Summary
Ett robust protokoll presenteras här för att isolera neuromelaningranulat från human post-mortem substantia nigra pars compacta-vävnad via lasermikrodissektion. Detta reviderade och optimerade protokoll minimerar massivt den tid som krävs för provtagning, minskar den erforderliga provmängden och förbättrar identifieringen och kvantifieringen av proteiner genom LC-MS/MS-analys.
Abstract
Neuromelanin är ett svartbrunaktigt pigment, närvarande i så kallade neuromelaningranuler (NMG) i dopaminerga neuroner i substantia nigra pars compacta. Förutom neuromelanin innehåller NMG en mängd olika proteiner, lipider och metaller. Även om NMG-innehållande dopaminerga nervceller företrädesvis går förlorade i neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom och demens med Lewy-kroppar, är endast lite känt om mekanismen för NMG-bildning och NMG: s roll i hälsa och sjukdom. Således är ytterligare forskning om molekylär karakterisering av NMG nödvändig. Tyvärr är standardprotokoll för isolering av proteiner baserade på ultracentrifugering av densitetsgradient och kräver därför stora mängder mänsklig vävnad. Således upprättas ett automatiserat lasermikrodissektionsbaserat (LMD) -baserat protokoll här som möjliggör insamling av NMG och omgivande substantia nigra (SN) vävnad med minimala mängder vävnad på ett opartiskt, automatiserat sätt. Utskurna prover analyseras därefter med masspektrometri för att dechiffrera deras proteomiska sammansättning. Med detta arbetsflöde identifierades 2 079 proteiner varav 514 proteiner uteslutande identifierades i NMG och 181 i SN. De nuvarande resultaten har jämförts med en tidigare studie med en liknande LMD-baserad metod som når en överlappning på 87,6% för båda proteomerna, vilket verifierar tillämpligheten av det reviderade och optimerade protokollet som presenteras här. För att validera aktuella fynd analyserades proteiner av intresse med riktad masspektrometri, t.ex. parallell reaktionsövervakning (PRM) -experiment.
Introduction
Varje vävnad består av en heterogen blandning av olika celltyper, men den specifika isoleringen av en celltyp är ofta oumbärlig för en mer exakt karakterisering. Lasermikrodissektion (LMD), som kopplar ett mikroskop med en laserapplikation, är ett kraftfullt verktyg för specifik isolering av vävnadsområden, enskilda celler eller cellulära understrukturer ur en komplex komposit. Tillämpningen av LMD i kombination med masspektrometri (LMD-MS) har redan framgångsrikt implementerats för flera forskningsfrågor, inklusive isolering av DNA1, RNA2 och proteiner 3,4,5. I detta protokoll beskrivs ett reviderat och optimerat LMD-MS-protokoll för proteomisk analys av human post-mortem hjärnvävnad och subcellulära komponenter för att dechiffrera nya patomekanismer för Parkinsons sjukdom.
Neuromelanin är ett svart, nästan olösligt pigment som finns i katekolaminerga, dopaminproducerande nervceller i substantia nigra pars compacta6. Tillsammans med proteiner och lipider ackumuleras det i organellliknande granuler omgivna av ett dubbelmembran, kallat neuromelaningranulat (NMG)7,8,9. NMG kan observeras från tre års ålder hos människor som ökar i kvantitet och densitet under åldringsprocessen10,11. Hittills finns det ingen bestämd hypotes om neuromelaninbildning, men ett antagande är att neuromelanin bildas genom oxidation av dopamin12. Andra hypoteser är baserade på enzymatisk produktion av neuromelanin (t.ex. tyrosinas)13. Neuromelanin i sig visade sig ha en hög bindningsaffinitet till lipider, toxiner, metalljoner och bekämpningsmedel. Baserat på dessa fynd antas bildandet av NMG skydda cellen från ansamling av giftiga och oxidativa ämnen och från miljögifter14,15. Förutom denna neuroprotektiva funktion finns det bevis för att neuromelanin kan orsaka neurodegenerativa effekter, t.ex. genom järnmättnad och efterföljande katalys av fria radikaler16,17. Dessutom kan neuromelanin som frigörs under neurodegenerativa processer sönderdelas av väteperoxid, vilket kan påskynda nekros av reaktiva metaller och andra giftiga föreningar som tidigare var bundna till neuromelanin och kan bidra till neuroinflammation och cellulär skada18. Men hittills är den exakta rollen av NMG i neurodegenerativa processer som i samband med Parkinsons sjukdom inte klart förstått. Ändå verkar NMG vara involverade i patogenesen av Parkinsons sjukdom och deras specifika analys är av yttersta vikt för att avslöja deras roll i neurodegeneration. Tyvärr saknar vanliga försöksdjur (t.ex. möss och råttor) och cellinjer NMG19. Därför förlitar sig forskare särskilt på hjärnvävnad efter döden för sin analys. Tidigare förlitade sig NMG-isolering genom densitetsgradientcentrifugering på tillgången på stora mängder substantia nigra-vävnad 20,21. Idag presenterar LMD ett mångsidigt verktyg för att specifikt isolera NMG från mänskliga hjärnprover för att sedan analysera dem med LC-MS / MS.
