Summary
Denne protokollen beskriver disseksjonsprosedyren, kulturtilstanden og levende avbildning av et antenne-hjerne-utvisningssystem for studiet av den olfaktoriske kretsenheten.
Abstract
~ Nevroner er nøyaktig sammenkoblet for å danne kretser som er avgjørende for riktig funksjon av hjernen. Drosophila olfaktorisk system gir en utmerket modell for å undersøke denne prosessen siden 50 typer olfaktoriske reseptor neuroner (ORNer) fra antennene og maxillary palps projisere sine aksoner til 50 identifiserbare glomeruli i antenneloben og danne synaptiske forbindelser med dendritter fra 50 typer andreordens projeksjons neuroner (PN). Tidligere studier fokuserte hovedsakelig på å identifisere viktige molekyler som regulerer den nøyaktige målrettingen i den olfaktoriske kretsen ved hjelp av faste vev. Her beskrives et antenne-hjerne-explant-system som rekapitulerer viktige utviklingsmilepæler av olfaktorisk kretsmontering i kulturen. Gjennom dissekering av ytre kutikal og rengjøring av ugjennomsiktige fettlegemer som dekker den utviklende pupalhjernen, kan bilder av høy kvalitet av enkeltnevroner fra levende hjerner samles ved hjelp av to-fotonmikroskopi. Dette tillater tidsforløpavbildning av enkel ORN axon-målretting fra levende vev. Denne tilnærmingen vil bidra til å avdekke viktige cellebiologiske sammenhenger og funksjoner til tidligere identifiserte viktige gener og identifisere mekanismer som ligger til grunn for den dynamiske prosessen med kretsmontering.
Introduction
Nevroner er nøyaktig sammenkoblet for å danne kretser som er avgjørende for riktig funksjon av hjernen. I over 100 år har nevrologer forsøkt å forstå hvordan nevritter strekker seg mot deres mellomliggende og endelige mål med ekstrem presisjon. Som et resultat har de identifisert viktige gener som koder veiledningssignaler for å utvikle nevronprosesser1. Drosophila olfaktorisk system gir en utmerket modell for å undersøke denne prosessen siden olfaktoriske reseptor neuroner (ORNer, de primære sensoriske nevroner) prosjektet til 50 identifiserbare glomeruli med stereotypisk størrelse, form og relativ posisjon, hvor de danner synaptiske forbindelser med dendritter fra 50 typer andre ordens projeksjon neuroner (PN), som hver sender dendritter til en av de 50 glomeruli2 (Figur 1 ). Derfor er det relativt enkelt å identifisere mutantfenotyper ved synaptisk (glomerulær) oppløsning i fly olfaktorisk system. Dette førte til funn av viktige gener som regulerer olfaktorisk kretsmontering3.
Monteringen av fly olfaktorisk krets er avhengig av temporally og romlig koordinerte utviklingsprosesser3. ORNer og PNer får distinkte celle skjebner, som satte opp programmet for sine ledningsspesifikasjoner. Deretter prepatnerer PN antenneloben (figur 1B). Axonene til ORNs omskjærer deretter den ipsilaterale antenneloben og krysser midtlinjen i hjernen for å nå den kontralaterale antenneloben. Deretter invaderer ORN-axoner både ipsi- og kontralaterale antennelober og danner synapser med dendritter av partner-PN-ene sine i spesifikk glomeruli. Denne grove modellen for olfaktorisk kretsmontering ble foreslått basert på karakterisering av faste prøver fra mellomliggende tidspunkter under utviklingen. Den dårlige temporale oppløsningen og manglende evne til å følge de samme nevronale prosessene på tvers av utvikling fra fast vev begrenser den mekanistiske forståelsen av kretsmonteringsprosessen.
