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Biology

Quantifizierung des Eisentransports über die Mausplazenta in vivo unter Verwendung nichtradioaktiver Eisenisotope

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Dieser Artikel zeigt, wie transferringebundenes nichtradioaktives Isotopeneisen für Studien zum Eisentransport in der Mausschwangerschaft vorbereitet und verabreicht wird. Der Ansatz zur Quantifizierung von isotopischem Eisen in fetoplazentaren Kompartimenten wird ebenfalls beschrieben.

Abstract

Eisen ist essentiell für die Gesundheit von Mutter und Fötus während der Schwangerschaft, wobei etwa 1 g Eisen beim Menschen benötigt wird, um eine gesunde Schwangerschaft aufrechtzuerhalten. Die fetale Eisenausstattung hängt vollständig vom Eisentransfer über die Plazenta ab, und Störungen dieses Transfers können zu nachteiligen Schwangerschaftsergebnissen führen. Bei Mäusen beruhte die Messung des Eisenflusses über die Plazenta traditionell auf radioaktiven Eisenisotopen, ein hochempfindlicher, aber belastender Ansatz. Stabile Eisenisotope (57Fe und 58Fe) bieten eine nichtradioaktive Alternative für den Einsatz in Schwangerschaftsstudien beim Menschen.

Unter physiologischen Bedingungen ist transferringebundenes Eisen die vorherrschende Form von Eisen, das von der Plazenta aufgenommen wird. So wurde 58Fe-Transferrin hergestellt und intravenös in schwangere Muttertiere injiziert, um den Plazenta-Eisentransport direkt zu beurteilen und die mütterliche Eisenabsorption im Darm als Störvariable zu umgehen. Isotopisches Eisen wurde in den embryonalen Geweben der Plazenta und der Maus mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) quantifiziert. Diese Methoden können auch in anderen Tiermodellsystemen der Physiologie oder Krankheit eingesetzt werden, um die Eisendynamik in vivo zu quantifizieren.

Introduction

Eisen ist entscheidend für verschiedene Stoffwechselprozesse, einschließlich Wachstum und Entwicklung, Energieproduktion und Sauerstofftransport1. Die Aufrechterhaltung der Eisenhomöostase ist ein dynamischer, koordinierter Prozess. Eisen wird aus der Nahrung im Zwölffingerdarm aufgenommen und im Kreislauf, der an das Eisentransportprotein Transferrin (Tf) gebunden ist, durch den Körper transportiert. Es wird von jeder Zelle für enzymatische Prozesse verwendet, in Hämoglobin in entstehende Erythrozyten eingebaut und von Makrophagen aus gealterten Erythrozyten recycelt. Eisen wird in der Leber gespeichert, wenn es im Übermaß ist und durch Blutungen oder Zellablösung aus dem Körper verloren geht. Die Menge an zirkulierendem Eisen ist das Ergebnis des Gleichgewichts zwischen dem Verbrauch und der Versorgung mit Eisen, wobei letzteres durch das Leberhormon Hepcidin (HAMP), den zentralen Regulator der Eisenhomöostase1, streng reguliert wird. Hepcidin begrenzt die Bioverfügbarkeit von Eisen im Blut, indem es die Ubiquitinierung verdeckt oder induziert und den Eisenexporteur Ferroportin (FPN) abbaut2. Die Verringerung des funktionellen FPN führt zu einer verminderten Eisenaufnahme in der Nahrung, Eisensequestrierung in der Leber und vermindertem Eisenrecycling aus Makrophagen1.

Hepcidin wird durch Eisenstatus, Entzündung, erythropoetischen Antrieb und Schwangerschaft reguliert (überprüft in 3). Da die Eisenhomöostase sehr dynamisch ist, ist es wichtig, den gesamten Eisenpool und die Eisenverteilung und den Eisenumsatz zu verstehen und zu messen. Tierstudien stützten sich traditionell auf radioaktive Eisenisotope, ein hochempfindlicher, aber belastender Ansatz zur Messung der Eisendynamik. In neueren Studien, einschließlich der hier vorgestellten Studie4, werden jedoch nichtradioaktive, stabile Eisenisotope (58Fe) verwendet, um den Eisentransport während der Schwangerschaft zu messen 5,6,7,8,9. Stabile Isotope sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung des Nährstoffstoffwechsels (überprüft in 10). Die Verwendung stabiler Eisenisotope in Humanstudien zeigte, dass i) die Eisenabsorption gegen Ende der Schwangerschaft zunimmt5,6, ii) die Übertragung von Eisen in die Nahrung zum Fötus vom mütterlichen Eisenstatus abhängt7, iii) mütterlich aufgenommenes Hämeisen vom Fötus leichter aufgenommen wird als Nicht-Häm-Eisen 8 und iv) der Eisentransfer zum Fötus negativ mit dem mütterlichen Hepcidinspiegel 8 korreliert, 9. Diese Experimente maßen Eisenisotope in Seren oder deren Einbau in Erythrozyten; Die Messung von Eisen, das allein in Erythrozyten eingebaut ist, kann jedoch die tatsächliche Eisenabsorption unterschätzen9. In der aktuellen Studie werden sowohl Häm- als auch Nicht-Häm-Eisen in Geweben gemessen.

Während der Schwangerschaft wird Eisen benötigt, um die Ausdehnung des mütterlichen Volumens der roten Blutkörperchen zu unterstützen und über die Plazenta zu übertragen, um das Wachstum und die Entwicklung des Fötuszu unterstützen 11. Die fetale Eisenausstattung hängt vollständig vom Eisentransport über die Plazenta ab. Während der Schwangerschaft von12 und Nagetieren 4,13 sinkt der Hepcidinspiegel dramatisch ab, wodurch die Verfügbarkeit von Plasmaeisen für den Transfer zum Fötus erhöht wird.

