Summary
이 기사는 마우스 임신에서 철 수송 연구를 위해 트랜스페린 결합 비 방사성 동위 원소 철을 준비하고 투여하는 방법을 보여줍니다. 태아 태반 구획에서 동위 원소 철을 정량화하는 접근법도 설명됩니다.
Abstract
철분은 임신 중 산모와 태아의 건강에 필수적이며, 건강한 임신을 유지하기 위해 인간에게 약 1g의 철분이 필요합니다. 태아의 철분 기증은 태반을 가로지르는 철분 전달에 전적으로 의존하며, 이러한 전달의 섭동은 불리한 임신 결과를 초래할 수 있습니다. 생쥐에서 태반을 가로지르는 철 플럭스의 측정은 전통적으로 방사성 철 동위원소에 의존했는데, 이는 매우 민감하지만 부담스러운 접근 방식이었습니다. 안정한 철 동위 원소 (57Fe 및 58Fe)는 인간 임신 연구에 사용하기위한 비 방사성 대안을 제공합니다.
생리 학적 조건 하에서, 트랜스페린 결합 철은 태반에 의해 흡수되는 철분의 주된 형태입니다. 따라서 58Fe- 트랜스페린을 준비하고 임신 한 댐에 정맥 주사하여 태반 철 수송을 직접 평가하고 모체 장 철분 흡수를 교란 변수로 우회했습니다. 동위원소 철은 유도결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)에 의해 태반 및 마우스 배아 조직에서 정량화되었다. 이들 방법은 또한 생체내 철 동력학을 정량화하기 위해 생리학 또는 질병의 다른 동물 모델 시스템에서 사용될 수 있다.
Introduction
철분은 성장과 발달, 에너지 생산, 산소 수송을 포함한 다양한 대사 과정에 중요합니다1. 철 항상성의 유지는 역동적이고 조정 된 과정입니다. 철분은 십이지장의 음식에서 흡수되어 철 수송 단백질 트랜스페린 (Tf)에 결합 된 순환을 통해 몸 전체로 운반됩니다. 그것은 효소 과정을 위해 모든 세포에 의해 활용되고, 초기 적혈구의 헤모글로빈에 통합되고, 대 식세포에 의해 노화 된 적혈구에서 재활용됩니다. 철분은 과도하게 간장에 저장되고 출혈이나 세포 박리를 통해 신체에서 손실됩니다. 순환하는 철분의 양은 철분 소비와 공급 사이의 균형의 결과이며, 후자는 철 항상성1의 중앙 조절 자 인 간 호르몬 헵시딘 (HAMP)에 의해 엄격하게 조절됩니다. 헵시딘은 유비퀴틴화를 폐색 또는 유도하고 철 수출업자 페로포르틴(FPN)을 분해하여 혈액 내 철 생체 이용률을 제한하는 기능을 합니다.2. 기능성 FPN의 감소는 식이 철분 흡수 감소, 간에서의 철분 격리 및 대식세포로부터의 철 재활용 감소로이어집니다1.
헵시딘은 철분 상태, 염증, 적혈구 생성 드라이브 및 임신에 의해 조절됩니다 (3에서 검토 됨). 철 항상성이 매우 역동적이라는 점을 감안할 때 총 철 풀과 철 분포 및 회전율을 이해하고 측정하는 것이 중요합니다. 동물 연구는 전통적으로 방사성 철 동위 원소에 의존했는데, 이는 철 역학을 측정하는 데 매우 민감하지만 부담스러운 접근 방식입니다. 그러나 여기에 제시된 연구4를 포함한보다 최근의 연구에서는 비 방사성, 안정한 철 동위 원소 (58Fe)가 임신 중 철 수송을 측정하는 데 사용됩니다 5,6,7,8,9. 안정 동위 원소는 영양소 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다 (10에서 검토 됨). 인간 연구에서 안정한 철 동위 원소의 사용은 i) 임신 말기에 철 흡수가 증가하고, 5,6, ii)식이 철분의 태아로의 전달은 산모의철분 상태에 의존하며, iii) 산모가 섭취 한 헴철은 비헴 철보다 태아에 의해 더 쉽게 통합되며, iv) 태아로의 철분 전달은 모체 헵시딘 수치8와 음의 상관 관계가 있음을 입증했으며, 9. 이 실험은 혈청의 철 동위 원소 또는 적혈구로의 통합을 측정했습니다. 그러나 적혈구에 통합된 철의 측정만으로는 진정한철 흡수를 과소평가할 수 있습니다9. 현재 연구에서는 헴철과 비헴철이 모두 조직에서 측정됩니다.
임신 중에는 산모의 적혈구 부피 확장을 지원하고 태아의 성장과 발달을 지원하기 위해 태반을 가로질러 전달하기 위해 철분이 필요합니다11. 태아의 철 자질은 태반을 가로지르는 철 수송에 전적으로 의존한다. 인간 12 및 설치류 4,13 임신 동안 헵시딘 수치가 급격히 감소하여 태아에게 전달하기위한 혈장 철분 가용성이 증가합니다.