Det er teknisk utfordrende å live image ORN og PN prosesser in vivo siden ledningsprosessen skjer i første halvdel av puppetrinnet når antenneloben er omgitt av ugjennomsiktig fettlegeme inne i puppetuiet. Det er derfor umulig å direkte avbilde den utviklende olfaktoriske kretsen fra intakt pupper. Dissekert vev dyrket ex vivo kan omgå vev opasitet og har blitt vellykket brukt til å studere nevral utvikling 4,5,6. Utfordringen med å bruke en lignende ex vivo explant kulturstrategi for å studere nevronale ledninger i pupalhjernen er om den rekapitulerer den presise nevronmålrettingen i en kulturtilstand. Basert på en tidligere rapportert ex vivo-kulturtilstand for fly eye-brain-komplekset7, har en utvisning som inneholder hele pupalhjernen, antennene og de tilkoblede antennenervene intakt nylig blitt utviklet, som beholder presis målretting av den olfaktoriske kretsen og kan bli utsatt for to-fotonmikroskopibasert levende bildebehandling i opptil 24 timer ved frekvensen av hver 20 min8 . Her beskrives en detaljert protokoll for utvisningskulturen og avbildningen. Explant-systemet gir en kraftig metode for å studere montering av olfaktorisk krets og potensielt andre kretser i den sentrale hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av reagenser
MERK: Alle trinnene i denne protokollen utføres ved romtemperatur (20-25 °C) med mindre annet er forklart.
- For å klargjøre kulturretten for å immobilisere utløpet under tidsforløpavbildning, legg 0,5 cm tykk Sylgard (bland grundig to flytende komponenter ved 10:1-forholdet før bruk) på undersiden av en 60 mm x 15 mm Petri-tallerken og la den kurere i 48 timer ved romtemperatur (figur 2A, referert til som Sylgard-plate i følgende tekst).
- For å klargjøre mikropinner for immobilisering av utvisning på denne platen, bruk et par tang til å feste flere mikropinner på et bånd med de skarpe endene justert på den ene siden (figur 2B). Bruk en saks til å kutte ~2 mm fra de skarpe endene av mikropinnene (figur 2B'). Bruk tang til å holde de kuttede mikropinnene og sett dem inn i Sylgard-laget på en ferdiglaget Sylgard-plate (figur 2C). To mikropinner brukes til å immobilisere en explant.
- Bruk en børste til å samle hvite pupper, som danner puparium innen 1 time, av hsFLP, pebbled-GAL4 /+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 genotype og overfør dem til nye hetteglass. Varmesjokk i 37 °C vannbad i 40 minutter for å indusere sparsomme ORN-kloner fra tilfeldige typer. Etter varmesjokk, sett hetteglassene ved 25 °C i 30 timer, noe som resulterer i pupper i alderen 30 timer etter pupariumdannelse (APF).
- For å forberede kulturmediet for explant, legg til 5 ml Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) til 500 ml Schneiders Drosophila Medium. Filtrer mediet og lag 45 ml aliquots i 50 ml koniske rør. Mediet kan oppbevares ved 4 °C i 1-2 måneder.
- På dagen for avbildning, ta ett rør med 45 ml Schneiders Drosophila-medium og tilsett 5 ml foster bovint serum (10 % v/v), 125 μL 4 mg/ml humaninsulin oppløsning (10 μg/ml endelig konsentrasjon), 50 μL 1 mg/ml 20-hydroksyecdysonbestandsoppløsning oppløst i etanol (1 μg/ml endelig konsentrasjon). Bland godt og overfør 15 ml fullt medium til et nytt 50 ml konisk rør. Resten av hele mediet kan oppbevares ved 4 °C i en uke. Fetal Bovine Serum, human insulin lager løsning og 20-hydroksyecdysone lager løsning er aliquoted og lagret ved -20 °C.
- Oksygener det 15 ml fulle mediet ved å pumpe oksygenbobler fra en oksygenflaske under væskeoverflaten gjennom en steril 5 ml pipettespiss med en boble /s i 20-30 minutter. Bruk en parafinfilm for å dekke åpningen av røret under denne prosessen.
