Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

To peelingmetoder til isolering af fotoreceptorcellerum i musenehinden til proteinanalyse

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Denne protokol præsenterer to teknikker til at isolere de subcellulære rum af murine stang fotoreceptorer til proteinanalyse. Den første metode bruger levende nethinde- og cellulosefilterpapir til at adskille stangens ydre segmenter, mens den anden anvender lyofiliseret nethinde og klæbebånd til at skrælle stangens indre og ydre segmentlag væk.

Abstract

Rodfotoreceptorer er stærkt polariserede sensoriske neuroner med forskellige rum. Musestænger er lange (~ 80 μm) og tynde (~ 2 μm) og pakkes sideværts i det yderste lag af nethinden, fotoreceptorlaget, hvilket resulterer i justering af analoge subcellulære rum. Traditionelt er tangentiel sektionering af den frosne fladmonterede nethinde blevet brugt til at studere bevægelsen og lokaliseringen af proteiner inden for forskellige stangrum. Den høje krumning af den stangdominerende musenehinden gør imidlertid tangentiel sektionering udfordrende. Motiveret af undersøgelsen af proteintransport mellem rum udviklede vi to skrælningsmetoder, der pålideligt isolerer stangens ydre segment (ROS) og andre subcellulære rum til vestlige pletter. Vores relativt hurtige og enkle teknikker leverer berigede og subcellulære specifikke fraktioner til kvantitativt at måle fordelingen og omfordelingen af vigtige fotoreceptorproteiner i normale stænger. Desuden kan disse isolationsteknikker også let tilpasses til at isolere og kvantitativt undersøge proteinsammensætningen af andre cellulære lag inden for både sund og degenererende nethinde.

Introduction

Rodfotoreceptorceller, tæt pakket i det yderste lag af den neurale nethinde, er en integreret del af svagt lyssyn. For at fungere som trofaste fotontællere bruger stænger en G-proteinbaseret signalvej, nævnt fototransduktion, til at generere hurtige, forstærkede og reproducerbare reaktioner på enkelt fotonoptagelse. Denne reaktion på lys udløser i sidste ende en ændring i strømmen ved plasmamembranen og signaleres efterfølgende til resten af det visuelle system1. Som navnet antyder, har hver stangcelle en særskilt stanglignende form og udviser en stærkt polariseret cellulær morfologi, der består af et ydre segment (OS), indre segment (IS), cellelegeme (CB) og synaptisk terminal (ST). Hvert subcellulært rum har specifikke proteinmaskiner (membranbundne og opløselige), biomolekylære egenskaber og proteinkomplekser, der spiller afgørende roller såsom visuel fototransduktion, generel husholdning og proteinsyntese og synaptisk transmission2,3.

For over 30 år siden blev den lysafhængige gensidige bevægelse af subcellulære proteiner, specifikt transducin (væk fra operativsystemet) og arrestin (mod operativsystemet), først observeret4,5,6,7. Tidligt blev dette observerede fænomen modtaget med skepsis, delvis på grund af immunhistokemiens sårbarhed over for epitopmaskering8. I begyndelsen af 2000'erne blev stimulusafhængig proteintranslokation bekræftet ved hjælp af en streng og besværlig fysisk sektioneringsteknik9. Seriel tangentiel sektionering af den frosne fladmonterede gnaver nethinde efterfulgt af immunoblotting afslørede, at transducin9,10, arrestin11,12 og recoverin13 alle gennemgår subcellulær omfordeling som reaktion på lys. Det antages, at lysdrevet translokation af disse vigtige signalproteiner ikke kun regulerer følsomheden af fototransduktionskaskaden9,14,15, men kan også være neurobeskyttende mod lysskader16,17,18. Fordi lysdrevet proteintransport i stænger synes at være meget vigtig for stangcellebiologi og fysiologi, er teknikker, der tillader isolering af forskellige subcellulære rum til bestemmelse af proteinfordeling, værdifulde forskningsværktøjer.

I øjeblikket er der et par metoder, der tager sigte på at isolere stangens subcellulære rum. Disse metoder kan dog være langvarige og vanskelige at reproducere eller kræve en betydelig mængde retinal isolat. Stangens ydre segment (ROS) præparater via densitetsgradientcentrifugering19 anvendes for eksempel almindeligvis til at adskille ROS fra retinal homogenat. Denne metode anvendes i vid udstrækning til western blot, men proceduren er meget tidskrævende og kræver mindst 8-12 murine retinae20. På den anden side er seriel tangentiel sektionering af frossen murine og rotte nethinde blevet implementeret med succes i isolering af OS, IS, CB og ST9,11,13. Denne metode er imidlertid teknisk udfordrende på grund af nødvendigheden af fuldt ud at flade den lille og stærkt buede murin nethinde for at justere retinale lag inden tangentiel sektionering. Da der er en overflod af musemodeller og transgene mus, der rekapitulerer sygdomme i det visuelle system, er oprettelsen af en teknik, der pålideligt, hurtigt og let adskiller individuelle stangrum, lovende med at afsløre de fysiologiske processer, der forekommer i hvert specialiseret rum og de mekanismer, der ligger til grund for visuelle processer inden for sundhed og sygdom.

For at lette disse undersøgelser beskriver vi to skrælningsmetoder, der lettere isolerer stangens subcellulære rum end de nuværende protokoller. Den første peelingmetode, der er tilpasset fra en teknik til at udsætte fluorescerende mærkede bipolære celler til optagelse af plasterklemmer21, anvender cellulosefilterpapir til sekventielt at fjerne ROS fra en levende, isoleret murin nethinde (figur 1). Den anden metode, tilpasset fra en procedure, der isolerer de tre primære retinale cellelag fra en chick22 og frog23 nethinden, bruger klæbebånd til at fjerne ROS og stangens indre segment (RIS) fra en lyofiliseret nethinden (figur 2). Begge procedurer kan gennemføres på 1 time og er betydeligt brugervenlige. Vi leverer validering af effektiviteten af disse to separationsprotokoller for western blot ved at anvende mørketilpasset og lyseponeret nethinde fra C57BL/6J-mus til at demonstrere lysinduceret translokation af stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1). Desuden giver vi ved hjælp af båndskrælningsmetoden yderligere bevis for, at vores teknik kan bruges til at undersøge og adressere uoverensstemmelser mellem proteinlokaliseringsdata erhvervet af immunocytokemi (ICC) og vestlige blots. Specifikt viste vores teknik, at: 1) proteinkinase C-alfa (PKCα) isoform er til stede ikke kun i bipolære celler, men også i murin ROS og RIS, omend i lave koncentrationer24,25, og 2) rhodopsinkinase (GRK1) er overvejende til stede i den isolerede OS-prøve. Disse data viser effektiviteten af vores to peelingteknikker til adskillelse og kvantificering af specifikke stang- og retinale proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg blev udført i henhold til de lokale institutionelle retningslinjer fra udvalget for forskning dyrepleje fra University of Southern California (USC).