I detta protokoll presenteras en förbättrad och automatiserad version av ett tidigare protokoll22 för isolering av NMG och omgivande vävnad (SN), vilket möjliggör en snabbare provgenerering, högre antal identifierade och kvantifierade proteiner och en kraftig minskning av erforderliga vävnadsmängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av mänsklig hjärnvävnad godkändes av etikkommittén vid Ruhr-universitetet Bochum, Tyskland (filnummer 4760-13), enligt tyska regler och riktlinjer. Detta protokoll har tillämpats på kommersiellt erhållna substantia nigra pars compacta vävnadsskivor. En grafisk översikt över det presenterade protokollet visas i figur 1.
1. Vävnadssnitt
- Förkyl kryostatkammaren.
OBS: Varje vävnad kräver olika kryostattemperaturer, som finns i respektive leverantörsprotokoll. - Rengör kniven i rostfritt stål med 70% etanol och montera den i bladhållaren.
- Överför vävnaden från frysen -80 °C till kryostaten med hjälp av en isbox och låt den anpassa sig till kryostatkammarens temperatur i 15 minuter.
- Märk entydigt membranglas med en penna.
OBS: PET / PEN-membranglas krävs för den LMD-baserade provsamlingen. Hantera PET/PEN-membranglasen med försiktighet eftersom de är extremt ömtåliga. - Applicera en droppe kommersiellt fryst sektionsmedium på vävnadshållaren. Innan den är helt frusen, placera vävnaden på det frusna sektionsmediet och låt det härda, så att vävnaden är ansluten till vävnadshållaren.
- Montera vävnadshållaren i kryostatkammaren och justera dess orientering innan du börjar sektionera. Optimal hållarorientering beror på vävnadens orientering.
OBS: Det kan vara nödvändigt att trimma vävnaden tills det sektionsplan som behövs för skivorna har uppnåtts. - Innan vävnadsområdet av intresse uppnås, justera skärinställningen till önskad vävnadstjocklek.
OBS: 5 eller 10 μm är den föreslagna tjockleken för detta protokoll eftersom 20 μm tjocka sektioner befanns vara oförenliga med den LMD-baserade provsamlingen22. - Klipp två sektioner och kassera dem.
- Lägg ner antirullplattan.
- Skär en del av vävnaden, öppna antirullplattan försiktigt, ta en membranbild och förhindra vävnadsvikning medan du placerar vävnadssektionen på membranglaset.
OBS: Förvaring av membranglasen vid rumstemperatur före vidhäftning möjliggör exakt provfästning. Flera sektioner kan placeras på samma membranglas men vävnadsöverlappning måste förhindras. - Förvara vävnadssektioner placerade på membranglas i kryostaten tills sektionering är klar.
- Förvara den kryokerade vävnaden vid -20 °C tills vidare bearbetning eller fortsätt direkt med proceduren nedan. Förvara de snittade vävnadsglasen vid -80 °C tills de används vidare.
2. Laser mikrodissektion och tryckkatapultering
OBS: Eftersom neuromelaningranulat är synliga utan färgning på grund av deras svartbruna färg, behövs ingen färgning för detta protokoll. Ändå kan olika färgningsförfaranden kombineras med detta protokoll om det behövs. Tänk på att användningen av blockerande lösningar eller antikroppar kommer att påverka LC-MS/MS-analyserna.
