Summary
Detta protokoll beskriver dissektionsproceduren, odlingstillståndet och levande avbildning av ett antenn-hjärnexplantsystem för studier av luktkretsenheten.
Abstract
~ Neuroner är exakt sammankopplade för att bilda kretsar som är väsentliga för hjärnans korrekta funktion. Drosophila-luktsystemet ger en utmärkt modell för att undersöka denna process eftersom 50 typer av luktreceptorneuroner (ORN) från antennerna och maxillära palps projicerar sina axoner till 50 identifierbara glomeruli i antennalloben och bildar synaptiska anslutningar med dendriter från 50 typer av andra ordningens projektionsneuroner (PNs). Tidigare studier fokuserade främst på att identifiera viktiga molekyler som reglerar den exakta inriktningen i luktkretsen med hjälp av fasta vävnader. Här beskrivs ett antenn-hjärnexplantsystem som rekapitulerar viktiga utvecklingsmilstolpar för luktkretsmontering i kultur. Genom att dissekera den yttre nagelbanden och rengöra ogenomskinliga fettkroppar som täcker den utvecklande pupala hjärnan kan högkvalitativa bilder av enstaka neuroner från levande hjärnor samlas in med hjälp av tvåfotonmikroskopi. Detta möjliggör time-lapse-avbildning av enstaka ORN-axoninriktning från levande vävnad. Detta tillvägagångssätt kommer att bidra till att avslöja viktiga cellbiologiska sammanhang och funktioner hos tidigare identifierade viktiga gener och identifiera mekanismer som ligger till grund för den dynamiska processen för kretsmontering.
Introduction
Neuroner är exakt sammankopplade för att bilda kretsar som är väsentliga för hjärnans korrekta funktion. I över 100 år har neuroforskare försökt förstå hur neuriter sträcker sig mot sina mellan- och slutmål med extrem precision. Som ett resultat har de identifierat viktiga gener som kodar för vägledningssignaler för att utveckla neuronala processer1. Drosophila-luktsystemet ger en utmärkt modell för att undersöka denna process eftersom luktreceptorneuroner (ORN, de primära sensoriska neuronerna) projicerar till 50 identifierbara glomeruli med stereotyp storlek, form och relativ position, där de bildar synaptiska anslutningar med dendriter från 50 typer av andra ordningens projektionsneuroner (PNs), som var och en skickar dendriter till en av de 50 glomeruli2 (figur 1A ). Därför är det relativt enkelt att identifiera mutanta fenotyper vid synaptisk (glomerulär) upplösning i flugnoktersystemet. Detta ledde till upptäckter av viktiga gener som reglerar luktkretsmontering3.
Sammansättningen av flugnokterkretsen bygger på tidsmässigt och rumsligt samordnade utvecklingsprocesser3. ORN och PNs förvärvar distinkta cellöden, som ställer in programmet för deras ledningsspecificiteter. Därefter prepatternerar PN antennloben (figur 1B). Axonerna av ORN omger sedan den ipsilaterala antennloben och korsar hjärnans mittlinje för att nå den kontralaterala antennloben. Därefter invaderar ORN-axoner både ipsi- och kontralaterala antennlober och bildar synapser med dendriter av deras partner PNs i specifika glomeruli. Denna grova modell för luktkretsmontering föreslogs baserat på karakterisering av fasta prover från mellanliggande tidpunkter under utvecklingen. Den dåliga tidsmässiga upplösningen och oförmågan att följa samma neuronala processer över utveckling från fast vävnad begränsar den mekanistiska förståelsen av kretsmonteringsprocessen.
Det är tekniskt utmanande att leva bild ORN- och PN-processer in vivo eftersom ledningsprocessen inträffar under den första halvan av valpstadiet när antennloben är omgiven av ogenomskinlig fettkropp inuti pupalfallet. Det är därför omöjligt att direkt avbilda den utvecklande luktkretsen från intakta puppor. Dissekerade vävnader odlade ex vivo kan kringgå vävnadens opacitet och har framgångsrikt använts för att studera neural utveckling 4,5,6. Utmaningen med att använda en liknande ex vivo explantkulturstrategi för att studera neuronala ledningar i pupalhjärnan är om den rekapitulerar den exakta neuroninriktningen i ett odlingstillstånd. Baserat på ett tidigare rapporterat ex vivo-odlingstillstånd för flugögon-hjärnkomplexet7 har en explant som innehåller hela pupalhjärnan, antennerna och de anslutande antennnerverna intakta nyligen utvecklats, vilket behåller exakt inriktning på luktkretsen och kan utsättas för tvåfotonmikroskopibaserad levande avbildning i upp till 24 timmar vid frekvensen av var 20: e minut8 . Här beskrivs ett detaljerat protokoll över explantkulturen och avbildning. Explantsystemet ger en kraftfull metod för att studera sammansättningen av luktkrets och potentiellt andra kretsar i den centrala hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagenser
OBS: Alla steg i detta protokoll utförs vid rumstemperatur (20-25 °C) om inte annat förklaras.