1. Levende celle retinal peeling metode

  1. Tilberedning af Ames 'buffere, skrælpapir og dissektionsskål
    1. Brug stump spids iris saks (eller tilsvarende saks type) skære cellulosefilterpapiret (Grade 413) i rektangler, der måler ca. 5 mm x 2,5 mm. Opbevar stiklinger til fremtidig brug.
    2. Forbered 1 liter af Ames 'HEPES-buffer ved at kombinere en flaske Ames 'Medium, 2,38 g HEPES og 0,877 g NaCl. Reagenserne opløses i en steril glasflaske med destilleret ultrarent vand, og osmolariteten og pH justeres til henholdsvis 280 mOsm og 7,4. Filtrer for at sterilisere (porestørrelse 0,2 μm), forsegl låget med paraffinfilm, og opbevar det ved 4 °C.
    3. Der forberedes 1 liter Ames' bicarbonatbuffer ved at kombinere en flaske Ames' Medium og 1,9 g NaHCO3. Reagenserne opløses i en steril glasflaske med destilleret ultrarent vand, og osmolariteten og pH justeres til henholdsvis 280 mOsm og 7,4. Filtrer for at sterilisere (porestørrelse 0,2 μm), forsegl låget med paraffinfilm, og opbevar det ved 4 °C.
      BEMÆRK: Ames' HEPES- og Ames-bikarbonatbuffere kan fremstilles på forhånd og opbevares i 1 uge ved 4 °C.
    4. I bunden af en 35 x 10 mm petriskål skal du oprette et gitter- eller skakbrætmønster med en skalpel (blad nr. 11, 40 mm).
      BEMÆRK: Den teksturerede bund af petriskålen holder det isolerede, fritsvævende øje på plads under retinal dissektionen.
  2. Dissektion af nethinden
    BEMÆRK: Til denne procedure skal bufferen bringes til og opbevares ved stuetemperatur (RT). Opdater Ames 'bicarbonatbuffer hvert 15. minut med frisk carbogenated Ames 'bicarbonatbuffer under dissektionen. Dette opretholder den nødvendige fysiologiske pH.
    1. Omkring 15-20 minutter før dissektionen iltes Ames ' HEPES-buffer i en 100 ml laboratorie- eller medieflaske udstyret med en rørhætteadapter og bobler Ames 'bicarbonatbuffer med 95% O2 og 5% CO2 i et vævsinkubationskammer og i et 100 ml laboratorium eller medieflaske udstyret med en rørhætteadapter.
    2. Aflive et lige antal af begge køn af C57BL/6J-mus (2-3 måneder gamle) enten ved isofluranindånding eller kuldioxid (CO2) efterfulgt af cervikal dislokation. Enukleater øjnene med buet saks og placer øjnene i den teksturerede 35 x 10 mm petriskål fyldt med boblende Ames bikarbonatbuffer.
    3. Opret en øjenkop (figur 1A) ved at punktere et hul ved hornhinde-limbus-krydset med en 18 G-nål. Skær langs omkredsen af dette kryds ved hjælp af mikrodissektion iris saks for at fjerne hornhinden i hvert øje. Adskil linsen og glasagtig humor fra hvert øje ved hjælp af pincet og kassér den.
    4. Isoler nethinden fra øjenkoppen ved omhyggeligt at skrælle det retinale pigmenterede epitel (RPE)-sclera-choroid kompleks væk fra den neurale nethinde. Kassér RPE-sclera-choroid-komplekset. Sørg for, at nethinden ikke beskadiges under dissektionen ved kun at håndtere kanterne.
    5. Overfør isoleret nethinde ved hjælp af en bred boreoverførselspipette til låget på et 60 x 15 mm fad fyldt med boblet Ames bicarbonatbuffer.
    6. Orienter den halvkugleformede nethinde konkav op (fotoreceptorerne vender ned mod bunden af fadet) og gennemsekt hver nethinde (gennem synsnerven) ved hjælp af irissaks eller en skalpel (blad nr. 10, 40 mm). Trim de buede kanter af hver halv nethinde for at lave to rektangler (figur 1A).
      BEMÆRK: Minimering af krumningen af hver halveret nethinde gør det muligt for nethinden at flade bedre ud i efterfølgende skrælningstrin og producerer en nøjagtig skræl af stangens ydre segment (ROS) lag.
    7. Opbevar den halverede nethinde i vævsinkubationskammeret, der kontinuerligt bobles med 95% O2 og 5% CO2.
      BEMÆRK: Isoleret nethinde kan opbevares i den carbogated Ames 'bicarbonatbuffer i ~ 24 timer.
  3. Ros-opsamling (Rod outer segment) ved afskalning af filterpapir
    BEMÆRK: Opdater den RT-iltede Ames ' HEPES-buffer hvert 15.-20. minut under skrælningsprocessen for at opretholde den nødvendige fysiologiske pH-værdi.
    1. Overfør et retinalt rektangel fra vævskammeret med en bred boreoverførselspipette og et 5 mm x 2,5 mm stykke filterpapir til en 35 x 10 mm petriskål fyldt med Ames' HEPES-buffer boblet med 100 % O2.
    2. Orienter den opdelte nethinde konkav op og sørg for, at fotoreceptorerne vender ned mod bunden af fadet. Tag let fat i siderne af den halverede nethinde med en pincet og flyt den oven på filterpapiret. Når nethinden er centreret om filterpapiret, skal du flytte filterpapiret opad, så den halverede nethinde berører filterpapiret for at skabe ROS-til-filter-papiradhæsionen (figur 1B).
      BEMÆRK: Sørg for, at fotoreceptorlaget kommer i direkte kontakt med filterpapiret.
    3. Løft forsigtigt filterpapiret med den fastgjorte nethinde ud af Ames' HEPES-buffer. Læg undersiden af filterpapiret (siden uden nethinden) på et køkkenrulle, og dup den 2-3 gange for at tørre (figur 1B).
    4. Tilsæt en dråbe Ames 'HEPES på siden af filterpapiret med nethinden. Læg filterpapiret på køkkenrullen igen for at tørre, som netop beskrevet. Gentag denne proces to gange mere.
    5. Læg filterpapiret med nethinden tilbage i petriskålen. Brug en pincet til forsigtigt at skubbe alle kanter af den halverede nethinde op og væk fra filterpapiret på alle sider.
    6. Skræl nethinden forsigtigt væk fra filterpapiret. Rør kun ved nethindens ekstreme omkreds under skrælningsprocessen for at bevare nethindens strukturelle integritet.
    7. Løft filterpapiret fra petriskålen, og fjern overskydende væske på et køkkenrulle. Sørg for, at den side, der var i kontakt med nethinden, ikke kommer i kontakt med papirhåndklædet.
    8. Læg filterpapiret med det delvise ROS-lag i et mærket rør på is (figur 1B). Hold den skrællede nethinde nedsænket i Ames 'HEPES-buffer.
    9. Gentag skrælningsprocessen for denne halverede nethinde ca. 7-8 gange for at fjerne hele ROS-laget. Efter hver skræl skal du placere filterpapiret i det samme rør, som vil indeholde den isolerede ROS fra en halveret nethinden.
      BEMÆRK: Pas på ikke at rive den halverede nethinde, når du skræller den væk fra filterpapiret, da nethinden bliver tyndere under denne proces.
    10. Røret, der indeholder alle filterpapirskræller af den isolerede ROS, anbringes på is med øjeblikkelig anvendelse eller fryses direkte på tøris og opbevares ved -80 °C.
    11. Brug pincet til at overføre den resterende skrællede nethinde (mangler ROS) til et passende mærket rør. Læg røret på is til øjeblikkelig brug eller frys med tøris og opbevar det ved -80 °C.
    12. Gentag skrælningsprocessen for hver halveret nethinde og mærk hvert rør nøjagtigt.

