Summary
Denne protokol beskriver dissektionsproceduren, kulturtilstanden og levende billeddannelse af et antenne-hjerne-eksplantationssystem til undersøgelse af den olfaktoriske kredsløbssamling.
Abstract
Neuroner er præcist sammenkoblet for at danne kredsløb, der er afgørende for hjernens korrekte funktion. Drosophila olfaktoriske system giver en fremragende model til at undersøge denne proces, da 50 typer olfaktoriske receptorneuroner (ORN'er) fra antennerne og maksillære palper projicerer deres axoner til 50 identificerbare glomeruli i antennelappen og danner synaptiske forbindelser med dendritter fra 50 typer andenordens projektionsneuroner (PN'er). Tidligere undersøgelser fokuserede primært på at identificere vigtige molekyler, der regulerer den præcise målretning i det olfaktoriske kredsløb ved hjælp af faste væv. Her beskrives et antenne-hjerne-eksplantsystem, der rekapitulerer vigtige udviklingsmæssige milepæle for olfaktorisk kredsløbssamling i kultur. Ved at dissekere den eksterne kutikel og rense uigennemsigtige fedtlegemer, der dækker den udviklende puppehjerne, kan billeder af høj kvalitet af enkelte neuroner fra levende hjerner indsamles ved hjælp af to-fotonmikroskopi. Dette muliggør time-lapse-billeddannelse af enkelt ORN-axonmålretning fra levende væv. Denne tilgang vil hjælpe med at afsløre vigtige cellebiologiske sammenhænge og funktioner i tidligere identificerede vigtige gener og identificere mekanismer, der understøtter den dynamiske proces med kredsløbssamling.
Introduction
Neuroner er præcist sammenkoblet for at danne kredsløb, der er afgørende for hjernens korrekte funktion. I over 100 år har neuroforskere forsøgt at forstå, hvordan neuritter strækker sig mod deres mellemliggende og endelige mål med ekstrem præcision. Som et resultat har de identificeret vigtige gener, der koder for vejledningssignaler til udvikling af neuronale processer1. Drosophila olfaktoriske system giver en fremragende model til at undersøge denne proces, da olfaktoriske receptorneuroner (ORN'er, de primære sensoriske neuroner) projicerer til 50 identificerbare glomeruli med stereotyp størrelse, form og relativ position, hvor de danner synaptiske forbindelser med dendritter fra 50 typer andenordens projektionsneuroner (PN'er), som hver især sender dendritter til en af de 50 glomeruli2 (figur 1A ). Derfor er det relativt let at identificere mutante fænotyper ved synaptisk (glomerulær) opløsning i flueolfaktorsystemet. Dette førte til opdagelser af vigtige gener, der regulerer olfaktorisk kredsløbssamling3.
Samlingen af flueolfaktorkredsløbet er afhængig af tidsmæssigt og rumligt koordinerede udviklingsprocesser3. ORN'er og PN'er erhverver forskellige celleskæbner, som opretter programmet for deres ledningssspecifikke forhold. Dernæst dendritterer PN prepattern antenneloben (figur 1B). AXONERNE af ORN'er omgår derefter den ipsilaterale antennelap og krydser hjernens midterlinje for at nå den kontralaterale antennelap. Derefter invaderer ORN axoner både ipsi- og kontralaterale antennelapper og danner synapser med dendritter af deres partner PN'er i specifikke glomeruli. Denne grove model til olfaktorisk kredsløbssamling blev foreslået baseret på karakteriseringen af faste prøver fra mellemliggende tidspunkter under udviklingen. Den dårlige tidsmæssige opløsning og manglende evne til at følge de samme neuronale processer på tværs af udvikling fra fast væv begrænser den mekanistiske forståelse af kredsløbssamlingsprocessen.
