Summary
Un robusto protocollo è presentato qui per isolare i granuli di neuromelanina dal tessuto umano post-mortem substantia nigra pars compacta tramite microdissezione laser. Questo protocollo rivisto e ottimizzato riduce drasticamente il tempo necessario per la raccolta dei campioni, riduce la quantità di campione richiesta e migliora l'identificazione e la quantificazione delle proteine mediante analisi LC-MS/MS.
Abstract
La neuromelanina è un pigmento nero-brunastro, presente nei cosiddetti granuli di neuromelanina (NMG) nei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta. Oltre alla neuromelanina, gli NMG contengono una varietà di proteine, lipidi e metalli. Sebbene i neuroni dopaminergici contenenti NMG siano persi preferenzialmente nelle malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e la demenza con corpi di Lewy, si sa solo poco sul meccanismo di formazione di NMG e sul ruolo dei NMG nella salute e nella malattia. Pertanto, ulteriori ricerche sulla caratterizzazione molecolare degli NMG sono essenziali. Sfortunatamente, i protocolli standard per l'isolamento delle proteine si basano sull'ultracentrifugazione a gradiente di densità e quindi richiedono elevate quantità di tessuto umano. Pertanto, qui viene stabilito un protocollo automatizzato basato sulla microdissezione laser (LMD) che consente la raccolta di NMG e tessuto circostante di substantia nigra (SN) utilizzando quantità minime di tessuto in modo imparziale e automatizzato. I campioni asportati vengono successivamente analizzati mediante spettrometria di massa per decifrare la loro composizione proteomica. Con questo flusso di lavoro, sono state identificate 2.079 proteine, di cui 514 proteine sono state identificate esclusivamente in NMG e 181 in SN. I risultati attuali sono stati confrontati con uno studio precedente utilizzando un approccio simile basato su LMD raggiungendo una sovrapposizione dell'87,6% per entrambi i proteomi, verificando l'applicabilità del protocollo rivisto e ottimizzato qui presentato. Per convalidare i risultati attuali, le proteine di interesse sono state analizzate mediante spettrometria di massa mirata, ad esempio esperimenti di monitoraggio delle reazioni parallele (PRM).
Introduction
Ogni tessuto è costituito da una miscela eterogenea di diversi tipi cellulari, ma l'isolamento specifico di un tipo di cellula è spesso indispensabile per una caratterizzazione più precisa. La microdissezione laser (LMD), che accoppia un microscopio con un'applicazione laser, è un potente strumento per l'isolamento specifico di aree tissutali, singole cellule o sottostrutture cellulari da un composito complesso. L'applicazione di LMD in combinazione con la spettrometria di massa (LMD-MS) è già stata implementata con successo per diverse domande di ricerca, tra cui l'isolamento del DNA1, RNA2 e proteine 3,4,5. In questo protocollo, viene descritto un protocollo LMD-MS rivisto e ottimizzato per l'analisi proteomica del tessuto cerebrale umano post-mortem e dei componenti subcellulari per decifrare nuovi meccanismi patologici della malattia di Parkinson.
La neuromelanina è un pigmento nero, quasi insolubile trovato nei neuroni catecolaminergici, produttori di dopamina della substantia nigra pars compacta6. Insieme alle proteine e ai lipidi, si accumula in granuli simili a organelli circondati da una doppia membrana, chiamata granuli di neuromelanina (NMG)7,8,9. Gli NMG possono essere osservati dall'età di tre anni nell'uomo aumentando in quantità e densità durante il processo di invecchiamento10,11. Ad oggi, non esiste un'ipotesi definitiva sulla formazione di neuromelanina, ma un'ipotesi è che la neuromelanina si formi attraverso l'ossidazione della dopamina12. Altre ipotesi si basano sulla produzione enzimatica di neuromelanina (ad esempio, tirosinasi)13. La neuromelanina stessa è stata trovata per avere un'alta affinità di legame a lipidi, tossine, ioni metallici e pesticidi. Sulla base di questi risultati, si presume che la formazione di NMG protegga la cellula dall'accumulo di sostanze tossiche e ossidative e dalle tossine ambientali14,15. Oltre a questa funzione neuroprotettiva, ci sono prove che la neuromelanina può causare effetti neurodegenerativi, ad esempio, dalla saturazione del ferro e dalla successiva catalisi dei radicali liberi16,17. Inoltre, la neuromelanina rilasciata durante i processi neurodegenerativi può essere decomposta dal perossido di idrogeno, che potrebbe accelerare la necrosi da metalli reattivi e altri composti tossici precedentemente legati alla neuromelanina e può contribuire alla neuroinfiammazione e al danno cellulare18. Tuttavia, fino ad ora il ruolo esatto dei NMG nei processi neurodegenerativi come nel corso della malattia di Parkinson non è chiaramente compreso. Tuttavia, gli NMG sembrano essere coinvolti nella patogenesi della malattia di Parkinson e la loro analisi specifica è della massima importanza per svelare il loro ruolo nella neurodegenerazione. Sfortunatamente, gli animali da laboratorio comuni (ad esempio, topi e ratti) e le linee cellulari mancano di NMG19. Pertanto, i ricercatori si affidano in particolare al tessuto cerebrale post-mortem per la loro analisi. In passato, l'isolamento NMG mediante centrifugazione a gradiente di densità si basava sulla disponibilità di elevate quantità di tessuto substantia nigra 20,21. Oggi, LMD presenta uno strumento versatile per isolare specificamente NMG da campioni di cervello umano per poi analizzarli mediante LC-MS / MS.