Die Grundlagen des Plazenta-Eisentransports wurden erstmals in den 1950er-70er Jahren mit radioaktiven Tracern (59Fe und 55Fe) charakterisiert. Diese Studien ergaben, dass der Eisentransport durch die Plazenta unidirektionalist 14,15 und dass Diferric Transferrin eine Hauptquelle für Eisen für die Plazenta und den Fötus16,17 ist. Das derzeitige Verständnis des Plazenta-Eisentransports ist vollständiger, obwohl einige wichtige Eisentransporter und Regulationsmechanismen unbekannt sind. Mausmodelle waren für das Verständnis der Eisenregulation und des Eisentransports unerlässlich18, da die wichtigsten Transporter und Mechanismen bemerkenswert ähnlich sind. Sowohl menschliche als auch Mausplazenta sind hämochororisch, dh mütterliches Blut steht in direktem Kontakt mit dem fetalen Chorion19. Es gibt jedoch einige bemerkenswerte strukturelle Unterschiede.

Der Synzytiotrophoblast ist die Plazentazellschicht, die den mütterlichen und fetalen Kreislauf trennt und aktiv Eisen und andere Nährstoffe transportiert20. Beim Menschen ist der Synzytiotrophoblast eine einzelne Schicht verschmolzener Zellen. Im Gegensatz dazu besteht die Mausplazenta aus zwei Synzytiotrophoblastschichten21, Syn-I und Syn-II. Gap Junctions an der Grenzfläche von Syn-I und Syn-II ermöglichen jedoch die Diffusion von Nährstoffen zwischen den Schichten22,23. Somit funktionieren diese Schichten als eine einzige Synzytialschicht, ähnlich dem menschlichen Synzytiotrophoblasten. Weitere Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen menschlichen und Maus-Plazenta werden von Rossant und Cross21 überprüft. Der plazentale Eisentransport wird durch die Bindung von Eisen-Tf aus dem mütterlichen Blut an den Transferrinrezeptor (TfR1) ausgelöst, der auf der apikalen Seite des Synzytiotrophoblasten24 lokalisiert ist. Diese Wechselwirkung induziert eine Eisen-Tf/TfR1-Internalisierung über Clathrin-vermittelte Endozytose25. Eisen wird dann aus Tf im sauren Endosom26 freigesetzt, durch eine unbestimmte Ferrireduktase zu Eisen reduziert und durch einen noch zu bestimmenden Transporter aus dem Endosom in das Zytoplasma exportiert. Wie Eisen innerhalb des Synzytiotrophoblasten begleitet wird, muss ebenfalls noch beschrieben werden. Eisen wird schließlich vom Eisenexporteur FPN auf die fetale Seite transportiert, lokalisiert auf der basalen oder fötalen Oberfläche des Synzytiotrophoblasten (überprüft in27).

Um zu verstehen, wie die physiologische und pathologische Regulation von TfR1, FPN und Hepcidin den Plazenta-Eisentransport beeinflusst, wurden stabile Eisenisotope verwendet, um den Eisentransport vom mütterlichen Kreislauf zur Plazenta und zum Embryo in vivo zu quantifizieren 4. In diesem Artikel werden die Methoden zur Herstellung und Verabreichung von isotopischem Eisentransferrin an trächtige Mäuse, zur Verarbeitung von Geweben für ICP-MS und zur Berechnung der Eisenkonzentrationen in Geweben vorgestellt. Die Verwendung stabiler Eisenisotope in vivo kann angepasst werden, um die Eisenregulation und -verteilung in verschiedenen Tiermodellen zu untersuchen, um die physiologische und pathologische Eisenregulation zu untersuchen.

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Protocol

Alle Tierprotokolle und experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California Los Angeles genehmigt.

1. Vorbereitung von 58Fe-TF

HINWEIS: Das Protokoll verwendet 58Fe; Ein identisches Protokoll kann jedoch für 57Fe verwendet werden. Beide Isotope können als Standard-Eisenchemikalie ohne zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen verwendet und entsorgt werden.