Det er teknisk udfordrende at leve billede ORN og PN processer in vivo, da ledningsprocessen sker i første halvdel af puppestadiet, når antennelappen er omgivet af uigennemsigtig fedt krop inde i puppehuset. Det er derfor umuligt at direkte afbilde det udviklende olfaktoriske kredsløb fra intakte pupper. Dissekeret væv dyrket ex vivo kan omgå vævets opacitet og er blevet anvendt med succes til at studere neural udvikling 4,5,6. Udfordringen ved at bruge en lignende ex vivo explant kulturstrategi til at studere neuronale ledninger i puppehjernen er, om den rekapitulerer den præcise neuronmålretning i en kulturtilstand. Baseret på en tidligere rapporteret ex vivo-dyrkningstilstand for flueøje-hjerne-komplekset7 er der for nylig udviklet et eksplanten, der indeholder hele puppehjernen, antennerne og de forbindende antennenerver intakte, som bevarer præcis målretning af det olfaktoriske kredsløb og kan udsættes for to-fotonmikroskopibaseret levende billeddannelse i op til 24 timer ved frekvensen på hver 20 min8 . Her beskrives en detaljeret protokol over eksplantationskulturen og billeddannelsen. Eksplantationssystemet giver en kraftfuld metode til at studere samlingen af olfaktorisk kredsløb og potentielt andre kredsløb i den centrale hjerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser
BEMÆRK: Alle trin i denne protokol udføres ved stuetemperatur (20-25 °C), medmindre andet er forklaret.
- For at forberede kulturskålen til immobilisering af eksplantanten under tidsforløbsbilleddannelse skal du lægge 0,5 cm tyk Sylgard (bland grundigt to flydende komponenter i forholdet 10:1 før brug) på bundfladen af en 60 mm x 15 mm petriskål og lad den hærde i 48 timer ved stuetemperatur (figur 2A, benævnt Sylgard-plade i den følgende tekst).
- For at forberede mikrostifter til immobilisering af eksplantation på denne plade skal du bruge et par tang til at klæbe flere mikrostifter på et bånd med de skarpe ender justeret på den ene side (figur 2B). Brug en saks til at klippe ~2 mm fra de skarpe ender af mikrostifterne (figur 2B'). Brug tang til at holde de afskårne mikrostifter og indsæt i Sylgard-laget på en præfabrikeret Sylgard-plade (figur 2C). To mikrostifter bruges til at immobilisere en eksplant.
- Brug en børste til at samle hvide pupper, der danner puparium inden for 1 time, af hsFLP, pebbled-GAL4 / +; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 genotype og overfør dem til nye hætteglas. Varmechok i 37 °C vandbad i 40 minutter for at fremkalde sparsomme ORN-kloner fra tilfældige typer. Efter varmechok sættes hætteglassene ved 25 °C i 30 timer, hvilket resulterer i pupper i alderen 30 timer efter pupariumdannelse (APF).
- For at forberede dyrkningsmediet til eksplantation tilsættes 5 ml Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) til 500 ml Schneiders Drosophila Medium. Filtrer mediet og lav 45 ml alikvoter i 50 ml koniske rør. Mediet kan opbevares ved 4 °C i 1-2 måneder.
- På billeddannelsesdagen tages et rør på 45 ml Schneiders Drosophila-medium og tilsættes 5 ml føtalt kvægserum (10 % v/v), 125 μL 4 mg/ml human insulinstændeopløsning (10 μg/ml endelig koncentration), 50 μL 1 mg/ml 20-hydroxyecdyson-stamopløsning opløst i ethanol (1 μg/ml endelig koncentration). Bland godt og overfør 15 ml fuldt medium til et nyt 50 ml konisk rør. Resten af det fulde medium kan opbevares ved 4 °C i en uge. Føtal bovin serum, human insulin stamopløsning og 20-hydroxyecdyson stamopløsning aliciteres og opbevares ved -20 °C.
- Oxygener det 15 ml fulde medium ved at pumpe iltbobler fra en iltcylinder under væskeoverfladen gennem en steril 5 ml pipettespids med en hastighed på en boble / s i 20-30 minutter. Brug en paraffinfilm til at dække rørets åbning under denne proces.