- Steriliser disseksjonsbrønnoverflaten og Sylgardplaten (med mikropinner satt inn på Sylgard-laget, fremstilt i trinn A1 og A2) med 70% etanol. La dem tørke før bruk.
2. Utvisning av disseksjon
- Bruk en børste til å overføre 30 h APF (30 h etter pupariumdannelse) pupper til et papirvev og tørk den ytre overflaten av puppene i 5 minutter.
- Sett et stykke dobbeltsidig tape på en glasssklie. Fest forsiktig den tørkede puppen på den klissete overflaten av båndet med dorsalsiden vendt oppover. Trykk forsiktig på puppene med en børste for å hjelpe den ventrale siden av puppene til å feste seg godt til båndet (figur 3A). Ikke skad puppen.
- Bruk et par tang for å fjerne brun puppetui som dekker dorsalsiden av hodet (figur 3A,B). Sett inn en skarp spiss av tangene mellom den brune puppetuiet og puppen fra sidesiden og bryt forsiktig den brune puppetuiet gjennom en linje til den bakre enden av puppen (figur 3B, C). Åpne den brune puppetuiet. Bruk et par tang for å forsiktig holde puppen og overføre til disseksjonsbrønnen med 1 ml oksygenert fullt medium. Senk flytende pupa under på middels overflate for å hjelpe den med å synke til bunnen av brønnen (figur 3D).
MERK: Ikke sett tangspissen for dypt inn i det brune valpehuset for å unngå å skade puppen med tangene. - For å dissekere antennehjernen som utvises fra puppen, bruk tang til å holde puppen forsiktig med den ene hånden og bruk et par mikroscissorer for å kutte et lite hull fra den bakre siden av puppen med den andre hånden (figur 3E). Dette lille hullet frigjør høytrykket inne i puppen.
- Skjær gjennom puppens ventrale midtlinje fra hullet til nakken (den smale strukturen som forbinder hodet og thoraxen) med mikroscissorene (figur 3F). Klipp deretter gjennom omkretsen av nakken for å løsne hodet fra puppens kropp (figur 3G). Fjern kroppen og legg den i en annen brønn.
MERK: Ikke skjær nakken direkte fra den dorsale/ventrale siden av puppen, noe som kan klemme hjernen. - Klipp den gjennomsiktige kutiklen som dekker dorsalsiden av hjernen (figur 3H). Dette vil avsløre den fete kroppen på toppen av hjernen. Hold litt kutikal som netthinnen og antennene festes til. Gjenta den samme prosedyren til den ventrale siden av hjernen.
MERK: Ikke sett saksens blad for dypt inn under neglebåndet, da dette vil føre til at antennenervene forbinder antennene og hjernen (figur 3H). - Bruk en P10-pipette til forsiktig å vaske ut den fete kroppen som dekker hjernen og antennene ved å pipettere mediet mot de åpne områdene på dorsale og ventrale sider av hodet (figur 3I).
MERK: Vær svært forsiktig når du rører mediet, da hjernen lett kan løsnes fra neglebåndet. Forsikre deg om at all fettlegeme er fjernet i løpet av dette trinnet. Arrestert utvikling av ORN axons ble observert når fett kroppen ikke ble rengjort godt, sannsynligvis på grunn av dårlig oksygen tilgang fra mediet. - For å studere samspillet mellom bilaterale ORN-aksoner eller ORN-axoner til PN dendrite-målretting, kutt en eller to antennenervene med mikroscissorene i dette stadiet8 (figur 3J). Plasser forsiktig bladene på saksen mellom kutikalen og hjernen og fjern interesserte antennenerver.