2. Lyofiliseret nethinden skrælning metode

  1. Buffere, peeling medium, dissektion skål forberedelse, og lyophilizer opsætning
    1. I en 1 L opbevaringsflaske fremstilles Ringers opløsning ved at tilsætte 500 ml destilleret ultrarent vand. Reagenserne opløses for at nå en endelig koncentration på 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES og 0,02 mM EDTA. Juster pH til 7,4 med NaOH, tilsæt ultrarent vand for at bringe det endelige volumen til 1 L, og juster osmolariteten til 313 mOsm.
    2. Før brug filtreres Ringers opløsning med et sterilt filter (porestørrelse 0,2 μm), forsegles låget med paraffinfilm og opbevares ved 4 °C.
    3. Brug stump spids iris saks (eller tilsvarende saks type) skære cellulosefilterpapiret i rektangler, der måler ca. 5 mm x 2,5 mm. Brug en blyant til at skrive på den ene side af filterpapiret for at oprette en unik etiket.
    4. Opret et gitter- eller skakbrætmønster i bunden af en 35 x 10 mm petriskål ved hjælp af en skalpel (blad nr. 11, 40 mm).
    5. Tænd for lyophilizeren i henhold til producentens specifikationer.
    6. Flydende nitrogen opnås i en Dewar-kolbe eller lignende isolerende vakuumkolbe.
  2. Retinal dissektion
    1. Fuldfør nethindedissektionen som beskrevet i protokollens afsnit 1 (figur 1A). Brug kold Ringers opløsning i stedet for Ames 'buffer.
    2. Opbevar den halverede, rektangulære nethinde efter dissektion i en 35 x 10 mm petriskål fyldt med kold Ringers opløsning og læg den på is.
  3. Retinal prøve forberedelse til lyofilisering
    1. Læg et 5 x 2,5 mm stykke filterpapir og overfør en halveret nethinde til den teksturerede 35 x 10 mm petriskål fyldt med kold Ringers buffer. Brug en bred boreoverførselspipette til at flytte hver nethinde mellem tallerkener.
    2. Brug pincetten til forsigtigt at vende nethinden, så den er orienteret konkavt op (fotoreceptorerne peger opad) og flyt den, så den hviler oven på filterpapiret (figur 2A).
      BEMÆRK: Sørg for, at fotoreceptorerne ikke kommer i kontakt med filterpapiret (retinal ganglioncellelaget skal være i direkte kontakt med filterpapiret), og at den unikke etiket er synlig. For nemt og hurtigt at identificere nethindeisolatet anbefales det, at den unikke etiket placeres på undersiden af filterpapiret.
    3. Løft filterpapiret ved kanterne opad, så det halverede stykke nethinde rører ved filterpapiret, og fortsæt med at løfte filterpapiret ud af Ringerens opløsning.
    4. Læg undersiden af filterpapiret (siden uden nethinden på) på et papirhåndklæde og dup forsigtigt 2-3 gange for at fjerne overskydende væske (figur 2A).
    5. Tag filterpapiret op med en pincet, og tilsæt en dråbe kolde Ringer's på siden af filterpapiret med nethinden. Læg filterpapiret på køkkenrullen igen for at fjerne overskydende væske. Gentag processen to gange mere.
      BEMÆRK: Disse skiftevis befugtnings- og tørringstrin sikrer, at vævet er fastgjort til filterpapiret.
    6. Opbevar hver vedhæftet nethinde/filterpapirprøve i en petriskål fyldt med kolde Ringer's, indtil den er klar til at fryse alle prøver. Gentag denne proces for alle halverede nethinden.
    7. Få en ren og tør 35 x 10 mm petriskål (kun nederst) og et stykke aluminiumsfolie skåret i en 3,5 x 3,5 tommer firkant.
    8. Løft hver prøve ud af den kolde Ringers buffer med en pincet. Sørg for, at pincetten kun kommer i kontakt med filterpapirkanterne, så du undgår den halverede nethinde.
    9. Læg undersiden af hvert filterpapir (siden uden nethinden på) på et papirhåndklæde, og fjern overskydende væske.
    10. Tilsæt en dråbe kold 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) på siden af filterpapiret, hvor nethinden klæbes. Dup filterpapiret på køkkenrullen for at fjerne overskydende væske.
      BEMÆRK: Sørg for, at fugten fra filterpapiret er fjernet tilstrækkeligt inden frysning.
    11. Læg alle filterpapirstykker i 35 x 10 mm petriskålen. Brug et fnugfrit silkepapir til at transportere overskydende væske, der omgiver filterpapiret, væk.
      BEMÆRK: Overfyld ikke petriskålen med prøver. Hvis der anvendes mere end fire murine øjne, kan du overveje at bruge en større petriskål eller flere mindre petriskåle til at holde nethinden / filterpapirprøverne.
    12. Pak hele fadet tæt ind med aluminiumsfolie. Sørg for, at aluminiumsfoliens kanter er fastgjort og presset glat ind i bunden af petriskålen. Punktere en håndfuld 0,1-0,2 mm huller i aluminiumsfoliens låg (figur 2A).
    13. Brug metaltang til gradvist at sænke den aluminiumsfoliedækkede petriskål ned i det flydende nitrogen. Opbevar prøverne i det flydende nitrogen (<10 min.), indtil de er klar til lyofilisering.
  4. Lyofilisering
    1. Anbring den aluminiumsfoliedækkede petriskål i en frysetørrende kolbe, og fastgør den til lyophilizer-maskinen efter producentens protokol. Lyofiliser nethinden i 30 minutter.
    2. Fjern kolben fra lyofilisatoren, og sluk for maskinen i henhold til producenten.
    3. Fjern aluminiumsfolien og arbejd enten med de frysetørrede prøver samme dag eller opbevar dem i korrekt mærkede 1 ml mikrocentrifugerør. Anbring disse rør i en beholder (f.eks. et 50 ml konisk rør) fyldt med et vandfrit tørremiddel, og prøverne opbevares ved -80 °C.
  5. Stang ydre og indre segmentopsamling ved afskalning af klæbebånd.
    1. Klip strimler af klar tape (1-2 cm) og opbevar strimler på kanten af bånddispenseren/laboratoriebænken/osv. for hurtig brug.
    2. Flyt en retinal prøve til låget på en plastik 60 x 15 mm petriskål til skrælning. Sørg for kun at få fat i de yderste kanter af filterpapiret og undgå at røre nethinden.
    3. Brug stump spids iris saks (eller tilsvarende saks type) til at skære et lille rektangulært stykke tape til den omtrentlige størrelse af vævet (1,5 x 2,5 mm).
    4. Læg forsigtigt et lille stykke tape oven på den lyofiliserede nethinde (figur 2B) og påfør let tryk med pincetten for at sikre, at den binder sig til fotoreceptorlaget (det orange/pink-tonede øverste lag).
    5. Skræl langsomt båndet væk. Både stangens ydre segment (ROS) og stangens indre segment (RIS) klæbes til båndet (figur 2B).
    6. Sørg for, at der er en tynd hvid film på den brækkede overflade. Dette er RIS.To adskille RIS, placere et andet stykke tape og skubbe båndet ned på den brudte overflade (figur 2B).
      BEMÆRK: Det kan tage mere end et stykke tape at fjerne hele det tynde hvide lag.
    7. Anbring tapestykket med kun det orange/lyserøde lag i et mikrocentrifugerør mærket +ROS.
    8. Anbring båndet eller båndstykkerne med det tynde hvide lag i et mikrocentrifugerør mærket +RIS.
      BEMÆRK: Adskillelse af den lyofiliserede nethinde med tape kræver øvelse. Mængden af tryk, der påføres båndet, vil påvirke, hvordan den lyofiliserede prøve vil fraktionere. Hvis der lægges for meget pres på båndet over prøven, vil hele den lyofiliserede nethinde skrælle filterpapiret af og klæbe til båndet. Hvis der tilføjes for lidt tryk til båndet, klæber det orange/lyserøde toplag (+ROS) ikke til båndet.
    9. Saml det resterende nethindevæv (berøvet ROS- og RIS-lag, -OIS), der er placeret på filterpapiret, ved at skrælle det tykke, hvide lag af filterpapiret ved hjælp af tape. Anbring isolatet i et rør mærket -OIS.
    10. Gentag disse trin for hver halveret retinal prøve.
    11. Opbevar de isolerede lag fra den lyofiliserede nethinde enten ved stuetemperatur, hvis der udføres proteinkvantificering, gelelektroforese og proteinimmunklatter samme dag, eller opbevar i en beholder (såsom 50 ml konisk rør) fyldt med vandfrit tørremiddel ved -80 ° C til senere brug.