- Steriliser dissektionsbrøndens overflade og Sylgard-pladen (med mikrostifter indsat på Sylgard-laget, fremstillet i trin A1 og A2) med 70% ethanol. Lad dem tørre inden brug.
2. Udsmid dissektion
- Brug en børste til at overføre 30 timers APF (30 timer efter pupariumdannelse) pupper til et papirvæv og tør puppens ydre overflade i 5 minutter.
- Sæt et stykke dobbeltsidet tape på et glasglas. Fastgør forsigtigt de tørrede pupper på båndets klæbrige overflade med den dorsale side opad. Tryk forsigtigt på pupperne med en børste for at hjælpe den ventrale side af pupperne med at fastgøre godt til båndet (figur 3A). Beskadiger ikke puppen.
- Brug et par tang til at fjerne brun puppekasse, der dækker den dorsale side af hovedet (figur 3A,B). Indsæt en skarp spids af tangen mellem den brune puppekasse og puppen fra sidesiden og bryd forsigtigt den brune puppekasse gennem en linje til den bageste ende af puppen (figur 3B,C). Åbn den brune puppekasse. Brug et par tang til forsigtigt at holde puppen og overfør til dissektionen godt med 1 ml iltet fuldt medium. Nedsænk flydende puppe på den mellemstore overflade for at hjælpe den med at synke til bunden af brønden (figur 3D).
BEMÆRK: Indsæt ikke tangspidsen for dybt inde i den brune puppekasse for at forhindre at skade puppen med tangen. - For at dissekere antenne-hjerne-eksplanten fra puppen skal du bruge tang til forsigtigt at holde puppen med den ene hånd og bruge et par mikrosakser til at skære et lille hul fra den bageste side af puppen med den anden hånd (figur 3E). Dette lille hul frigiver det høje tryk inde i puppen.
- Skær gennem puppens ventrale midterlinje fra hullet til halsen (den smalle struktur, der forbinder hovedet og brystkassen) med mikroaksen (figur 3F). Skær derefter gennem halsens omkreds for at løsne hovedet fra puppens krop (figur 3G). Fjern kroppen og læg den i en anden brønd.
BEMÆRK: Skær ikke halsen direkte fra den dorsale / ventrale side af puppen, som kan klemme hjernen. - Skær den gennemsigtige neglebånd, der dækker den dorsale side af hjernen (figur 3H). Dette vil udsætte den fede krop oven på hjernen. Opbevar noget neglebånd, som nethinden og antennerne fastgøres til. Gentag den samme procedure til den ventrale side af hjernen.
BEMÆRK: Indsæt ikke saksens blad for dybt under neglebåndet, da dette vil medføre afskæring af antennenerverne, der forbinder antennerne og hjernen (figur 3H'). - Brug en P10-pipette til forsigtigt at vaske den fede krop, der dækker hjernen og antennerne, ved at pipettere mediet mod de åbne områder på hovedets dorsale og ventrale sider (figur 3I).
BEMÆRK: Vær meget forsigtig, når du pipetterer mediet, da hjernen let kan løsnes fra neglebåndet. Sørg for, at al fed krop fjernes i løbet af dette trin. Standset udvikling af ORN axoner blev observeret, når fedt krop ikke blev rengjort godt, sandsynligvis på grund af dårlig iltadgang fra mediet. - For at studere interaktionen mellem bilaterale ORN-axoner eller ORN-axoner til PN-dendritmålretning skal du afskære en eller to antennenerver med mikroaksen i løbet af dette trin8 (figur 3J). Placer forsigtigt saksens knive mellem neglebåndet og hjernen og afskær interesserede antennenerver.
- For at overføre den dissekerede eksplant til Sylgard-pladen skal du placere en dråbe iltet fuldt medium (~ 200 μL) på Sylgard-overfladen. Belæg den indre overflade af en 200 μL bred spids pipettespids med fedtlegemet fra den dissekerede bagagerum (trin 1.6) ved at pipettere fedtlegemet flere gange, hvilket forhindrer eksplanterne i at klæbe pipettespidsen under overførslen. Brug derefter denne brede spidspipettespids til at overføre eksplanten fra dissektionsbrønden til mediumdråben på kulturpladen (figur 3K).
