Summary
En robust protokoll er presentert her for å isolere nevromelaningranuler fra humant post mortem substantia nigra pars compacta-vev via lasermikrodisseksjon. Denne reviderte og optimaliserte protokollen minimerer massivt den nødvendige tiden for prøveinnsamling, reduserer den nødvendige prøvemengden og forbedrer identifiseringen og kvantifiseringen av proteiner ved LC-MS / MS-analyse.
Abstract
Neuromelanin er et svartbrunt pigment, tilstede i såkalte neuromelaningranuler (NMG) i dopaminerge nevroner av substantia nigra pars compacta. Foruten neuromelanin inneholder NMG en rekke proteiner, lipider og metaller. Selv om NMG-holdige dopaminerge nevroner fortrinnsvis går tapt i nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom og demens med Lewy-legemer, er det lite kjent om mekanismen for NMG-dannelse og NMGs rolle i helse og sykdom. Dermed er videre forskning på molekylær karakterisering av NMG avgjørende. Dessverre er standardprotokoller for isolering av proteiner basert på tetthetsgradient ultracentrifugering og krever derfor høye mengder humant vev. Dermed etableres en automatisert lasermikrodisseksjon (LMD) -basert protokoll her som tillater innsamling av NMG og omkringliggende substantia nigra (SN) vev ved hjelp av minimale mengder vev på en objektiv, automatisert måte. Utskårne prøver analyseres deretter ved massespektrometri for å dechiffrere deres proteomiske sammensetning. Med denne arbeidsflyten ble 2079 proteiner identifisert, hvorav 514 proteiner utelukkende ble identifisert i NMG og 181 i SN. De nåværende resultatene er sammenlignet med en tidligere studie som bruker en lignende LMD-basert tilnærming som nådde en overlapping på 87,6% for begge proteomene, og verifiserte anvendeligheten av den reviderte og optimaliserte protokollen som presenteres her. For å validere nåværende funn ble proteiner av interesse analysert ved målrettet massespektrometri, for eksempel parallell reaksjonsovervåking (PRM) -eksperimenter.
Introduction
Hvert vev består av en heterogen blanding av forskjellige celletyper, men den spesifikke isolasjonen av en celletype er ofte uunnværlig for en mer presis karakterisering. Lasermikrodisseksjon (LMD), som kobler et mikroskop med en laserapplikasjon, er et kraftig verktøy for spesifikk isolering av vevsområder, enkeltceller eller cellulære understrukturer ut av en kompleks kompositt. Anvendelsen av LMD i kombinasjon med massespektrometri (LMD-MS) har allerede blitt implementert for flere forskningsspørsmål, inkludert isolering av DNA1, RNA2 og proteiner 3,4,5. I denne protokollen er en revidert og optimalisert LMD-MS-protokoll beskrevet for proteomisk analyse av humant post mortem hjernevev og subcellulære komponenter for å dechiffrere nye patomekanikker av Parkinsons sykdom.
Neuromelanin er et svart, nesten uoppløselig pigment som finnes i katekolaminerge, dopaminproduserende nevroner av substantia nigra pars compacta6. Sammen med proteiner og lipider akkumuleres det i organellelignende granulater omgitt av en dobbel membran, kalt neuromelaningranuler (NMG)7,8,9. NMG kan observeres fra en alder av tre år hos mennesker som øker i mengde og tetthet under aldringsprosessen10,11. Til dags dato er det ingen bestemt hypotese om nevromelanindannelse, men en antagelse er at nevromelanin dannes ved oksidasjon av dopamin12. Andre hypoteser er basert på enzymatisk produksjon av nevromelanin (f.eks. tyrosinase)13. Neuromelanin i seg selv ble funnet å ha en høy bindingsaffinitet til lipider, toksiner, metallioner og plantevernmidler. Basert på disse funnene antas dannelsen av NMG å beskytte cellen mot akkumulering av giftige og oksidative stoffer og fra miljøgifter14,15. Foruten denne nevrobeskyttende funksjonen er det bevis på at nevromelanin kan forårsake nevrodegenerative effekter, for eksempel ved jernmetning og påfølgende katalyse av frie radikaler16,17. Videre kan nevromelanin frigjort under nevrodegenerative prosesser dekomponeres av hydrogenperoksid, noe som kan akselerere nekrose av reaktive metaller og andre giftige forbindelser som tidligere var bundet til nevromelanin og kan bidra til nevroinflammasjon og cellulær skade18. Men til nå er den nøyaktige rollen til NMG i nevrodegenerative prosesser som i løpet av Parkinsons sykdom ikke klart forstått. Likevel synes NMG å være involvert i patogenesen av Parkinsons sykdom, og deres spesifikke analyse er av største betydning for å løse sin rolle i nevrodegenerasjon. Dessverre mangler vanlige forsøksdyr (f.eks. mus og rotter) og cellelinjer NMG19. Derfor er forskere spesielt avhengige av post-mortem hjernevev for deres analyse. Tidligere var NMG-isolasjon ved tetthetsgradientsentrifugering avhengig av tilgjengeligheten av høye mengder substantia nigra-vev 20,21. I dag presenterer LMD et allsidig verktøy for å spesifikt isolere NMG-er fra menneskelige hjerneprøver for deretter å analysere dem ved LC-MS / MS.