  1. 58Fe werden in 12 N HCl bei 50 μL HCl/mg 58Fe gelöst.
    1. Fügen Sie HCl zu dem Metall in der vom Verkäufer gelieferten Durchstechflasche hinzu und setzen Sie die Kappe lose wieder auf. Um das Bügeleisen aufzulösen, erwärmen Sie die 58Fe/HCl-Lösung 1 h lang auf 60 °C. Wenn immer noch nicht aufgelöst, lassen Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur im Abzug auflösen.
      HINWEIS: Die gelöste 58Fe/HCl-Lösung hat eine gelblich-orange Farbe.
      Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl 3(aq) + 4H2 O
  2. Oxidieren Sie alle verbleibenden Fe(II)Cl2 , um die Fe(III)Cl3-Lösung zu erzeugen.
    1. Die 58Fe/HCl-Lösung mit abgenommener Kappe auf 60 °C erwärmen, um die Oxidation zu erleichtern.
    2. 1 μL 35%H2O2pro 50 μL 58Fe/HCl-Lösung zugeben, um die Oxidation weiter zu erleichtern.
      Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) +2H2O
  3. Eisenchlorid (58Fe(III)Cl3)-Lösung wird hergestellt.
    1. Lassen Sie die Eisenchloridlösung bei 60 °C mit abgenommener Kappe in der Haube, um die Probe zu verdampfen.
      HINWEIS: Die Verdunstung kann zwischen einem und mehreren Tagen dauern.
    2. Rekonstituieren Sie 58 Fe(III)Cl3 bis 100 mM mit hochreinem H2O und berechnen Sie die erforderliche Menge an hochreinem H2O basierend auf dem in Schritt 1.1 verwendeten Anfangsmetallgewicht (Molekulargewicht von 58Fe(III)Cl3 ist 162,2).
  4. Herstellung von 58 Fe(III)-nitrilotriacetat (NTA) durch Inkubation von 58Fe(III)Cl3 mit NTA im Verhältnis 1:5 in Gegenwart von 20 mM NaHCO3.
    1. 500 mM NTA in 1 N NaOH vorbereiten.
    2. 5x Transferrin-Ladepuffer (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl) vorbereiten.
    3. 1 MNaHCO3 in hochreinemH2Oherstellen.
    4. Zu einem 15-ml-konischen Röhrchen werden 150 μL 100 mM 58 Fe(III)Cl3-Lösung (aus Schritt 1.3.2), 150 μL 500 mM NTA in 1 N NaOH, 480 μL hochreinesH2O, 200 μL 5xTransferrin-Ladepuffer und 20 μL 1 M NaHCO3-Lösung gegeben.
    5. Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Laden Sie apo-Tf mit 58Fe(III)-NTA zu 58Fe-Tf.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von McCarthy und Kosman28 übernommen.
    1. 500 mg apo-Tf in 4 mL 1x Tf-Ladepuffer auflösen.
    2. Zu dem 15-ml-konischen Röhrchen in Schritt 1.4.4, das 1 ml der 58Fe(III)-NTA-Lösung enthält, werden 4 ml apo-Tf-Lösung hinzugefügt.
      HINWEIS: Dies ist ein 3:1 molares Verhältnis von 58Fe-NTA mit apo-Tf. Jede Tf enthält 2 Fe-Bindungsstellen; mehr als 58Fe-NTA wurde hinzugefügt, um sicherzustellen, dass Tf vollständig geladen war.
    3. Um eine maximale Beladung von 58Fe-NTA auf apo-TF zu ermöglichen, überprüfen Sie, ob die Lösung einen pH-Wert von 7,5 aufweist, und stellen Sie den pH-Wert gegebenenfalls mit NaHCO3 oder HCl ein.
    4. Inkubieren Sie für 2,5 h bei Raumtemperatur.
  6. Entfernen Sie überschüssiges ungebundenes 58Fe(III)-NTA und freigegebenes NTA.
    1. Die 58 Fe-Tf-Lösung wird in eine Molekulargewichts-Cutoff-Säule (30 kDa-Cutoff) überführt und bei 2.500× g für 15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
    2. Waschen Sie die Säule mit 10 mL 1x Transferrin-Ladepuffer und zentrifugieren Sie sie bei 2.500 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren, führen Sie eine Kochsalzwäsche mit 10 ml Kochsalzlösung durch und zentrifugieren Sie bei 2.500 × g für 15 min bei Raumtemperatur.
  7. Berechnen Sie die Konzentration von 58Fe-Tf.
    HINWEIS: Aufgrund der Zugabe von überschüssigem 58Fe in Schritt 1.5.2 ist davon auszugehen, dass das gesamte Transferrin diferrisch ist. Da 500 mg Apo-Tf verwendet wurden, wurden ~500 mg 58Fe-Tf in Schritt 1.5.4 hergestellt.
    1. Messen Sie das Volumen, das nach der Salzwäsche nach der Salzwäsche aus der Zentrifugation gewonnen wird.
    2. 500 mg werden durch das gewonnene Volumen dividiert, um die Konzentration (in mg/ml) der 58Fe-Tf-Lösung zu bestimmen.
  8. Die 58Fe-Tf-Lösung wird mit einem 0,22-μm-Spritzenfilter sterilisiert. Bei 4 °C lagern, bis sie gebrauchsfertig sind.
    HINWEIS: 58Fe-Tf-Lösung wurde 1 bis 4 Wochen nach der Zubereitung verwendet.

2. Zeitgesteuerte Mausschwangerschaften einrichten

  1. Verwenden Sie 6 bis 8 Wochen alte weibliche Mäuse. Setzen Sie die Tiere 2 Wochen vor der Paarung auf eine eisenarme Diät (4 ppm Eisen) oder Standardfutter (185 ppm Eisen) und halten Sie die Tiere während der gesamten Trächtigkeit auf den entsprechenden Diäten.
  2. Option 01: Bestätigen Sie die Schwangerschaft durch Gewichtszunahme bei E7,5.
    1. Richten Sie mehrere Zuchtkäfige ein. Kombinieren Sie für jeden Käfig 2 Weibchen mit 1 Männchen über Nacht; der folgende Tag, an dem die Tiere getrennt werden, gilt als embryonaler Tag (E)0,5. Wiegen Sie Weibchen bei E7,5, um festzustellen, ob sie schwanger sind. Verpaaren Sie Männchen wieder mit Weibchen, die nicht zugenommen haben.
      HINWEIS: In WT C57BL/6 ist eine Gewichtszunahme von 1 g bei E7,5 ein guter Indikator für eine Schwangerschaft. Diese Methode stellt sicher, dass die Implantation innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens von 16 Stunden erfolgte, was eine synchrone Behandlung aller Tiere ermöglicht, die während derselben Paarungszeit trächtig wurden.
  3. Option 02: Bestätigen Sie die Schwangerschaft durch Steckerprüfungen.
    1. Kombinieren Sie 2 Weibchen mit 1 Männchen und führen Sie tägliche Plug-Checks durch, um festzustellen, ob eine Kopulation stattgefunden hat.
      HINWEIS: Diese Methode kann zu gestaffelten Schwangerschaften führen, und das Vorhandensein eines Plugs garantiert keine Schwangerschaft.