- För att förbereda odlingsskålen för immobilisering av explanten under time lapse-avbildning, lägg 0,5 cm tjock Sylgard (blanda noggrant två flytande komponenter i förhållandet 10: 1 före användning) på bottenytan på en 60 mm x 15 mm petriskål och låt den härda i 48 timmar vid rumstemperatur (figur 2A, kallad Sylgard-tallrik i följande text).
- För att förbereda mikrostift för immobilisering av explant på denna platta, använd ett par pincett för att fästa flera mikrostift på ett tejp med de skarpa ändarna inriktade på ena sidan (figur 2B). Använd en sax för att klippa ~ 2 mm från de vassa ändarna på mikrostiften (figur 2B '). Använd pincett för att hålla de skurna mikrostiften och sätt in i Sylgard-lagret på en förgjord Sylgard-platta (figur 2C). Två mikrostift används för att immobilisera en explant.
- Använd en borste för att samla vita puppor, som bildar puparium inom 1 h, av hsFLP, pebbled-GAL4 /+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 genotyp och överför dem till nya injektionsflaskor. Värmechock i 37 °C vattenbad i 40 minuter för att inducera glesa ORN-kloner från slumpmässiga typer. Efter värmechock, sätt injektionsflaskorna vid 25 °C i 30 timmar, vilket resulterar i puppor som åldras vid 30 timmar efter pupariumbildning (APF).
- För att förbereda odlingsmediet för explantat, tillsätt 5 ml penicillin-streptomycin (10 000 U / ml) till 500 ml Schneiders Drosophila Medium. Filtrera mediet och gör 45 ml alikvoter i 50 ml koniska rör. Mediet kan förvaras vid 4 °C i 1-2 månader.
- På bilddagen, ta en tub på 45 ml av Schneiders Drosophila-medium och tillsätt 5 ml fetalt bovint serum (10 % v/v), 125 μl 4 mg/ml humaninsulinlösning (10 μg/ml slutkoncentration), 50 μl 1 mg/ml 20-hydroxiektyson stamlösning upplöst i etanol (1 μg/ml slutkoncentration). Blanda väl och överför 15 ml fullt medium till ett nytt 50 ml koniskt rör. Resten av hela mediet kan förvaras vid 4 °C i en vecka. Fetalt bovint serum, human insulinlösning och 20-hydroxiecdyson stamlösning alikvoteras och lagras vid -20 °C.
- Oxygenera 15 ml fullt medium genom att pumpa syrebubblor från en syrecylinder under vätskeytan genom en steril 5 ml pipettspets med en hastighet av en bubbla / s i 20-30 min. Använd en paraffinfilm för att täcka rörets öppning under denna process.
- Sterilisera dissektionsbrunnytan och Sylgard-plattan (med mikrostift införda på Sylgard-skiktet, beredda i steg A1 och A2) med 70% etanol. Låt dem torka före användning.
2. Explant dissektion
- Använd en borste för att överföra 30 h APF (30 h efter pupariumbildning) puppor till en pappersvävnad och torka den yttre ytan av pupporna i 5 minuter.
- Lägg en bit dubbelsidig tejp på en glasskiva. Fäst försiktigt de torkade popparna på tejpens klibbiga yta med ryggsidan uppåt. Tryck försiktigt på pupporna med en borste för att hjälpa popparnas ventrala sida att fästa väl på tejpen (figur 3A). Skada inte poppan.