- For å overføre den dissekerte utvisningen til Sylgardplaten, plasser en dråpe oksygenert hele mediet (~200 μL) på Sylgardoverflaten. Belegge den indre overflaten av en 200 μL bred spiss pipettespiss med fettlegemet fra den dissekerte stammen (trinn 1.6) ved å pipettere fettlegemet flere ganger, noe som forhindrer at utløpene stikker pipettespissen under overføring. Bruk deretter denne brede pipettespissen til å overføre utvisningen fra disseksjonsbrønnen til middels dråpe på kulturplaten (figur 3K).
- Bruk tang til å feste utvisningen på Sylgard-laget i de to optiske lobene (figur 3L). Plasser Sylgardplaten forsiktig på bildestasjonen og immobiliser platen med bånd. Tilsett sakte 10 ml oksygenert full medium til Sylgardplaten ved hjelp av P1000 pipette.
MERK: Unngå å forstyrre utløpet når du legger mediet til Sylgardplaten.
3. To-foton mikroskopi-basert levende bildebehandling
- Hvis du vil utføre tidsforløpavbildning, bruker du et tofotonmikroskop, en Ti:Sapphire-laser, et 20x vann-nedsenkingsmål (1,0 NA) og en bildebehandlingsprogramvare. Bruk eksitasjonsbølgelengden ved 920 nm for avbildning av GFP-proteiner. Juster pikselens oppholdstid til 10 μs.
- Juster bildestasjonsposisjonen slik at uttjeningene er omtrent under målet. Bruk 70% etanol for å sterilisere linsen før avbildning. Senk sakte målet under mediet nær utløpene. Sjekk om det er noen boble på objektivets linse.
- I så fall løfter du målet over mediet og gjentar dette til boblen er borte. Finn uttredingene ved hjelp av okularet og midtstill en utvisning i feltet.
- For å sikre en utvisning med noen få ORNer som er tynt merket for tidsforløpavbildning, dissekerer du ~ 10 utvisler hver gang og justerer på y-aksen på kulturplaten. Screen alle explants ved å flytte målet langs y aksen og velg en explant der noen få enkelt ORN axoner nettopp har nådd antenneloben for bildebehandling (figur 4A).
- Gjenkjenne antenneloben med sin ovale form og ORN-axonene som begynner å omgå den. Bilde a ~150 μm x 150 μm-område i xy-planet (3x zoom med 20x-målet). Beregn grensen til de to antennelobene og sentrer dem i bildeområdet.
- Velg et innledende bildeområde langs z-aksen ved å definere den nederste delen og den øverste delen av skanningen. Sett opp bildeområde langs z-aksen. Angi den dypeste delen med ORN-axonsignaler som den første bildebehandlingsøkten og økten 100 μm ovenfor (mer overfladisk side) som siste bildebehandlingsøkt (figur 4B).
MERK: Dette etterlater noen seksjoner på toppen (overfladisk side) av ORN-aksonene og unngår skifte av ORN-axoner oppover utenfor bildeområdet på grunn av veksten i hjernen under kulturen.- Bilde med intervaller på 2 μm. Angi automatisk skanning av bilder med frekvensen av hver 20.
- Flytt bildeområdet 20 μm oppover langs z-aksen etter de første 4 t avbildningene og ytterligere 20 μm oppover langs z-aksen etter 16 timers bildebehandling. Dette kan oppnås ved å angi et skript og forskjellige z-stabler i bildebehandlingsprogramvaren.
- Kultur explant for en ekstra periode post imaging (opptil 24 h ex vivo) før fiksering og farging med N-kadherin, en neuropil markør, for å avsløre den genetiske identiteten til hver enkelt ORN av glomerulus den retter seg mot.
4. Bildebehandling
- For å behandle z-stakkbilder fra seksjonsserier tatt på hvert tidspunkt ved hjelp av Fiji-programvaren, åpne bildeseksjonsserien, klikk på Bilde | Stabler | Z-prosjekt [/].
- For å korrigere lateral drift av prøven under kultur, installer TurboReg Plugin i Fiji.