3. 58Fe-Tf intravenös an E17,5 trächtige Mäuse verabreichen

  1. Bereiten Sie 58Fe-Tf aus Schritt 1.8 für die Injektion vor.
    1. 58Fe-Tf-Lösung bei 35 mg/ml in Kochsalzlösung herstellen; injizieren Sie 100 μL pro Maus.
    2. Füllen Sie eine Insulinspritze mit 100 μL der 58Fe-Tf-Lösung.
      HINWEIS: Jede Dosis enthält 3,5 mg 58 Fe-Tf beim Menschen (5 μg 58Fe).
  2. Betäuben Sie eine schwangere Maus mit Isofluran.
    1. Verwenden Sie einen Isofluran-Regulator mit einer Kammer.
    2. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 5% Isofluran, 2 L/mlO2, 2 min.
    3. Bestätigen Sie, dass die Maus betäubt ist, indem Sie nach mangelnder Reaktion auf ein Zehenklemmen suchen.
    4. Tragen Sie Augengleitmittel auf die Augenoberfläche auf und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen.
  3. Injizieren Sie die 58Fe-Tf-Lösung langsam und vorsichtig in den retroorbitalen Sinus.
  4. Lassen Sie die Maus von der Anästhesie erholen; Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das sternale Liegen aufrechtzuerhalten.
  5. Sechs Stunden nach der Injektion Euthanasieren Sie E17,5 schwangere Frauen durch Isofluran-Überdosierung.
    1. Führen Sie eine Herzpunktion durch, um die Maus als eine Form der sekundären Euthanasie zu entbluten.
    2. Stecken Sie die Füße zur Stabilisierung mit Nadeln fest.
  6. Sammeln Sie die Plazenta und die Embryoleber.
    1. Entfernen Sie mit steriler Pinzette und Sezierschere vorsichtig die Gebärmutter von der schwangeren Maus. Schneiden Sie eine plazentare fetale Plazentaeinheit ab, die einen einzelnen Fötus und eine Plazenta in der Fruchtblase umfasst, die von einem Teil der Gebärmutter umgeben ist.
    2. Schneiden Sie vorsichtig durch die Gebärmutter und die Fruchtblase, ohne den Fötus und die Plazenta zu stören.
    3. Schälen Sie die Fruchtblase zurück und entfernen Sie den Fötus und die Plazenta.
    4. Schneiden Sie die Nabelschnur durch.
    5. Tupfen Sie den Fötus und die Plazenta auf einem sauberen Abwischtuch ab, um das überschüssige Fruchtwasser zu entfernen.
    6. Notieren Sie die Gewichte der gesamten Plazenta.
    7. Schneiden Sie jede Plazenta mit einer Rasierklinge in zwei Hälften, legen Sie jede Hälfte in ein 2,0-ml-Röhrchen und frieren Sie in flüssigem Stickstoff ein.
      HINWEIS: Da 58 Fe keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen und Entsorgung erfordert, kann die eine Hälfte der Plazenta für die Messung von 58Fe und die andere Hälfte für alle anderen Analysen verwendet werden, einschließlich der Quantifizierung der Transferrinrezeptor- (TFR1) und Ferroportinexpression (FPN) durch Western Blotting und qPCR.
    8. Um embryonale Lebern zu sammeln, opfern Sie den Embryo: Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Embryo schnell zu enthaupten.
      HINWEIS: Bei E17.5 müssen alle Embryonen in der Gebärmutter einzeln eingeschläfert werden, auch wenn sie nicht in der Studie verwendet werden.
    9. Fixieren Sie den Embryo zur Stabilisierung und lassen Sie den Bauch frei.
    10. Machen Sie mit einer Dissektionsschere einen kleinen Einschnitt, an dem die Nabelschnur befestigt war, führen Sie ein Ende der Dissektionsschere in den Einschnitt ein und führen Sie einen mittleren Schnitt in Richtung der koronalen Ebene von etwa 1/4 Zoll durch. Führen Sie dann transversale Ebenenschnitte durch, um die fetale Leber freizulegen.
    11. Verwenden Sie eine Pinzette, um die fetale Leber zu entfernen.
    12. Notieren Sie das Gewicht der gesamten embryonalen Leber.
    13. Legen Sie die gesamte Embryonenleber in 2 ml Röhrchen und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.
      HINWEIS: Alternativ kann nur ein Teil der embryonalen Leber für die Messung von 58Fe verwendet werden, wenn zusätzliche Analysen gewünscht werden. Die Verwendung von 2,0-ml-Röhrchen ermöglicht eine bessere Gewebehomogenisierung als 1,5-ml-Röhrchen.
  7. Lagern Sie das Gewebe unbegrenzt bei -80 °C.