3. Western blot prøveforberedelse til skrælning af isolationer

  1. Forbered RIPA lysis buffer
    1. I en 100 ml opbevaringsflaske tilsættes reagenser for at opnå en endelig koncentration på 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS og 1 mM EDTA. Tilsæt 100 ml deioniseret ultrarent vand og bland grundigt.
      BEMÆRK: RIPA lysis buffer kan opbevares ved 2-8 °C i 2-3 uger. Ved længere opbevaring, aliquot og opbevar i -20 °C fryseren.
    2. På dagen for eksperimentet tilsættes en proteasehæmmercocktail (0,1 M PMSF, 1:1000 Aprotinin og 1:1000 Leupeptin) til RIPA lysisbufferen og holder på is.
  2. Filterpapir, der skræller lysatforberedelse til western blot
    1. Sørg for, at rør, der indeholder filterpapirskræller og rester af skrællet nethinde, opbevares på is (til forsøget samme dag) eller fjernes fra -80 °C fryseopbevaring og lægges på is.
    2. Fjern overskydende væske fra bunden af mikrocentrifugerørene, der indeholder filterpapirskrællerne. Spin hurtigt i en minicentrifuge i 2-4 s og kassér eventuel resterende væske.
    3. Pipette 45-55 μL kold RIPA-buffer i rør, der indeholder filterpapirisolatet.
    4. Homogeniser hver prøve med en ren, autoklaveret pestleblander i 1 min. Sørg for, at filterpapiret forbliver i kontakt med pestleblanderen. Opbevar filterpapiret på siden af hvert rør i stedet for i bunden.
    5. Med en pincet skal du flytte filterpapirerne til siden af hvert rør og dreje i minicentrifugen i 2-4 s. Dette fjerner RIPA-bufferen fra filterpapiret.
    6. Fjern tørret filterpapir, og gentag om nødvendigt for alle filterpapirer i hvert rør.
    7. Overfør homogenatet til et nyt rør og mærk det korrekt.
      BEMÆRK: Dette er det mest tidskrævende trin, og hvis det ikke gennemføres korrekt, vil meget af prøven ende med at blive absorberet af filterpapiret.
    8. Pipette 60-80 μL kold RIPA buffer ind i de enkelte rør med den resterende skrællede nethinde.
    9. Homogeniser hver prøve med en ren, autoklaveret pestleblander i 1 min.
  3. Tape peeling Lysate forberedelse til western blot
    1. Anbring de RT-lyofiliserede prøver eller -80 °C-prøverne på is.
    2. Pipette 50-70 μL kold RIPA-buffer ind i hvert rør indeholdende +ROS og +RIS tape peelings.
    3. Pipette 60-80 μL koldlysebuffer ind i -OIS-rørene, der indeholder den resterende lyofiliserede nethinde, med ROS og RIS fjernet.
    4. Homogeniser hver prøve med en ren pestleblander i 1 min. Sørg for, at båndet i de enkelte rør forbliver i kontakt med pestleblanderen og lysisbufferen.
    5. Med steriliseret pincet skal du flytte båndet til siden af rørene og dreje med en minicentrifuge i 2-4 s. Dette fjerner væsken fra båndet. Fjern det tørrede tape fra rørene.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan du kombinere to halve retinale isolater fra den samme nethinde til enten 'filterpapirskrælning' eller 'tape peeling' -metoden for at sikre, at du har nok volumen til at udføre et bicinkoninsyreassay (BCA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De nuværende strategier blev udviklet til at give relativt hurtige og enkle metoder til at isolere og analysere proteiner blandt specifikke stang subcellulære rum til western blot analyse. Vi anvendte to sekventielle peelingteknikker (figur 1 og figur 2) efterfulgt af immunoblotting for at påvise, at disse metoder pålideligt kunne anvendes til at påvise den kendte fordeling af stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1) hos både mørke- og lystilpassede dyr. For at validere effektiviteten af vores to protokoller i præcist isolerende stang subcellulære rum uden forurening fra andre cellulære lag blev immunoblots undersøgt med antistoffer for cytokrom C (Cyt C), actin og Gß5S / Gß5L26. En liste over anvendte antistoffer og fortyndinger fremgår af tabel 1. Cyt C og actin indikerede ROS renhed, da de er rigelige proteiner i den proksimale nethinde, men er fraværende i ROS. Gß5L, en komponent i GTPase-aktiverende protein (GAP) til GNAT127, er til stede i ROS og RIS og fungerede som en kontrol for disse isolationer. Gß5S, den kortere splejsningsisoform, der ikke er til stede i ROS eller RIS, men er i alle andre stangrum, fungerede som en kontrol for ikke-ROS/RIS isolerede subcellulære rum.