- Åpne en z-stakkbildeserie og ett enkelt z-stakkbilde fra serien. Åpne plugins | Registrering | TurboReg.
- Velg bildeserien z-stakk i Kilde og enkeltbildet av z-stakken i Mål-| Oversettelse. Klikk på Batch-knappen for å registrere alle bildene fra den åpne z stack-bildeserien.
- For å maksimere nytten av avbildede prøver, separer tynt merkede enkeltaksoner i nærheten til hverandre fra z-stakkbildene etter 3D-bildeinndelinger.
- For å trekke ut enkle ORN-axoner fra noen få axoner i samme bilde, åpne bildeseksjonsserien, klikk på Plugins | Segmentering | Redigeringsprogrammet for segmentering [/]. Velg penselverktøyet og masker interessert ORN axon i arbeidsvinduet segmenteringsredigering ved hjelp av velg "+" eller "-" -knappene på hver bildedel.
- Klikk på Behandle | Bildekalkulator [/]. Velg "Bilde X" i bilde 1, "Multipliser" i drift, "Bilde X. etiketter" i bilde 2, [/]. Dette genererer en ny bildeseriefil bare med den interesserte axonen. Utfør trinn 4.1 for å behandle z-stakkbildet. Gjenta dette trinnet for alle tidspoeng for å generere en bildefil for tidsserier.
- Hvis du vil pseudofarge forskjellige axoner fra samme bilde, må du først utføre trinn 4.3 for å generere bildefilen for tidsserien for hver axon separat. Åpne bildefilene for tidsserien for forskjellige enkeltaksoner fra samme rådatabilde. Klikk på Bilde | Farge | Slå sammen kanaler. Velg andre bildefiler for tidsserier i forskjellige fargekanaler, og klikk OK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ORN-axoner ankommer antenneloben mellom 18 timer og 36 timer APF. Deretter navigerer de i antenneloben, krysser midtlinjen og innervater glomerulien. Video 1 er en representativ video som viser hele prosessen for flere individuelt identifiserbare aksoner, tatt med frekvensen av hver 20 min i 24 timer. Før registrering ved hjelp av TurboReg, viser axonene noen laterale drifting som hjernen utvikler (første halvdel av videoen). Etter registrering korrigeres driften (andre halvdel av videoen).
Hvis du vil skille noen ORN-axoner fra samme utvisning, vises ett eksempel i figur 5. Etter prosedyren i trinn 4.3 ble VA1d- og VA1v-axoner fra explant vist i figur 5A trukket ut for å generere et nytt z-stakkbilde med bare disse to axonene (figur 5B). På samme måte ble VM2- og VM3-aksoner (figur 5B)) og DL2 axon (figur 5B'') trukket ut. Figur 5C viser en sammenslåing av bilder i figur 5B-B med pseudofarger. De genetiske identitetene til hver ORN-axon ble avslørt ved immunstaining av en neuropilmarkør N-kadherin av den faste utløpet (figur 5D, E).