태반 철 수송의 기본은 방사성 추적자 (59Fe 및 55Fe)를 사용하여 1950-70 년대에 처음 특성화되었습니다. 이 연구는 태반을 가로 지르는 철 수송이 단방향14,15이고 이연 트랜스페린이 태반과 태아16,17의 주요 철분 공급원임을 확인했습니다. 태반 철 수송에 대한 현재의 이해는 더 완벽하지만 일부 주요 철 수송 체와 규제 메커니즘은 아직 알려지지 않았습니다. 마우스 모델은 철 조절과 수송을 이해하는 데 필수적이었습니다18 주요 수송 체와 메커니즘이 현저하게 유사하기 때문입니다. 인간 및 마우스 태반 모두는 hemochorial, 즉, 모체 혈액이 태아 chorion19와 직접 접촉한다. 그러나 몇 가지 주목할만한 구조적 차이가 있습니다.
세포 융합 영양성 세포는 산모와 태아의 순환을 분리하고 철분 및 기타 영양소를 적극적으로 운반하는 태반 세포층입니다20. 인간에서 세포 융합 성 영양 세포는 융합 된 세포의 단일 층입니다. 대조적으로, 마우스 태반은 2개의 세포융합 영양성 층(21), Syn-I 및 Syn-II로 구성된다. 그러나, Syn-I 및 Syn-II의 계면에서의 갭 접합은 층들(22, 23) 사이의 영양분의 확산을 허용한다. 따라서, 이들 층은 인간 세포 융합 영양성 세포와 유사한 단일 세포 융합 층으로서 기능한다. 인간과 마우스 태반 사이의 추가적인 유사점 및 차이점은 Rossant 및 Cross21에 의해 검토됩니다. 태반 철 수송은 모체 혈액에서 세포 융합 성 영양 세포24의 정점 쪽에 국한된 트랜스페린 수용체 (TfR1)로의 철 -Tf의 결합에 의해 유발됩니다. 이 상호 작용은 클라 트린 매개 세포 내 이입25를 통해 철 -Tf / TfR1 내재화를 유도합니다. 그런 다음 철은 산성 엔도솜26의 Tf에서 방출되고, 미확인 페리환원효소에 의해 철철로 환원되고, 아직 결정되지 않은 수송체에 의해 엔도솜에서 세포질로 내보내집니다. 동합성 영양성 세포 내에서 철분이 어떻게 보호되는지도 설명해야 합니다. 철은 결국 철 수출업자 인 FPN에 의해 태아 측으로 운반되며, 이는 세포 융합 성 영양 세포의 기저 또는 태아 대면 표면에 국한된다 (27에서 검토).
TfR1, FPN 및 헵시딘의 생리학적 및 병리학적 조절이 태반 철 수송에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위해 안정한 철 동위원소를 활용하여 모체 순환에서 태반 및 배아로의 철 수송을 생체 내4로 정량화했습니다. 이 논문은 임신 한 마우스에 동위 원소 철-트랜스페린을 제조 및 투여하고, ICP-MS를위한 조직을 처리하고, 조직의 철 농도를 계산하는 방법을 제시합니다. 생체 내에서 안정한 철 동위원소의 사용은 생리학적 및 병리학적 철 조절을 조사하기 위해 다양한 동물 모델에서 철 조절 및 분포를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 프로토콜 및 실험 절차는 캘리포니아 대학교 로스 앤젤레스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 58Fe-TF의 제조
참고: 프로토콜은 58Fe를 사용합니다. 그러나 57Fe에 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 동위 원소는 추가 예방 조치없이 표준 철 화학 물질로 사용 및 폐기 할 수 있습니다.
- 58Fe의 HCl / mg 50μL에서 12N HCl에 58Fe를 용해시킵니다.
- 공급 업체에서 제공 한 유리 바이알의 금속에 HCl을 추가하고 캡을 느슨하게 교체하십시오. 철을 녹이려면 58Fe / HCl 용액을 60 ° C로 1 시간 동안 따뜻하게합니다. 그래도 용해되지 않으면 용액을 흄 후드의 실온에서 밤새 방치하여 용해시킵니다.
참고: 용해된 58Fe/HCl 용액은 황주황색입니다.
철 3 O 4 (들) + 8HCl (수성) → 철 (II) Cl 2 (수성) + 2 철 (III) Cl3 (수성) + 4H 2 O
- 공급 업체에서 제공 한 유리 바이알의 금속에 HCl을 추가하고 캡을 느슨하게 교체하십시오. 철을 녹이려면 58Fe / HCl 용액을 60 ° C로 1 시간 동안 따뜻하게합니다. 그래도 용해되지 않으면 용액을 흄 후드의 실온에서 밤새 방치하여 용해시킵니다.