For det første blev effektiviteten af vores sekventielle retinale afskalningsmetode for levende celler vurderet ved at analysere fordelingen af GNAT1 og ARR1 i stænger af mørke- og lysetilpassede mus (figur 3). Filterpapirerne indeholdende ROS (+ROS) blev samlet fra i alt en hel nethinde, og det tilsvarende restvæv (-ROS) blev også kombineret. Signalerne fra de angivne proteiner blev efterfølgende sammenlignet mellem +ROS-prøverne og -ROS-prøverne, og en hel isoleret nethinde fungerede som inputkontrol. Proteinkoncentration og homogeniseringsvolumen for disse prøver er præsenteret i tabel 2. Resultaterne i figur 3A viser, at fordelingen af GNAT1 og ARR128 hos mørktytrede dyr nøje matchede deres kendte mørktilstandsfordelinger, hvor GNAT1-signalet var synligt det stærkeste i +ROS-isolationen, mens ARR1-signalet var mere robust i -ROS-isolationen. Følgelig blev GNAT1-signalet i den lyseksponerede nethinde mærkbart reduceret i +ROS-isolationen og havde et øget signal i -ROS-prøven, mens lysinduceret ARR1-translokation kunne visualiseres i +ROS- og -ROS-prøver. Resultater fra seks forskellige forsøg blev kvantificeret, og der blev fundet statistisk signifikante forskelle mellem mørke/lysforhold for GNAT1 og ARR1 i +ROS- og -ROS-prøverne (figur 3B). Disse resultater er i overensstemmelse med den tidligere kendte protein lys / mørke bevægelse inden for stangens subcellulære rum og indikerer stærkt, at denne teknik kan isolere berigede +ROS-fraktioner.

For yderligere at validere vores levende celleskrælningsmetode undersøgte vi kendte ROS-renhedsmarkørfordelinger i både +ROS- og -ROS-prøver. I både mørke- og lystilpassede prøver er Gß5S-, Cyt C- og actinsignalerne udelukket fra +ROS-prøverne (figur 3A), hvilket viser fravær af kontaminering fra andre cellulære lag. Derudover var Gß5L-signalet tydeligt synligt i +ROS-prøverne (figur 3A). Desuden bekræftede actin- og Gß5L-signaler ikke kun renheden af +ROS- og -ROS-fraktionerne, men fungerede også som kontroller for normalisering, hvor signalerne fra +ROS-prøverne blev normaliseret mod Gß5L- og -ROS-prøver, der blev normaliseret mod actin. Som vist i figur 3A anbefales det, at de levende celleskrælningsisolater indlæses sammen med en belastningskontrol, specifikt et helt retinalt homogenat, for optimal immunoblotting normalisering og analyse. Tilsammen validerer disse data, at vores levende celleskrælningsmetode kan give en hurtig og reproducerbar tilgang til at isolere ros-subcellulært lag fra resten af stangen og nethinden til proteinanalyse.

Vi evaluerede derefter vores lyofiliserede peelingteknik for at kontrollere, at denne metode reproducerbart kunne isolere ROS- og RIS-rummene. Før immunoblotting afbildede vi overfladerne af intakte og skrællede lyofiliserede musenetinae ved hjælp af et scanningselektronmikroskop (SEM) for at analysere, hvilket fotoreceptor subcellulært lag båndskrælningen gav (figur 4). Før skrælning med tape matchede overfladen af den intakte lyofiliserede nethinde (orange/pink-tonet lag) nøje profilen af den karakteristiske cylindriske ROS (figur 4A). Efter den indledende båndskræl syntes ROS og RIS at være helt fjernet, som det fremgår af det ensartede nukleare lag, der er til stede på overfladen af den resterende skrællede lyofiliserede nethinde (figur 4C). Efterfølgende tape peeling fjernede RIS (tyndt hvidt lag, figur 4B) fra den frie overflade af det skrællede lag, en proces, der sandsynligvis blev hjulpet af det smalle og skrøbelige forbindelsescilium, der forbinder de indre og ydre segmenter. Disse resultater bekræftede, at stangens subcellulære lag fra lyofiliseret retinalvæv kan fraktioneres specifikt ved hjælp af tape.