In questo protocollo, viene presentata una versione migliorata e automatizzata di un precedente protocollo22 per l'isolamento di NMG e tessuto circostante (SN), consentendo una generazione più rapida del campione, un numero più elevato di proteine identificate e quantificate e una grave riduzione delle quantità tissutali richieste.
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Protocol
L'uso di tessuto cerebrale umano è stato approvato dal comitato etico della Ruhr-University Bochum, Germania (numero di fascicolo 4760-13), secondo le normative e le linee guida tedesche. Questo protocollo è stato applicato su fette di tessuto substantia nigra pars compacta ottenute commercialmente. Una panoramica grafica del protocollo presentato è mostrata nella Figura 1.
1. Sezionamento dei tessuti
- Preraffreddare la camera del criostato.
NOTA: Ogni tessuto richiede temperature di criostato diverse, che possono essere trovate nel rispettivo protocollo del fornitore. - Pulire il coltello in acciaio inossidabile con etanolo al 70% e installarlo nel supporto della lama.
- Trasferire il tessuto dal congelatore a -80 °C al criostato utilizzando una ghiacciaia e lasciarlo regolare alla temperatura della camera del criostato per 15 minuti.
- Etichettare in modo inequivocabile le diapositive a membrana usando una matita.
NOTA: i vetrini a membrana PET/PEN sono necessari per la raccolta di campioni basata su LMD. Maneggiare con cura i vetrini a membrana PET/PEN in quanto estremamente fragili. - Applicare una goccia di mezzo di sezione congelato commerciale sul supporto del tessuto. Prima che sia completamente congelato, posizionare il tessuto sul mezzo della sezione congelata e lasciarlo indurire, in modo che il tessuto sia collegato con il supporto del tessuto.
- Installare il supporto del tessuto nella camera del criostato e regolarne l'orientamento prima di iniziare la sezione. L'orientamento ottimale del titolare dipende dall'orientamento del tessuto.
NOTA: Potrebbe essere necessario tagliare il tessuto fino a raggiungere il piano di sezione necessario per le fette. - Prima di raggiungere l'area del tessuto di interesse, regolare l'impostazione di taglio in base allo spessore del tessuto desiderato.
NOTA: 5 o 10 μm è lo spessore suggerito per questo protocollo poiché sezioni spesse 20 μm sono risultate incompatibili con la raccolta di campioni basata su LMD22. - Tagliare due sezioni e scartarle.
- Posare la piastra antirollio.
- Tagliare una sezione del tessuto, aprire attentamente la piastra antirollio, prendere un vetrino a membrana e prevenire il ripiegamento del tessuto mentre si posiziona la sezione di tessuto sul vetrino della membrana.
NOTA: la conservazione dei vetrini a membrana a temperatura ambiente prima dell'adesione consente un fissaggio accurato del campione. Diverse sezioni possono essere posizionate sullo stesso vetrino di membrana, ma è necessario evitare la sovrapposizione dei tessuti. - Conservare le sezioni di tessuto posizionate su vetrini di membrana nel criostato fino al completamento del sezionamento.
- Conservare il tessuto criosecato a -20 °C fino a ulteriore lavorazione o procedere direttamente con la procedura riportata di seguito. Conservare i vetrini di tessuto sezionato a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
2. Microdissezione laser e catapulta di pressione
NOTA: Poiché i granuli di neuromelanina sono visibili senza alcuna colorazione a causa del loro colore nero-brunastro, non è necessaria alcuna colorazione per questo protocollo. Tuttavia, diverse procedure di colorazione possono essere combinate con questo protocollo, se necessario. Tenere presente che l'uso di soluzioni bloccanti o anticorpi influenzerà le analisi LC-MS/MS.
- Accendere il sistema MicroBeam e aprire il software associato sul computer (vedere Tabella dei materiali).
- Posizionare il vetrino della membrana tissutale nello SlideHolder sul RoboStage con il tessuto rivolto verso l'alto.
NOTA: a seconda del dispositivo LMD, potrebbe essere necessario posizionare il vetrino della membrana in modo tale che il tessuto sia rivolto verso il basso. In generale, la raccolta dei campioni viene eseguita in un ambiente a temperatura controllata per garantire condizioni ottimali e riproducibili. - Impostare il microscopio sull'ingrandimento desiderato (qui si utilizza 50 volte) per le scansioni panoramiche.
- Utilizzare la funzione Scan, disponibile nella finestra Navigator dell'interfaccia del software, per acquisire una scansione panoramica della sezione del tessuto. Cerca l'angolo in alto a sinistra e l'angolo in basso a destra dell'area di interesse e selezionali nell'interfaccia del software. Quindi, selezionare Scansiona tutti i ROI per eseguire le scansioni.
NOTA: le scansioni panoramiche non sono obbligatorie, ma consentono un migliore orientamento nella diapositiva e possono essere salvate per un utilizzo successivo. - Regolare l'ingrandimento del microscopio per il tessuto appropriato, che è 400 volte nel caso presente dei granuli di neuromelanina.
- Cerca un'area con granuli di neuromelanina. Selezionare Analisi campo visivo nell'interfaccia del software, selezionare Inverti risultato e impostare la soglia per i canali RGB in modo che solo i granuli di neuromelanina siano evidenziati in rosso nella finestra di anteprima. Fare clic su OK per utilizzare le impostazioni regolate per il campo visivo.
NOTA: è possibile che vengano selezionati anche oggetti più piccoli di colore scuro. Per tenere conto di ciò, scartare tutti gli oggetti che coprono un'area inferiore a 100 μm2 prima di isolare i granuli di neuromelanina. Per fare ciò, aprire l'Elenco elementi facendo clic sull'icona nella barra degli strumenti, selezionare la diapositiva in esame e ordinare gli elementi per area. Selezionare quelli con aree inferiori a 100 μm2 ed eliminarli. - Regolare le impostazioni laser utilizzando un'area della diapositiva coperta solo dalla membrana.
NOTA: Si consiglia di utilizzare la procedura guidata di regolazione laser Cut e seguire le istruzioni del software. Le impostazioni laser richieste possono variare tra le diverse diapositive. Per sezioni da 5 μm con ingrandimento di 400 volte, le impostazioni tipiche sono 32 energia e 51 messa a fuoco per il taglio e 28 energia e -1 messa a fuoco per la catapulta a impulsi laser (LPC). - Regolare le impostazioni di velocità per il posizionamento e il taglio per garantire un corretto isolamento.
NOTA: la velocità del 30% è risultata ottimale per l'isolamento NMG. - Riempire il tappo del tubo di raccolta del campione con 50 μL di acqua ultrapura e inserire il tappo nel collettore del RoboMover.
NOTA: Il collettore di tubi utilizzato per i presenti esperimenti può trasportare una provetta di raccolta del campione alla volta. - Posiziona il RoboMover sopra RoboStage II utilizzando l'interfaccia software per avviare la raccolta dei campioni.
NOTA: Per fare ciò, apri la finestra RoboMover, che visualizza il raccoglitore. Fai clic sul tappo del tubo di raccolta del campione visualizzato nella finestra RoboMover per spostare il tappo nell'area di lavoro. Regola l'altezza ottimale di movimento e di lavoro nella finestra RoboMover. In caso contrario, l'acqua nel tappo potrebbe cadere sul vetrino o gli oggetti catapultati non raggiungeranno il tappo. - Avviare il laser. Controllare le impostazioni di energia e messa a fuoco durante il processo laser e regolare le impostazioni se necessario. Garantire il corretto isolamento e catapultazione degli oggetti isolati nel tappo della provetta di raccolta dei campioni per almeno i primi dieci oggetti.
NOTA: Il corretto isolamento e catapulta devono essere controllati visivamente. Entrambi dovrebbero risultare in un'area priva di tessuto delle dimensioni dell'oggetto preselezionato nella fetta di tessuto (vedi Figura 2C,D). Regolare le impostazioni del laser se l'oggetto rimane attaccato alla fetta di tessuto dopo il taglio e la catapultazione. Per la catapulta, l'opzione CenterRoboLPC è ritenuta adatta per l'isolamento NMG. Le impostazioni di catapulta possono essere regolate per ogni oggetto selezionato nell'elenco degli elementi. - Al termine del campionamento, guida il RoboMover fino alla sua posizione iniziale. Rimuovere la provetta per la raccolta dei campioni.
NOTA: Quando il numero di oggetti raccolti è piuttosto basso e gli oggetti sono abbastanza grandi, la raccolta dei campioni può essere assicurata facendo clic su Cap Check, che posizionerà il cappuccio della provetta di raccolta del campione sotto il microscopio in modo che il numero di oggetti all'interno dell'acqua nel tappo possa essere contato (vedere Figura 2H). - Far girare il campione usando una centrifuga. Brevi giri di 5 s con forza centrifuga crescente dovuta all'accelerazione della centrifuga sono risultati sufficienti. A questo punto, conservare i campioni a -80 °C, poiché tutti i campioni devono essere ulteriormente elaborati insieme.
NOTA: Per il confronto del profilo proteomico, anche il tessuto che circonda gli NMG è stato isolato dopo la loro escissione. L'isolamento del tessuto circostante è stato eseguito con un ingrandimento di 50 volte. - Asciugare i campioni in un concentratore a vuoto. 1,5 ore sono risultate sufficienti per 50 μL di acqua.
- Solubilizzare e lisare il tessuto in acido formico 40 μL per 20 minuti (temperatura ambiente).
- Migliora la lisi tissutale mediante sonicazione a 45 kHz (kilohertz) per 5 minuti in un bagno di sonicazione. Riempire il bagno di sonicazione con ghiaccio per evitare che i tubi si sciolgano. Conservare i campioni a -80 °C fino a ulteriore lavorazione.
3. Digestione triptica
- Scongelare i campioni sul ghiaccio.
- Asciugare completamente i campioni in un concentratore a vuoto.
- Riempire il campione con 50 μL di un tampone di digestione adatto, ad esempio 50 mM di bicarbonato di ammonio.
- Dopo l'aggiunta di 1,25 μL di 200 mM di 1,4-ditiotreitolo, incubare i campioni per 30 minuti a 60 °C e 300 giri/min utilizzando un termomiscelatore e successivamente raffreddarli a temperatura ambiente (RT).
- Quindi, incubare i campioni a RT per 30 minuti al buio dopo l'aggiunta di 1,36 μL 0,55 M di iodoacetammide.
- Aggiungere una quantità adeguata di tripsina ai campioni e incubare i campioni per una notte (~16 h) a 37 °C.
NOTA: Per 1.000.000 μm2, 0,1 μg di tripsina sono risultati sufficienti. - Aggiungere 2,6 μL di acido trifluoroacetico al 10% (TFA) ai campioni per interrompere la digestione (concentrazione finale dello 0,5% TFA).
- Asciugare completamente i campioni utilizzando un concentratore di vuoto. Quindi, riempire i campioni fino a un volume finale definito con lo 0,1% di TFA. I campioni NMG sono stati riempiti fino a 20 μL di cui 5 μL sono stati utilizzati per un esperimento di spettrometria di massa (MS).
- Conservare i campioni a -80 °C fino a ulteriore utilizzo. Determinare la concentrazione del peptide mediante analisi degli amminoacidi o un altro metodo di quantificazione adatto (ad esempio, Direct Detect).
NOTA: Basse quantità di campione potrebbero non essere quantificabili utilizzando le tecniche menzionate. Per garantire un carico identico del campione, ogni campione deve contenere la stessa quantità di tessuto isolato e ogni campione deve essere trattato allo stesso modo.
4. Cromatografia liquida ad alte prestazioni e spettrometria di massa
NOTA: Le seguenti analisi spettrometriche di massa (MS) per cromatografia liquida (HPLC) ad alte prestazioni sono ottimizzate per il sistema LC specifico con un dispositivo a colonna di intrappolamento e uno spettrometro di massa qui utilizzati (vedere la tabella dei materiali). Per altri sistemi LC e MS, si raccomanda l'adattamento dei parametri.
- Utilizzando il software Xcalibur, regolare le impostazioni HPLC come segue.
- Colonna trappola: temperatura impostata a 60 °C, portata a 30 μL/min, tampone corrente allo 0,1% di acido trifluoroacetico.
- Colonna analitica C18 a fase inversa: impostare la temperatura a 60 °C, la portata a 30 μL/min, il buffer corrente A allo 0,1% di acido trifluoroacetico, il tampone corrente B all'84% di acetonitrile e il gradiente al 5% -30% del buffer di corsa B su 98 min.
NOTA: L'adattamento del gradiente può essere inevitabile ed è fortemente raccomandato quando si utilizzano tessuti o cellule diversi. Il tempo di gradiente totale può variare a causa del carico del campione all'inizio del gradiente e del lavaggio del campione alla fine del gradiente. Il gradiente totale in questo protocollo consiste in un caricamento del campione di 7 minuti e un lavaggio aggiuntivo della colonna per 15 minuti, con un tempo di gradiente totale di 120 minuti.