- Slå på MicroBeam-systemet och öppna tillhörande programvara på datorn (se Materialförteckning).
- Placera vävnadsmembrangliden i glidhållaren på RoboStage med vävnaden uppåt.
OBS: Beroende på LMD-enheten kan det vara nödvändigt att placera membranglaset så att vävnaden är vänd nedåt. I allmänhet utförs provtagning i en temperaturkontrollerad miljö för att säkerställa optimala och reproducerbara förhållanden. - Ställ in mikroskopet på önskad förstoring (50-faldig används här) för översiktsskanningarna.
- Använd funktionen Skanna, som finns i fönstret Navigatör i programvarugränssnittet, för att få en översiktsskanning av vävnadssektionen. Sök efter det övre vänstra hörnet och det nedre högra hörnet av intresseområdet och välj dem i programvarugränssnittet. Välj sedan Skanna alla ROI:er för att utföra genomsökningarna.
OBS: Översiktsskanningar är inte obligatoriska, men de möjliggör bättre orientering i bilden och kan sparas för senare användning. - Justera mikroskopets förstoring för lämplig vävnad, som är 400 gånger i det aktuella fallet av neuromelaningranuler.
- Sök efter ett område med neuromelaningranuler. Välj Vyfältsanalys i programvarugränssnittet, välj Invertera resultat och ställ in tröskelvärdet för RGB-kanalerna så att endast neuromelaningranulat markeras med rött i förhandsgranskningsfönstret. Klicka på OK för att använda de justerade inställningarna för synfältet.
Det kan hända att mindre objekt med en mörk färg också väljs. För att ta hänsyn till det, kassera alla föremål som täcker ett område som är mindre än 100 μm2 innan du isolerar neuromelaningranulat. För att göra detta, öppna elementlistan genom att klicka på ikonen i verktygsfältet, välj den aktuella bilden och ordna element efter område. Välj de med områden som är mindre än 100 μm2 och ta bort dem. - Justera laserinställningarna med hjälp av ett område på bilden som endast täcks av membranet.
OBS: Det rekommenderas att använda guiden Cut Laser Adjustment och följa instruktionerna i programvaran. Nödvändiga laserinställningar kan skilja sig åt mellan olika objektglas. För 5 μm sektioner med 400-faldig förstoring är typiska inställningar 32 energi och 51 fokus för skärning och 28 energi och -1 fokus för laserpulskatapultering (LPC). - Justera hastighetsinställningarna för positionering och skärning för att säkerställa korrekt isolering.
OBS: 30% hastighet befanns vara optimal för NMG-isolering. - Fyll locket på provuppsamlingsröret med 50 μL ultrarent vatten och sätt in locket i uppsamlaren på RoboMover.
OBS: Röruppsamlaren som används för nuvarande experiment kan bära ett provuppsamlingsrör i taget. - Placera RoboMover ovanför RoboStage II med hjälp av programvarugränssnittet för att starta provinsamlingen.
OBS: För att göra detta, öppna RoboMover-fönstret, som visar samlaren. Klicka på provuppsamlingsrörets lock som visas i RoboMover-fönstret för att flytta locket till arbetsområdet. Justera den optimala rörelse- och arbetshöjden i RoboMover-fönstret. Annars kan vattnet i locket falla på bilden eller de katapulterade föremålen når inte locket. - Starta lasern. Kontrollera energi- och fokusinställningar under laserprocessen och justera inställningarna vid behov. Se till att de isolerade föremålen isoleras och katapulteras ordentligt i provuppsamlingsrörets lock för minst de första tio föremålen.
OBS: Korrekt isolering och katapultering måste kontrolleras visuellt. Båda bör resultera i ett vävnadsfritt område av storleken på det förvalda objektet i vävnadsskivan (se figur 2C,D). Justera laserinställningarna om objektet förblir fäst vid vävnadsskivan efter skärning och katapultering. För katapultering har CenterRoboLPC-alternativet visat sig vara väl lämpat för NMG-isolering. Katapulteringsinställningarna kan justeras för varje markerat objekt i elementlistan. - När provtagningen är klar navigerar du RoboMover till dess startposition. Ta bort provuppsamlingsröret.