Efter at have valideret effektiviteten af denne metode visuelt blev mørk- og lystilpasset skrællet nethinde udsat for immunoblotting ved hjælp af den samme tilgang ved hjælp af proteinmarkører til forskellige rum som skitseret for vores levende celleskrælningsmetode (figur 3). Proteinkoncentration og homogeniseringsvolumen for ROS-isolering (+ROS), RIS-isolering (+RIS) og de resterende retinale lag (-OIS) er præsenteret i tabel 2. Som forventet var der et klart lysinduceret skift for GNAT1 fra ROS til RIS samt ARR1 fra RIS til ROS (figur 5A). GNAT1 var mest udbredt i +ROS-prøven i mørke og +RIS-prøven i lyset, mens ARR1-signalet blev vendt (figur 5A). Vi normaliserede og kvantificerede derefter de translokerende proteinsignaler fra +ROS-, +RIS- og -OIS-isolationer (figur 5B) ved hjælp af de samme kontroller og fremgangsmåde som den levende skrælningsmetode. Vi kombinerede også +RIS- og -OIS-prøver (figur 5C) for en mere direkte sammenligning med vores metode til afskalning af levende cellefilterpapir (figur 3B). Begge grafer viser den veletablerede og karakteristiske lysinducerede translokation af både GNAT1 og ARR1. Baseret på disse observationer synes båndskrælningspræparatet at give berigede ROS- og RIS-fraktioner, som det fremgår af proteinsammensætningen af ARR1 og GNAT1 i disse isolationer.

Dernæst blev renheden af individuelle subcellulære isolationer evalueret. I lighed med resultaterne vist i figur 3A manglede +ROS-prøverne signaler for actin, cytokrom C og Gß5S, mens de viste et stærkt Gß5L-signal (figur 5). Dette fund viser en mangel på forurening fra andre subcellulære rum i vores +ROS-prøveforberedelse. Proteinindholdet i stangens efterfølgende subcellulære lag, +RIS-isolationen, blev derefter vurderet. Vi fandt ud af, at +RIS-prøven var positiv for Cyt C, Gß5L og actin. Dette fund er i overensstemmelse med den kendte sammensætning af RIS, som er rig på mitokondrier og cytoskeletale elementer. Det sidste lag, -OIS-isolatet, havde proteinfordelinger, der var i overensstemmelse med -ROS-prøverne vist i figur 3A.

For yderligere at vurdere nytten af vores klæbebåndsskrælningsmetode til undersøgelse af stangens subcellulære rums proteinsammensætninger undersøgte vi specifikt immunreaktiviteten af rhodopsinkinase (GRK1) og proteinkinase C-alpha (PKCα) i vores +ROS-, +RIS- og -OIS-prøver. Forskellige eksperimentelle metoder, såsom immunocytokemi (ICC) og western blot, giver ofte modstridende resultater om den præcise lokalisering af disse proteiner i stænger og nethinden. GRK1 menes for eksempel at være relativt rigelig i stang- og kegle-OS til at formidle fosforylering af lysaktiverede opsiner29. Immunolabeling af retinale skiver har imidlertid afsløret lokaliseringen af GRK1 enten specifikt i OS30,31 eller i hele fotoreceptorlaget32. PKCα er derimod et protein, der almindeligvis anvendes til ICC til at mærke bipolære celler. På trods af ingen klare beviser for stangspecifik PKCα-immunmærkning i retinale skiver25 er der betydelige biokemiske24,25 og funktionelle33,34,35 beviser, der understøtter PKCα's tilstedeværelse og fosforylerende rolle i ROS. Ved hjælp af vores teknik fandt vi, at GRK1-immunreaktivitet var mest intens i +ROS-prøverne i lyseksponeret nethinde og var fraværende i -OIS-prøver (figur 6A). Omvendt viser vi, at +ROS- og +RIS-prøverne viste et svagt signal for PKCα. Som det kan ses i figur 6B, påvises PKCα almindeligvis ikke i ROS eller RIS ved immunofluorescensfarvning af retinale sektioner. PKCα blev imidlertid immundekteret af western blot (figur 6A,D). Fordi +ROS- og +RIS-isoleringerne viser et stærkt Gß5L-signal og et fravær af Gß5S (figur 6A), er vi overbeviste om, at det svage PKCα-signal i både ROS- og RIS-prøver er ægte og ikke på grund af forurening fra andre lag. For at visualisere de enkelte signaler i +ROS-, +RIS- og -OIS-isolationer blev GRK1- og PKCα-blots kombineret og plottet til sammenligning (figur 6C).