- Creare un metodo di acquisizione dipendente dai dati (DDA) utilizzando XCalibur Instrument Setup, disponibile nel menu della roadmap del software HPLC.
- Nella scheda Parametri globali , definire la modalità di infusione Cromatografia liquida, la larghezza di picco LC prevista (30 s) e lo stato di carica predefinito (2).
- Passare alla scheda Parametri di scansione e aggiungere le seguenti scansioni e filtri nell'ordine indicato: MS OT, MIPS, Intensità, Stato di carica, Esclusione dinamica e ddMS2 OT HCD.
NOTA: le impostazioni dettagliate dei parametri per ogni scansione e filtro sono disponibili nella tabella supplementare 1. Le impostazioni ottimali di MS e DDA possono variare per lo spettrometro di massa specifico utilizzato e per il tipo di campione e devono pertanto essere adattate. - Preparare i campioni sciogliendo 200-400 ng di peptidi campione in un volume definito di TFA allo 0,1% in ingressi di flaconcini di vetro spettrometrici di massa inerte. Se la determinazione della concentrazione non è applicabile a causa della bassa quantità di campione, verificare il carico identico del campione confrontando la corrente ionica totale (TIC).
NOTA: Per fare ciò, aprire il file risultante della misurazione spettrometrica di massa in un software adatto, ad esempio FreeStyle, e controllare il cromatogramma. Le intensità devono essere comparabili per tutti i campioni. Un TIC rappresentativo è mostrato nella Figura 3. - Analizzare i dati grezzi ottenuti utilizzando un software proteomico adatto, ad esempio MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics o Proteome Discoverer, ed eseguire un'analisi statistica dei dati basata sulla domanda di ricerca.
5. Analisi di dati grezzi proteomici utilizzando MaxQuant
NOTA: Informazioni dettagliate sui parametri MaxQuant sono fornite nella Tabella supplementare 2. Sono brevemente descritti di seguito.
- Caricare i file raw nel software MaxQuant nell'intestazione dei dati grezzi facendo clic su Carica.
- Assegna nomi di esempio facendo clic su Imposta esperimento.
- Definire parametri specifici del gruppo. Innanzitutto, aggiungi modifiche. A causa dell'elaborazione del campione, scegliere Deamidazione (NQ), Ossidazione (M) e Carbamidometilazione (N-termine) come modifiche variabili e aggiungere Carbamidometilazione (C) come modifica fissa.
- Scegliere Tripsina come enzima di digestione nella scheda Digestione .
- Aggiungere l'opzione di quantificazione senza etichette LFQ nella scheda Quantificazione senza etichetta . Se devono essere elaborati più di 10 file, scegliere l'opzione Fast LFQ per ridurre il tempo di elaborazione. Aggiungere l'opzione iBAQ come misura per la quantificazione delle proteine24.
- Assicurarsi che tutti gli altri parametri specifici del gruppo rimangano nelle impostazioni di fabbrica.
- Passare alla scheda Parametri globali e aggiungere il file FASTA derivato da uniprot.org nella scheda Sequenze . Modificare di conseguenza la regola identificativa e aggiungere l'ID della tassonomia, in questo caso, 9606 per l'homo sapiens.
- Per la quantificazione delle proteine scegliere i peptidi Unique e Razor .
- Assicurarsi che tutti gli altri parametri globali rimangano nelle impostazioni di fabbrica.
- Fare clic su Start e recuperare l .txt output dei gruppi proteici dopo l'analisi MaxQuant per ulteriori analisi in Perseus.
6. Analisi statistica con Perseus
- Carica il file .txt gruppi proteici in Perseus, aggiungi i valori iBAQ come colonne principali e ordina tutte le altre colonne in base al loro tipo.
- Filtrare le esche e i contaminanti filtrando le righe in base alla colonna categoriale.
- Filtrare i risultati in base a valori validi. Nel caso di specie, con solo due campioni inclusi nell'analisi, è stato scelto un numero minimo di un valore valido.
- Esportare l'output di Perseus in .txt formato per ulteriori elaborazioni, ad esempio in Excel, e valutare i risultati relativi alla domanda di ricerca.
7. Validazione di proteine selezionate
NOTA: I metodi comunemente usati per la convalida dei dati della SM sono, ad esempio, la colorazione immunologica o il Western Blot. A causa del colore scuro e dell'autofluorescenza della neuromelanina, la colorazione immunologica delle proteine all'interno dei granuli di neuromelanina con anticorpi coniugati con perossidasi di rafano o fluorofori non è applicabile. Per l'analisi Western Blot, sarebbero necessarie grandi quantità di tessuto post-mortem . Pertanto, le proteine selezionate sono convalidate mediante spettrometria di massa mirata e, in questo caso, sono stati condotti esperimenti di monitoraggio delle reazioni parallele (PRM).
- Selezionare le proteine per la convalida. Scegli peptidi di queste proteine già rilevati negli esperimenti DDA. I peptidi non devono contenere scissioni o modifiche mancate per garantire una quantificazione affidabile.
NOTA: Ci possono essere diverse ragioni per la convalida di una proteina specifica, ad esempio, abbondanze differenziali nelle condizioni studiate. Per i risultati rappresentativi, è stata selezionata la catena pesante 1 della dineina 1 citoplasmatica, che è risultata essere equivalentemente abbondante nei campioni NMG e SN e potrebbe quindi essere utilizzata come riferimento per garantire un carico uniforme del campione. - Utilizzare i peptidi selezionati per impostare la prima versione di un metodo PRM utilizzando il software HPLC. Mantenere tutte le impostazioni della cromatografia e dei parametri globali dal metodo DDA.
- Aggiungere MS OT e tMS2 OT HCD come tipi di scansione. Assicurarsi che le impostazioni per MS OT siano le stesse del metodo DDA. Le impostazioni dettagliate per il metodo PRM sono disponibili nella tabella supplementare 1.
- Per tMS2 OT HCD, aggiungere peptidi selezionati come elenco di inclusione. Pertanto, aggiungere la sequenza di amminoacidi e il valore m/z osservato nelle misurazioni DDA. Per il primo esperimento PRM, non aggiungere finestre temporali di conservazione o impostare t start su 0 e t stop su 120 (per un gradiente di 120 minuti).
- Valutare il metodo PRM dopo la misurazione utilizzando software adatti, ad esempio Skyline, e ottenere il tempo di ritenzione dei peptidi aggiunti alla lista di inclusione. Per i peptidi inclusi, verificare che picchi comparabili siano osservabili per almeno tre ioni precursori nelle scansioni MS1 e cinque ioni frammento nelle scansioni MS2 con errore di massa basso (±5 ppm).
- Perfezionare il metodo PRM, ad esempio, aumentando la risoluzione per la scansione HCD tMS2 OT e aggiungendo finestre temporali di conservazione all'elenco di inclusione.
NOTA: Le finestre temporali di ritenzione di 3 minuti sono risultate adatte nei presenti esperimenti (il tempo di ritenzione osservato nel primo esperimento PRM ± 1,5 minuti). - Con il raffinato metodo PRM, eseguire la quantificazione di peptidi e proteine di interesse in base all'area di picco sia a livello MS1 che MS2 con software adatto.
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Representative Results
L'isolamento specifico di NMG e tessuto SN è il passo più importante per il successo dell'applicazione di questo protocollo. Utilizzando la funzione Field of View Analysis nel software LMD fornito dal fornitore, gli NMG possono essere selezionati automaticamente in base al colore. Pertanto, è necessario identificare le aree tissutali contenenti NMG (Figura 2A) e deve essere eseguita un'analisi del campo visivo con soglie di colore regolate, con conseguente etichettatura degli NMG (Figura 2B). Dopo aver filtrato oggetti che coprono un'area inferiore a 100 μm², solo gli NMG dovrebbero rimanere etichettati per l'isolamento (Figura 2C). L'isolamento preciso degli NMG marcati viene ottenuto dopo aver regolato le impostazioni laser (Figura 2D). Dopo l'isolamento degli NMG (Figura 2E), il tessuto SN può essere selezionato con un ingrandimento di 50 volte (Figura 2F) e isolato (Figura 2G) per il confronto del profilo proteomico. Per il tessuto SN, gli oggetti isolati possono essere visualizzati utilizzando la funzione Cap Check (Figura 2H). Per entrambi i tipi di campione, NMG e SN, l'isolamento di 500.000 μm2 di tessuto cerebrale è risultato sufficiente per questo protocollo, consentendo un minimo di tre cicli di SM per campione.
Un esempio rappresentativo di un esperimento DDA di 120 minuti è mostrato nella Figura 3 (poiché la colonna principale viene lavata negli ultimi 15 minuti della misurazione, il cromatogramma viene ritagliato poco prima di 105 minuti). Il metodo applicato dovrebbe consentire un'eluizione del campione sull'intero gradiente, creando picchi netti e concisi e l'intensità della corrente ionica totale (TIC) dovrebbe essere comparabile tra tutti i campioni.
L'applicazione del protocollo presentato su un campione di 500.000 μm² di NMG e un campione di tessuto SN di 1.000.000 μm² con volumi aggiustati per campioni di SM (5 μL per NMG e 2,5 μL per SN) per garantire un carico peptidico identico, ha portato all'identificazione di 1.898 gruppi proteici (PG) nel campione NMG e 1.565 PG nel campione SN. Un ulteriore confronto ha rivelato che 1.384 PG sono stati identificati in entrambi i campioni, mentre 514 PG sono stati identificati esclusivamente in NMG e 181 PG nel tessuto SN (Figura 4). In totale, 2.079 PG sono stati identificati in questo esperimento rappresentativo. Il confronto con un set di dati di riferimento di uno studio precedente22 ha mostrato che l'87,6% dei PG riportati in tale studio potrebbe anche essere identificato dal presente protocollo rivisto e automatizzato, dimostrandone l'applicabilità. Inoltre, il numero di PG identificati potrebbe essere migliorato di 1.143.
Poiché quantità minime di campioni non consentono l'applicazione di metodi di convalida classici come Western Blots, la convalida delle proteine di interesse può essere ottenuta mediante approcci spettrometrici di massa mirati, ad esempio PRM. I risultati rappresentativi per il peptide ESPEVLLTLDILK della proteina citoplasmatica dynein 1 catena pesante 1 sono mostrati nella Figura 5. Il valore di iBAQ di questa proteina è risultato essere leggermente più alto negli NMG rispetto a SN nelle misurazioni DDA, che potrebbero essere verificate da esperimenti PRM basati sull'area di picco a livello MS1- (Figura 5A, B, E) e MS2 (Figura 5C, D, F).
Figura 1: Flusso di lavoro per la caratterizzazione proteomica dei granuli di neuromelanina (NMG) e del tessuto circostante (SN). I campioni NMG e SN sono stati isolati da fette di tessuto tramite microdissezione laser (LMD). Le proteine sono state isolate ed è stata eseguita la digestione triptica in soluzione. I peptidi risultanti sono stati analizzati tramite misurazioni LC-MS/MS in modalità di acquisizione dipendente dai dati (DDA). L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando i software MaxQuant e Perseus. La convalida di proteine selezionate è stata effettuata con esperimenti di monitoraggio delle reazioni parallele (PRM). I dati PRM sono stati analizzati utilizzando il software Skyline. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Selezione e isolamento basato su LMD di campioni NMG e SN. Inizialmente, un'area contenente NMG, visibile senza ulteriori colorazioni con un ingrandimento di 400 volte, viene posta sotto il microscopio (A). Dopo aver eseguito un'analisi del campo visivo, vengono selezionati NMG e altre aree scure (B). Solo gli NMG rimangono selezionati dopo il filtraggio (C) e vengono isolati dopo aver regolato le impostazioni del laser (D). Dopo che tutti gli NMG sono stati isolati (E), il tessuto SN viene selezionato con un ingrandimento di 50 volte (F) e isolato (G). Poiché gli oggetti isolati per i campioni SN sono piuttosto grandi, possono essere osservati nel cappuccio di raccolta dei campioni utilizzando la funzione Cap Check (H). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Corrente ionica totale (TIC) di una misura DDA di 120 minuti. Il cromatogramma mostra l'abbondanza relativa degli ioni corrispondenti ai peptidi eluiti nell'intervallo di tempo di ritenzione da 0 a ~ 105 min. Poiché la colonna principale viene lavata tra il 105° e il 120° minuto, il cromatogramma viene ritagliato al 105° minuto. L'intensità del picco più alto è 2,86 x 108. I numeri sopra i picchi indicano il tempo di ritenzione e lo ione più abbondante di quel picco specifico (BP = picco di base). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Diagramma di Venn che mostra la corrispondenza dei gruppi proteici (PG) identificati negli NMG e nel tessuto SN. In totale, sono stati identificati 1.898 PG nei NMG e 1.565 PG nel tessuto SN, di cui 1.384 PG sono stati identificati in entrambe le aree tissutali. 514 PG sono stati identificati esclusivamente nel tessuto NMG, mentre 181 PG sono stati identificati esclusivamente nel tessuto SN. Il diagramma è stato creato utilizzando lo strumento online Venny25. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Risultati degli esperimenti PRM per il peptide ESPEVLLTLDILK (dineina citoplasmatica 1 catena pesante 1, ++). I cromatogrammi a livello MS1- (A,B) e MS2 (C,D), così come le aree di picco a livello MS1- (E) e MS2 (F), sono mostrati per un campione esemplare di NMG e tessuto SN. Colori diversi sono usati per indicare diversi precursori (a livello MS1) o ioni prodotto (a livello MS2). I cromatogrammi vengono visualizzati dopo l'esecuzione della levigatura Savitzky-Golay. Le intensità e le aree di picco erano comparabili a livello MS1- (A, B, E) e MS2 (C, D, F). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella supplementare 1: Parametri degli esperimenti di spettrometria di massa. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 2: Parametri dell'analisi MaxQuant. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
LMD è una tecnica ampiamente applicabile per l'isolamento di specifiche aree tissutali, singole cellule o strutture subcellulari. Nel protocollo rivisto e automatizzato qui presentato, questa tecnica viene applicata per l'isolamento specifico dei granuli di neuromelanina (NMG) e del tessuto circostante NMG (SN). Fino ad ora, due diversi approcci per l'isolamento di NMG dal tessuto cerebrale umano post-mortem sono stati pubblicati e ampiamente utilizzati:
a) Un gradiente discontinuo di saccarosio che consuma 1 g di tessuto substantia nigra 20. Poiché il tessuto umano post-mortem substantia nigra è raro e di grande interesse per diverse domande di ricerca, è purtroppo piuttosto difficile istituire un ampio studio di coorte se sono richieste elevate quantità di tessuto per paziente. Pertanto, questo approccio è stato ulteriormente migliorato riducendo la quantità di tessuto richiesta a 0,15 g per un sufficiente isolamento degli NMG26. Tuttavia, era necessaria almeno la metà di una substantia nigra pars compacta completa.
b) L'escissione di NMG utilizzando LMD. Nel 2016, Plum et al hanno stabilito un nuovo protocollo basato sull'escissione precisa di NMG tramite LMD. Con questo protocollo, la quantità di campione richiesta potrebbe essere ridotta a dieci sezioni di tessuto da 10 μm, con una conseguente riduzione impressionante del campione di tessuto richiesto da 150 mg a 16,6 mg22.
Il protocollo ottimizzato e automatizzato basato su LMD qui presentato richiede quantità di campione ancora più basse in quanto è stato necessario utilizzare quantità di campione più sottili (5 μm rispetto a 10 μm) e meno sezioni di tessuto (massimo 7 rispetto a 8) e richiede meno tempo per la generazione del campione (4 ore per campione rispetto a 1-2 giorni) attraverso l'uso del rilevamento NMG automatizzato. Pertanto, il tempo di raccolta dei campioni richiesto è stato ridotto in modo massiccio e il numero di PG identificati potrebbe essere drasticamente migliorato applicando un metodo LC-MS ottimizzato e strumentazione all'avanguardia. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre domande di ricerca e tessuti.
Per l'adattamento del protocollo presentato relativo alle domande di ricerca definite dall'utente, i seguenti aspetti sono evidenziati in base all'esperienza:
a) Isolamento di quantità di campioni comparabili: poiché la resa peptidica attesa di questo protocollo è piuttosto bassa rispetto, ad esempio, alla coltura cellulare o ai lisati tissutali, la determinazione della concentrazione peptidica potrebbe non essere possibile. Pertanto, è fondamentale che quantità uguali di tessuto siano isolate tramite LMD, che può essere stimato in base all'area tissutale degli oggetti selezionati. Nella configurazione attuale, aree tissutali di 500.000 μm² sono sufficienti per la generazione di peptidi per almeno tre misurazioni della SM.
b) Digestione della tripsina: la durata della digestione e la concentrazione di tripsina devono essere comparabili tra i campioni.
c) Adattamento dei parametri per i diversi tessuti: a seconda del tessuto da analizzare, la quantità di tessuto raccolto deve essere regolata, rendendo così necessario regolare anche la quantità di tripsina aggiunta. Il rapporto tripsina/proteina non deve essere inferiore a 1:40.
d) Limitazione del processo LMD: per l'isolamento basato su LMD degli oggetti di interesse, esistono limitazioni per quanto riguarda le dimensioni degli oggetti selezionati e lo spessore delle sezioni. A causa della perdita di tessuto durante il taglio laser del tessuto, gli oggetti più piccoli di 100 μm² sono stati considerati troppo piccoli per l'isolamento.
e) Adattamento dei parametri LC e MS: a seconda dei sistemi LC e MS utilizzati, la quantità di tessuto isolato deve essere aumentata (ad esempio, quando si opera con un sistema a microflusso) e i parametri MS devono essere adattati (ad esempio, quando si lavora con un sistema di rilevamento basato su trappola ionica).
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da de. NBI, un progetto del Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF) (numero di sovvenzione FKZ 031 A 534A) e sovvenzioni P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr in Europa) e Center for Protein Diagnostics (ProDi), entrambi dal Ministero dell'innovazione, della scienza e della ricerca della Renania settentrionale-Vestfalia, Germania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
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