- Använd ett par pincett för att ta bort brunt pupalfodral som täcker huvudets ryggsida (figur 3A,B). För in en vass spets på tången mellan det bruna puppan och puppan från sidosidan och bryt försiktigt det bruna pupalhöljet genom en linje till puppans bakre ände (figur 3B,C). Öppna det bruna valpfodralet. Använd ett par pincett för att försiktigt hålla poppan och överför till dissektionsbrunnen med 1 ml syresatt fullt medium. Sänk ner flytande puppa på medelytan för att hjälpa den att sjunka till botten av brunnen (figur 3D).
OBS: Sätt inte in tångspetsen för djupt inuti det bruna valpfodralet för att förhindra att poppan skadas med tången. - För att dissekera antennhjärnan som explantas från puppan, använd pincett för att försiktigt hålla poppan med ena handen och använd ett par mikroscissorer för att skära ett litet hål från puppans bakre sida med den andra handen (Figur 3E). Detta lilla hål släpper ut det höga trycket inuti poppan.
- Skär genom poppens ventrala mittlinje från hålet till nacken (den smala strukturen som förbinder huvudet och bröstkorgen) med mikroscissorerna (figur 3F). Skär sedan genom halsens omkrets för att lossa huvudet från poppens kropp (figur 3G). Ta bort kroppen och placera den i en annan brunn.
OBS: Skär inte halsen direkt från den dorsala / ventrala sidan av puppan, vilket kan pressa hjärnan. - Skär den genomskinliga nagelbandet som täcker hjärnans ryggsida (figur 3H). Detta kommer att exponera den feta kroppen ovanpå hjärnan. Håll någon nagelband som näthinnan och antennerna fäster på. Upprepa samma procedur till hjärnans ventrala sida.
OBS: För inte in saxbladet för djupt under nagelbandet eftersom detta kommer att orsaka avskiljning av antennnerverna som förbinder antennen och hjärnan (figur 3H '). - Använd en P10-pipett för att försiktigt tvätta bort fettkroppen som täcker hjärnan och antennerna genom att pipettera mediet mot de öppna regionerna på huvudets dorsala och ventrala sidor (figur 3I).
OBS: Var mycket försiktig när du pipetterar mediet eftersom hjärnan lätt kan lossna från nagelbandet. Se till att all fet kropp tas bort under detta steg. Arresterad utveckling av ORN-axoner observerades när fettkroppen inte rengjordes väl, troligen på grund av dålig syreåtkomst från mediet. - För att studera interaktionen mellan bilaterala ORN-axoner eller ORN-axoner till PN-dendritinriktning, skär en eller två antennnerver med mikroscissorerna under detta steg8 (Figur 3J). Placera försiktigt saxens blad mellan nagelbanden och hjärnan och skär av intresserade antennnerver.
- För att överföra den dissekerade explanten till Sylgard-plattan, placera en droppe syresatt fullt medium (~ 200 μL) på Sylgard-ytan. Täck den inre ytan på en 200 μL bred tippipettspets med fettkroppen från den dissekerade stammen (steg 1.6) genom att pipettera fettkroppen flera gånger, vilket förhindrar att explantaterna fastnar i pipettspetsen under överföringen. Använd sedan denna breda spetspipettspets för att överföra explantet från dissektionsbrunnen till medeldroppen på odlingsplattan (figur 3K).
- Använd pincett för att fästa explanten på Sylgard-skiktet i de två optiska loberna (figur 3L). Placera försiktigt Sylgard-plattan på bildstationen och immobilisera plattan med tejp. Tillsätt långsamt 10 ml syresatt fullt medium till Sylgard-plattan med P1000-pipett.
OBS: Undvik att störa explanten när du lägger till mediet på Sylgard-plattan.
3. Tvåfotonmikroskopibaserad levande avbildning
- För att utföra time-lapse-avbildning, använd ett tvåfotonmikroskop, en Ti: Sapphire-laser, ett 20x vatten-nedsänkningsmål (1.0 NA) och en bildprogramvara. Använd excitationsvåglängden vid 920 nm för avbildning av GFP-proteiner. Justera pixelns uppehållstid till 10 μs.
- Justera bildstationens position så att explantaten ligger ungefär under målet. Använd 70% etanol för att sterilisera linsen före avbildning. Sänk långsamt målet under mediet nära explantaten. Kontrollera om det finns någon bubbla på objektivlinsen.
- Lyft i så fall målet ovanför mediet och upprepa detta tills bubblan är borta. Hitta explantarna med okularet och centrera en explant i fältet.