- Brug tang til at fastgøre eksplantationen på Sylgard-laget i de to optiske lobes (figur 3L). Placer forsigtigt Sylgard-pladen på billedbehandlingsstationen, og immobiliser pladen med bånd. Tilsæt langsomt 10 ml iltet fuldt medium til Sylgard-pladen ved hjælp af P1000-pipette.
BEMÆRK: Undgå at forstyrre eksplantationen, når du tilføjer mediet til Sylgard-pladen.
3. To-fotonmikroskopi-baseret levende billeddannelse
- For at udføre time-lapse-billeddannelse skal du bruge et to-fotonmikroskop, en Ti: Sapphire-laser, et 20x vandnedsænkningsmål (1,0 NA) og en billedbehandlingssoftware. Brug excitationsbølgelængden ved 920 nm til billeddannelse af GFP-proteiner. Juster pixelopgangstiden til 10 μs.
- Juster billedbehandlingsstationens position, så eksplantatorerne er nogenlunde under målet. Brug 70% ethanol til at sterilisere linsen før billeddannelse. Sænk langsomt målet under mediet tæt på eksplanterne. Kontroller, om der er nogen boble på objektivets linse.
- I så fald skal du løfte målet over mediet og gentage dette, indtil boblen er væk. Find eksplanterne ved hjælp af okularet og centrer en eksplant i marken.
- For at sikre en eksplantation med et par ORN'er, der er sparsomt mærket til tidsforløbsbilleddannelse, skal du dissekere ~ 10 eksplantationer hver gang og justere på y-aksen på kulturpladen. Skærm alle eksplantationer ved at flytte målet langs y-aksen og vælg en eksplant, hvor et par enkelte ORN-axoner netop har nået antennelappen til billeddannelse (figur 4A).
- Genkend antennelappen ved sin ovale form og ORN-axonerne, der begynder at omgå den. Forestil dig et ~150 μm x 150 μm område i xy-planet (3x zoom med 20x målet). Anslå grænsen for de to antennelober og centrer dem i billeddannelsesområdet.
- Vælg et indledende billedområde langs z-aksen ved at definere den nederste sektion og den øverste del af scanningen. Konfigurer billedbehandlingsområdet langs z-aksen. Indstil den dybeste sektion med ORN-axonsignaler som den første billedbehandlingssession og sessionen 100 μm over (mere overfladisk side) som den sidste billedbehandlingssession (figur 4B).
BEMÆRK: Dette efterlader nogle sektioner ovenpå (overfladisk side) af ORN-axonerne og undgår forskydning af ORN-axoner opad uden for billeddannelsesområdet på grund af hjernens vækst under dyrkning.- Billede med 2 μm intervaller. Indstil automatisk billedscanning med frekvensen på hvert 20. minut ved hjælp af billedbehandlingssoftware.
- Skift billeddannelsesområdet 20 μm opad langs z-aksen efter den første 4 timers billeddannelse og yderligere 20 μm opad langs z-aksen efter 16 timers billeddannelse. Dette kan opnås ved at indstille et script og forskellige z-stakke i billedbehandlingssoftwaren.
- Kultur eksplanteringen i en yderligere periode efter billeddannelse (op til 24 timer ex vivo) før fiksering og farvning med N-cadherin, en neuropilmarkør, for at afsløre den genetiske identitet af hver enkelt ORN ved den glomerulus, den er målrettet mod.
4. Billedbehandling
- For at behandle z stack-billeder fra sektionsserier taget på hvert tidspunkt ved hjælp af Fiji-softwaren skal du åbne billedsektionsserien, klikke på Billede | Stakke | Z-projekt [/].
- For at korrigere lateral drift af prøven under kultur skal du installere TurboReg Plugin i Fiji.