Figur 1: Struktur av fly olfaktorisk krets. (A) Et voksent fluehode vises med en ORN fra høyre antenner (grønn) som sender axonen til både antennelober (ALs) i hjernen og danner synaptisk forbindelse i en bestemt glomerulus med dendritter av PNer (rød) i ipsilaterale og kontralaterale ALs. Stiplet loddrett linje angir midtlinjen i dette og etterfølgende diagrammer og bilder. (B) Diagram som viser den olfaktoriske kretsutviklingen. (1) PN dendrites først innervate en region i antenneloben (rød). ORN-axoner når antennelobene i hjernen. (2) ORN-aksoner tar enten en dorsolateral (grønn) eller ventromedial (blå) bane for å omgå antenneloben. (3) ORN-aksoner krysser midtlinjen. (4) ORN axoner innervate glomeruli i antenneloben. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Klargjøring av bildekammeret for utvisning. (A) Legg et lag silikonelastomer (~0,5 cm) nederst på en 60 mm Petri-tallerken. (B-B') Juster pinnene på et bånd og kutt til ~ 2 mm lang ved hjelp av en saks. (C) Fest mikropinnene på silikonelastomerlaget på kulturplaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Disseksjonsprosedyren for antennehjernen utviser. (A) Fest ventralsiden av en papirvevtørket pupa på et dobbeltsidig tape på en glasssklie. (B-C) Bruk tang til å kutte den ytre brune kutiklet for å eksponere puppen inni. (D) Overfør puppen til en disseksjonsbrønn med oksygenert fullt medium. (E-G) Separer forsiktig puppestammen fra hodet ved hjelp av mikroscissorer. (H) Klipp biter av halvgjennomsiktig kutikulær som dekker dorsale og ventrale sider av hjernen. Hold litt kutiklet på de fremre og laterale sidene av hjernen for å beholde forbindelser mellom netthinnen, antennene og hjernen. (H') Unngå å kutte antennenerven i dette trinnet. (I) Rengjør den fete kroppen som dekker hjernen ved å pipetter forsiktig. (J) Sever en eller to antenne nerve (er) ved hjelp av mikroscissors i visse eksperimenter. (K) Plasser en dråpe oksygenert full medium på overflaten av kulturplaten. Overfør den dissekerte utløpet ved hjelp av en bred spiss pipettespiss. (L) Bruk tang til å feste de to optiske lobene på utvisningen på silikonelastomerlaget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tidsforløpavbildning av enkel ORN-axonmålretting fra en utvisning. (A) Velg en utvisning med noen orn-aksoner som bare når antenneloben. Beregn formen på to antennelober ved krumningen av axonene og sentrer antennelobene i bildefeltet. (B) Angi bildeområdet langs z-aksen. Tenk på at antenneloben vil skifte oppover etter hvert som hjernen vokser og utvikler seg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Trekk ut enkle ORNer og avslør deres dystre identiteter. (A) Et maksimalt projeksjonsbilde av en utvisning med 5-10 enkle ORN-aksoner ved hjelp av tofotonmikroskopi med 20x objektiv og 3x zoom inn. (B-B'') 1-2 enkeltaksoner trekkes ut fra (A) ved å opprette masker manuelt i bildeseksjoner fra rå bildedata. (C) Slå sammen bildene av (B-B'') med hver axon pseudofarget forskjellig. (D-D') Maksimalt antall kondoleringsbilder tatt med 40x objektiv og 1,5x zoom. Explant vist i (A) ble fikset etterfulgt av farging med anti-GFP og anti-N-kadherin (neuropil markør). Fremre og bakre halvdeler av antennelobene er stabler separat i (D) og (D'). (E) Antenne lobe kart viser ekstrahert ORN axons i (B, C). Noen bilder vist i denne figuren er endret fra en tidligere studie8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Tofotonmikroskopibaserte tidsforløpbilder viser målretting av to ORN-aksoner, før og etter bilderegistrering. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila-antennehjernen beholder normal målretting av den olfaktoriske kretsen. Vi la merke til at utviklingen er 2 ganger langsommere ex vivo sammenlignet med in vivo. Det bemerkes at explant-systemet ikke beholder maksillær palp, som er vert for seks typer ORNer. For å sikre normal utvikling er recapitulated ex vivo, strekker antenne nerver må unngås under explant disseksjon. Under ex vivo kultur forårsaker bakterievekst vanligvis arrestert utvikling av den olfaktoriske kretsen. Derfor er grundig sterilisering av kulturretten og pinnene før avbildning og oppbevaring av bilderommet rent og isolert viktig.