OBS: När antalet insamlade föremål är ganska lågt och föremålen är tillräckligt stora kan provtagning säkerställas genom att klicka på Cap Check, som placerar provuppsamlingsrörets lock under mikroskopet så att antalet föremål inuti vattnet i locket kan räknas (se figur 2H). - Snurra ner provet med en centrifug. Korta snurr på 5 s med ökande centrifugalkraft på grund av acceleration av centrifugen visade sig vara tillräckliga. Förvara vid denna tidpunkt prover vid -80 °C, eftersom alla prover bör bearbetas ytterligare tillsammans.
OBS: För jämförelsen av den proteomiska profilen isolerades vävnaden som omger NMG: erna också efter deras excision. Isoleringen av den omgivande vävnaden utfördes vid 50-faldig förstoring. - Torka proverna i ett vakuumkoncentrator. 1,5 timmar visade sig vara tillräckligt för 50 μl vatten.
- Lösgör och lysera vävnaden i 40 μl myrsyra i 20 min (rumstemperatur).
- Förbättra vävnadslys genom ultraljudsbehandling vid 45 kHz (kilohertz) för 5 min i ett ultraljudsbehandling bad. Fyll ultraljudsbehandling bad med is för att förhindra att rören smälter. Förvara proverna vid -80 °C tills de bearbetas vidare.
3. Tryptisk matsmältning
- Frysa prover på is.
- Torka proverna helt i en vakuumkoncentrator.
- Fyll provet med 50 μl av en lämplig rötningsbuffert, t.ex. 50 mM ammoniumbikarbonat.
- Efter tillsats av 1,25 μl 200 mM 1,4-ditiotreitol inkuberar du proverna i 30 minuter vid 60 °C och 300 rpm med hjälp av en termomixer och kyler dem därefter till rumstemperatur (RT).
- Inkubera sedan prover vid RT i 30 minuter i mörker efter tillsats av 1,36 μl 0,55 M jodoacetamid.
- Tillsätt en lämplig mängd trypsin till proverna och inkubera proverna över natten (~16 timmar) vid 37 °C.
OBS: För 1 000 000 μm2 befanns 0,1 μg trypsin vara tillräckligt. - Tillsätt 2,6 μl 10% trifluorättiksyra (TFA) till proverna för att stoppa matsmältningen (slutkoncentration på 0,5% TFA).
- Torka proverna helt med en vakuumkoncentrator. Fyll sedan prover upp till en definierad slutlig volym med 0.1% TFA. NMG-prover fylldes upp till 20 μL varav 5 μL användes för ett masspektrometriskt (MS) experiment.
- Förvara proverna vid -80 °C tills de används vidare. Bestäm peptidkoncentrationen genom aminosyraanalys eller annan lämplig kvantifieringsmetod (t.ex. Direct Detect).
OBS: Låga provmängder kanske inte är kvantifierbara med de nämnda teknikerna. För att säkerställa identisk provbelastning bör varje prov innehålla samma mängd isolerad vävnad och varje prov bör behandlas lika.
4. Högpresterande vätskekromatografi och masspektrometri
OBS: Följande högpresterande vätskekromatografi (HPLC) masspektrometriska (MS) analys är optimerade för det specifika LC-systemet med en fångstkolonnanordning och masspektrometer som används här (se Materialförteckning). För andra LC- och MS-system rekommenderas anpassning av parametrar.
- Använd programvaran Xcalibur och justera HPLC-inställningarna enligt följande.
- Fällkolonn: Ställ in temperaturen på 60 °C, flödeshastigheten till 30 μl/min, körbufferten till 0,1 % trifluorättiksyra.
- Analytisk C18-kolonn med omvänd fas: Ställ in temperaturen på 60 °C, flödeshastigheten till 30 μl/min, löpbuffert A till 0,1 % trifluorättiksyra, löpbuffert B till 84 % acetonitril och gradienten till 5%-30 % löpande buffert B under 98 minuter.
OBS: Anpassning av gradienten kan vara oundviklig och rekommenderas starkt vid användning av olika vävnader eller celler. Den totala övertoningstiden kan variera beroende på provbelastningen i början av övertoningen och tvättning av provet i slutet av övertoningen. Den totala gradienten i detta protokoll består av 7 minuters provbelastning och ytterligare kolonntvätt under 15 min vilket resulterar i en total gradienttid på 120 min.
- Skapa en databeroende förvärvsmetod (DDA) med XCalibur Instrument Setup, som finns i HPLC-programvaruöversiktsmenyn.
- På fliken Globala parametrar definierar du vätskekromatografi i infusionsläge, förväntad LC-toppbredd (30 s) och standardladdningsstatus (2).
- Fortsätt till fliken Skanningsparametrar och lägg till följande skanningar och filter i den ordning som nämns: MS OT, MIPS, Intensitet, Laddningstillstånd, Dynamisk uteslutning och ddMS2 OT HCD.
OBS: De detaljerade parameterinställningarna för varje skanning och filter finns i tilläggstabell 1. Optimala MS- och DDA-inställningar kan variera för den specifika masspektrometern som används såväl som provtypen och bör därför anpassas. - Förbered prover genom att lösa 200-400 ng provpeptider i en definierad volym av 0,1% TFA i inerta masspektrometriska glasflaskinlopp. Om koncentrationsbestämning inte är tillämplig på grund av låg provmängd, kontrollera identisk provbelastning genom att jämföra den totala jonströmmen (TIC).
OBS: För att göra detta, öppna den resulterande filen med masspektrometrisk mätning i en lämplig programvara, t.ex. FreeStyle, och kontrollera kromatogrammet. Intensiteterna bör vara jämförbara för alla prover. Ett representativt TIC visas i figur 3. - Analysera rådata som erhållits med hjälp av en proteomisk lämplig programvara, t.ex. MaxQuant23, Progenesis QI för Proteomics eller Proteome Discoverer, och utföra en statistisk dataanalys baserad på forskningsfrågan.
5. Analys av proteomiska rådata med MaxQuant
OBS: En detaljerad information om MaxQuant-parametrar finns i tilläggstabell 2. De beskrivs kortfattat nedan.
- Läs in råfiler i MaxQuant-programvaran i rådatahuvudet genom att klicka på Läs in.
- Tilldela exempelnamn genom att klicka på Ange experiment.
- Definiera gruppspecifika parametrar. Lägg först till ändringar. På grund av provbehandling, välj Deamidation (NQ), Oxidation (M) och Carbamidomethylation (N-term) som variabla modifieringar och tillsätt Carbamidomethylation (C) som fast modifiering.
- Välj Trypsin som matsmältningsenzym på fliken Matsmältning .
- Lägg till alternativet för etikettfri kvantifiering LFQ på fliken Etikettfri kvantifiering . Om mer än 10 filer ska bearbetas väljer du alternativet Snabb LFQ för att förkorta bearbetningstiden. Lägg till iBAQ-alternativet som ett mått för proteinkvantifiering24.
- Se till att alla andra gruppspecifika parametrar finns kvar i fabriksinställningarna.
- Fortsätt till fliken Globala parametrar och lägg till FASTA-filen som härleds från uniprot.org på fliken Sekvenser . Ändra identifierarregeln i enlighet med detta och lägg till taxonomi-ID, i det här fallet 9606 för homo sapiens.
- För proteinkvantifiering välj Unique och Razor peptider.
- Se till att alla andra globala parametrar finns kvar i fabriksinställningarna.
- Klicka på Start och hämta proteingrupperna.txt utdata efter MaxQuant-analys för vidare analys i Perseus.
6. Statistisk analys med Perseus
- Ladda proteingrupperna.txt filen i Perseus, lägg till iBAQ-värdena som huvudkolumner och sortera alla andra kolumner efter deras typ.
- Filtrera bort lockbeten och föroreningar genom att filtrera rader baserat på den kategoriska kolumnen.
- Filtrera resultat baserat på giltiga värden. I förevarande fall, där endast två prover ingick i analysen, valdes ett minsta antal giltiga värden.
- Exportera Perseus-utdata i .txt format för vidare bearbetning, till exempel i Excel, och utvärdera resultaten angående forskningsfrågan.
7. Validering av utvalda proteiner
OBS: Vanliga metoder för validering av MS-data är till exempel immunologisk färgning eller Western Blot. På grund av den mörka färgen och autofluorescensen av neuromelanin är immunologisk färgning av proteiner inuti neuromelaningranuler antingen med pepparrotsperoxidas- eller fluoroforkonjugerade antikroppar inte tillämpliga. För Western Blot-analys skulle mycket stora mängder vävnad efter slakt vara nödvändiga. Därför valideras utvalda proteiner genom riktad masspektrometri, och i detta fall inrättades parallella reaktionsövervakningsexperiment (PRM).