- Åbn en z stack billedserie og et enkelt z stack billede fra serien. Åbn Plugins | | TurboReg.
- Vælg z stack-billedserien i Kilde og det enkelte z-stakbillede i Target | Oversættelse. Klik på knappen Batch for at registrere alle billederne fra den åbnede z stack-billedserie.
- For at maksimere nytten af afbildede prøver skal du adskille sparsomt mærkede enkeltakseoner i nærheden af hinanden fra z-stakbillederne efter 3D-billedsektioner.
- For at udtrække enkelte ORN-axoner fra et par axoner i det samme billede skal du åbne billedsektionsserien, klikke på Plugins | | segmentering Segmentering Editor [/]. Vælg penselværktøjet, og masker interesseret ORN-axon i arbejdsvinduet Segmenteringseditor ved hjælp af knapperne Vælg "+" eller "-" i hvert billedafsnit.
- Klik på Proces | Billedberegner [/]. Vælg "Billede X" i Billede 1, "Multiplicer" i Drift, "Billede X. etiketter" i Billede 2, [/]. Dette genererer kun en ny billedseriefil med den interesserede axon. Udfør trin 4.1 for at behandle z-stakbilledet. Gentag dette trin for alle tidspunkter for at generere en tidsseriebilledfil.
- Hvis du vil pseudofarve forskellige axoner fra det samme billede, skal du først udføre trin 4.3 for at generere tidsseriebilledfilen for hver axon separat. Åbn tidsseriebilledfilerne for forskellige enkelte axoner fra det samme rå databillede. Klik på | Farve | Flet kanaler. Vælg forskellige billedfiler i tidsserier i forskellige farvekanaler, og klik på OK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ORN axoner ankommer til antennelappen mellem 18 timer og 36 timer APF. De navigerer derefter i antennelappen, krydser midterlinjen og inderverer glomeruli. Video 1 er en repræsentativ video, der viser hele processen for flere individuelt identificerbare axoner, taget med en frekvens på hvert 20. minut i 24 timer. Før registrering ved hjælp af TurboReg udviser axonerne en vis lateral drifting, når hjernen udvikler sig (første halvdel af videoen). Efter registrering korrigeres drifting (anden halvdel af videoen).
For at adskille et par ORN-axoner fra den samme eksplant er et eksempel vist i figur 5. Efter fremgangsmåden i trin 4.3 blev VA1d- og VA1v-axoner fra eksplantationer vist i figur 5A ekstraheret for at generere et nyt z-stakbillede med kun disse to axoner (figur 5B). Tilsvarende blev VM2- og VM3-axoner (figur 5B' og DL2-axon (figur 5B'') ekstraheret. Figur 5C viser en sammensmeltning af billeder i figur 5B-B'' med pseudofarver. De genetiske identiteter af hver ORN axon blev afsløret ved immunstaining af en neuropil markør N-cadherin af den faste eksplant (figur 5D,E).