4. Prozessgewebe für die quantitative Eisenanalyse mittels ICP-MS

  1. Verarbeiten Sie die Plazenta und die fetale Leber für die Quantifizierung von Nichthämeisen.
    1. Plazentahälften und ganze fetale Lebern auftauen und Plazentahälften wiegen (siehe Schritt 3.6.12 zur Erfassung des fetalen Lebergewichts).
    2. 400 μL Proteinfällungslösung (0,53 N HCl, 5,3% TCA) zugeben.
    3. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem elektrischen Homogenisator.
    4. Die Proben werden 1 h lang bei 100 °C inkubiert.
    5. Kühlen Sie die Proben in Wasser bei Raumtemperatur für 2 min.
    6. Öffnen Sie die Kappen, um den Druck abzubauen, und schließen Sie die Röhrchen wieder.
    7. Bei 17.000 × g für 10 min bei Raumtemperatur auf Pelletgewebereste zentrifugieren.
    8. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues beschriftetes Röhrchen.
    9. Senden Sie Proben zur ICP-MS-Analyse.
  2. Verarbeiten Sie die Plazenten und fetalen Lebern für die Quantifizierung von Häm-Eisen.
    HINWEIS: Nach der Extraktion von Nichthämeisen in Schritt 1 ist das im Pellet verbleibende Eisen überwiegend Häm.
    1. Notieren Sie das Gewicht jedes Pellets aus Schritt 4.1.7.
    2. Aufschluss der Pellets in 10 mL konzentriertem 70% HNO3, ergänzt mit 1 mL 30%H2O2
      HINWEIS: Wenden Sie sich an den ICP-MS-Kern oder das ICP-MS-Zentrum, um das Volumen von HNO3 für bestimmte Studien zu optimieren. Das Volumen hängt teilweise vom Probengewicht ab.
    3. Die Proben 15 min lang auf 200 °C erhitzen.
    4. Senden Sie die Proben zur ICP-MS-Analyse.
      HINWEIS: Wenn keine Unterscheidung zwischen Häm- und Nicht-Häm-Eisenquellen erforderlich ist und nur das Gesamteisen gemessen wird, kann im ersten Schritt das gesamte Gewebe in HNO3 verdaut werden.

5. Datenanalyse

ANMERKUNG: Die Daten von ICP-MS wurden als 56Fe- und 58Fe-Konzentrationen in ng/ml oder mg, ppb angegeben (Tabelle 1). 56 Fe ist das am häufigsten vorkommende Eisenisotop in der Natur, und seine Messung spiegelt die Eisenakkumulation in der Plazenta / im Embryo über die gesamte Schwangerschaft wider, während die 58-Fe-MessungEisen widerspiegelt, das während 6 Stunden nach der Injektion übertragen wurde.

  1. Subtrahieren Sie die natürliche Häufigkeit von 58 Fe (0,28% des gesamten Fe) von den gemessenen 58Fe-Werten.
  2. Berechnen Sie die Gesamtmenge von 58Fe.
    1. Berechnen Sie das Gesamteiseneisen (ng) der Embryoleber, indem zunächst die in Schritt 5.1 berechnete Eisenkonzentration (ng/ml) mit dem Volumen (ml) während der Erstverarbeitung in Schritt 4.1.2 multipliziert wird, um die Gesamtmenge 58Fe zu schätzen.
    2. Die Eisenmenge in der gesamten Plazenta wird berechnet, indem Sie das in Schritt 3.6.6 gemessene Gesamtgewicht der Plazenta durch das Gewicht der in Schritt 4.1.1 verarbeiteten Plazenta dividieren. Multiplizieren Sie diesen Wert mit dem in Schritt 5.2.1 berechneten Gesamteisen (ng), um den Gesamtgehalt der Plazenta an Nichthäm von 58Fe zu erhalten.
  3. Berechnen Sie das Gesamthäm 58Fe.
    1. Die Gesamthämmenge 58Fe wird berechnet, indem zunächst die in Schritt 5.1 berechnete Eisenkonzentration (ng/mg) mit dem Gewicht des in Schritt 4.2.1 gemessenen Pellets (in mg) multipliziert wird.
    2. Dann wird das in Schritt 3.5.1 gemessene Gesamtgewicht der Plazenta durch das in Schritt 4.2.1 gemessene Gewicht des Plazentapellets dividiert. Multiplizieren Sie diesen Wert mit dem in Schritt 5.3.1 berechneten Gesamthämeisen (ng), um den Gesamthäm-Gehalt der Plazenta von 58Fe zu erhalten.
  4. Summieren Sie die berechneten Werte für Nichthäm und Häm 58Fe, um den Gesamteisengehalt für jedes Gewebe zu bestimmen.

Figure 1
Abbildung 1: Visuelle Zusammenfassung der Schritte im Protokoll. (A) Herstellung von 58Fe-Transferrin. (B) In-vivo-Verabreichung von 58 Fe-Transferrin. c) Gewebeentnahme und -lagerung. (D) Verarbeitung der Plazenta und der embryonalen Leber zur Quantifizierung von Metallspezies mittels ICP-MS. Abkürzungen: Fe = Eisen; NTA = Nitrilotriessigsäure; Tf = Transferrin; PPS = Proteinfällungslösung; Sup = Überstand; TCA = Trichloressigsäure; ICP-MS = Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Representative Results

Eine frühere Studie mit stabilen Eisenisotopen zur Messung des Eisentransports zeigte, dass mütterlicher Eisenmangel zur Herunterregulierung des Plazenta-Eisenexporteurs FPN4 führte. FPN ist der einzige bekannte Eisenexporteur von Säugetieren, und das Fehlen von FPN während der Entwicklung führt zum Embryonaltod vor E9.529. Um festzustellen, ob die beobachtete Abnahme der FPN-Expression funktionell zu einem verminderten Plazenta-Eisentransport führte, wurde 58Fe-Tf intravenös in schwangere Muttertiere injiziert und Eisen in der Plazenta und im Embryo bei mütterlichem Eisenmangel quantifiziert.

Um zu verstehen, wie der Plazenta-Eisentransport durch den mütterlichen Eisenstatus beeinflusst wird, wurde Eisenmangel an Mäusen modelliert4. Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden 2 Wochen vor und während der Schwangerschaft auf eine eisenarme Diät (4 ppm Eisen) oder Standard-Chow (185 ppm Eisen) gesetzt. Diese Diät führt zu einem niedrigeren mütterlichen Leber-Nonhäm-Eisen und Serumeisen und Hämoglobin bei E12,5, E15,5 und E18,5 im Vergleich zu Tieren mit einer Standarddiät4. Bei E18,5 hatten Embryonen von Müttern mit Eisenmangel ein niedrigeres Lebereisen und waren hypoferrämisch und anämisch als Embryonen von eisenreichen Müttern. Drei trächtige Mäuse wurden in jeder der eisenhaltigen und eisenarmen Gruppen verwendet, und 2-3 Plazenten wurden von jeder schwangeren Maus zur Analyse verwendet.

Zur Quantifizierung des Plazenta-Eisentransports wurde 58 Fe-Transferrin hergestellt und intravenös in schwangere Muttertiere injiziert und 58Fe in der Plazenta und der fetalen Leber mittels ICP-MS gemessen, wie im Protokoll beschrieben und in Abbildung 1 dargestellt. Vor dem Versand von Nicht-Häm-Eisenproben zur ICP-MS-Analyse wurden die Gesamt-Nicht-Häm-Eisenspiegel unabhängig voneinander über eine zuvor beschriebene Ferenmethode quantifiziert30. Die mit der Feren- versus ICP-MS-Methode gemessenen Nicht-Häm-Eisenkonzentrationen waren in allen gemessenen Geweben hochsignifikant korreliert (R2 = 0,94, P < 0,0001, n = 36). Repräsentative Ergebnisse der ICP-MS-Quantifizierung von Eisenisotopen sind in Tabelle 1 dargestellt. Insgesamt wurden 58Fe wie in Schritt 5 des Protokolls beschrieben berechnet. Die Daten werden als Gesamteisen und nicht als Häm- oder Nichthämeisen dargestellt (Abbildung 2A-D), da das Ziel darin bestand, das Gesamteisen, das in die Plazenta übertragen wird, und das Gesamteisen, das von der Plazenta auf den Embryo übertragen wird, zu quantifizieren.

Im Durchschnitt wurden 21% der verabreichten Dosis von 58Fe in der Plazenta, der embryonalen Leber und dem embryonalen Serum zusammen wiedergefunden. Die 56Fe-Messung gibt Aufschluss über den langfristigen Eisentransfer in der Plazenta und der embryonalen Leber während der Schwangerschaft. Die Gesamtplazenta 56Fe war in der eisendefizienten und -vollständigen Gruppe ähnlich (Abbildung 2A), während das gesamte Lebereisen des Embryos in der eisendefizienten Gruppe erniedrigt war (Abbildung 2B). Dies wurde aufgrund der beobachteten Abnahme der Plazenta-FPN in der Eisenmangelgruppe4 erwartet, was zu Eisenretention in der Plazenta auf Kosten des Embryos führen würde. Total 58Fe liefert eine Momentaufnahme des kurzfristigen Eisentransports. In dieser Studie, ähnlich wie 56Fe, war die Plazenta 58 Fe sowohl in der Eisenmangel- als auch in der -replete-Gruppe ähnlich (Abbildung 2C), und die Embryonenleber 58Fe war in der Eisenmangelgruppe erniedrigt (Abbildung 2D). Diese Daten deuten darauf hin, dass während einer Eisenmangelschwangerschaft die Herunterregulierung der Plazenta-FPN zu einem verminderten Eisentransport zum Embryo führt, was zu kumulativen Unterschieden im Eisengehalt in der Plazenta und im Embryo führt.

Es ist wichtig, die verabreichte Eisendosis zu berücksichtigen, da dies zu unbeabsichtigten Veränderungen der Hepcidinkonzentration oder der Eisentransporterexpression führen könnte31. Es wurde gezeigt, dass mütterlicher Eisenmangel eine Abnahme der Plazenta FPN4 verursachte. Um festzustellen, ob die Fe-Tf-Injektion diese Regulation beeinflusst, wurde die Plazenta FPN 6 h nach der Injektion mittels Western Blot gemessen. Die Eisendosis von 5 μg reichte nicht aus, um die Plazenta-FPN-Regulation durch mütterlichen Eisenmangel zu verändern (Abbildung 3).

Zusammenfassend wurde diese Methode verwendet, um zu zeigen, dass die physiologische Regulation der plazentaren FPN während des mütterlichen Eisenmangels zu einem verminderten Eisentransport durch die Plazenta in vivo führt. Stabile Eisenisotope bieten eine empfindliche und quantifizierbare Alternative zur Radioaktivität zur Messung des Eisentransports und der Eisenverteilung und ermöglichen die gleichzeitige Verwendung von Geweben für zusätzliche Analysen.

Figure 2
Abbildung 2: Transport von 56Fe und 58Fe über die Plazenta bei eisenarmen oder eisenreichen Schwangerschaften. Insgesamt 56Fe in der Plazenta (A) und der embryonalen Leber (B). Insgesamt 58Fe in der Plazenta (C) und der fetalen Leber (D). Die statistische Analyse wurde unter Verwendung eines 2-seitigen Student's t-Tests für normalverteilte Werte und ansonsten mit einem Mann-Whitney U-Rangsummentest (gekennzeichnet durch ein Sternchen nach dem p-Wert) durchgeführt. Die Anzahl der Tiere wird in den x-Achsen der Box- und Whisker-Plots angegeben. Der obere Teil des Box-Diagramms zeigt das 75. Perzentil und der untere das 25. Perzentil an. Schnurrhaare über dem Feld zeigen das 90. Perzentil an, und die unter dem Feld zeigen das 10. Perzentil an. Die durchgezogene Linie innerhalb des Feldes gibt den Median und die gestrichelte Linie den Mittelwert an. Die statistische Analyse wurde mit wissenschaftlicher Grafik- und Datenanalysesoftware durchgeführt. Diese Zahl wurde von4 geändert. Abkürzung: Fe = Eisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Plazenta-TFR1- und FPN-Spiegel. (A) Die TFR1- und FPN-Expression wurde 6 h nach der Behandlung von Müttern mit 58Fe-Tf durch Western Blot bei eisenarmen und -reichen Plazenta beurteilt. (B) Die Proteinexpression wurde quantifiziert und als Proteinexpression relativ zu β-Aktin dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit einem 2-seitigen Student's t-Test für normalverteilte Werte durchgeführt. Die Anzahl der Tiere wird in den x-Achsen der Box- und Whisker-Plots angegeben. Der obere Teil des Box-Diagramms zeigt das 75. Perzentil und der untere das 25. Perzentil an. Schnurrhaare über dem Feld zeigen das 90. Perzentil an, und die unter dem Feld zeigen das 10. Perzentil an. Die durchgezogene Linie innerhalb des Feldes gibt den Median und die gestrichelte Linie den Mittelwert an. Die statistische Analyse wurde mit wissenschaftlicher Grafik- und Datenanalysesoftware durchgeführt. Diese Zahl wurde von4 geändert. Abkürzungen: TFR1 = Transferrinrezeptor; FPN = Ferroportin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Probe 56 Fe 58 Fe Insgesamt Fe
Konzentration [ng/ml oder mg, ppb] Konzentration [ng/ml oder mg, ppb] Summe der Isotope [ng/ml oder mg]
Durchschnitt* stdev Durchschnitt* stdev
Nichthäm-Eisen Plazenta Eisenmangel 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
Eisen-voll 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Häm Plazenta Eisenmangel 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
Eisen-voll 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Nichthäm-Eisen Embryonale Leber Eisenmangel 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
Eisen-voll 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Häm Embryonale Leber Eisenmangel 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
Eisen-voll 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Tabelle 1: Repräsentative Ergebnisse der ICP-MS-Quantifizierung von 56 Fe und 58Fe in Plazenten und embryonalen Lebern. Abkürzungen: ppb = parts per billion; stdev = Standardabweichung; ICP-MS = Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma.

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Discussion

Eisen ist wichtig für viele biologische Prozesse, und seine Bewegung und Verteilung im Körper sind hochdynamisch und reguliert. Stabile Eisenisotope bieten eine konsistente und bequeme Alternative zu radioaktiven Isotopen zur Beurteilung der Dynamik der Eisenhomöostase. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Verfolgung aller Gewebegewichte und -volumina. Eisen ist ein Element und kann daher weder synthetisiert noch abgebaut werden. Wenn also alle Gewichte und Volumina sorgfältig protokolliert werden, kann das gesamte Eisen innerhalb des Systems durch Berechnung berücksichtigt werden. Wie beschrieben, kann diese Methode verwendet werden, um zwischen Häm- und Nicht-Häm-Eisenquellen zu unterscheiden. Wenn diese Unterscheidung zwischen Eisenformen jedoch nicht notwendig ist und nur das Gesamteisen gemessen wird, kann das Protokoll vereinfacht werden, indem Gewebe nur mit konzentriertem HNO3 behandelt wird, wie in Protokollschritt 4.2 beschrieben. Es ist wichtig zu beachten, dass, wenn Gewebe vor der Analyse nicht durchblutet werden, insbesondere stark vaskuläre Gewebe wie die Plazenta, das Vorhandensein von Blut zu einer Überschätzung des Hämeisengehalts des Gewebes führen kann.

Transferringebundenes Eisen wurde für die Studie ausgewählt, da es die Hauptquelle für Eisen ist, das von der Plazenta aufgenommenwird 16,17. Der globale Knockdown von TFR1 bei Mäusen führte zu einer embryonalen Letalität vor E12.5, was darauf hindeutet, dass transferringebundenes Eisen für die Entwicklung entscheidend ist. Es ist möglich, dass andere Eisenspezies, wie Ferritin und Nontransferrin-gebundenes Eisen (NTBI), in geringerem Maße ebenfalls zur fetalen Eisenausstattung beitragen. Der Beitrag dieser alternativen Eisenspezies wurde jedoch nicht bewertet. In Zukunft könnten stabile Isotope verwendet werden, um den Beitrag verschiedener Eisenquellen zur Entwicklung und Eisenausstattung des Embryos zu bestimmen.

Ziel der Studie war es, die Auswirkungen von Veränderungen des mütterlichen Eisenstatus auf den Plazenta-Eisentransport zu bestimmen. Ein vermindertes Hepcidin während eines Eisenmangels führt jedoch zu erhöhten Enterozyten-FPN-Spiegeln und einem verbesserten Eisentransport in den Kreislauf1. Daher wäre in eisenarmen Dämmen die Eisenabsorption aus der Nahrung von Natur aus erhöht und die Interpretation der Ergebnisse verwirrt, wenn 58Fe oral verabreicht worden wäre. Daher wurde die intravenöse Verabreichung von 58Fe-Tf gewählt, da es die Eisenregulation auf der Ebene der intestinalen Absorption umgeht. Eine Dosis von 5 μg 58Fe/Maus wurde basierend auf den Serumeisenkonzentrationen von eisenreichen E18,5-trächtigen Muttertieren ausgewählt. In Wildtyp-C57BL/6 E18.5-trächtigen Muttertieren liegen die Serumeisenkonzentrationen zwischen 10 und 50 μM4. Es wird erwartet, dass eine trächtige E18,5-Maus etwa 2 ml Gesamtblutvolumenhat 32. So liegt die Gesamtmenge an Eisen im Kreislauf eisenreicher schwangerer Muttertiere zwischen 1,1 und 5,6 μg. Somit entsprechen 5 μg 58Fe/Maus den physiologischen Konzentrationen, die bei eisenreichen Tieren beobachtet werden.

Eine Einschränkung der ICP-MS-Detektion von 58 Fe ist die isobare Interferenz von 58Ni. Die endogenen Ni-Konzentrationen in der Mausplazenta betragen 0,04 ± 0,02 μg/g Nassgewicht33. Eine durchschnittliche E18,5-Mausplazenta wiegt 0,080 g; Daher beträgt die Gesamtmenge an Ni ungefähr 3,2 ng. Die natürliche Häufigkeit von 58 Ni beträgt 68%; Somit beträgt die Menge an 58 Ni in der Mausplazenta ~ 2,2 ng, was etwa 10-mal niedriger ist als die nachgewiesenen 58Fe-Werte. Im Embryo sind die Ni-Konzentrationen mit 0,01 ± 0,01 μg/g Nassgewicht noch niedriger33. Der durchschnittliche E18,5-Mausembryo wiegt 1 g; Somit beträgt die Gesamtmenge an Ni in einem normalen Mausembryo etwa 10 ng. Unter der Annahme, dass der gesamte Embryo Ni in der Embryoleber gefunden wird, sind diese Werte immer noch 10-mal niedriger als die 58-Fe-Konzentrationen und fast 1.000-mal niedriger als der gesamte Eisengehalt der Embryo-Leber. Angesichts der geringeren Häufigkeit von Ni in diesen Mausgeweben wurde die 58Ni-Interferenz in dieser Studie nicht berücksichtigt.

Eine weitere Überlegung ist die Nachweisgrenze des Assays. Die Nachweisgrenze in dieser Studie lag bei 250 pg/ml 58Fe. Dieser Grenzwert kann jedoch geändert werden, um noch niedrigere Konzentrationen von 58Fe zu erkennen, wenn die Verdünnung des Gewebes im Schritt der Gewebeverarbeitung (Protokollschritt 4.1.2 und Abbildung 1D) oder durch Modifikationen in der ICP-MS-Kernanlage reduziert wird. Wenn 58 Fe im gesamten Embryo gemessen wurde, wurden seine Konzentrationen nicht nachgewiesen, da die Konzentration von 58Fe unter der Nachweisgrenze lag. 58Fe wurde jedoch in der embryonalen Leber nachgewiesen, die das primäre Eisenspeicherorgan ist. Es ist möglich, dass die Verabreichung einer größeren Dosis von 58Fe den Nachweis von 58Fe sogar im gesamten Embryo ermöglicht hätte. Eine relativ geringe Menge von 58Fe wurde jedoch verwendet, um eine Eisenbeladung der Plazenta zu vermeiden, die Rückkopplungsmechanismen auslösen und die Expression von Eisentransportern verändern könnte. In diesem Modell, das Wildtyp-C57BL/6-Mäuse verwendete, wurde das embryonale Lebereisen als Spiegelbild des gesamten Plazenta-Eisentransports gemessen, da die Eisenkonzentration der Embryonenleber proportional zur gesamten Eisenkonzentration des Embryos ist4. In Mausmodellen, in denen die Eisenverteilung verändert ist34, kann das embryonale Lebereisen allein jedoch den gesamten Plazenta-Eisentransport nicht genau darstellen. In solchen Fällen kann es notwendig sein, Eisen zu messen, das in den gesamten Embryo oder das Erythrozytenkompartiment eingebaut ist. Darüber hinaus erfordern Variationen der experimentellen Zeitpunkte auch eine weitere Optimierung und Messung von Eisen in verschiedenen fetalen Kompartimenten. Dieser Ansatz der Stabilisotopenverfolgung wurde verwendet, um den Eisentransport während der Mausschwangerschaft zu quantifizieren. Die Methodik ist leicht anpassbar, um den Eisentransport in nicht trächtigen Mäusen und anderen Tiermodellen zu untersuchen.

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Disclosures

EN ist wissenschaftlicher Mitbegründer von Intrinsic LifeSciences und Silarus Pharma und Berater für Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics und Disc Medicine. VS deklariert keine Konflikte.

Acknowledgments

Die Autoren würdigen die Nutzung der ICP-MS-Einrichtung innerhalb des UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology in CNSI an der UCLA für ihre Unterstützung bei der Optimierung des Protokolls für 58Fe-Messungen. Die Studie wurde vom NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, bis VS) und NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, bis EN) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

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Biologie Ausgabe 183
Quantifizierung des Eisentransports über die Mausplazenta <em>in vivo</em> unter Verwendung nichtradioaktiver Eisenisotope
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Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

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