- För att säkerställa en explant med några ORN som är sparsamt märkta för time lapse-avbildning, dissekera ~ 10 explantater varje gång och justera på y-axeln på odlingsplattan. Screena alla explantat genom att flytta målet längs y-axeln och välj en explant där några enstaka ORN-axoner just har nått antennloben för avbildning (figur 4A).
- Känn igen antennloben genom sin ovala form och ORN-axonerna som börjar kringgå den. Avbilda ett område på ~150 μm x 150 μm i xy-planet (3x zoom med 20x-målet). Uppskatta gränsen för de två antennloberna och centrera dem i bildområdet.
- Välj ett inledande avbildningsområde längs z-axeln genom att definiera det nedre och det övre avsnittet av skanningen. Ställ in bildområdet längs z-axeln. Ställ in det djupaste avsnittet med ORN-axonsignaler som den första avbildningssessionen och sessionen 100 μm ovan (mer ytlig sida) som den sista bildsessionen (figur 4B).
OBS: Detta lämnar vissa sektioner ovanpå (ytlig sida) av ORN-axonerna och undviker förskjutning av ORN-axoner uppåt utanför bildområdet på grund av hjärnans tillväxt under kulturen.- Bild med 2 μm intervall. Ställ in automatisk bildskanning på frekvensen var 20: e minut med hjälp av bildprogramvara.
- Flytta avbildningsområdet 20 μm uppåt längs z-axeln efter den första 4-timmarsavbildningen och ytterligare 20 μm uppåt längs z-axeln efter 16 timmars avbildning. Detta kan uppnås genom att ställa in ett skript och olika z-stackar i bildprogramvaran.
- Odla explanten under ytterligare en period efter avbildning (upp till 24 timmar ex vivo) före fixering och färgning med N-kadherin, en neuropilmarkör, för att avslöja den genetiska identiteten för varje enskild ORN av glomerulus den riktar sig till.
4. Bildbehandling
- För att bearbeta z stack bilder från sektionsserier tagna vid varje tidpunkt med hjälp av Fiji-programvaran, öppna bildsektionsserier, klicka på Bild | Staplar | Z-projektet [/].
- För att korrigera sidodrift av provet under odling, installera TurboReg Plugin i Fiji.
- Öppna en z stack-bildserie och en enda z-stackbild från serien. Öppna plugins | Registrering | TurboReg.
- Välj z stack-bildserien i Source och den enda z-stackbilden i Target | Översättning. Klicka på Batch-knappen för att registrera alla bilder från den öppnade z stack-bildserien.
- För att maximera nyttan av avbildade prover, separera glest märkta enstaka axoner i närheten av varandra från z-stackbilderna efter 3D-bildavsnitt.
- För att extrahera enstaka ORN-axoner från några axoner i samma bild, öppna bildsektionsserien, klicka på Plugins | Segmentering | Segmenteringsredigerare [/]. Välj penselverktyget och maskera intresserad ORN-axon i segmenteringsredigerarens arbetsfönster med knapparna Välj "+" eller "-" på varje bildavsnitt.
- Klicka på Process | Bildkalkylator [/]. Välj "Bild X" i bild 1, "Multiplicera" i drift, "Bild X. etiketter" i bild 2, [/]. Detta genererar en ny bildseriefil med endast den intresserade axonen. Utför steg 4.1 för att bearbeta z-stackbilden. Upprepa det här steget för alla tidpunkter för att generera en tidsseriebildfil.
- Om du vill pseudofärga olika axoner från samma bild utför du först steg 4.3 för att generera tidsseriebildfilen för varje axon separat. Öppna tidsseriebildfilerna för olika enskilda axoner från samma rådatabild. Klicka på Bild | Färg | Slå samman kanaler. Välj olika tidsseriebildfiler i olika färgkanaler och klicka på OK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ORN-axoner anländer till antennloben mellan 18 h och 36 h APF. De navigerar sedan i antennloben, korsar mittlinjen och innerverar glomeruli. Video 1 är en representativ video som visar hela processen för flera individuellt identifierbara axoner, tagna med frekvensen var 20: e minut i 24 timmar. Innan registrering med TurboReg uppvisar axonerna en del lateral drifting när hjärnan utvecklas (första halvan av videon). Efter registrering korrigeras driften (andra halvan av videon).