I denne protokollen presenteres en forbedret og automatisert versjon av en tidligere protokoll22 for isolering av NMG og omkringliggende vev (SN), noe som muliggjør en raskere prøvegenerering, høyere antall identifiserte og kvantifiserte proteiner og en alvorlig reduksjon av nødvendige vevsmengder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av menneskelig hjernevev ble godkjent av etikkkomiteen ved Ruhr-Universitetet Bochum, Tyskland (filnummer 4760-13), i henhold til tyske forskrifter og retningslinjer. Denne protokollen har blitt brukt på kommersielt oppnådde substantia nigra pars compacta vevsskiver. En grafisk oversikt over den presenterte protokollen er vist i figur 1.
1. Vevsseksjonering
- Forkjøl kryostatkammeret.
MERK: Hvert vev krever forskjellige kryostattemperaturer, som du finner i den respektive leverandørprotokollen. - Rengjør kniven i rustfritt stål med 70% etanol og installer den i bladholderen.
- Overfør vevet fra -80 °C fryseren til kryostat ved hjelp av en isboks og la det justeres til kryostatkammertemperaturen i 15 minutter.
- Utvetydig merke membran lysbilder ved hjelp av en blyant.
MERK: PET/PEN-membranlysbilder kreves for den LMD-baserte prøvesamlingen. Håndter PET/PEN membranskliene med forsiktighet, da de er ekstremt skjøre. - Påfør en dråpe kommersielt frosset seksjonsmedium på vevsholderen. Før det er helt frosset, plasser vevet på det frosne seksjonsmediet og la det herdes, slik at vevet er forbundet med vevsholderen.
- Monter vevsholderen i kryostatkammeret og juster retningen før du begynner å seksjonere. Optimal holderorientering avhenger av vevets orientering.
MERK: Det kan være nødvendig å trimme vevet til seksjonsplanet som trengs for skivene er nådd. - Før vevsområdet av interesse er nådd, juster skjæreinnstillingen til ønsket vevtykkelse.
MERK: 5 eller 10 μm er den foreslåtte tykkelsen for denne protokollen, da 20 μm tykke seksjoner ble funnet å være uforenlige med den LMD-baserte prøvesamlingen22. - Klipp to seksjoner og kast dem.
- Legg ned Anti-roll Plate.
- Klipp en del av vevet, åpne Anti-roll Plate forsiktig, ta en membran lysbilde, og hindre vev folding mens du plasserer vev delen på membranen lysbildet.
MERK: Oppbevaring av membranglassene ved romtemperatur før vedheft muliggjør nøyaktig prøvefesting. Flere seksjoner kan plasseres på samme membranglid, men overlappende vev må forhindres. - Oppbevar vevsseksjoner plassert på membranglass i kryostaten til seksjonering er fullført.
- Oppbevar det kryosekterte vevet ved -20 °C til videre behandling, eller fortsett direkte med prosedyren nedenfor. Oppbevar de snittede vevsglassene ved -80 °C til videre bruk.
2. Laser mikrodisseksjon og trykkkatapulting
MERK: Siden nevromelaningranulater er synlige uten flekker på grunn av deres svartbrune farge, er det ikke nødvendig med farging for denne protokollen. Likevel kan forskjellige fargeprosedyrer kombineres med denne protokollen om nødvendig. Husk at bruk av blokkerende løsninger eller antistoffer vil påvirke LC-MS/MS-analysene.
- Slå på MicroBeam-systemet og åpne tilhørende programvare på datamaskinen (se Materialtabell).