Endelig viser et eksempel på en suboptimal peelingsession (figur 6D), hvordan kontaminering fra forskellige underlag kan skævvride resultaterne, hvilket yderligere illustrerer betydningen af datafortolkning og inkludering af de relevante kontrolantistoffer til at screene for eksperimentelle peelingfejl. I dette eksempel på båndafskalning er et svagt Gß5S-signal tydeligt i RIS-isolationsbanen, hvilket indikerer let forurening fra -OIS-prøven. Afhængigt af brugerens mål er denne lille forurening muligvis ikke et problem. I dette tilfælde undersøgte vi imidlertid PKCα-signalet i +ROS- og +RIS-prøver, og PKCα-signalet er lidt højere i RIS-banen sammenlignet med ROS-banen (figur 6A,D), måske på grund af forurening. Således skal man være forsigtig under skrælningsprocessen for at sikre en nøjagtig isolering og for at minimere forurening. På trods af minimal forurening på grund af individuel fejl giver disse data overbevisende bevis for, at båndskrælningsmetoden kan give nøjagtige sekventielle isolationer af stangfotoreceptorlag til proteinanalyse.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over de levende celleskrælningstrin. (A) Diagram viser de vigtigste trin til dissekering og hemisektering af det isolerede øje. (B) Fotoreceptor ydre segmenter fjernes trinvist ved sekventiel skrælning ved hjælp af filterpapir. For det første er nethinden orienteret, så fotoreceptorlaget er i kontakt med filterpapiret. Derefter tørres filterpapiret ved blotting på et papirhåndklæde, og nethinden skrælles væk fra filterpapiret. Dette skrællede isolat opsamles i et rør, der holdes på is. Denne proces gentages syv til otte gange for helt at fjerne stangens ydre segment (+ROS). Denne figur blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Lyofiliseret nethindeskrælningsproces. (A) Flowdiagram over prøveforberedelsen til den lyofiliserede nethinde. Nethinden er orienteret, så retinal ganglioncellelaget er i kontakt med filterpapiret, og fotoreceptorerne vender op. (B) Efter lyofilisering klæbes den frysetørrede nethinde til et stykke tape efter tilsætning af let tryk til toppen af båndet. Båndet skrælles væk og fjerner stangens ydre segment (ROS) og stangens indre segment (RIS) lag. RIS-laget fjernes med flere båndskræller, indtil ROS-laget er synligt (orange/lyserødt lag). Denne figur blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ekspression af GNAT1 og ARR1 i isolerede stangfotoreceptorer efter sekventiel filterpapirskrælning. (A) Immunoblots af +ROS- og -ROS-prøver (ROS-udtømte) indsamlet ved hjælp af filterpapirskrælningsmetoden erhvervet fra mørk- og lystilpasset nethinde. Blots blev undersøgt med antistoffer for lysudløste proteiner (transducin (GNAT1) og arrestin (ARR1)) og kvalitetskontrolmarkører (GTPase-aktiverende protein (Gß5L / S) cytokrom C (Cyt C) og actin). To halverede nethinden blev kombineret for disse repræsentative blots. B) Kvantificerede signaler fra GNAT1 og ARR1 fra mørk- og lysekørehæmmede nethinden. Der er gensidig lysudløst bevægelse af GNAT1 og ARR fra +ROS- og -ROS-isolater. Violinplots skildrer det normaliserede udtryk for +ROS- og -ROS-prøver. Dette tal er blevet modificeret fra Rose et al.36. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Scanning af elektronmikroskopbilleder af lyofiliseret nethinden. (A) Overflade af lyofiliseret nethinde før tape peeling (fotoreceptor side op). (B) Det indre segmentlag efter tape skrælning. (C) Afskalningen af cellekropslaget efter tape viser et ensartet nukleart udseende. Denne figur er blevet modificeret fra Rose et al.36 og blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Validering af båndskrælningsmetoden til isolering af ROS og RIS fra lyofiliseret nethinden. (A) Western blots af +ROS, +RIS og -OIS (ROS/RIS-udtømt) prøver indsamlet ved hjælp af båndskrælningsmetoden. Immunoblots blev undersøgt med transducin (GNAT1), arrestin (ARR1), GTPase-aktiverende protein (Gß5L/S), cytokrom C (Cyt C) og actinantistoffer. Prøver blev opnået fra mørk- og lystilpasset nethinde, og halverede retinale isolater (+ROS, +RIS, -OIS) blev kombineret til mere koncentreret materiale. (B) Kvantificerede signaler fra GNAT1 og ARR1 er afbildet som violinplot for de forskellige isolerede retinale lag, som blev opnået fra mørk- og lystilpasset nethinde. (C) Normaliserede ekspressionsniveauer fra +RIS og -OIS blev kombineret og plottet for at sammenligne tape- og filterpapirskrælningsmetoder. Mørke- og lytilpassede prøver viste kendt bevægelse af vigtige fototransduktionsproteiner. Dette tal er blevet modificeret fra Rose et al.36. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Tape peeling af lyofiliseret nethinden for at undersøge den subcellulære lokalisering af GRK1 og PKCα i fotoreceptorer. (A) En repræsentativ vestlig plet af skrællede prøver fra lytilpassede C57BL/ 6J mus, der demonstrerer de relative niveauer af rhodopsinkinase (GRK1), proteinkinase C-alpha (PKCα), GTPase-aktiverende protein (Gß5L / S) og actin. (B) Frossen retinal sektion fremstillet af lyseponerede mus inkuberet med PKCα-antistof (grøn, 1:100). RPE, retinal pigmenteret epitel; OS, ydre segment; IS, indre segment; CB, celle krop; ST, synaptisk terminal. Skalabjælke = 10 μm. (C) PKCα og GRK1 normaliserede udtryksniveauer for +ROS, +RIS, -OIS prøver er afbildet som violinplot. (D) Suboptimal tape peeling kan potentielt give let forurenede prøver. Den røde firkant fremhæver +RIS-prøven, der er forurenet med nogle -OIS-prøver, hvilket producerer både Gß5L / S-bånd og et højere PKCα-signal. To halverede nethinden blev kombineret for alle blots. Klik her for at se en større version af denne figur.

Mål Antistof Fortynding Fabrikant
Arrestin Kanin anti-ARR1 1:1000 Chen, et. al., 2006.
Transducin Mus anti-GNAT (TF-15) 1:1000 CytoSignal.
ß Actin Kanin anti-ß Actin 1:5000 GeneTex Inc.
Cytokrom C Kanin anti-cytokrom C 1:500 Santa Cruz, sc-7159.
GAP (Gß5L/S) Kanin anti-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson, et. al., 1996.
Proteinkinase C alfa (PKC) Kanin anti-PKC (#2050) 1:1000 Celle signalering teknologi.
Rhodopsin Kinase (GRK1) Mus anti-GRK1 (G-8) 1:200 Santa Cruz, sc-8004.

Tabel 1: Liste over antistoffer, der anvendes til western blot-validering af separationsteknikker.

Filtrer papir retinal isolering
+ROS* -ROS* Hele nethinden
Gennemsnitlig proteinkoncentration (μg/ml) 700 1,500 1,500
RIPA-buffervolumen (μL) 90 150 200
Tape skrælning retinal isolering
+ROS* +RIS* -ROS* Hele nethinden
Gennemsnitlig proteinkoncentration (μg/ml) 520 440 1,200 1,600
RIPA-buffervolumen (μL) 100 100 125 150
* Kombineret to halverede retinale isolationer.

Tabel 2: Proteinkoncentration i retinale isolationshomogenater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange retinale sygdomme påvirker stangfotoreceptorceller, hvilket fører til stangdød og i sidste ende fuldstændigt synstab37. En betydelig del af den genetiske og mekanistiske oprindelse af menneskelig retinal degeneration er med succes blevet rekapituleret i adskillige musemodeller gennem årene. I den sammenhæng vil evnen til let og selektivt at adskille individuelle stang subcellulære rum fra den lille muse nethinde i høj grad forbedre vores forståelse af de lokaliserede biokemiske og molekylære underlag for retinale sygdomme. Desuden tillader den lagdelte natur af den neurale nethinde kombineret med det unikke, stærkt polariserede arrangement af stangfotoreceptorer isolering af stangrum ved selektiv skrælning. Dette manuskript beskriver to protokoller, der bruges til at isolere individuelle subcellulære rum af stangfotoreceptorceller til immunoblotting. Ikke alene er begge metoder betydeligt hurtigere og mindre teknisk udfordrende sammenlignet med den eksisterende metode til tangentiel sektionering9, men de kræver også en væsentligt mindre prøvestørrelse end den almindelige biokemiske isolering af ROS ved hjælp af densitetsgradienter19. Sådanne ROS-gradientrensningsteknikker kræver 8-10 murin nethinde for pålideligt at genvinde rigelig ROS, mens de protokoller, der præsenteres her, er egnede til enkelt nethinden.

