Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

Het bestuderen van integrale membraaneiwitten in hun oorspronkelijke omgeving was een uitdaging vanwege de complexiteit van het plasmamembraan. Gigantische unilamellaire lipide blaasjes, of GUVs, zijn een van de meest prominente platforms om biomembraaneigenschappen te bestuderen en ze kunnen worden ontworpen om verschillende fysiologische omstandigheden na te bootsen. Dit protocol beschrijft een methode om eiwit-geïncorporeerde GUVs te fabriceren op basis van spontane integratie, na hydrogelzwelling. Traditionele methoden om GUVs te fabriceren zijn niet generaliseerbaar voor integrale membraaneiwitincorporatie. Deze methoden zijn vaak laag rendement, methodologisch complex en ad hoc, niet van toepassing op brede klassen van eiwitten. Aan de andere kant vertegenwoordigt dit protocol een flexibele, robuuste en eenvoudige methode om functionele integrale membraaneiwitten op te nemen in GUVs.We hebben dit bereikt door een hydrogelsteiger te bereiden, die het eiwit bevat en er een dunne laag lipide bovenop afzet. In het hier gepresenteerde voorbeeld hebben we G-eiwitgekoppelde receptor, of GPCR, opgenomen in de GUVs.Bij rehydratatie van het hele systeem, GUVs knop van het oppervlak van de hydrogel met het membraan dat goed georiënteerde GPCR’s bevat.Laat alle reagentia op kamertemperatuur komen. Reinig gedurende deze tijd de afdeksels door ze in methanol te plaatsen en gedurende 30 minuten bij 40