- Plasser vevsmembranen i slideholderen på RoboStage med vevet vendt oppover.
MERK: Avhengig av LMD-enheten kan det være nødvendig å plassere membranglidningen slik at vevet vender nedover. Generelt utføres prøvetaking i et temperaturkontrollert miljø for å sikre optimale og reproduserbare forhold. - Sett mikroskopet til ønsket forstørrelse (50 ganger brukes her) for oversiktsskanningene.
- Bruk skannefunksjonen, som du finner i Navigator-vinduet i programvaregrensesnittet, for å få en oversiktsskanning av vevsseksjonen. Søk etter øverste venstre hjørne og nederst til høyre i interesseområdet, og velg dem i programvaregrensesnittet. Velg deretter Skann alle avkastninger for å utføre skanningene.
MERK: Oversiktsskanninger er ikke obligatoriske, men de gir bedre orientering i lysbildet og kan lagres for senere bruk. - Juster forstørrelsen av mikroskopet for riktig vev, som er 400 ganger i det foreliggende tilfellet av neuromelaningranuler.
- Søk etter et område med neuromelaningranulat. Velg Field of View Analysis i programvaregrensesnittet, velg Inverter resultat, og angi terskelen for RGB-kanalene slik at bare nevromelaningranulat utheves i rødt i forhåndsvisningsvinduet. Klikk på OK for å bruke de justerte innstillingene for synsfeltet.
MERK: Det kan forekomme at mindre objekter med mørk farge også blir valgt. For å ta hensyn til det, kast alle gjenstander som dekker et område mindre enn 100 μm2 før du isolerer neuromelaningranulater. For å gjøre dette, åpne elementlisten ved å klikke på ikonet i verktøylinjen, velg lysbildet under vurdering og sorter elementer etter område. Velg de med områder mindre enn 100 μm2 og slett dem. - Juster laserinnstillingene ved hjelp av et område av lysbildet som bare dekkes av membranen.
MERK: Det anbefales å bruke Cut Laser Adjustment Wizard og følge instruksjonene i programvaren. Nødvendige laserinnstillinger kan variere mellom forskjellige lysbilder. For 5 μm seksjoner med 400 ganger forstørrelse er typiske innstillinger 32 energi og 51 fokus for skjæring, og 28 energi og -1 fokus for laserpulskatapulting (LPC). - Juster hastighetsinnstillingene for posisjonering og skjæring for å sikre riktig isolasjon.
MERK: 30% hastighet ble funnet å være optimal for NMG-isolasjon. - Fyll prøveoppsamlingsrørhetten med 50 μL ultrarent vann og sett hetten inn i samleren til RoboMover.
MERK: Rørsamleren som brukes til nåværende eksperimenter, kan bære ett prøveoppsamlingsrør om gangen. - Plasser RoboMover over RoboStage II ved hjelp av programvaregrensesnittet for å starte prøveinnsamlingen.
MERK: For å gjøre dette, åpne RoboMover-vinduet, som viser samleren. Klikk på prøveoppsamlingsrørhetten som vises i RoboMover-vinduet for å flytte hetten til arbeidsområdet. Juster optimal bevegelses- og arbeidshøyde i RoboMover-vinduet. Ellers kan vannet i hetten falle ned på lysbildet, eller de katapulterte gjenstandene når ikke hetten. - Start laseren. Kontroller energi- og fokusinnstillingene under laserprosessen og juster innstillingene om nødvendig. Sørg for riktig isolering og katapultering av de isolerte gjenstandene i prøveoppsamlingsrørhetten for minst de ti første gjenstandene.
MERK: Riktig isolasjon og katapultering må kontrolleres visuelt. Begge deler skal resultere i et vevfritt område av størrelsen på det forhåndsvalgte objektet i vevsskiven (se figur 2C,D). Juster laserinnstillingene hvis objektet forblir festet til vevsskiven etter kutting og katapultering. For katapultering er CenterRoboLPC-alternativet funnet å være godt egnet for NMG-isolasjon. Katapultinnstillingene kan justeres for hvert valgte objekt i elementlisten. - Når prøvetakingen er fullført, naviger RoboMover til startposisjonen. Fjern prøveoppsamlingsrøret.