- 남아있는 Fe (II) Cl2 를 산화시켜 Fe (III) Cl3 용액을 생성한다.
- 산화를 촉진하기 위해 캡을 제거한 상태에서 58Fe / HCl 용액을 60 ° C로 예열합니다.
- 산화를 더욱 촉진하기 위해 58Fe / HCl 용액 50 μL 당 1 μL의 35 % H 2 O2를 첨가하십시오.
철 (II) Cl 2 (aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe (III) Cl3 (aq) + 2H 2 O
- 염화제이철(58Fe(III)Cl3) 용액을 준비한다.
- 뚜껑을 제거한 상태에서 60°C의 후드에 염화철 용액을 그대로 두어 샘플을 증발시킵니다.
알림: 증발에는 하루에서 며칠이 걸릴 수 있습니다. - 초순수H2O로 58Fe(III)Cl3를 100mM로 재구성하고, 단계 1.1에서 사용된 초기 금속량을 기준으로 필요한 초순수H2O의 양을 계산한다(58Fe(III)Cl3의 분자량은 162.2이다).
- 뚜껑을 제거한 상태에서 60°C의 후드에 염화철 용액을 그대로 두어 샘플을 증발시킵니다.
- 20 mM NaHCO 3의 존재하에 1 : 5 몰비로 NTA와 58Fe (III) Cl3을 배양하여 58Fe (III) - 니트릴로 트리 아세테이트 (NTA)를 제조한다.
- 1 N NaOH에서 500 mM NTA를 준비합니다.
- 5x 트랜스페린 로딩 완충액(0.5 M hepes, pH 7.5; 0.75 M NaCl)을 준비합니다.
- 초순수 H2O에서 1 M NaHCO3 를 준비한다.
- 15mL 원뿔형 튜브에, 100 mM 58Fe(III)Cl3 용액 150 μL(단계 1.3.2에서), 1 N NaOH에서 제조된 500 mM NTA 150 μL, 초순수H2O 480μL, 5x 트랜스페린 로딩 완충액 200 μL, 및 1 M NaHCO3 용액 20 μL를 첨가한다.
- 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양한다.
- 58Fe (III) -NTA로 apo-Tf를로드하여 58Fe-Tf를 형성합니다.
참고 :이 프로토콜은 McCarthy와 Kosman28에서 채택되었습니다.- 500 mg의 apo-Cf를 4 mL의 1x Tf 로딩 완충액에 녹입니다.
- 1.4.4단계 15mL의 58Fe(III)-NTA 용액이 들어 있는 58mL원뿔형 튜브에 4mL의 apo-Tf 용액을 추가합니다.
알림: 이것은 3 Fe-NTA와 apo-Tf의 1 : 58몰비입니다. 각각의 Tf는 2 개의 Fe 결합 부위를 함유하고; Tf가 완전히로드되었는지 확인하기 위해 초과 58Fe-NTA가 추가되었습니다. - apo-Tf에 58Fe-NTA를 최대로 적재 할 수 있도록하려면 용액이 pH 7.5인지 확인하고 필요한 경우 NaHCO3 또는 HCl로 pH를 조정하십시오.
- 실온에서 2.5 시간 동안 배양하십시오.
- 과도한 결합되지 않은 58Fe (III) -NTA를 제거하고 NTA를 해제합니다.
- 58Fe-Tf 용액을 분자량 차단 컬럼 (30kDa 컷오프)으로 옮기고 실온에서 15 분 동안 2,500 ×g에서 원심 분리합니다.
- 10mL의 1x 트랜스페린 로딩 완충액으로 컬럼을 세척하고 실온에서 15분 동안 2,500× g 에서 원심분리합니다. 세척 및 원심분리를 반복하고, 식염수 10mL로 식염수 세척을 수행하고, 실온에서 15분 동안 2,500× g 에서 원심분리한다.
- 58Fe-Tf의 농도를 계산하십시오.
참고 : 1.5.2 단계에서 과량의 58Fe가 첨가 되었기 때문에 모든 트랜스페린이 이연이라고 가정합니다. 500mg의 apo-Tf가 사용됨에 따라, ~500mg 58Fe-Tf가 단계 1.5.4에서 생성되었다.- 단계 1.6.2에서 식염수 세척 후 원심분리로부터 회수된 부피를 측정한다.
- 500mg을 회수된 부피로 나누어 58Fe-Tf 용액의 농도(mg/mL)를 결정합니다.
- 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 58Fe-Tf 용액을 멸균합니다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
참고: 58Fe-Tf 용액은 준비 후 1주에서 4주 사이에 사용되었습니다.
2. 임신 시간 설정
- 6-8 주 된 암컷 마우스를 사용하십시오. 짝짓기 전에 2 주 동안 동물을 저철분 식단 (철분 4ppm) 또는 표준 차우 (철분 185ppm)에 놓고 임신 기간 동안 각각의 식단을 유지하십시오.