- Välj proteiner för validering. Välj peptider av dessa proteiner som redan upptäckts i DDA-experiment. Peptider bör inte innehålla några missade klyvningar eller modifieringar för att säkerställa en tillförlitlig kvantifiering.
OBS: Det kan finnas flera orsaker till validering av ett specifikt protein, till exempel differentiella överflöd under de undersökta förhållandena. För de representativa resultaten har cytoplasmatisk dynein 1 tungkedja 1 valts ut, vilket visade sig vara lika rikligt i NMG- och SN-prover och därför kunde användas som referens för att säkerställa lika provbelastning. - Använd de valda peptiderna för att ställa in den första versionen av en PRM-metod med hjälp av HPLC-programvaran. Behåll alla kromatografi- och globala parameterinställningar från DDA-metoden.
- Lägg till MS OT och tMS2 OT HCD som skanningstyper. Se till att inställningarna för MS OT är desamma som för DDA-metoden. Detaljerade inställningar för metoden för personer med nedsatt rörlighet finns i tilläggstabell 1.
- För tMS2 OT HCD, lägg till utvalda peptider som en inkluderingslista. Lägg därför till aminosyrasekvensen och m/z-värdet som observerats i DDA-mätningarna. För det första PRM-experimentet ska du inte lägga till kvarhållningstidsfönster eller ställa in t start på 0 och t stopp till 120 (för en lutning på 120 minuter).
- Utvärdera PRM-metoden efter mätningen med hjälp av lämplig programvara, till exempel Skyline, och få retentionstiden för peptiderna som läggs till i inkluderingslistan. För inkluderade peptider, kontrollera att jämförbara toppar är observerbara för minst tre prekursorjoner i MS1-skanningar och fem fragmentjoner i MS2-skanningar med lågt massfel (±5 ppm).
- Förfina PRM-metoden, till exempel genom att öka upplösningen för tMS2 OT HCD-skanningen och lägga till kvarhållningstidsfönster i inkluderingslistan.
OBS: Retentionstidsfönster på 3 min visade sig vara väl lämpade i nuvarande experiment (observerad retentionstid i första PRM-experimentet ± 1,5 min). - Med den förfinade PRM-metoden utföra kvantifiering av peptider och proteiner av intresse baserat på topparean både på MS1- och MS2-nivå med lämplig programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den specifika isoleringen av NMG och SN-vävnad är det viktigaste steget för en framgångsrik tillämpning av detta protokoll. Med hjälp av funktionen Vyfältsanalys i LMD:s leverantörsbaserade programvara kan NMG:er väljas automatiskt på ett färgberoende sätt. Därför måste vävnadsområden som innehåller NMG (figur 2A) identifieras och en synfältsanalys med justerade färgtrösklar måste utföras, vilket resulterar i märkning av NMG (figur 2B). Efter filtrering av objekt som täcker ett område under 100 μm² bör endast NMG förbli märkta för isolering (figur 2C). Exakt isolering av de märkta NMG:erna uppnås efter att laserinställningarna har justerats (figur 2D). Efter isolering av NMG (figur 2E) kan SN-vävnad väljas med 50-faldig förstoring (figur 2F) och isoleras (figur 2G) för jämförelse av den proteomiska profilen. För SN-vävnad kan isolerade objekt visualiseras med hjälp av Cap Check-funktionen (figur 2H). För båda provtyperna, NMG och SN, visade det sig att isolering av 500 000 μm2 hjärnvävnad var tillräcklig för detta protokoll, vilket möjliggjorde minst tre MS-körningar per prov.
Ett representativt exempel på ett 120 min DDA-experiment visas i figur 3 (eftersom huvudkolonnen tvättas under de sista 15 minuterna av mätningen beskärs kromatogrammet strax före 105 min). Den tillämpade metoden bör tillåta en provförlängning över hela gradienten, vilket skapar skarpa och koncisa toppar, och intensiteten hos den totala jonströmmen (TIC) bör vara jämförbar för alla prover.