MERK: Når antallet innsamlede gjenstander er ganske lavt og gjenstandene er store nok, kan prøvetakingen sikres ved å klikke på Cap Check, som vil plassere prøveoppsamlingsrørhetten under mikroskopet slik at antall gjenstander inne i vannet i hetten kan telles (se figur 2H). - Spinn ned prøven ved hjelp av en sentrifuge. Korte spinn på 5 s med økende sentrifugalkraft på grunn av akselerasjon av sentrifugen ble funnet å være tilstrekkelig. På dette tidspunktet lagrer du prøver ved -80 ° C, da alle prøver skal behandles videre.
MERK: For sammenligning av den proteomiske profilen ble vevet rundt NMG-ene også isolert etter eksisjonen. Isoleringen av det omkringliggende vevet ble utført ved 50 ganger forstørrelse. - Tørk prøvene i en vakuumkonsentrator. 1,5 timer ble funnet å være tilstrekkelig for 50 μL vann.
- Løselig og lyse vevet i 40 μL maursyre i 20 minutter (romtemperatur).
- Forbedre vevslysis ved sonikering ved 45 kHz (kilohertz) i 5 minutter i et sonikeringsbad. Fyll sonikeringsbadet med is for å forhindre at rørene smelter. Oppbevar prøvene ved -80 °C inntil videre bearbeiding.
3. Tryptisk fordøyelse
- Avfrys prøver på is.
- Tørk prøvene helt i en vakuumkonsentrator.
- Fyll opp prøven med 50 μL av en egnet fordøyelsesbuffer, for eksempel 50 mM ammoniumbikarbonat.
- Etter tilsetning av 1,25 μL på 200 mM 1,4-dithiothreitol, inkuber prøvene i 30 minutter ved 60 ° C og 300 o / min ved hjelp av en termomikser og avkjøl dem til romtemperatur (RT) etterpå.
- Deretter inkuberer prøver ved RT i 30 minutter i mørket etter tilsetning av 1,36 μL 0,55 M iodoacetamid.
- Tilsett en passende mengde trypsin til prøvene og inkuber prøvene over natten (~ 16 timer) ved 37 ° C.
MERK: For 1 000 000 μm2 ble 0,1 μg trypsin funnet å være tilstrekkelig. - Tilsett 2,6 μL 10% trifluoreddiksyre (TFA) til prøvene for å stoppe fordøyelsen (sluttkonsentrasjon på 0,5% TFA).
- Tørk prøvene helt med en vakuumkonsentrator. Fyll deretter prøver opp til et definert endelig volum med 0.1% TFA. NMG-prøver ble fylt opp til 20 μL hvorav 5 μL ble brukt til ett massespektrometrisk (MS) eksperiment.
- Oppbevar prøvene ved -80 °C inntil videre bruk. Bestem peptidkonsentrasjon ved aminosyreanalyse eller en annen egnet kvantifiseringsmetode (f.eks. Direkte detektering).
MERK: Lave prøvemengder kan ikke kvantifiserbare ved hjelp av de nevnte teknikkene. For å sikre identisk prøvebelastning bør hver prøve inneholde samme mengde isolert vev, og hver prøve bør behandles likt.
4. Høyytelses væskekromatografi og massespektrometri
MERK: Følgende høyytelses væskekromatografi (HPLC) massespektrometrisk (MS) analyse er optimalisert for det spesifikke LC-systemet med en fangstkolonneanordning og massespektrometer som brukes her (se Materialtabell). For andre LC- og MS-systemer anbefales tilpasning av parametere.
- Bruk programvaren Xcalibur til å justere HPLC-innstillingene som følger.
- Trap-kolonne: Sett temperaturen til 60 °C, strømningshastighet til 30 μL/min, løpende buffer til 0,1 % trifluoreddiksyre.
- Analytisk C18 omvendt fasekolonne: Still temperaturen til 60 °C, strømningshastigheten til 30 μL / min, løpende buffer A til 0,1% trifluoreddiksyre, løpende buffer B til 84% acetonitril og gradient til 5% -30% løpende buffer B over 98 min.
MERK: Tilpasning av gradienten kan være uunngåelig og anbefales sterkt når du bruker forskjellige vev eller celler. Total gradienttid kan variere på grunn av prøveinnlasting i begynnelsen av gradienten og prøvevask på slutten av gradienten. Den totale gradienten i denne protokollen består av 7 min prøvelasting og ekstra kolonnevask i 15 minutter, noe som resulterer i en total gradienttid på 120 min.