Denne utvisningsenheten støtter langsiktig tofotonmikroskopibasert tidsforløpavbildning. Kombinert med en nyutviklet reporter for sparsom merking av enkle ORNer, tillater explant-systemet høyoppløselig bildebehandling fra enkelt axon terminus. Dette systemet er kraftig for å studere cellebiologiske mekanismer som underbygger den dynamiske prosessen med olfaktorisk kretsmontering8. Selv om olfaktorisk kretsutvikling ble vist her som et eksempel, kan dette systemet potensielt utvides til studier av andre kretser eller andre utviklingsprosesser i den utviklende sentrale hjernen.
Explant opprettholder normal utvikling i kulturen i minst 24 timer, noe som kan fange hele prosessen med ORN-målretting. Det gjør det mulig for forskere å avsløre den genetiske identiteten til enkle ORN-aksoner gjennom motfarging med en neuropilmarkør etter fiksering, da antenneloben allerede utvikler åpenbar glomerulær struktur ved slutten av kulturen. Denne strategien omgår problemet med å mangle spesifikke genetiske drivere for mange ORN-typer på et tidlig utviklingsstadium for å oppnå avbildning av bestemte typer ORNer ved hjelp av en pan-ORN-driver.
For å oppnå høyere romlig oppløsning kan dette explant-systemet avbildes ved hjelp av mer avansert mikroskopi, adaptiv optikk-gitter lysarkmikroskopi (AO-LLSM). Det har vist seg at AO-LLSM muliggjør visualisering av fine strukturer av axonterminaler og skannefrekvens på hvert 30 sekund per volum 8,9,10,11. En fordel med explant er kompatibiliteten med Janelia Fluorophore fargestoff 12,13,14 merking ved å inkubere explant uttrykke Halo-tag i spesifikke nevroner med fargestoffer i mediet før avbildning. Det ble lagt merke til at inkubering av utløpet med fargestoffholdig medium resulterer i mye sterkere merking enn å mate larver med fargestoffet. Denne unike fordelen tillot oss å avbilde axoner på et tidlig utviklingsstadium som knapt ble visualisert av GFP-merking8.
I tillegg til tidsforløpavbildning har explant-systemet andre fordeler. For eksempel er det mulig å kutte antennenervene fra de dissekerte utvise ensidig eller bilateralt på bestemte utviklingstidspunkter (trinn 2.8). Dette gjør det mulig for forskere å undersøke kravet til ORN-aksoner i målrettingen av alle nevrontyper i den olfaktoriske kretsen ved distinkte utviklingstrinn. Spesielt ensidig antenne nerve severing analyser, som ikke kan oppnås ved tradisjonell genetisk manipulasjon, førte til en interessant oppdagelse at interaksjon mellom bilaterale ORN axons er nødvendig for riktig kontralateral målretting av ORN axons8. Videre dyrkes utløpet direkte i medium i stedet for å bli innebygd i agarose, og tillater derfor rask levering og vask ut av noen små molekyler eller stoffer. Sammenlignet med genetisk manipulasjon har narkotikabehandling fordelene med rask effekt og reversibilitet av manipulasjonen. Det gjør det mulig for forskere å vurdere noen viktige prosesser for celler i senere utviklingsstadier ved å omgå celledødelighet eller usunne problemer på grunn av konstituerende forstyrrelser gjennom genetiske manipulasjoner. Det hjelper også visualisering av subtile endringer ved å sammenligne før og etter narkotikabehandling, og etter legemiddelvask.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker N. Özel og R. Hiesinger for deres råd om den utplantede kulturen; M. Wagner for teknisk hjelp av to-foton mikroskopi; D.J. Luginbuhl for å generere transgene fluer; D. Friedmann for forslag til Fiji programvareanalyse; Y. Ge for hjelp på flyarbeid; C. McLaughlin og K.K.L. Wong for kommentarer til manuskriptet. L.L. er etterforsker ved Howard Hughes Medical Institute. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grants 1K99DC01883001 (til T.L.) og R01-DC005982 (til L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