- 옵션 01 : E7.5에서 체중 증가로 임신을 확인하십시오.
- 여러 개의 번식 케이지를 설치하십시오. 각 케이지에 대해 2 명의 암컷과 1 마리의 수컷을 밤새 결합하십시오. 동물이 분리 된 다음 날은 배아 일 (E) 0.5로 간주됩니다. 임신 여부를 확인하기 위해 E7.5에서 여성의 체중을 측정하십시오. 체중이 증가하지 않은 암컷과 수컷을 다시 짝짓기하십시오.
알림: WT C57BL / 6에서 E1에서 7.5g의 체중 증가는 임신의 좋은 지표입니다. 이 방법은 특정 16 시간 내에 이식이 이루어 졌음을 보장하여 동일한 짝짓기 기간 동안 임신 한 모든 동물의 동시 치료를 가능하게합니다.
- 여러 개의 번식 케이지를 설치하십시오. 각 케이지에 대해 2 명의 암컷과 1 마리의 수컷을 밤새 결합하십시오. 동물이 분리 된 다음 날은 배아 일 (E) 0.5로 간주됩니다. 임신 여부를 확인하기 위해 E7.5에서 여성의 체중을 측정하십시오. 체중이 증가하지 않은 암컷과 수컷을 다시 짝짓기하십시오.
- 옵션 02: 플러그 체크로 임신을 확인합니다.
- 암컷 2 마리와 수컷 1 마리를 결합하고 매일 플러그 검사를 수행하여 교미가 발생했는지 확인합니다.
알림: 이 방법을 사용하면 시차를 두고 임신할 수 있으며 플러그가 있다고 해서 임신이 보장되는 것은 아닙니다.
- 암컷 2 마리와 수컷 1 마리를 결합하고 매일 플러그 검사를 수행하여 교미가 발생했는지 확인합니다.
3. E17.5 임신한 마우스에 58Fe-Tf 정맥 투여
- 주입을 위해 1.8 단계에서 58Fe-Tf를 준비하십시오.
- 식염수에서 35 mg / mL로 58Fe-Tf 용액을 준비하십시오. 마우스당 100μL를 주입합니다.
- 인슐린 주사기에 100 μL의 58Fe-Tf 용액을 채 웁니다.
참고 : 각 용량에는 3.5mg의 인간 58 Fe-Tf ( 58Fe 58μg)가 들어 있습니다.
- 이소 플루 란을 사용하여 임신 한 마우스를 마취하십시오.
- 챔버가있는 이소 플루 란 조절기를 사용하십시오.
- 다음 설정을 사용하십시오: 5% 이소플루란, 2L/mL의 O 2,2분.
- 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인하여 마우스가 마취되었는지 확인합니다.
- 눈 표면에 눈 윤활제를 바르고 마우스를 가열 패드에 놓습니다.
- 천천히 조심스럽게 58Fe-Tf 용액을 후 궤도 부비동에 주입합니다.
- 마우스가 마취에서 회복되도록하십시오. 동물이 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
- 주사 6 시간 후, 이소 플루 란 과다 복용으로 E17.5 임산부를 안락사시킨다.
- 2 차 안락사의 한 형태로 마우스를 추방하기 위해 심장 천자를 수행하십시오.
- 안정화를 위해 바늘로 발을 고정하십시오.
- 태반과 배아 간을 수집하십시오.
- 멸균 집게와 해부 가위를 사용하여 임신 한 마우스에서 자궁을 조심스럽게 제거하십시오. 자궁의 일부로 둘러싸인 양막에서 단일 태아와 태반으로 구성된 태반 태아 - 태반 단위를 잘라냅니다.
- 태아와 태반을 방해하지 않고 자궁과 양막을 조심스럽게 자릅니다.
- 양막을 벗겨 내고 태아와 태반을 제거하십시오.
- 탯줄을 자르십시오.
- 태아와 태반을 깨끗한 작업 닦음으로 닦아서 과도한 양수를 제거하십시오.
- 전체 태반의 무게를 기록하십시오.
- 면도날로 각 태반을 반으로 자르고 각 반쪽을 2.0mL 튜브에 넣고 액체 질소에 스냅 동결합니다.
참고: 58 Fe는 특별한 취급 예방 조치 및 폐기가 필요하지 않기 때문에 태반의 절반은 58Fe 측정에 사용하고 나머지 절반은 웨스턴 블로팅 및 qPCR에 의한 트랜스페린 수용체(TFR1) 및 페로포르틴(FPN) 발현의 정량을 포함한 기타 분석에 사용할 수 있습니다. - 배아 간을 수집하려면 배아를 희생하십시오 : 면도날을 사용하여 배아를 빠르게 참수하십시오.