På trods af den overordnede enkelhed i de foreslåede teknikker er en af de største udfordringer, der er fælles for begge protokoller, udfladningen af den buede nethinde på det filterpapir, der kræves for korrekt isolering af de forskellige subcellulære rum. Den isolerede nethinde har tendens til at krølle sig sammen og få en muslingelignende form. Hvis nethinden har foldede kanter, når den placeres på filterpapiret (fotoreceptorsiden enten op eller ned), kan dette reducere udbyttet af de ønskede isolerede stanglag. Endnu vigtigere, hvis nethinden ikke er korrekt fladt, er lagforskydning og forurening fra andre subcellulære rum og retinale celler et sandsynligt resultat (figur 6D). For at begrænse krumningen af det halverede retinale rektangel og for at rette op på den ufuldkomne justering af stangen og retinale lag, kan retinal rektanglet skæres i halve for at producere to retinale firkanter. Ved at skære den neurale nethinde i mindre stykker reduceres nethindens naturlige krumning, og vævet er mere tilbøjeligt til at ligge fladt på filterpapiret.

At genkende, når de forskellige stangrum er blevet fysisk adskilt, kan være vanskeligt for en person, der er uerfaren med disse teknikker. Vi anbefaler, at brugeren, inden han påbegynder et biologisk signifikant eksperiment, skal løbe gennem processen med prøve nethinden i en time eller to. Øvelse bør resultere i en væsentlig forbedring af operatørens færdigheder og færdigheder i metoderne. Når du bruger filterpapir til at skrælle ROS væk fra en levende nethinde, angiver ingen tydelige visuelle signaler, hvornår ROS-laget er blevet isoleret. Mens nethinden bliver tyndere og mere skrøbelig, skal brugeren selv overvåge og validere antallet af skræl for at isolere ROS nøjagtigt. Desuden vil brug af filterpapir med forskellige fibertykkelser og grovhed ændre ROS-skrælningstiden. Filterpapir med tykkere fibre (såsom VWR Grade 413) isolerer retinale lag hurtigere (6-8 skræl), men er muligvis ikke så selektiv og kan føre til forurening fra andre lag. Filterpapir med tyndere fibre (såsom Whatman Grade 1) vil isolere retinale lag langsommere (12-15 skræl) og vil give en ren isolering af fotoreceptorlagene. Vi anbefaler at bruge både tykkere og tyndere filterpapir for at minimere afskalningstiden og sikre opsamlingens renhed.

Samtidig er visuel tilnærmelse og håndtering af båndprøver begge nøglen til succesen med at isolere de subcellulære rum fra den lyofiliserede nethinde. Hvis der tilsættes for meget tryk til båndet, klæber hele den lyofiliserede nethinde til båndet. Når dette sker, bliver adskillelsen af ROS længere og vanskeligere, men ikke umulig: Læg et andet stykke tape på nethindens frie overflade (på ganglioncellesiden) og træk langsomt lagene væk med tape, indtil kun det orange/lyserøde lag er synligt på det oprindelige stykke tape. Isolering af RIS på dette tidspunkt er imidlertid umuligt. Hvis der tilsættes for lidt tryk til båndet, klæber en stor del af ROS ikke til båndet. For at sikre korrekt ROS-tape vedhæftning anbefaler vi forsigtigt at trykke med pincet på de områder, der ikke klæber til båndet. Typisk resulterer det mindste tryk i fjernelse af ROS- og RIS-lagene, men trykmængden skal bestemmes ud fra erfaring. Tilstedeværelsen af isoleret RIS kan konstateres ved at kontrollere, om et tyndt, hvidt lag (beslægtet med en let støvning af sne) er synligt på den indledende ROS-båndskal, mens tilstedeværelsen af isoleret ROS let kan bestemmes ved at kontrollere farven på stangens fotoreceptorlag (orange for mørktilpasset, lyserød for lysetilpasset) på båndet.

En sidste udfordring opstår, når filterpapiret skræller (+ROS) homogeniseres fra den levende nethinde. Filterpapir absorberer let væske, og en betydelig mængde af homogeniseringsbufferen vil blive gennemblødt under dette trin i protokollen. Spinding af væsken ned i en minicentrifuge efter at have lagt skrælpapiret på siden af hvert rør hjælper med at forhindre tab af prøve. Desværre kan det være en tidskrævende proces at spinde ned flere stykker filterpapir, og tab af prøve er uundgåeligt. For at løse dette problem skal du fjerne nogle af filterpapirstykkerne og fokusere på at homogenisere færre stykker ad gangen. For at undgå tab af prøve i løbet af dette trin skal du desuden overveje at minimere den samlede mængde filterpapir, der bruges til at isolere ROS.

Selvom begge vores metoder ikke kræver en stor prøvestørrelse eller den præcise justering af et blad for at sektionere nethinden, er der et par begrænsninger for vores fotoreceptorskrælningsteknikker, der er værd at bemærke. For det første er den lyofiliserede murine nethinde muligvis ikke egnet til at skrælle efterfølgende fotoreceptorlag ud over ROS og RIS. For det andet er vores peelingsmetoder mere velegnede til behandling af individuel nethinde og er ikke modtagelige for stor batchbehandling i et møde. For det tredje er eksperimentets succes afhængig af følsomhedsgrænsen for det antistof, der anvendes i den vestlige blot. På trods af disse begrænsninger viser vores repræsentative resultater, at vores to isolationsskrælningsteknikker effektivt kan isolere specifikke stangfotoreceptorrum. Derudover bruger disse to metoder billige og almindelige laboratoriematerialer (filterpapir og tape), hvilket gør dem meget tilgængelige. I vores undersøgelse vurderede vi ikke direkte, om andre retinale celler kunne isoleres til immunblotting; Vi mener dog, at disse metoder let kan ændres til gavn for behovene hos et bredt tværsnit af retinalforskningsmiljøet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH Grant EY12155, EY027193 og EY027387 til JC. Vi er taknemmelige over for Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) og Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) for korrekturlæsning af manuskriptet. Vi vil også gerne takke Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) og Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) for at have leveret det nødvendige udstyr til at indsamle forfatteren leverede optagelser. Materiale fra: Kasey Rose et al,Separation of photoreceptor cell compartments in mouse netina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, offentliggjort [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Tags

Neurovidenskab udgave 178
To peelingmetoder til isolering af fotoreceptorcellerum i musenehinden til proteinanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter