Summary
Burada, nöromelanin granüllerinin lazer mikrodiseksiyonu yoluyla insan post-mortem substantia nigra pars compacta dokusundan izole edilmesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu revize edilmiş ve optimize edilmiş protokol, numune toplama için gereken süreyi büyük ölçüde en aza indirir, gerekli numune miktarını azaltır ve LC-MS / MS analizi ile proteinlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini geliştirir.
Abstract
Nöromelanin, substantia nigra pars compacta'nın dopaminerjik nöronlarında nöromelanin granüllerinde (NMG'ler) bulunan siyah-kahverengimsi bir pigmenttir. Nöromelaninin yanı sıra, NMG'ler çeşitli proteinler, lipitler ve metaller içerir. NMG'leri içeren dopaminerjik nöronlar, Parkinson hastalığı ve Lewy cisimcikli demans gibi nörodejeneratif hastalıklarda tercihen kaybolmasına rağmen, NMG oluşumunun mekanizması ve NMG'lerin sağlık ve hastalıktaki rolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, NMG'lerin moleküler karakterizasyonu hakkında daha fazla araştırma yapılması esastır. Ne yazık ki, proteinlerin izolasyonu için standart protokoller yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemeye dayanır ve bu nedenle yüksek miktarda insan dokusu gerektirir. Bu nedenle, burada NMG'lerin ve çevresindeki substantia nigra (SN) dokusunun tarafsız ve otomatik bir şekilde minimum miktarda doku kullanılarak toplanmasını sağlayan otomatik bir lazer mikrodiseksiyon (LMD) tabanlı protokol oluşturulmuştur. Eksize edilen numuneler daha sonra proteomik bileşimlerini deşifre etmek için kütle spektrometresi ile analiz edilir. Bu iş akışıyla, 514 proteini yalnızca NMG'lerde ve 181'i SN'de tanımlanan 2.079 protein tanımlandı. Mevcut sonuçlar, her iki proteom için% 87.6'lık bir örtüşmeye ulaşan benzer bir LMD tabanlı yaklaşım kullanılarak önceki bir çalışma ile karşılaştırılmış ve burada sunulan revize edilmiş ve optimize edilmiş protokolün uygulanabilirliğini doğrulamıştır. Mevcut bulguları doğrulamak için, ilgili proteinler hedeflenen kütle spektrometrisi, örneğin paralel reaksiyon izleme (PRM) deneyleri ile analiz edildi.
Introduction
Her doku, farklı hücre tiplerinin heterojen bir karışımından oluşur, ancak bir hücre tipinin spesifik izolasyonu genellikle daha kesin bir karakterizasyon için vazgeçilmezdir. Bir mikroskobu lazer uygulamasıyla birleştiren lazer mikrodiseksiyonu (LMD), doku alanlarının, tek hücrelerin veya hücresel alt yapıların karmaşık bir kompozitten spesifik izolasyonu için güçlü bir araçtır. LMD'nin kütle spektrometresi (LMD-MS) ile kombinasyon halinde uygulanması, DNA1, RNA2 ve proteinlerinizolasyonu 3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli araştırma soruları için başarıyla uygulanmıştır. Bu protokolde, Parkinson hastalığının yeni patomekanizmalarını deşifre etmek için insan post-mortem beyin dokusunun ve hücre altı bileşenlerin proteomik analizi için gözden geçirilmiş ve optimize edilmiş bir LMD-MS protokolü tanımlanmıştır.
Nöromelanin, substantia nigra pars compacta6'nın katekolaminerjik, dopamin üreten nöronlarında bulunan siyah, neredeyse çözünmeyen bir pigmenttir. Proteinler ve lipitlerle birlikte, nöromelanin granülleri (NMG'ler) 7,8,9 olarak adlandırılan çift zarla çevrili organel benzeri granüllerde birikir. NMG'ler, yaşlanma sürecinde10,11 oranında artan insanlarda üç yaşından itibaren gözlenebilir. Bugüne kadar, nöromelanin oluşumu hakkında kesin bir hipotez yoktur, ancak bir varsayım, nöromelaninin dopamin12'nin oksidasyonu yoluyla oluştuğudur. Diğer hipotezler, nöromelaninin enzimatik üretimine dayanmaktadır (örneğin, tirozinaz)13. Nöromelaninin kendisinin lipitlere, toksinlere, metal iyonlarına ve pestisitlere yüksek bağlanma afinitesine sahip olduğu bulunmuştur. Bu bulgulara dayanarak, NMG'lerin oluşumunun hücreyi toksik ve oksidatif maddelerin birikmesinden ve çevresel toksinlerden koruduğu varsayılmaktadır14,15. Bu nöroprotektif fonksiyonun yanı sıra, nöromelaninin nörodejeneratif etkilere neden olabileceğine dair kanıtlar vardır, örneğin demir doygunluğu ve ardından serbest radikallerin katalizi16,17. Ayrıca, nörodejeneratif süreçler sırasında salınan nöromelanin, daha önce nöromelanine bağlı reaktif metaller ve diğer toksik bileşikler tarafından nekrozu hızlandırabilen ve nöroinflamasyona ve hücresel hasara katkıda bulunabilen hidrojen peroksit tarafından ayrıştırılabilir18. Bununla birlikte, şimdiye kadar NMG'lerin Parkinson hastalığı sırasında olduğu gibi nörodejeneratif süreçlerdeki kesin rolü açıkça anlaşılamamıştır. Yine de, NMG'ler Parkinson hastalığının patogenezinde rol oynamaktadır ve spesifik analizleri nörodejenerasyondaki rollerini çözmek için son derece önemlidir. Ne yazık ki, yaygın laboratuvar hayvanları (örneğin, fareler ve sıçanlar) ve hücre hatları NMG'lerden yoksundur19. Bu nedenle, araştırmacılar analizleri için özellikle ölüm sonrası beyin dokusuna güvenmektedir. Geçmişte, yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile NMG izolasyonu, yüksek miktarda substantia nigra dokusunun mevcudiyetine dayanıyordu20,21. Günümüzde LMD, NMG'leri insan beyni örneklerinden özel olarak izole etmek ve daha sonra LC-MS / MS ile analiz etmek için çok yönlü bir araç sunmaktadır.
Bu protokolde, NMG'lerin ve çevresindeki dokunun (SN) izolasyonu için önceki bir protokol22'nin geliştirilmiş ve otomatikleştirilmiş bir versiyonu sunularak daha hızlı bir numune üretimi, daha fazla sayıda tanımlanmış ve nicelleştirilmiş protein ve gerekli doku miktarlarının ciddi şekilde azaltılması sağlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan beyin dokusunun kullanımı, Alman yönetmeliklerine ve yönergelerine göre, Almanya'daki Bochum Ruhr Üniversitesi etik komitesi (dosya numarası 4760-13) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol ticari olarak elde edilen substantia nigra pars compacta doku dilimlerine uygulanmıştır. Sunulan protokolün grafiksel bir genel bakışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Doku kesitleme
- Kriyostat odasını önceden soğutun.
NOT: Her doku, ilgili satıcı protokolünde bulunabilen farklı kriyostat sıcaklıkları gerektirir. - Paslanmaz çelik bıçağı %70 etanol ile temizleyin ve bıçak tutucuya takın.
- Dokuyu -80 °C dondurucudan kriyostata bir buz kutusu kullanarak aktarın ve 15 dakika boyunca kriyostat odası sıcaklığına ayarlanmasına izin verin.
- Membran slaytlarını bir kalem kullanarak açık bir şekilde etiketleyin.
NOT: PET/PEN membran slaytları, LMD tabanlı numune toplama için gereklidir. PET/PEN membran kızaklarını son derece kırılgan oldukları için dikkatli kullanın. - Doku tutucuya bir damla ticari dondurulmuş kesit ortamı uygulayın. Tamamen donmadan önce, dokuyu dondurulmuş bölüm ortamına yerleştirin ve sertleşmesine izin verin, böylece doku doku tutucuya bağlanır.
- Doku tutucuyu kriyostat odasına takın ve bölüme başlamadan önce yönünü ayarlayın. Optimal tutucu oryantasyonu, dokunun oryantasyonuna bağlıdır.
NOT: Dilimler için gerekli kesit düzlemine ulaşılana kadar dokunun kesilmesi gerekebilir. - İlgilenilen doku alanına ulaşılmadan önce, kesme ayarını istenen doku kalınlığına ayarlayın.
NOT: 5 veya 10 μm, bu protokol için önerilen kalınlıktır, çünkü 20 μm kalınlığındaki kesitlerin LMD tabanlı numune toplama22 ile uyumsuz olduğu bulunmuştur. - İki bölümü kesin ve atın.
- Anti-roll Plate'i yere koyun.
- Dokunun bir bölümünü kesin, Anti-roll Plate'i dikkatlice açın, bir membran slaytı alın ve doku bölümünü membran slaytına yerleştirirken dokunun katlanmasını önleyin.
NOT: Membran kızaklarının yapışmadan önce oda sıcaklığında saklanması, numunenin doğru şekilde takılmasını sağlar. Aynı membran sürgüsüne birkaç kesit yerleştirilebilir, ancak doku örtüşmesi önlenmelidir. - Membran slaytları üzerine yerleştirilen doku kesitlerini, kesitleme tamamlanana kadar kriyostatta saklayın.
- Kriyoseksiyonlu dokuyu daha sonraki işlemlere kadar -20 ° C'de saklayın veya doğrudan aşağıdaki prosedüre devam edin. Kesitli doku slaytlarını daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
2. Lazer Mikrodiseksiyon ve Basınç Mancınığı
NOT: Nöromelanin granülleri siyah-kahverengimsi renkleri nedeniyle lekelenmeden görülebildiğinden, bu protokol için lekelenmeye gerek yoktur. Bununla birlikte, gerekirse farklı boyama prosedürleri bu protokol ile birleştirilebilir. Bloke edici çözeltilerin veya antikorların kullanılmasının LC-MS/MS analizlerini etkileyeceğini unutmayın.
- MicroBeam sistemini açın ve bilgisayarda ilgili yazılımı açın (bkz.
- Doku zarı slaytını, doku yukarı bakacak şekilde RoboStage'deki SlideHolder'a yerleştirin.
NOT: LMD cihazına bağlı olarak, membran kızağını doku aşağı bakacak şekilde yerleştirmek gerekebilir. Genel olarak, numune toplama, optimum ve tekrarlanabilir koşulları sağlamak için sıcaklık kontrollü bir ortamda gerçekleştirilir. - Genel bakış taramaları için mikroskopu istenen büyütmeye ayarlayın (burada 50 kat kullanılır).
- Doku bölümünün genel bir taramasını elde etmek için yazılım arabiriminin Gezgin penceresinde bulunan Tarama işlevini kullanın. İlgi alanının sol üst köşesini ve sağ alt köşesini arayın ve yazılım arayüzünde seçin. Ardından, taramaları gerçekleştirmek için Tüm YG'leri tara'yı seçin.
NOT: Genel bakış taramaları zorunlu değildir, ancak slaytta daha iyi yönlendirme sağlar ve daha sonra kullanılmak üzere kaydedilebilir. - Mevcut nöromelanin granülleri durumunda 400 kat olan uygun doku için mikroskobun büyütülmesini ayarlayın.
- Nöromelanin granülleri içeren bir alan arayın. Yazılım arayüzünde Görüş Alanı Analizi'ni seçin, Sonucu Tersine Çevir'i seçin ve RGB kanallarının eşiğini, önizleme penceresinde yalnızca nöromelanin granülleri kırmızı renkle vurgulanacak şekilde ayarlayın. Görüş alanı için ayarlanan ayarları kullanmak üzere Tamam'a tıklayın.
NOT: Koyu renge sahip daha küçük nesnelerin de seçilmesi söz konusu olabilir. Bunu hesaba katmak için, nöromelanin granüllerini izole etmeden önce 100μm2'den daha küçük bir alanı kaplayan tüm nesneleri atın. Bunu yapmak için, araç çubuğundaki simgeye tıklayarak Öğe Listesi'ni açın, incelenen slaytı seçin ve öğeleri alana göre sıralayın. 100μm2'den küçük alanlara sahip olanları seçin ve silin. - Lazer ayarlarını, slaytın yalnızca membran tarafından kaplanmış bir alanını kullanarak yapın.
NOT: Kesim Lazer Ayarlama Sihirbazı'nı kullanmanız ve yazılımın talimatlarını izlemeniz önerilir. Gerekli lazer ayarları farklı slaytlar arasında farklılık gösterebilir. 400 kat büyütmeli 5 μm kesitler için tipik ayarlar kesme için 32 enerji ve 51 odak ve lazer darbe mancınığı (LPC) için 28 enerji ve -1 odaktır. - Uygun izolasyonu sağlamak için konumlandırma ve kesme için hız ayarlarını yapın.
NOT: %30 hızın NMG izolasyonu için en uygun olduğu bulunmuştur. - Numune toplama tüpü kapağını 50 μL ultra saf suyla doldurun ve kapağı RoboMover'ın kolektörüne yerleştirin.
NOT: Mevcut deneyler için kullanılan tüp toplayıcı, bir seferde bir numune toplama tüpü taşıyabilir. - Örnek toplamayı başlatmak için yazılım arayüzünü kullanarak RoboMover'ı RoboStage II'nin üzerine yerleştirin.
NOT: Bunu yapmak için, toplayıcıyı görüntüleyen RoboMover penceresini açın. Kapağı çalışma alanına taşımak için RoboMover penceresinde görüntülenen numune toplama tüp kapağına tıklayın. RoboMover penceresinde optimum hareket ve çalışma yüksekliğini ayarlayın. Aksi takdirde, kapaktaki su kızağın üzerine düşebilir veya mancınıkla fırlatılan nesneler kapağa ulaşmaz. - Lazeri başlatın. Lazer işlemi sırasında enerji ve odak ayarlarını kontrol edin ve gerekirse ayarları yapın. İzole edilen nesnelerin en az ilk on nesne için numune toplama tüpü kapağına uygun şekilde yalıtıldığından ve mancınıkla fırlatıldığından emin olun.
NOT: Uygun izolasyon ve mancınıklama görsel olarak kontrol edilmelidir. Her ikisi de doku diliminde önceden seçilmiş nesnenin boyutunda dokusuz bir alanla sonuçlanmalıdır (bkz. Şekil 2C, D). Nesne kesildikten ve mancınıkla fırlatıldıktan sonra doku dilimine bağlı kalırsa lazer ayarlarını yapın. Mancınık için, CenterRoboLPC seçeneğinin NMG izolasyonu için çok uygun olduğu bulunmuştur. Mancınık ayarları, Öğe Listesi'nde seçilen her nesne için ayarlanabilir. - Örnekleme tamamlandığında, RoboMover'ı başlangıç konumuna getirin. Numune toplama tüpünü çıkarın.
NOT: Toplanan nesnelerin sayısı oldukça düşük ve nesneler yeterince büyük olduğunda, numune toplama tüpü kapağını mikroskop altına yerleştirecek olan Cap Check'e tıklanarak numune toplanması sağlanabilir, böylece kapaktaki suyun içindeki nesnelerin sayısı sayılabilir (bkz. Şekil 2H). - Bir santrifüj kullanarak numuneyi döndürün. Santrifüjün hızlanması nedeniyle artan santrifüj kuvveti ile 5 sn'lik kısa spinler yeterli bulunmuştur. Bu noktada, numuneleri -80 °C'de saklayın, çünkü tüm numuneler birlikte daha fazla işlenmelidir.
NOT: Proteomik profilin karşılaştırılması için, NMG'leri çevreleyen doku da eksizyonlarından sonra izole edildi. Çevreleyen dokunun izolasyonu 50 kat büyütmede yapıldı. - Numuneleri vakum yoğunlaştırıcıda kurutun. 50 μL su için 1.5 saat yeterli bulunmuştur.
- Dokuyu 20 dakika (oda sıcaklığında) 40 μL formik asit içinde çözündürün ve lize edin.
- Bir sonication banyosunda 45 dakika boyunca 5 kHz'de (kilohertz) sonikasyon ile doku lizisini artırın. Tüplerin erimesini önlemek için sonikasyon banyosunu buzla doldurun. Numuneleri bir sonraki işleme kadar -80 °C'de saklayın.
3. Triptik sindirim
- Buz üzerindeki örnekleri dondurun.
- Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcısında tamamen kurulayın.
- Numuneyi 50 μL uygun bir sindirim tamponuyla, örneğin 50 mM amonyum bikarbonatla doldurun.
- 1.25 μL 200 mM 1,4-dithiothreitol ilavesinden sonra, numuneleri bir termomikser kullanarak 60 ° C ve 300 rpm'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra oda sıcaklığına (RT) soğutun.
- Daha sonra, 1.36 μL 0.55 M iyodoasetamit ilavesinden sonra karanlıkta 30 dakika boyunca RT'de numuneleri inkübe edin.
- Numunelere uygun miktarda tripsin ekleyin ve numuneleri 37 ° C'de gece boyunca (~ 16 saat) inkübe edin.
NOT: 1.000.000 μm2 için 0.1 μg tripsin yeterli bulunmuştur. - Sindirimi durdurmak için numunelere 2,6 μL% 10 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin (% 0,5 TFA'lık son konsantrasyon).
- Bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak numuneleri tamamen kurulayın. Ardından, numuneleri %0,1 TFA ile tanımlanmış bir son hacme kadar doldurun. NMG örnekleri, bir kütle spektrometrik (MS) deneyi için 5 μL'nin kullanıldığı 20 μL'ye kadar dolduruldu.
- Numuneleri daha fazla kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Peptit konsantrasyonunu amino asit analizi veya başka bir uygun niceleme yöntemi (örneğin, Direct Detect) ile belirleyin.
NOT: Düşük numune miktarları, belirtilen teknikler kullanılarak ölçülemeyebilir. Aynı numune yüklemesini sağlamak için, her numune aynı miktarda izole doku içermeli ve her numune eşit şekilde muamele edilmelidir.
4. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi
NOT: Aşağıdaki yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kütle spektrometrik (MS) analizi, burada kullanılan bir yakalama sütunu cihazı ve kütle spektrometresi ile belirli LC sistemi için optimize edilmiştir (bkz. Diğer LC ve MS sistemleri için parametrelerin uyarlanması önerilir.
- Xcalibur yazılımını kullanarak, HPLC ayarlarını aşağıdaki gibi yapın.
- Tuzak kolonu: Sıcaklığı 60 °C'ye, akış hızını 30 μL / dak'ya, çalışan tamponu% 0.1 trifloroasetik aside ayarlayın.
- Analitik C18 ters fazlı kolon: Sıcaklığı 60 °C'ye, akış hızını 30 μL/dak'ya, çalışan tampon A'yı %0,1 trifloroasetik asite, çalışan tampon B'yi %84 asetonitril'e ve gradyanı 98 dakika boyunca %5-%30 çalışan tampon B'ye ayarlayın.
NOT: Degradenin adaptasyonu kaçınılmaz olabilir ve farklı dokular veya hücreler kullanılırken şiddetle tavsiye edilir. Toplam gradyan süresi, gradyanın başındaki numune yüklemesi ve gradyanın sonundaki numune yıkama nedeniyle değişebilir. Bu protokoldeki toplam gradyan, 7 dakikalık numune yükleme ve 15 dakika boyunca ek kolon yıkamadan oluşur ve toplam 120 dakikalık bir gradyan süresi ile sonuçlanır.
- HPLC yazılımı yol haritası menüsünde bulunan XCalibur Instrument Setup'ı kullanarak veriye bağımlı bir alma (DDA) yöntemi oluşturun.
- Global Parametreler sekmesinde, infüzyon modu Sıvı Kromatografisi, Beklenen LC Tepe Genişliği (30 sn) ve Varsayılan şarj durumunu (2) tanımlayın.
- Tarama Parametreleri sekmesine ilerleyin ve aşağıdaki taramaları ve filtreleri belirtilen sırayla ekleyin: MS OT, MIPS, Yoğunluk, Şarj Durumu, Dinamik dışlama ve ddMS2 OT HCD.
NOT: Her tarama ve filtre için ayrıntılı parametre ayarları Ek Tablo 1'de bulunabilir. Optimal MS ve DDA ayarları, kullanılan spesifik kütle spektrometresine ve numune tipine göre değişebilir ve bu nedenle uyarlanmalıdır. - İnert kütle spektrometrik cam şişe girişlerinde 200-400 ng numune peptidini% 0.1 TFA'lık tanımlanmış bir hacimde çözerek numuneler hazırlayın. Düşük numune miktarı nedeniyle konsantrasyon tayini mümkün değilse, Toplam İyon Akımını (TIC) karşılaştırarak aynı numune yüklemesini doğrulayın.
NOT: Bunu yapmak için, elde edilen kütle spektrometrik ölçüm dosyasını uygun bir yazılımda, örneğin FreeStyle'da açın ve kromatogramı kontrol edin. Yoğunluklar tüm numuneler için karşılaştırılabilir olmalıdır. Temsili bir TIC Şekil 3'te gösterilmiştir. - MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics, veya Proteome Discoverer gibi proteomik uygun bir yazılım kullanarak elde edilen ham verileri analiz edin ve araştırma sorusuna dayalı istatistiksel bir veri analizi gerçekleştirin.
5. MaxQuant kullanarak proteomik ham verilerin analizi
NOT: MaxQuant parametreleri hakkında ayrıntılı bilgi Ek Tablo 2'de verilmiştir. Aşağıda kısaca açıklanmıştır.
- Ham veri üstbilgisindeki MaxQuant yazılımına Yükle'yi tıklatarak ham dosyaları yükleyin.
- Denemeyi Ayarla'ya tıklayarak örnek adlar atayın.
- Gruba özgü parametreleri tanımlayın. İlk olarak, değişiklikler ekleyin. Numune işleme nedeniyle, değişken modifikasyonlar olarak Deamidasyon (NQ), Oksidasyon (M) ve Karbamidometilasyonu (N-term) seçin ve sabit modifikasyon olarak Karbamidometilasyon (C) ekleyin.
- Sindirim sekmesinde sindirim enzimi olarak Tripsin'i seçin.
- Etiketsiz niceleme seçeneği LFQ'yu Etiketsiz Niceleme sekmesine ekleyin. 10'dan fazla dosya işlenecekse, işleme süresini kısaltmak için Hızlı LFQ seçeneğini belirleyin. Protein niceliği için bir ölçüt olarak iBAQ seçeneğini ekleyin24.
- Gruba özgü diğer tüm parametrelerin fabrika ayarlarında kaldığından emin olun.
- Genel Parametreler sekmesine ilerleyin ve uniprot.org türetilen FASTA dosyasını Diziler sekmesine ekleyin. Tanımlayıcı kuralı uygun şekilde değiştirin ve taksonomi kimliğini, bu durumda, homo sapiens için 9606'yı ekleyin.
- Protein niceliği için Benzersiz ve Jilet peptitlerini seçin.
- Diğer tüm genel parametrelerin fabrika ayarlarında kaldığından emin olun.
- Başlat'a tıklayın ve Perseus'ta daha fazla analiz için MaxQuant analizinden sonra protein gruplarının.txt çıktısını alın.
6. Perseus kullanarak istatistiksel analiz
- Protein gruplarını .txt dosyasını Perseus'a yükleyin, iBAQ değerlerini ana sütunlar olarak ekleyin ve diğer tüm sütunları türlerine göre sıralayın.
- Satırları kategorik sütuna göre filtreleyerek tuzakları ve kirleticileri filtreleyin.
- Sonuçları geçerli değerlere göre filtreleyin. Mevcut durumda, analize dahil edilen sadece iki örneklemle, en az bir geçerli değer sayısı seçilmiştir.
- Perseus çıktısını, örneğin Excel'de daha fazla işlem için .txt biçiminde dışa aktarın ve araştırma sorusuyla ilgili sonuçları değerlendirin.
7. Seçilen proteinlerin doğrulanması
NOT: MS verilerinin doğrulanması için yaygın olarak kullanılan yöntemler, örneğin, immünolojik boyama veya Western Blot'tur. Nöromelaninin koyu rengi ve otofloresansı nedeniyle, nöromelanin granüllerinin içindeki proteinlerin yaban turpu peroksidaz veya florofor konjuge antikorlarla immünolojik boyanması mümkün değildir. Western Blot analizi için, çok büyük miktarlarda post-mortem doku gerekli olacaktır. Bu nedenle, seçilen proteinler hedeflenen kütle spektrometrisi ile doğrulanır ve bu durumda paralel reaksiyon izleme (PRM) deneyleri kurulmuştur.
- Doğrulama için proteinleri seçin. DDA deneylerinde zaten tespit edilen bu proteinlerin peptitlerini seçin. Peptitler, güvenilir bir niceleme sağlamak için kaçırılmış bölünmeler veya modifikasyonlar içermemelidir.
NOT: Belirli bir proteinin doğrulanmasının birkaç nedeni olabilir, örneğin, araştırılan koşullardaki diferansiyel bolluklar. Temsili sonuçlar için, NMG ve SN örneklerinde eşdeğer derecede bol olduğu ve bu nedenle eşit numune yüklemesini sağlamak için referans olarak kullanılabilecek sitoplazmik dinein 1 ağır zincir 1 seçilmiştir. - HPLC yazılımını kullanarak PRM yönteminin ilk sürümünü kurmak için seçilen peptitleri kullanın. Tüm kromatografi ve global parametre ayarlarını DDA yönteminden saklayın.
- MS OT ve tMS2 OT HCD'yi tarama türleri olarak ekleyin. MS OT ayarlarının DDA yöntemiyle aynı olduğundan emin olun. PRM yönteminin ayrıntılı ayarları Ek Tablo 1'de bulunabilir.
- tMS2 OT HCD için, seçilen peptitleri ekleme listesi olarak ekleyin. Bu nedenle, amino asit dizisini ve DDA ölçümlerinde gözlenen m / z değerini ekleyin. İlk PRM denemesi için bekletme süresi pencereleri eklemeyin veya t start değerini 0 ve t stop değerini 120 olarak ayarlamayın (120 dakikalık bir gradyan için).
- Ölçümden sonra PRM yöntemini, örneğin Skyline gibi uygun bir yazılım kullanarak değerlendirin ve dahil etme listesine eklenen peptitlerin tutma süresini elde edin. Dahil edilen peptitler için, karşılaştırılabilir tepe noktalarının MS1 taramalarında en az üç öncü iyon ve MS2 taramalarında düşük kütle hatasıyla (±5 ppm) beş parça iyonu için gözlemlenebilir olduğunu kontrol edin.
- PRM yöntemini, örneğin, tMS2 OT HCD taraması için çözünürlüğü artırarak ve ekleme listesine bekletme süresi pencereleri ekleyerek hassaslaştırın.
NOT: 3 dakikalık tutma süresi pencerelerinin mevcut deneylerde çok uygun olduğu bulunmuştur (ilk PRM deneyinde gözlenen tutma süresi 1,5 dakika ±). - Rafine PRM yöntemi ile, uygun bir yazılımla hem MS1 hem de MS2 seviyelerinde zirve alanına dayalı olarak ilgilenilen peptitlerin ve proteinlerin niceliğini gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NMG'lerin ve SN dokusunun spesifik izolasyonu, bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için en önemli adımdır. LMD'nin satıcı tarafından sağlanan yazılımındaki Görüş Alanı Analizi işlevi kullanılarak NMG'ler renge bağlı bir şekilde otomatik olarak seçilebilir. Bu nedenle, NMG'leri içeren doku alanları (Şekil 2A) tanımlanmalı ve NMG'lerin etiketlenmesiyle sonuçlanan ayarlanmış renk eşiklerine sahip bir Görüş Alanı Analizi yapılmalıdır (Şekil 2B). 100 μm²'nin altındaki bir alanı kaplayan nesneler filtrelendikten sonra, yalnızca NMG'ler izolasyon için etiketlenmiş olarak kalmalıdır (Şekil 2C). Etiketli NMG'lerin hassas izolasyonu, lazer ayarları ayarlandıktan sonra elde edilir (Şekil 2D). NMG'lerin izolasyonundan sonra (Şekil 2E), SN dokusu proteomik profilin karşılaştırılması için 50 kat büyütme (Şekil 2F) ile seçilebilir ve izole edilebilir (Şekil 2G). SN dokusu için, izole edilmiş nesneler Cap Check işlevi kullanılarak görselleştirilebilir (Şekil 2H). Her iki örnek tipi için, NMG ve SN, 500.000μm2 beyin dokusunun izolasyonunun bu protokol için yeterli olduğu bulundu ve örnek başına en az üç MS çalışması sağlandı.
120 dakikalık bir DDA deneyinin temsili bir örneği Şekil 3'te gösterilmiştir (ana sütun ölçümün son 15 dakikasında yıkandığından, kromatogram 105 dakikadan hemen önce kırpılır). Uygulanan yöntem, tüm gradyan üzerinde bir numune elüsyonuna izin vermeli, keskin ve özlü pikler oluşturmalı ve Toplam İyon akımının (TIC) yoğunluğu tüm numunelerde karşılaştırılabilir olmalıdır.
Sunulan protokolün 500.000 μm²'lik bir NMG örneği ve MS örnekleri için ayarlanmış hacimlere sahip 1.000.000 μm²'lik bir SN dokusu örneği (NMG için 5 μL ve SN için 2.5 μL) üzerinde aynı peptid yükünü sağlamak için uygulanması, NMG örneğinde 1.898 protein grubunun (PG) ve SN örneğinde 1.565 PG'nin tanımlanmasıyla sonuçlanmıştır. Daha ileri karşılaştırma, her iki örnekte de 1.384 PG'nin tanımlandığını, 514 PG'nin sadece NMG ve 181 PG'nin SN dokusunda tanımlandığını ortaya koymuştur (Şekil 4). Toplamda, bu temsili deneyde 2.079 PG tanımlanmıştır. Eski bir çalışma22'den alınan bir referans veri seti ile karşılaştırıldığında, bu çalışmada bildirilen PG'lerin% 87.6'sının mevcut gözden geçirilmiş ve otomatik protokol tarafından da tanımlanabileceğini ve uygulanabilirliğini kanıtladığını göstermiştir. Ayrıca, tanımlanan PG'lerin sayısı 1.143 oranında iyileştirilebilir.
Minimum numune miktarları, Western Blots gibi klasik doğrulama yöntemlerinin uygulanmasına izin vermediğinden, ilgili proteinlerin doğrulanması, PRM gibi hedeflenen kütle spektrometrik yaklaşımlarıyla sağlanabilir. Protein sitoplazmik dinein 1 ağır zincir 1'in peptid ESPEVLLTLDİLK'i için temsili sonuçlar Şekil 5'te gösterilmiştir. Bu proteinin iBAQ değerinin, DDA ölçümlerinde SN'ye kıyasla NMG'lerde biraz daha yüksek olduğu bulunmuştur; bu, MS1- (Şekil 5A, B, E) ve MS2 seviyesindeki (Şekil 5C, D, F) tepe alanına dayanan PRM deneyleri ile doğrulanabilir.
Şekil 1: Nöromelanin granüllerinin (NMG'ler) ve çevresindeki dokunun (SN) proteomik karakterizasyonu için iş akışı. NMG ve SN örnekleri lazer mikrodiseksiyon (LMD) ile doku dilimlerinden izole edildi. Proteinler izole edildi ve triptik solüsyon içi sindirim yapıldı. Elde edilen peptitler, veriye bağımlı toplama (DDA) modunda LC-MS / MS ölçümleri ile analiz edildi. Veri analizi MaxQuant ve Perseus yazılımları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Seçilen proteinlerin validasyonu paralel reaksiyon izleme (PRM) deneyleri ile gerçekleştirilmiştir. PRM verileri Skyline yazılımı kullanılarak analiz edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: NMG ve SN örneklerinin seçimi ve LMD tabanlı izolasyonu. İlk başta, 400 kat büyütmede daha fazla lekelenmeden görülebilen NMG'leri içeren bir alan mikroskop altına yerleştirilir (A). Bir Görüş Alanı Analizi yapıldıktan sonra, NMG'ler ve diğer karanlık alanlar seçilir (B). Filtrelemeden (C) sonra yalnızca NMG'ler seçili kalır ve lazer ayarları yapıldıktan sonra (D) izole edilir. Tüm NMG'ler izole edildikten (E) sonra, SN dokusu 50 kat büyütme (F) ve izole (G) ile seçilir. SN numuneleri için izole edilen nesneler oldukça büyük olduğundan, Cap Check işlevi (H) kullanılarak numune toplama kapağında gözlemlenebilirler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 120 dakikalık DDA ölçümünün Toplam İyon Akımı (TIC). Kromatogram, 0 ila ~ 105 dakika arasındaki tutma süresi aralığında salınan peptitlere karşılık gelen iyonların göreceli bolluğunu gösterir. Ana kolon 105. ve 120. dakikalar arasında yıkanırken, kromatogram 105. dakikada kırpılır. En yüksek zirvenin yoğunluğu 2.86 x 108'dir. Zirvelerin üzerindeki sayılar, tutma süresini ve bu belirli zirvenin en bol iyonunu gösterir (BP = taban tepe noktası). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: NMG'lerde ve SN dokusunda tanımlanan protein gruplarının (PG'ler) yazışmalarını gösteren Venn Diyagramı. Toplamda, NMG'lerde 1.898 PG ve SN dokusunda 1.565 PG tanımlanmıştır ve bunların 1.384'ü her iki doku bölgesinde de tanımlanmıştır. 514 PG sadece NMG dokusunda tanımlanırken, 181 PG sadece SN dokusunda tanımlanmıştır. Diyagram, çevrimiçi araç Venny25 kullanılarak oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ESPEVLLTLDILK peptidi (sitoplazmik dinein 1 ağır zincir 1, ++) için PRM deneylerinin sonuçları. MS1- (A,B) ve MS2-level (C,D)'deki kromatogramların yanı sıra MS1- (E) ve MS2-level (F)'deki tepe bölgeleri, NMG'lerin ve SN dokusunun örnek bir örneği için gösterilmiştir. Farklı öncülleri (MS1 düzeyinde) veya ürün iyonlarını (MS2 düzeyinde) belirtmek için farklı renkler kullanılır. Kromatogramlar Savitzky-Golay Düzgünleştirme yapıldıktan sonra görüntülenir. Yoğunluklar ve pik alanlar MS1- (A,B,E) ve MS2-seviyesinde (C,D,F) karşılaştırılabilirdi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Kütle spektrometresi deneylerinin parametreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 2: MaxQuant analizinin parametreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD, spesifik doku alanlarının, tek hücrelerin veya hücre altı yapıların izolasyonu için yaygın olarak uygulanan bir tekniktir. Burada sunulan revize edilmiş ve otomatik protokolde, bu teknik nöromelanin granüllerinin (NMG'ler) ve NMG'yi çevreleyen dokunun (SN) spesifik izolasyonu için uygulanır. Şimdiye kadar, NMG'lerin insan post-mortem beyin dokusundan izole edilmesi için iki farklı yaklaşım yayınlanmış ve yaygın olarak kullanılmıştır:
a) 1 g substantia nigra dokusu tüketen süreksiz bir sakkaroz gradyanı20. İnsan post-mortem substantia nigra dokusu nadir olduğundan ve çeşitli araştırma soruları için yüksek ilgi gördüğünden, hasta başına yüksek miktarda doku gerekiyorsa, büyük bir kohort çalışması kurmak ne yazık ki oldukça zordur. Bu nedenle, bu yaklaşım, NMG'lerin26'sının yeterli izolasyonu için gerekli doku miktarının 0.15 g'a düşürülmesiyle daha da geliştirilmiştir. Bununla birlikte, yine de, tam bir substantia nigra pars compacta'nın en az yarısı gerekliydi.