참고 : E17.5에서 자궁의 모든 배아는 연구에 사용되지 않더라도 개별적으로 안락사되어야합니다. - 안정화를 위해 배아를 고정하고 복부를 노출시킵니다.
- 해부 가위를 사용하여 탯줄이 부착 된 곳에 작은 절개를하고 해부 가위의 한쪽 끝을 절개 부위에 삽입하고 약 1/4 인치 정도의 관상 평면쪽으로 정중 평면 절단을 수행합니다. 그런 다음 횡단면 절단을 수행하여 태아 간을 노출시킵니다.
- 집게를 사용하여 태아 간을 제거하십시오.
- 전체 배아 간의 무게를 기록하십시오.
- 전체 배아 간을 2mL 튜브에 넣고 액체 질소에서 스냅 냉동합니다.
참고: 또는 추가 분석이 필요한 경우 배아 간의 일부만 58Fe측정에 사용할 수 있습니다. 2.0mL 튜브를 사용하면 1.5mL 튜브보다 더 나은 조직 균질화가 가능합니다.
- 조직을 -80 °C에서 무기한 보관하십시오.
4. ICP-MS에 의한 정량적 철 분석을 위한 공정 조직
- 비헴철의 정량을 위해 태반과 태아 간을 처리하십시오.
- 태반 반쪽과 전체 태아 간을 해동하고 태반 반쪽의 무게를 측정합니다 (태아 간 무게 기록은 3.6.12 단계 참조).
- 400μL의 단백질 침전 용액(0.53N HCl, 5.3% TCA)을 추가합니다.
- 전기 균질화를 사용하여 조직을 균질화하십시오.
- 샘플을 100°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 샘플을 실온의 물에서 2분 동안 냉각합니다.
- 캡을 열어 압력을 해제한 다음 튜브를 다시 닫습니다.
- 17,000 ×g에서 실온에서 10 분 동안 원 심 분리하여 조직 파편을 펠릿화합니다.
- 상청액을 새 라벨이 붙은 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
- ICP-MS 분석을 위해 샘플을 보냅니다.
- 헴철의 정량을 위해 태반과 태아 간을 처리하십시오.
알림: 1단계에서 비헴철을 추출한 후 펠릿에 남아 있는 철은 주로 헴입니다.- 4.1.7단계에서 각 펠릿의 무게를 기록합니다.
- 10 mL의 농축 된 70 %HNO3 3 mL에 30 % H 2 O 221 mL로 펠릿을 분해합니다.
알림: ICP-MS 코어 또는 센터와 상의하여 특정 연구를 위해 HNO3 의 부피를 최적화하십시오. 부피는 부분적으로 샘플 중량에 따라 달라집니다. - 샘플을 200°C로 15분 동안 가열합니다.
- ICP-MS 분석을 위해 샘플을 보냅니다.
참고: 헴철과 비헴철 공급원을 구별할 필요가 없고 총 철만 측정하는 경우 첫 번째 단계로 전체 조직을 HNO3 에서 소화할 수 있습니다.
5. 데이터 분석
참고 : ICP-MS의 데이터는 ng / mL 또는 mg, ppb (표 1) 단위의 56Fe 및 58Fe 농도로 제공되었습니다. 56 Fe는 자연에서 가장 풍부한 철 동위 원소이며, 그 측정은 전체 임신 기간 동안 태반 / 배아의 철 축적을 반영하는 반면, 58Fe 측정은 주사 후 6 시간 동안 전달 된 철을 반영합니다.
- 측정 된 58Fe 값에서 58Fe (총 Fe의 0.28 %)의 자연 풍부도를 뺍니다.
- 총 비헴 58Fe를 계산합니다.
- 먼저 5.1단계에서 계산된 철 농도(ng/mL)에 4.1.2단계에서 초기 처리 중 부피(mL)를 곱하여 총 58Fe를 추정하여 배아 간 총 비헴철(ng)을 계산합니다.
- 3.6.6단계에서 측정된 태반의 총 중량을 취하여 4.1.1단계에서 처리된 태반의 중량으로 나누어 전체 태반의 철분 양을 계산합니다. 이 값에 5.2.1단계에서 계산된 총 비헴철(ng)을 곱하여 태반의 총 비헴 58Fe함량을 구한다.
- 총 헴 58Fe를 계산합니다.
- 먼저 5.1단계에서 계산된 철 농도(ng/mg)에 4.2.1단계에서 측정한 펠릿의 무게(mg)를 곱하여 총 헴 58Fe를 계산합니다.
- 이어서, 단계 3.5.1에서 측정된 태반의 총 중량을 단계 4.2.1에서 측정된 태반 펠렛의 중량으로 나눈다. 이 값에 5.3.1단계에서 계산된 총 헴철(ng)을 곱하여 태반의 총 헴 58Fe함량을 구한다.
- 계산된 비헴 및 헴 58Fe값을 합산하여 각 조직에 대한 총 철 함량을 결정합니다.
그림 1: 프로토콜의 단계에 대한 시각적 요약. (A) 58Fe-트랜스페린의 제조. (B) 58Fe-트랜스페린의 생체 내 투여. (C) 조직 수집 및 보관. (d) ICP-MS에 의한 금속종의 정량을 위한 태반 및 배아 간의 처리. 약어 : Fe = 철; NTA = 니트릴로트리아세트산; Tf = 트랜스페린; PPS = 단백질 침전액; Sup = 상청액; TCA = 트리클로로아세트산; ICP-MS = 유도 결합 플라즈마 질량 분석법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
철 수송을 측정하기 위해 안정한 철 동위 원소를 사용한 초기 연구에서는 모체의 철분 결핍으로 인해 태반 철 수출국 인 FPN4의 하향 조절이 이루어 졌다는 것이 입증되었습니다. FPN은 유일하게 알려진 포유류 철 수출국이며, 발달 중에 FPN이 없으면 E9.529 이전에 배아 사망이 발생합니다. FPN 발현의 관찰된 감소가 기능적으로 감소된 태반 철 수송으로 전환되는지 여부를 결정하기 위해, 58Fe-Tf를 임신한 댐에 정맥내 주사하고, 태반 및 배아의 철분을 모체 철분 결핍의 존재 하에 정량화하였다.
태반 철 수송이 모체 철분 상태에 의해 어떻게 영향을 받는지 이해하기 위해 철분 결핍을 마우스4에서 모델링했습니다. 암컷 C57BL/6 마우스는 임신 전과 임신 내내 2주 동안 저철분 식단(4ppm 철) 또는 표준 차우(185ppm 철)에 배치되었습니다. 이 식이 요법은표준 식단을 섭취한 동물에 비해 E12.5, E15.5 및 E18.5에서 산모의 간 비헴철과 혈청 철분 및 헤모글로빈을 낮춥니다4. E18.5에서 철분이 결핍된 산모의 배아는 철분이 부족한 산모의 배아보다 간 철분이 낮고 저페레믹 및 빈혈이 있었습니다. 3 마리의 임신 한 마우스를 철분 충혈 및 철 결핍 그룹 각각에 사용했으며, 분석을 위해 각 임신 마우스에서 2-3 개의 태반을 사용했습니다.
태반 철 수송을 정량하기 위해, 58Fe- 트랜스페린을 제조하고 임신 댐에 정맥 주사하고 58Fe를 ICP-MS에 의해 태반 및 태아 간에서 측정했다 (프로토콜에 기술되고 그림 1에 도시된 바와 같이). ICP-MS 분석을 위해 비헴철 샘플을 보내기 전에, 총 비헴철 수준은 앞서 설명한 페렌 방법을 통해 독립적으로 정량화되었다(30). 페렌 대 ICP-MS 방법으로 측정된 비헴철 농도는 측정된 모든 조직에서 매우 유의하게 상관관계가 있었다(R2=0.94, P<0.0001, n=36). 철 동위원소의 ICP-MS 정량의 대표적인 결과는 표 1에 제시되어 있다. 총 58Fe는 프로토콜의 단계 5에 기재된 바와 같이 계산되었다. 데이터는 헴 또는 비헴철이 아닌 총체적으로 제시되는데(그림 2A-D), 태반으로 전달된 총 철과 태반에서 배아로 전달된 총 철을 정량화하는 것이 목표였기 때문입니다.
평균적으로, 투여된 58Fe 투여량의 21%가 태반, 배아 간, 및 배아 혈청을 조합하여 회복되었다. 56Fe 측정은 임신 기간 동안 태반과 배아 간에서 장기적인 철분 전달에 대한 통찰력을 제공합니다. 총 태반 56Fe는 철분 결핍 그룹과 -replete 그룹에서 유사했지만 (그림 2A), 총 배아 간 철분은 철 결핍 그룹에서 감소했습니다 (그림 2B). 이것은 철 결핍 그룹4에서 태반 FPN의 관찰 된 감소를 기반으로 예상되었으며, 이는 배아를 희생시키면서 태반에서 철분 보유를 초래할 것입니다. Total 58Fe는 단기 철 수송의 스냅 샷을 제공합니다. 이 연구에서, 56Fe와 유사하게, 태반 58 Fe는 철 결핍 그룹 및 -replete 그룹 모두에서 유사했으며 (그림 2C), 배아 간 58Fe는 철 결핍 그룹에서 감소했다 (그림 2D). 이 데이터는 철분 결핍 임신 중에 태반 FPN의 하향 조절이 배아로의 철 수송을 감소시켜 태반과 배아의 철분 함량에 누적 차이를 초래한다는 것을 나타냅니다.
투여된 철분의 투여량은 헵시딘 농도 또는 철 수송체 발현31의 의도하지 않은 변화를 초래할 수 있으므로 고려하는 것이 중요합니다. 산모의 철분 결핍이 태반 FPN4의 감소를 유발한다는 것이 입증되었습니다. Fe-Tf 주입이 이러한 조절에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 태반 FPN을 주입 후 6시간 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 5μg의 철분 용량은 산모의 철분 결핍에 의한 태반 FPN 조절을 변경하기에 충분하지 않았습니다(그림 3).
요약하면, 이 방법은 산모의 철분 결핍 동안 태반 FPN의 생리학적 조절이 생체 내에서 태반을 가로질러 철 수송을 감소시킨다는 것을 입증하기 위해 사용되었습니다. 안정한 철 동위원소는 철 수송 및 분포 측정을 위해 방사능에 대한 민감하고 정량화 가능한 대안을 제공하여 추가 분석을 위해 조직을 동시에 사용할 수 있습니다.
그림 2: 56Fe 및 58Fe는 철분 결핍 또는 철분 충만한 임신에서 태반을 가로질러 이동합니다. 태반 (A)과 배아 간 (B)에서 총 56Fe. 태반 (C)과 태아 간 (D)에서 총 58Fe. 통계 분석은 정규 분포 값에 대해 2-꼬리 스튜던트 t-검정을 사용하고 그렇지 않으면 Mann-Whitney U 순위합 검정(P-값 뒤에 별표로 표시)을 사용하여 수행되었습니다. 동물의 수는 상자와 수염 플롯의 x 축에 표시됩니다. 상자 그림의 위쪽 부분은 75번째 백분위수를 나타내고 아래쪽은 25번째 백분위수를 나타냅니다. 상자 위의 수염은 90번째 백분위수를 나타내고 상자 아래의 수염은 10번째 백분위수를 나타냅니다. 상자 안의 실선은 중앙값을 나타내고 파선은 평균을 나타냅니다. 통계 분석은 과학적 그래프 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 이 수치는4에서 수정되었습니다. 약어 : Fe = 철. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 태반 TFR1 및 FPN 수준. (A) TFR1 및 FPN 발현은 58Fe-TF로 산모를 처리한 후 6시간 후에 철 결핍 및 충혈 태반에서 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. (B) 단백질 발현을 정량하여 β-액틴에 대한 단백질 발현으로 제시하였다. 통계 분석은 정규 분포 값에 대한 2-꼬리 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. 동물의 수는 상자와 수염 플롯의 x 축에 표시됩니다. 상자 그림의 위쪽 부분은 75번째 백분위수를 나타내고 아래쪽은 25번째 백분위수를 나타냅니다. 상자 위의 수염은 90번째 백분위수를 나타내고 상자 아래의 수염은 10번째 백분위수를 나타냅니다. 상자 안의 실선은 중앙값을 나타내고 파선은 평균을 나타냅니다. 통계 분석은 과학적 그래프 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 이 수치는4에서 수정되었습니다. 약어 : TFR1 = 트랜스페린 수용체; FPN = 페로 포르틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 견본 | 56 철 | 58 철 | 총 철 | ||||
| 농도 [ng / mL 또는 mg, ppb] | 농도 [ng / mL 또는 mg, ppb] | 동위 원소의 합 [ng / mL 또는 mg] | |||||
| 평균의* | 스트데브 | 평균의* | 스트데브 | ||||
| 비헴철 | 태반 | 철분 결핍 | 729.7 | 17.7 | 2.5 | 0.5 | 732.2 |
| 704.9 | 6.2 | 3.8 | 0.1 | 708.8 | |||
| 649.8 | 3.8 | 0.0 | 0.0 | 649.8 | |||
| 799.2 | 4.6 | 3.8 | 0.2 | 803.0 | |||
| 철분 충혈 | 1919.1 | 5.3 | 11.0 | 0.2 | 1930.1 | ||
| 1610.0 | 26.8 | 11.7 | 0.6 | 1621.7 | |||
| 1925.5 | 39.0 | 14.0 | 0.3 | 1939.5 | |||
| 2551.6 | 16.1 | 8.3 | 0.4 | 2559.9 | |||
| 헴 | 태반 | 철분 결핍 | 253.8 | 1.8 | 1.1 | 0.0 | 254.9 |
| 32.9 | 0.4 | 0.3 | 0.0 | 33.2 | |||
| 337.7 | 5.1 | 1.4 | 0.0 | 339.1 | |||
| 402.3 | 5.3 | 1.7 | 0.0 | 404.0 | |||