- Opprett en dataavhengig anskaffelsesmetode (DDA) ved hjelp av XCalibur Instrument Setup, som du finner i veikartet for HPLC-programvaren.
- I kategorien Globale parametere definerer du infusjonsmodusen Væskekromatografi, Forventet maksimal LC-toppbredde (30 s) og Standard ladetilstand (2).
- Fortsett til kategorien Skanneparametere og legg til følgende skanninger og filtre i den rekkefølgen som er nevnt: MS OT, MIPS, Intensitet, Ladetilstand, Dynamisk ekskludering og ddMS2 OT HCD.
MERK: De detaljerte parameterinnstillingene for hver skanning og hvert filter finner du i tilleggstabell 1. Optimale MS- og DDA-innstillinger kan variere for det spesifikke massespektrometeret som brukes, så vel som prøvetypen, og bør derfor tilpasses. - Klargjør prøver ved å oppløse 200-400 ng prøvepeptider i et definert volum på 0,1% TFA i inerte massespektrometriske glassflaskeinnløp. Hvis konsentrasjonsbestemmelse ikke er aktuelt på grunn av lav prøvemengde, må du kontrollere identisk prøvebelastning ved å sammenligne total ionstrøm (TIC).
MERK: For å gjøre dette, åpne den resulterende filen med massespektrometrisk måling i en egnet programvare, for eksempel FreeStyle, og sjekk kromatogrammet. Intensiteten skal være sammenlignbar for alle prøver. En representativ TIC er vist i figur 3. - Analyser rådata oppnådd ved hjelp av en proteomisk egnet programvare, for eksempel MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics eller Proteome Discoverer, og utfør en statistisk dataanalyse basert på forskningsspørsmålet.
5. Analyse av proteomiske rådata ved bruk av MaxQuant
MERK: Detaljert informasjon om MaxQuant-parametere er gitt i tilleggstabell 2. De er kort beskrevet nedenfor.
- Last inn råfiler i MaxQuant-programvaren i rådatahodet ved å klikke Last inn.
- Tilordne eksempelnavn ved å klikke på Angi eksperiment.
- Definer gruppespesifikke parametere. Først legger du til modifikasjoner. På grunn av prøvebehandling velger du Deamidation (NQ), Oxidation (M) og Carbamidomethylation (N-term) som variable modifikasjoner, og legger til Carbamidomethylation (C) som fast modifikasjon.
- Velg Trypsin som fordøyelsesenzym i fordøyelsesfanen .
- Legg til alternativet etikettfri kvantifisering LFQ i kategorien Etikettfri kvantifisering . Hvis mer enn 10 filer skal behandles, velger du Fast LFQ alternativet for å forkorte behandlingstiden. Legg til iBAQ-alternativet som et mål for proteinkvantifisering24.
- Kontroller at alle andre gruppespesifikke parametere forblir i fabrikkinnstillingene.
- Fortsett til kategorien Globale parametere og legg til FASTA-filen avledet fra uniprot.org i kategorien Sekvenser . Endre identifikatorregelen tilsvarende, og legg til taksonomi-ID-en, i dette tilfellet 9606 for homo sapiens.
- For proteinkvantifisering velg unike og barberhøvelpeptider .
- Kontroller at alle andre globale parametere forblir i fabrikkinnstillingene.
- Klikk på Start og hent proteingruppene.txt output etter MaxQuant-analyse for videre analyse i Perseus.
6. Statistisk analyse ved hjelp av Perseus
- Last inn proteingruppene.txt filen i Perseus, legg til iBAQ-verdiene som hovedkolonner, og sorter alle andre kolonner i henhold til typen.
- Filtrer ut lokkeduer og forurensninger ved å filtrere rader basert på den kategoriske kolonnen.
- Filtrer resultater basert på gyldige verdier. I det foreliggende tilfellet, med bare to utvalg inkludert i analysen, ble det valgt et minimum antall av en gyldig verdi.
- Eksporter Perseus-utgangen i .txt format for videre behandling, for eksempel i Excel, og evaluer resultatene angående forskningsspørsmålet.
7. Validering av utvalgte proteiner
MERK: Vanlige metoder for validering av MS-data er for eksempel immunologisk farging eller Western Blot. På grunn av den mørke fargen og autofluorescensen av nevromelanin, er immunologisk farging av proteiner inne i nevromelaningranuler enten med pepperrotperoksidase- eller fluoroforkonjugerte antistoffer ikke anvendelig. For Western Blot-analyse vil det være nødvendig med svært store mengder post mortem-vev . Derfor valideres utvalgte proteiner ved målrettet massespektrometri, og i dette tilfellet ble det satt opp parallelle reaksjonsovervåkingseksperimenter (PRM).
- Velg proteiner for validering. Velg peptider av disse proteinene som allerede er oppdaget i DDA-eksperimenter. Peptider bør ikke inneholde tapte spaltninger eller modifikasjoner for å sikre en pålitelig kvantifisering.
MERK: Det kan være flere grunner til validering av ett bestemt protein, for eksempel differensielle mengder i de undersøkte forholdene. For de representative resultatene er cytoplasmatisk dynein 1 tung kjede 1 valgt, som ble funnet å være tilsvarende rikelig i NMG- og SN-prøver og kan derfor brukes som referanse for å sikre lik prøvebelastning. - Bruk de valgte peptidene til å sette opp den første versjonen av en PRM-metode ved hjelp av HPLC-programvaren. Behold alle innstillinger for kromatografi og globale parametere fra DDA-metoden.
- Legg til MS OT og tMS2 OT HCD som skannetyper. Forsikre deg om at innstillingene for MS OT er de samme som for DDA-metoden. Detaljerte innstillinger for PRM-metoden finnes i tilleggstabell 1.
- For tMS2 OT HCD, legg til utvalgte peptider som en inkluderingsliste. Legg derfor til aminosyresekvensen og m/z-verdien observert i DDA-målingene. For det første PRM-eksperimentet må du ikke legge til oppbevaringstidsvinduer eller sette t start til 0 og t stopp til 120 (for en 120 min gradient).
- Evaluer PRM-metoden etter målingen ved hjelp av egnet programvare, for eksempel Skyline, og få retensjonstiden til peptidene som er lagt til inkluderingslisten. For inkluderte peptider, sjekk at sammenlignbare topper er observerbare for minst tre forløperioner i MS1-skanninger og fem fragmenterioner i MS2-skanninger med lav massefeil (±5 ppm).
- Avgrens PRM-metoden, for eksempel ved å øke oppløsningen for tMS2 OT HCD-skanningen og legge til oppbevaringstidsvinduer i inkluderingslisten.
MERK: Retensjonstidsvinduer på 3 minutter ble funnet å være godt egnet i nåværende eksperimenter (observert retensjonstid i første PRM-eksperiment ± 1,5 min). - Med den raffinerte PRM-metoden, utfør kvantifisering av peptider og proteiner av interesse basert på toppområdet både på MS1- og MS2-nivå med egnet programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den spesifikke isoleringen av NMG og SN-vev er det viktigste trinnet for vellykket anvendelse av denne protokollen. Ved hjelp av Field of View Analysis-funksjonen i leverandørprogramvaren til LMD, kan NMG-er velges automatisk på en fargeavhengig måte. Derfor må vevsområder som inneholder NMG (figur 2A) identifiseres og en synsfeltanalyse med justerte fargeterskler må utføres, noe som resulterer i merking av NMG (figur 2B). Etter filtrering av objekter som dekker et område under 100 μm², skal bare NMG forbli merket for isolasjon (figur 2C). Nøyaktig isolering av de merkede NMG-ene oppnås etter at laserinnstillingene ble justert (figur 2D). Etter isolering av NMG (figur 2E) kan SN-vev velges med 50 ganger forstørrelse (figur 2F) og isoleres (figur 2G) for sammenligning av den proteomiske profilen. For SN-vev kan isolerte objekter visualiseres ved hjelp av Cap Check-funksjonen (figur 2H). For begge prøvetyper, NMG og SN, ble isolering av 500 000 μm2 hjernevev funnet å være tilstrekkelig for denne protokollen, noe som muliggjorde minst tre MS-kjøringer per prøve.
Et representativt eksempel på et 120 min DDA-eksperiment er vist i figur 3 (ettersom hovedkolonnen vaskes i løpet av de siste 15 minuttene av målingen, beskjæres kromatogrammet like før 105 min). Den anvendte metoden skal tillate en prøve-eluering over hele gradienten, skape skarpe og konsise topper, og intensiteten til den totale ionstrømmen (TIC) skal være sammenlignbar på tvers av alle prøver.
Anvendelse av den presenterte protokollen på en prøve på 500 000 μm² NMG og en prøve på 1 000 000 μm² SN-vev med justerte volumer for MS-prøver (5 μL for NMG og 2,5 μL for SN) for å sikre identisk peptidbelastning, resulterte i identifisering av 1 898 proteingrupper (PGs) i NMG-prøven og 1 565 PGs i SN-prøven. Videre sammenligning viste at 1.384 PGs ble identifisert i begge prøvene, mens 514 PGs ble utelukkende identifisert i NMG og 181 PGs i SN-vev (figur 4). Totalt ble 2.079 PGs identifisert i dette representative eksperimentet. Sammenligning med et referansedatasett fra en tidligere studie22 viste at 87,6% av PGene rapportert i den studien også kunne identifiseres ved den nåværende reviderte og automatiserte protokollen, noe som viste at den var anvendelig. Videre kan antall identifiserte PGer forbedres med 1,143.
Siden minimale prøvemengder ikke tillater anvendelse av klassiske valideringsmetoder som Western Blots, kan validering av proteiner av interesse oppnås ved målrettede massespektrometriske tilnærminger, for eksempel PRM. Representative resultater for peptidet ESPEVLLTLDILK av proteinet cytoplasmatisk dynein 1 tungkjede 1 er vist i figur 5. iBAQ-verdien av dette proteinet ble funnet å være litt høyere i NMG sammenlignet med SN i DDA-målingene, som kunne verifiseres ved PRM-eksperimenter basert på toppområdet på MS1- (figur 5A, B, E) og MS2-nivå (figur 5C, D, F).
Figur 1: Arbeidsflyt for proteomisk karakterisering av nevromelaningranulat (NMG) og omkringliggende vev (SN). NMG- og SN-prøver ble isolert fra vevsskiver via lasermikrodisseksjon (LMD). Proteiner ble isolert og tryptisk in-solution fordøyelse ble utført. De resulterende peptidene ble analysert via LC-MS / MS-målinger i dataavhengig innsamling (DDA) -modus. Dataanalyse ble utført ved hjelp av MaxQuant og Perseus programvare. Validering av utvalgte proteiner ble utført med eksperimenter med parallell reaksjonsovervåking (PRM). PRM-data ble analysert ved hjelp av Skyline-programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Seleksjon og LMD-basert isolering av NMG- og SN-prøver. Først plasseres et område som inneholder NMG, synlig uten ytterligere flekker ved 400 ganger forstørrelse, under mikroskopet (A). Etter å ha utført en feltanalyse, velges NMG og andre mørke områder (B). Bare NMG-er forblir valgt etter filtrering (C) og isoleres etter at laserinnstillingene er justert (D). Etter at alle NMG er isolert (E), er SN-vev valgt med 50 ganger forstørrelse (F) og isolert (G). Siden objekter isolert for SN-prøver er ganske store, kan de observeres i prøveinnsamlingshetten ved hjelp av Cap Check-funksjonen (H). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Total ionstrøm (TIC) av en 120 min DDA-måling. Kromatogrammet viser den relative overfloden av ioner som tilsvarer de eluerende peptidene over retensjonstidsområdet fra 0 til ~ 105 min. Når hovedsøylen vaskes mellom 105 th og 120th min, blir kromatogrammet beskåret ved 105th min. Intensiteten til den høyeste toppen er 2, 86 x 108. Tall over topper indikerer retensjonstiden og den mest tallrike ionen av den spesifikke toppen (BP = base peak). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Venn-diagram som viser samsvaret mellom proteingrupper (PGs) identifisert i NMG og SN-vev. Totalt ble 1 898 PGs identifisert i NMG og 1 565 PGs i SN-vev, hvorav 1 384 PGs ble identifisert i begge vevsområdene. 514 PGs ble utelukkende identifisert i NMG-vev, mens 181 PGs ble utelukkende identifisert i SN-vev. Diagrammet ble opprettet ved hjelp av det elektroniske verktøyet Venny25. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Resultater fra PRM-forsøk for peptidet ESPEVLLTLDILK (cytoplasmatisk dynein 1 tungkjede 1, ++). Kromatogrammer på MS1- (A,B) og MS2-nivå (C,D), samt toppområder på MS1- (E) og MS2-nivå (F), er vist for en eksemplarisk prøve av NMG og SN-vev. Ulike farger brukes til å betegne forskjellige forløpere (på MS1-nivå) eller produktioner (på MS2-nivå). Kromatogrammer vises etter at Savitzky-Golay Smoothing ble utført. Intensiteter og toppområder var sammenlignbare på MS1- (A, B, E) og MS2-nivå (C, D, F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende tabell 1: Parametre for massespektrometrieksperimentene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 2: Parametre for MaxQuant-analysen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD er en allment anvendelig teknikk for isolering av spesifikke vevsområder, enkeltceller eller subcellulære strukturer. I den reviderte og automatiserte protokollen som presenteres her, brukes denne teknikken for spesifikk isolering av neuromelaningranuler (NMG) og NMG-omkringliggende vev (SN). Inntil nå har to forskjellige tilnærminger for isolering av NMG ut av menneskelig post mortem hjernevev blitt publisert og mye brukt:
a) En diskontinuerlig sukrosegradient som forbruker 1 g substantia nigra vev20. Siden humant post mortem substantia nigra-vev er sjeldent og av stor interesse for flere forskningsspørsmål, er det dessverre ganske utfordrende å sette opp en stor kohortstudie hvis det kreves store mengder vev per pasient. Derfor ble denne tilnærmingen ytterligere forbedret og reduserte den nødvendige vevsmengden til 0,15 g for tilstrekkelig isolering av NMG26. Men likevel var det nødvendig med minst halvparten av en komplett substantia nigra pars compacta .