Figur 1: Struktur af flue olfaktorisk kredsløb. (A) Et voksent fluehoved vises med en ORN fra højre antenne (grøn), der sender sin axon til begge antennelober (AL'er) i hjernen og danner synaptisk forbindelse i en specifik glomerulus med dendritter af PN'er (rød) i de ipsilaterale og kontralaterale AL'er. Stiplet lodret linje angiver midterlinjen i dette og efterfølgende diagrammer og billeder. (B) Diagram, der viser udviklingen af det olfaktoriske kredsløb. (1) PN dendritterer først et område i antennelappen (rød). ORN axoner når antennelapperne i hjernen. (2) ORN-axoner tager enten en dorsolateral (grøn) eller ventroedial (blå) bane for at omgå antennelappen. (3) ORN-axoner krydser midterlinjen. (4) ORN axoner inderverer glomeruli i antennelappen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forberedelse af billedkammeret til eksplantanten. (A) Læg et lag silikoneelastomer (~ 0,5 cm) i bunden af en 60 mm petriskål. (B-B«). Juster stifter på et bånd og skær til ~ 2 mm lange ved hjælp af en saks. (C) Fastgør mikrostifterne på silikoneelastomerlaget på dyrkningspladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dissektionsproceduren for antenne-hjerne-eksplantationen. (A) Fastgør den ventrale side af en papirvævstørret puppe på et dobbeltsidet tape på et glasglas. (B-C) Brug tang til at skære den ydre brune neglebånd for at udsætte puppen indeni. (D) Overfør puppen til en dissektionsbrønde med iltet fuldt medium. (E-G) Adskil forsigtigt puppestammen fra hovedet ved hjælp af mikrosaks. (H) Skær stykkerne af halvgennemsigtigt neglebånd, der dækker de dorsale og ventrale sider af hjernen. Hold nogle neglebånd på de forreste og laterale sider af hjernen for at bevare forbindelserne mellem nethinden, antennerne og hjernen. (H') Undgå at skære antennenerven over i løbet af dette trin. (I) Rengør den fede krop, der dækker hjernen, ved forsigtigt pipettering. (J) Afse en eller to antennenerve(r) ved hjælp af mikrosaks i visse forsøg. (K) Anbring en dråbe iltet fuldt medium på overfladen af dyrkningspladen. Overfør det dissekerede eksplant ved hjælp af en bred spids pipettespids. (L) Brug tang til at fastgøre de to optiske lobes af eksplanten på silikoneelastomerlaget. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Time-lapse-billeddannelse af enkelt ORN-axonmålretning fra en eksplantant. (A) Vælg en eksplantant med et par ORN-axoner, der lige når antennelappen. Anslå formen af to antennelober ved axonernes krumning og centrer antennelobberne i billeddannelsesfeltet. (B) Indstil billedområdet langs z-aksen. Overvej at antennelappen vil skifte opad, når hjernen vokser og udvikler sig. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Uddrag enkelte ORN'er og afslør deres glomerulære identiteter. (A) Et maksimalt projektionsbillede af en eksplantat med 5-10 enkelte ORN-axoner ved hjælp af tofotonmikroskopi med 20x objektiv og 3x zoom ind. (B-B'') 1-2 enkelte axoner ekstraheres fra (A) ved manuelt at oprette masker i billedsektioner fra de rå billeddata. (C) Flet billederne af (B-B'') med hver axon pseudofarvet forskelligt. (D-D') Maksimal projektionskonfokale billeder taget med 40x mål og 1,5x zoom. Eksplantation vist i (A) blev fikseret efterfulgt af farvning med anti-GFP og anti-N-cadherin (neuropilmarkør). Anterior og posterior halvdele af antennelapperne er stakke separat i (D) og (D'). (E) Antennelapkortet viser ekstraherede ORN-axoner i (B,C). Nogle af billederne vist i denne figur er modificeret fra en tidligere undersøgelse8. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: To-fotonmikroskopibaserede time-lapse-billeder viser målretning af to ORN-axoner før og efter billedregistrering. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila antenne-hjerne eksplantanten bevarer normal målretning af det olfaktoriske kredsløb. Vi bemærkede, at udviklingen er 2 gange langsommere ex vivo sammenlignet med in vivo. Det bemærkes, at eksplantationssystemet ikke bevarer maksillær palp, som er vært for seks typer ORN'er. For at sikre, at normal udvikling rekapituleres ex vivo, skal strækning af antennenerverne undgås under eksplantationsdissektion. Under ex vivo-kulturen forårsager bakterievækst normalt standset udvikling af det olfaktoriske kredsløb. Derfor er det vigtigt med en grundig sterilisering af kulturskålen og stifterne inden billeddannelse og opbevaring af billedbehandlingsrummet rent og isoleret.