b) LMD kullanılarak NMG'lerin eksizyonu. 2016 yılında Plum ve arkadaşları, NMG'lerin LMD yoluyla hassas eksizyonuna dayanan yeni bir protokol oluşturdu. Bu protokolle, gerekli numune miktarı on adet 10 μm doku kesitine düşürülebilir ve bu da gerekli doku örneğinin 150 mg'dan 16.6 mg22'ye etkileyici bir şekilde azaltılmasıyla sonuçlanır.
Burada sunulan optimize edilmiş ve otomatikleştirilmiş LMD tabanlı protokol, daha ince (10 μm'ye kıyasla 5 μm) ve daha az doku kesitinin (8'e kıyasla maksimum 7 μm) kullanılması gerektiğinden daha düşük numune miktarları gerektirir ve otomatik NMG tespiti kullanılarak numune üretimi için daha az zaman gerektirir (1-2 güne kıyasla numune başına 4 saat). Böylece, gerekli numune toplama süresi büyük ölçüde kısaltıldı ve optimize edilmiş bir LC-MS yöntemi ve son teknoloji enstrümantasyon uygulanarak tanımlanan PG'lerin sayısı büyük ölçüde artırılabilir. Bu protokol diğer araştırma sorularına ve dokulara kolayca uyarlanabilir.
Kullanıcı tanımlı araştırma sorularıyla ilgili sunulan protokolün uyarlanması için, deneyime dayanarak aşağıdaki hususlar vurgulanmaktadır:
a) Karşılaştırılabilir numune miktarlarının izolasyonu: Bu protokolün beklenen peptid verimi, örneğin hücre kültürü veya doku lizatlarına kıyasla oldukça düşük olduğundan, peptid konsantrasyonunun belirlenmesi mümkün olmayabilir. Bu nedenle, seçilen nesnelerin doku alanına göre tahmin edilebilen LMD aracılığıyla eşit miktarda dokunun izole edilmesi çok önemlidir. Mevcut kurulumda, 500.000 μm²'lik doku alanları, en az üç MS ölçümü için peptitlerin üretilmesi için yeterlidir.
b) Tripsin-sindirim: Sindirim süresi ve tripsin konsantrasyonu numuneler arasında karşılaştırılabilir olmalıdır.
c) Farklı dokular için parametrelerin uyarlanması: Analiz edilecek dokuya bağlı olarak, toplanan doku miktarının ayarlanması gerekir, böylece ilave tripsin miktarının da ayarlanması gerekir. Tripsin / protein oranı 1:40'tan düşük olmamalıdır.
d) LMD sürecinin sınırlandırılması: İlgilenilen nesnelerin LMD tabanlı izolasyonu için, seçilen nesnelerin boyutu ve dilimlerin kalınlığı söz konusu olduğunda sınırlamalar vardır. Dokunun lazer tabanlı kesilmesi sırasında doku kaybı nedeniyle, 100 μm²'den küçük nesneler izolasyon için çok küçük kabul edildi.
e) LC ve MS parametrelerinin uyarlanması: Kullanılan LC ve MS sistemlerine bağlı olarak, izole edilmiş doku miktarı arttırılmalı (örneğin, bir mikroflow sistemi ile çalışırken) ve MS parametreleri uyarlanmalıdır (örneğin, iyon tutucu tabanlı bir dedektör sistemi ile çalışırken).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma de tarafından desteklenmiştir. NBI, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın (BMBF) (hibe numarası FKZ 031 A 534A) ve P.U.R.E. (Avrupa Protein Araştırma Birimi Ruhr) ve Protein Teşhis Merkezi'nin (ProDi) bir projesi, her ikisi de Almanya'nın Kuzey-Ren Vestfalya eyaletindeki Yenilik, Bilim ve Araştırma Bakanlığı'ndan hibe alıyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