b) Eksisjon av NMG-er ved bruk av LMD. I 2016 etablerte Plum et al en ny protokoll basert på nøyaktig eksisjon av NMG via LMD. Med denne protokollen kan den nødvendige prøvemengden reduseres til ti 10 μm vevsseksjoner, noe som resulterer i en imponerende reduksjon av den nødvendige vevsprøven fra 150 mg til 16,6 mg22.
Den optimaliserte og automatiserte LMD-baserte protokollen som presenteres her krever enda lavere prøvemengder som tynnere (5 μm sammenlignet med 10 μm) og færre vevsseksjoner (maksimalt 7 sammenlignet med 8) måtte brukes og krever mindre tid for prøvegenerering (4 timer per prøve sammenlignet med 1-2 dager) ved bruk av automatisert NMG-deteksjon. Dermed ble den nødvendige prøveinnsamlingstiden forkortet massivt, og antall identifiserte PGer kunne forbedres drastisk ved å bruke en optimalisert LC-MS-metode og toppmoderne instrumentering. Denne protokollen kan enkelt tilpasses andre forskningsspørsmål og vev.
For tilpasning av den presenterte protokollen om brukerdefinerte forskningsspørsmål belyses følgende aspekter erfaringsbasert:
a) Isolering av sammenlignbare prøvemengder: Siden det forventede peptidutbyttet av denne protokollen er ganske lavt sammenlignet med for eksempel cellekultur eller vevslysater, kan det hende at bestemmelse av peptidkonsentrasjon ikke er mulig. Det er derfor avgjørende at like mengder vev isoleres via LMD, som kan estimeres ut fra vevsarealet til de utvalgte objektene. I dagens oppsett er vevsarealer på 500 000 μm² tilstrekkelig for generering av peptider for minst tre MS-målinger.
b) Trypsinfordøyelse: Varigheten av fordøyelsen og trypsinkonsentrasjonen bør være sammenlignbar på tvers av prøver.
c) Tilpasning av parametere for forskjellige vev: Avhengig av vevet som skal analyseres, må den oppsamlede vevsmengden justeres og dermed gjøre det nødvendig å justere mengden tilsatt trypsin også. Trypsin til proteinforholdet bør ikke være lavere enn 1:40.
d) Begrensning av LMD-prosessen: For LMD-basert isolering av objekter av interesse, er det begrensninger når det gjelder størrelsen på utvalgte objekter og tykkelsen på skiver. På grunn av vevstap under laserbasert kutting av vevet ble gjenstander mindre enn 100 μm² ansett som for små for isolasjon.
e) Tilpasning av LC- og MS-parametere: Avhengig av LC- og MS-systemene som brukes, må mengden isolert vev økes (f.eks. ved drift med et mikrostrømningssystem) og MS-parametere må tilpasses (f.eks. ved arbeid med et ionefellebasert detektorsystem).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av de. NBI, et prosjekt fra det tyske utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) (tilskuddsnummer FKZ 031 A 534A) og P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr in Europe) og Center for Protein Diagnostics (ProDi) tilskudd, begge fra departementet for innovasjon, vitenskap og forskning i Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