Denne eksplantat understøtter langsigtet to-fotonmikroskopibaseret time-lapse-billeddannelse. Kombineret med en nyudviklet reporter til sparsom mærkning af enkelte ORN'er muliggør eksplantationssystemet billedbehandling i høj opløsning fra enkelt axon-endestation. Dette system er kraftfuldt til at studere de cellebiologiske mekanismer, der understøtter den dynamiske proces med olfaktorisk kredsløbssamling8. Selvom olfaktorisk kredsløbsudvikling blev vist her som et eksempel, kan dette system potentielt udvides til studier af andre kredsløb eller andre udviklingsprocesser i den udviklende centrale hjerne.
Eksplanten opretholder normal udvikling i kultur i mindst 24 timer, hvilket kan fange hele processen med ORN-målretning. Det gør det muligt for forskere at afsløre den genetiske identitet af enkelte ORN-axoner gennem modfarvning med en neuropilmarkør efter fiksering, da antennelappen allerede udvikler åbenlys glomerulær struktur ved slutningen af kulturen. Denne strategi omgår problemet med at mangle specifikke genetiske drivkræfter for mange ORN-typer på et tidligt udviklingsstadium for at opnå billeddannelse af specifikke typer ORN'er ved hjælp af en pan-ORN-driver.
For at opnå højere spatiotemporal opløsning kan dette eksplantatsystem afbildes ved hjælp af mere avanceret mikroskopi, den adaptive optik-gitter lysarkmikroskopi (AO-LLSM). Det har vist sig, at AO-LLSM muliggør visualisering af fine strukturer af axonterminaler og scanningsfrekvens ved hvert 30. sekund pr. Volumen 8,9,10,11. En fordel ved eksplanten er dens kompatibilitet med Janelia Fluorophore farvestof 12,13,14 mærkning ved at inkubere eksplantationen, der udtrykker Halo-tag i specifikke neuroner med farvestoffer i mediet før billeddannelse. Det blev bemærket, at inkubation af eksplantationen med farvestofholdigt medium resulterer i meget stærkere mærkning end fodring af larverne med farvestoffet. Denne unikke fordel gjorde det muligt for os at afbilde axoner på et tidligt udviklingsstadium, der næppe blev visualiseret af GFP-mærkning8.
Ud over time-lapse-billeddannelse har eksplantationssystemet andre fordele. For eksempel er det muligt at adskille antennenerver fra det dissekerede eksplantation ensidigt eller bilateralt på bestemte udviklingstidspunkter (trin 2.8). Dette gør det muligt for forskere at undersøge kravet om ORN-axoner i målretningen af neurontyper i det olfaktoriske kredsløb ved forskellige udviklingstrin. Især ensidige antennenerveafskæringsassays, som ikke kan opnås ved traditionel genetisk manipulation, førte til en interessant opdagelse af, at interaktion mellem bilaterale ORN-axoner er nødvendig for korrekt kontralateral målretning af ORN-axoner8. Desuden dyrkes eksplantationen direkte i medium i stedet for at være indlejret i agarose, hvilket muliggør hurtig levering og udvaskning af nogle små molekyler eller lægemidler. Sammenlignet med genetisk manipulation har lægemiddelbehandling fordelene ved hurtig effekt og reversibilitet af manipulationen. Det gør det muligt for forskere at vurdere nogle væsentlige processer for celler på senere udviklingsstadier ved at omgå celledødelighed eller usunde problemer på grund af konstitutiv forstyrrelse gennem genetiske manipulationer. Det hjælper også visualisering af subtile ændringer ved at sammenligne før og efter lægemiddelbehandling og efter lægemiddeludvaskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker N. Özel og R. Hiesinger for deres råd om eksplantkulturen; M. Wagner til teknisk hjælp fra to-fotonmikroskopien; D.J. Luginbuhl til generering af transgene fluer; D. Friedmann for forslag til Fiji-softwareanalyse; Y. Ge for assistance på flyvearbejde; C. McLaughlin og K.K.L. Wong for kommentarer til manuskriptet. L.L. er en Howard Hughes Medical Institute efterforsker. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud 1K99DC01883001 (til T.L.) og R01-DC005982 (til L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
