektorprep. Även om qPCR är en känslig kvantifieringsmetod, ger den ingen information om antalet infektiösa partiklar i förberedelsen. Dessutom kan känsligheten hos denna analys leda till variabilitet eftersom tekniska fel vid pipettering kan leda till variabilitet mellan analyserna. För alla experiment som innebär att jämföra olika AAV-vektorer är det därför viktigt att vektorerna titereras på samma qPCR-platta. Trots dessa begränsningar är qPCR den mest exakta metoden som utvecklats för titering AAV och är för närvarande den mest använda och accepterade metoden för kvantifiering av AAV-vektorer32. Användningen av en primer/sond som binder till SV40 polyA av ett rAAV-genom är baserad på det faktum att denna sekvens bevaras över många AAV-genomplasmider konstruerade i laboratoriet. Förutom att välja en bevarad sekvens bland läsarens rAAV-genomplasmider kan qPCR-sonder utformas för alla delar av rAAV-genomet, inklusive, men inte begränsat till, promotorer, transgener eller post-transkriptionella faktorer.
Att bedöma renheten och kvaliteten på AAV-produkten är ett viktigt steg i produktionsprocessen. Western blotting kan användas för att upptäcka strukturella proteiner VP1, VP2 och VP3 som utgör capsid av AAV, liksom alla förändrade former av VP. VP1, VP2 och VP3 är vanligtvis närvarande i ett förhållande av 1:1:10, men detta kan variera från 1:1:5 till 1:1:20 beroende på serotypen. Därför är det viktigt att bestämma förhållandet för varje system empiriskt, särskilt eftersom N-terminalregionen VP1 har visat sig vara viktig för smittsamhet och transduktion33. SDS-PAGE i kombination med Coomassie-färgning är en ganska enkel metod för att upptäcka VP1, VP2 och VP3, samt värdcellproteinföroreningar. Användningen av fluorescerande proteinfläckar som SYPRO Ruby erbjuder högre känslighetsdetektering av värdcellproteinföroreningar än Coomassie; Alla laboratorier har dock inte tillgång till den bildutrustning som krävs för att visualisera gelén. Slutligen kan kommersiella ELISAs användas för att kvantifiera värdcellproteinföroreningar i AAV-vektorer som produceras i HEK293-celler.
Detta protokoll ger en djupgående översikt över att producera hög titer, hög renhet rAAV för serotyper som binder till heparin. I avsnittet representativa resultat visar användningen av nya AAV6.2FF som uttrycker hIgG i en mängd olika djurmodeller säkerheten och effektiviteten hos denna rAAV in vivo. Även om AAV6.2FF vektorn administrerades IM, dessa högkvalitativa, hög renhet virus kan administreras via en mängd olika vägar in vivo, eftersom eventuella inflammatoriska föroreningar, såsom värdcellsprotein, har eliminerats genom våra reningsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sarah K. Wootton är uppfinnare på ett amerikanskt patent US10806802B2 för AAV6.2FF capsid.
Acknowledgments
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas och Jacob G. E. Yates var mottagare av Ontario Veterinary College Student Stipends samt Ontario Graduate Scholarships. Amira D. Rghei var mottagare av ett Mitacs Accelerate Studentship. Detta arbete finansierades av Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (#66009) och ett Collaborative Health Research Projects (NSERC partnered) anslag (#433339) till SKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
- FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
- Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
- Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
- Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
- Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
- Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
- Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
- Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
- Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
- van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
- Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
- Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
- qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
- Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).