För att separera några ORN-axoner från samma explant visas ett exempel i figur 5. Efter proceduren i steg 4.3 extraherades VA1d- och VA1v-axoner från explant som visas i figur 5A för att generera en ny z-stackbild med endast dessa två axoner (figur 5B). På liknande sätt extraherades VM2- och VM3-axoner (figur 5B') och DL2-axon (figur 5B''). Figur 5C visar en sammanslagning av bilder i figur 5B-B'' med pseudofärger. De genetiska identiteterna för varje ORN-axon avslöjades genom immunfärgning av en neuropilmarkör N-kadherin av den fasta explanten (figur 5D,E).
Figur 1: Struktur av flug luktkrets. (A) Ett vuxet flughuvud visas med ett ORN från höger antenn (grönt) som skickar sin axon till båda antennloberna (ALs) i hjärnan och bildar synaptisk anslutning i en specifik glomerulus med dendriter av PNs (röd) i ipsilaterala och kontralaterala ALs. Streckad vertikal linje indikerar mittlinje i detta och efterföljande diagram och bilder. (B) Diagram som visar luktkretsens utveckling. (1) PN-dendriter innerverar först en region i antennloben (röd). ORN-axoner når antennloberna i hjärnan. (2) ORN-axoner tar antingen en dorsolateral (grön) eller ventromedial (blå) bana för att kringgå antennloben. (3) ORN-axoner korsar mittlinjen. (4) ORN-axoner innerverar glomeruli i antennloben. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förberedelse av bildkammaren för explantet. (B-B') Rikta in stiften på en tejp och klipp till ~ 2 mm långa med en sax. (C) Fäst mikrostiften på odlingsplattans silikonelastomerskikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dissektionsproceduren för antenn-hjärnexplantet. (B-C) Använd pincett för att skära den yttre bruna nagelbandet för att exponera poppan inuti. (D) Överför puppan till en dissektionsbrunn med syresatt fullt medium. (E-G) Separera försiktigt pupalstammen från huvudet med hjälp av mikroscissorer. (H) Skär bitarna av halvtransparenta nagelband som täcker hjärnans dorsala och ventrala sidor. Håll lite nagelband på hjärnans främre och laterala sidor för att behålla anslutningarna mellan näthinnan, antennerna och hjärnan. (H') Undvik att bryta antennnerven under detta steg. (I) Rengör fettkroppen som täcker hjärnan genom att försiktigt pipettera. (J) Avskilj en eller två antennnerver med hjälp av mikroscissorer i vissa experiment. (K) Placera en droppe syresatt fullt medium på odlingsplattans yta. Överför den dissekerade explanten med en bred spetspipettspets. (L) Använd pincett för att fästa de två optiska loberna i explantet på silikonelastomerskiktet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Time-lapse-avbildning av enstaka ORN-axoninriktning från en explantat. Uppskatta formen på två antennallober genom axonernas krökning och centrera antennloberna i bildfältet. (B) Ställ in bildområdet längs z-axeln. Tänk på att antennloben kommer att skifta uppåt när hjärnan växer och utvecklas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Extrahera enstaka ORN och avslöja deras glomerulära identiteter. (A) En maximal projektionsbild av en explant med 5-10 enkla ORN-axoner med tvåfotonmikroskopi med 20x mål och 3x zooma in. (C) Slå samman bilderna av (B-B'') med varje axon pseudofärgad annorlunda. (D-D') Maximal projektion konfokalbilder tagna med 40x mål och 1,5x zoom. Explant som visas i (A) fixerades följt av färgning med anti-GFP och anti-N-cadherin (neuropilmarkör). Främre och bakre halvor av antennloberna är staplar separat i (D) och (D '). (E) Antennallobskarta visar extraherade ORN-axoner i (B,C). Vissa bilder som visas i denna figur är modifierade från en tidigare studie8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Tvåfotonmikroskopibaserade time-lapse-bilder visar inriktning på två ORN-axoner, före och efter bildregistrering. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila-antenn-hjärnexplantet behåller normal inriktning på luktkretsen. Vi märkte att utvecklingen är 2 gånger långsammare ex vivo jämfört med in vivo. Det noteras att explantsystemet inte behåller maxillär palp, som är värd för sex typer av ORN. För att säkerställa att normal utveckling rekapituleras ex vivo måste sträckning av antennnerverna undvikas under explantdissektion. Under ex vivo-odling orsakar bakterietillväxt vanligtvis stoppad utveckling av luktkretsen. Därför är det viktigt att grundlig sterilisering av odlingsskålen och stiften före avbildning och håller bildrummet rent och isolerat.