Tillämpning av det presenterade protokollet på ett prov på 500 000 μm² NMG och ett prov av 1 000 000 μm² SN-vävnad med justerade volymer för MS-prover (5 μL för NMG och 2,5 μL för SN) för att säkerställa identisk peptidbelastning, resulterade i identifiering av 1 898 proteingrupper (PG) i NMG-provet och 1 565 PGs i SN-provet. Ytterligare jämförelse visade att 1 384 PGs skulle identifieras i båda proverna, medan 514 PGs uteslutande identifierades i NMG och 181 PGs i SN-vävnad (Figur 4). Totalt identifierades 2 079 PGs i detta representativa experiment. En jämförelse med ett referensdataset från en tidigare studie22 visade att 87,6 % av de PGs som rapporterades i den studien också kunde identifieras genom det nuvarande reviderade och automatiserade protokollet, vilket bevisar dess tillämplighet. Dessutom skulle antalet identifierade PGs kunna förbättras med 1 143.
Eftersom minimala provmängder inte tillåter tillämpning av klassiska valideringsmetoder som Western Blots, kan validering av proteiner av intresse uppnås genom riktade masspektrometriska metoder, t.ex. PRM. Representativa resultat för peptiden ESPEVLLTLDILK av proteinet cytoplasmatisk dynein 1 tung kedja 1 visas i figur 5. iBAQ-värdet för detta protein visade sig vara något högre i NMG jämfört med SN i DDA-mätningarna, vilket kunde verifieras genom PRM-experiment baserat på topparean på MS1- (Figur 5A, B, E) och MS2-nivå (Figur 5C, D, F).
Figur 1: Arbetsflöde för proteomisk karakterisering av neuromelaningranulat (NMG) och omgivande vävnad (SN). NMG- och SN-prover isolerades från vävnadsskivor via lasermikrodissektion (LMD). Proteiner isolerades och tryptisk matsmältning i lösningen utfördes. De resulterande peptiderna analyserades via LC-MS/MS-mätningar i databeroende förvärvsläge (DDA). Dataanalys utfördes med hjälp av MaxQuant och Perseus programvara. Validering av utvalda proteiner utfördes med parallella reaktionsövervakningsexperiment (PRM). PRM-data analyserades med hjälp av Skyline-programvaran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Selektion och LMD-baserad isolering av NMG- och SN-prover. Först placeras ett område som innehåller NMG, synligt utan ytterligare färgning vid 400-faldig förstoring, under mikroskopet (A). Efter att ha utfört en synfältsanalys väljs NMG och andra mörka områden (B). Endast NMG förblir valda efter filtrering (C) och isoleras efter att laserinställningarna har justerats (D). När alla NMG är isolerade (E) väljs SN-vävnad med 50-faldig förstoring (F) och isoleras (G). Eftersom objekt som isolerats för SN-prover är ganska stora kan de observeras i provsamlingslocket med hjälp av Cap Check-funktionen (H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Total jonström (TIC) för en 120 min DDA-mätning. Kromatogrammet visar det relativa överflödet av jonerna som motsvarar de eluerande peptiderna över retentionstidsintervallet från 0 till ~ 105 min. Eftersom huvudkolonnen tvättas mellan 105och 120minuter beskärs kromatogrammet vid 105minuter. Intensiteten hos den högsta toppen är 2, 86 x 108. Siffror över toppar anger retentionstiden och den vanligaste jonen för den specifika toppen (BP = bastopp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Venndiagram som visar korrespondensen mellan proteingrupper (PGs) identifierade i NMG och SN-vävnad. Totalt identifierades 1 898 PG i NMG och 1 565 PG i SN-vävnad, varav 1 384 PGs identifierades i båda vävnadsområdena. 514 PGs identifierades uteslutande i NMG-vävnad, medan 181 PGs uteslutande identifierades i SN-vävnad. Diagrammet skapades med hjälp av onlineverktyget Venny25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Resultat av PRM-experiment för peptiden ESPEVLLTLDILK (cytoplasmatisk dynein 1 tungkedja 1, ++). Kromatogram på MS1- (A,B) och MS2-nivå (C,D), samt toppområden på MS1- (E) och MS2-nivå (F), visas för ett exemplariskt prov av NMG och SN-vävnad. Olika färger används för att beteckna olika prekursorer (på MS1-nivå) eller produktjoner (på MS2-nivå). Kromatogram visas efter att Savitzky-Golay Smoothing utfördes. Intensiteter och topparealer var jämförbara på MS1- (A,B,E) och MS2-nivå (C,D,F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggstabell 1: Parametrar för masspektrometriexperimenten. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tilläggstabell 2: Parametrar för MaxQuant-analysen. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD är en allmänt tillämplig teknik för isolering av specifika vävnadsområden, enskilda celler eller subcellulära strukturer. I det reviderade och automatiserade protokollet som presenteras här tillämpas denna teknik för specifik isolering av neuromelaningranuler (NMG) och NMG-omgivande vävnad (SN). Hittills har två olika metoder för isolering av NMG från mänsklig hjärnvävnad efter slakt publicerats och använts i stor utsträckning:
a) En diskontinuerlig sackarosgradient som konsumerar 1 g substantia nigra vävnad20. Eftersom human post-mortem substantia nigra-vävnad är sällsynt och av stort intresse för flera forskningsfrågor är det tyvärr ganska utmanande att inrätta en stor kohortstudie om stora mängder vävnad krävs per patient. Därför förbättrades detta tillvägagångssätt ytterligare, vilket minskade den erforderliga vävnadsmängden till 0,15 g för tillräcklig isolering av NMG26. Men ändå krävdes minst hälften av en komplett substantia nigra pars compacta .
b) Excision av NMG med LMD. År 2016 upprättade Plum et al ett nytt protokoll baserat på exakt excision av NMG via LMD. Med detta protokoll kunde den erforderliga provmängden minskas till tio 10 μm vävnadssektioner, vilket resulterade i en imponerande minskning av det erforderliga vävnadsprovet från 150 mg till 16,6 mg22.
Det optimerade och automatiserade LMD-baserade protokollet som presenteras här kräver ännu lägre provmängder eftersom tunnare (5 μm jämfört med 10 μm) och färre vävnadssektioner (maximalt 7 jämfört med 8) måste användas och kräver mindre tid för provgenerering (4 h per prov jämfört med 1-2 dagar) genom användning av automatiserad NMG-detektion. Således förkortades den erforderliga provtagningstiden massivt och antalet identifierade PGs kunde förbättras drastiskt genom att tillämpa en optimerad LC-MS-metod och toppmodern instrumentering. Detta protokoll kan enkelt anpassas till andra forskningsfrågor och vävnader.
För anpassning av det presenterade protokollet om användardefinierade forskningsfrågor belyses följande aspekter baserat på erfarenhet:
a) Isolering av jämförbara provmängder: Eftersom det förväntade peptidutbytet i detta protokoll är ganska lågt jämfört med till exempel cellodling eller vävnadslysater, kanske bestämning av peptidkoncentration inte är möjlig. Således är det avgörande att lika stora mängder vävnad isoleras via LMD, vilket kan uppskattas baserat på vävnadsområdet för de valda objekten. I den nuvarande installationen är vävnadsområden på 500 000 μm² tillräckliga för generering av peptider för minst tre MS-mätningar.
b) Trypsin-matsmältning: Varaktigheten av matsmältningen och trypsinkoncentrationen bör vara jämförbar mellan proverna.
c) Anpassning av parametrar för olika vävnader: Beroende på vävnaden som ska analyseras måste den uppsamlade vävnadsmängden justeras, vilket gör det nödvändigt att justera mängden tillsatt trypsin också. Förhållandet mellan trypsin och protein bör inte vara lägre än 1:40.
d) Begränsning av LMD-processen: För LMD-baserad isolering av objekt av intresse finns det begränsningar när det gäller storleken på valda objekt och tjockleken på skivor. På grund av vävnadsförlust under den laserbaserade skärningen av vävnaden ansågs föremål mindre än 100 μm² vara för små för isolering.
e) Anpassning av LC- och MS-parametrar: Beroende på vilka LC- och MS-system som används måste mängden isolerad vävnad ökas (t.ex. vid drift med ett mikroflödessystem) och MS-parametrar måste anpassas (t.ex. när man arbetar med ett jonfällebaserat detektorsystem).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av de. NBI, ett projekt från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (bidragsnummer FKZ 031 A 534A) och P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr inom Europa) och Center for Protein Diagnostics (ProDi) bidrag, båda från ministeriet för innovation, vetenskap och forskning i Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