Denna explant stöder långsiktig tvåfotonmikroskopibaserad time-lapse-avbildning. I kombination med en nyutvecklad reporter för gles märkning av enstaka ORN möjliggör explantsystemet högupplöst avbildning från en enda axonterminal. Detta system är kraftfullt för att studera de cellbiologiska mekanismerna som ligger till grund för den dynamiska processen för luktkretsmontering8. Även om luktkretsutveckling visades här som ett exempel, kan detta system potentiellt utvidgas till studier av andra kretsar eller andra utvecklingsprocesser i den utvecklande centrala hjärnan.
Explanten upprätthåller normal utveckling i kulturen i minst 24 timmar, vilket kan fånga hela processen med ORN-inriktning. Det gör det möjligt för forskare att avslöja den genetiska identiteten hos enstaka ORN-axoner genom motfärgning med en neuropilmarkör efter fixering, eftersom antennloben redan utvecklar uppenbar glomerulär struktur i slutet av kulturen. Denna strategi kringgår problemet med att sakna specifika genetiska drivrutiner för många ORN-typer i ett tidigt utvecklingsstadium för att uppnå avbildning av specifika typer av ORN med hjälp av en pan-ORN-drivrutin.
För att uppnå högre spatiotemporal upplösning kan detta explantsystem avbildas med mer avancerad mikroskopi, den adaptiva optik-gitterljus-arkmikroskopin (AO-LLSM). Det har visat sig att AO-LLSM möjliggör visualisering av fina strukturer av axonterminaler och skanningsfrekvens vid varje 30 sekund per volym 8,9,10,11. En fördel med explantet är dess kompatibilitet med Janelia Fluorophore dye 12,13,14 märkning genom att inkubera explanten som uttrycker Halo-tag i specifika neuroner med färgämnen i mediet före avbildning. Det märktes att inkubering av explanten med färginnehållande medium resulterar i mycket starkare märkning än att mata larverna med färgämnet. Denna unika fördel gjorde det möjligt för oss att avbilda axoner i ett tidigt utvecklingsstadium som knappast visualiserades av GFP-märkning8.
Förutom time-lapse-avbildning har explantsystemet andra fördelar. Det är till exempel möjligt att skära av antennnerver från den dissekerade explanten ensidigt eller bilateralt vid specifika utvecklingstidpunkter (steg 2.8). Detta gör det möjligt för forskare att undersöka kravet på ORN-axoner vid inriktningen av alla neurontyper i luktkretsen vid distinkta utvecklingssteg. I synnerhet ensidiga antennala nervavskiljande analyser, som inte kan uppnås genom traditionell genetisk manipulation, ledde till en intressant upptäckt att interaktion mellan bilaterala ORN-axoner krävs för korrekt kontralateral inriktning av ORN-axoner8. Dessutom odlas explanten direkt i medium istället för att vara inbäddad i agaros, vilket möjliggör snabb leverans och tvätt ur vissa små molekyler eller läkemedel. Jämfört med genmanipulation har läkemedelsbehandling fördelarna med snabb effekt och reversibilitet av manipulationen. Det gör det möjligt för forskare att bedöma vissa viktiga processer för celler i senare utvecklingsstadier genom att kringgå celldödlighet eller ohälsosamma problem på grund av konstitutiv störning genom genetiska manipulationer. Det hjälper också visualisering av subtila förändringar genom att jämföra före och efter läkemedelsbehandling och efter läkemedelstvätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar N. Özel och R. Hiesinger för deras råd om explantkulturen; M. Wagner för teknisk hjälp av tvåfotonmikroskopin; D.J. Luginbuhl för att generera transgena flugor; D. Friedmann för förslag på Fiji-programvaruanalys; Y. Ge för hjälp med flygarbete; C. McLaughlin och K.K.L. Wong för kommentarer till manuskriptet. L.L. är en Howard Hughes Medical Institute utredare. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag 1K99DC01883001 (till T.L.) och R01-DC005982 (till L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