| 철분 충혈 | 123.5 | 1.3 | 0.6 | 0.0 | 124.0 | ||
| 75.7 | 1.3 | 0.4 | 0.0 | 76.1 | |||
| 441.9 | 3.0 | 1.9 | 0.0 | 443.8 | |||
| 250.4 | 1.1 | 1.1 | 0.0 | 251.5 | |||
| 비헴철 | 배아 간 | 철분 결핍 | 361.6 | 8.3 | 31.9 | 1.0 | 393.5 |
| 652.4 | 3.4 | 61.7 | 0.3 | 714.1 | |||
| 411.9 | 10.7 | 43.1 | 0.8 | 455.0 | |||
| 631.1 | 7.5 | 62.8 | 0.2 | 693.9 | |||
| 철분 충혈 | 7657.5 | 129.3 | 226.4 | 2.2 | 7883.8 | ||
| 3820.2 | 69.5 | 119.4 | 3.4 | 3939.6 | |||
| 5519.0 | 112.9 | 145.6 | 0.5 | 5664.6 | |||
| 4617.4 | 78.6 | 91.6 | 1.0 | 4709.0 | |||
| 헴 | 배아 간 | 철분 결핍 | 44.5 | 0.3 | 1.6 | 0.0 | 46.0 |
| 31.0 | 0.4 | 2.9 | 0.0 | 34.0 | |||
| 11.8 | 0.2 | 1.1 | 0.0 | 12.9 | |||
| 42.3 | 0.1 | 3.2 | 0.0 | 45.5 | |||
| 철분 충혈 | 54.3 | 1.4 | 2.1 | 0.0 | 56.4 | ||
| 31.9 | 0.8 | 1.3 | 0.1 | 33.2 | |||
| 59.4 | 0.6 | 2.2 | 0.0 | 61.6 | |||
| 66.7 | 0.6 | 2.1 | 0.0 | 68.8 | |||
표 1: 태반 및 배아 간에서 56Fe및 58Fe의 ICP-MS 정량의 대표적인 결과. 약어 : ppb = 십억 분의 일; 표준 편차 = 표준 편차; ICP-MS = 유도 결합 플라즈마 질량 분석법.
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Discussion
철분은 많은 생물학적 과정에 중요하며 신체 내에서의 움직임과 분포는 매우 역동적이고 규제됩니다. 안정한 철 동위 원소는 철 항상성의 역학 평가를위한 방사성 동위 원소에 대한 일관되고 편리한 대안을 제공합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 모든 조직 무게와 부피를 추적하는 것입니다. 철은 원소이므로 합성하거나 분해할 수 없습니다. 따라서 모든 무게와 부피를 주의 깊게 기록하면 시스템 내의 모든 철을 계산하여 설명할 수 있습니다. 설명된 바와 같이, 이 방법은 헴과 비헴철 공급원을 구별하는데 사용될 수 있다. 그러나, 철 형태 사이의 이러한 구별이 필요하지 않고 총 철만이 측정되는 경우, 프로토콜 단계 4.2에 설명된 바와 같이 농축된 HNO3 로만 조직을 처리함으로써 프로토콜을 단순화할 수 있다. 분석 전에 조직, 특히 태반과 같은 고도의 혈관 조직이 관류되지 않으면 혈액의 존재로 인해 조직 헴철 함량이 과대 평가 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
트랜스페린 결합 철은 태반16,17이 흡수하는 철분의 주요 공급원이기 때문에 연구를 위해 선택되었습니다. 마우스에서 TFR1의 글로벌 녹다운은 E12.5 이전에 배아 치사율을 초래했으며, 이는 트랜스페린 결합 철이 발달에 중요하다는 것을 시사합니다. 페리틴 및 비 트랜스페린 결합 철 (NTBI)과 같은 다른 철 종도 태아 철 기증에 덜 기여할 수 있습니다. 그러나 이러한 대체 철 종의 기여도는 평가되지 않았습니다. 미래에는 안정 동위 원소를 사용하여 발달 및 배아 철 자질에 대한 다양한 철 공급원의 기여도를 결정할 수 있습니다.
이 연구의 목적은 모체 철분 상태의 변화가 태반 철 수송에 미치는 영향을 결정하는 것이 었습니다. 그러나 철분 결핍 동안 헵시딘이 감소하면 장 세포 FPN 수치가 상승하고 순환계로의 철분 수송이 향상됩니다1. 따라서 철분이 부족한 댐에서는 식단에서 철분 흡수가 본질적으로 증가하고 58Fe가 경구 투여되면 결과 해석이 혼란 스러울 것입니다. 따라서, 58Fe-Tf의 정맥 내 투여는 장 흡수 수준에서 철 조절을 우회하기 때문에 선택되었다. 철분이 풍부한 E18.5 임신 댐의 혈청 철 농도를 기준으로 58Fe / 마우스 5 μg의 용량을 선택했습니다. 야생형 C57BL/6 E18.5 임신 댐에서, 혈청 철 농도는 10 내지 50 μM4 범위이다. 임신한 E18.5 마우스는 약 2 mL의 총 혈액량32를 가질 것으로 예상된다. 따라서 철분이 풍부한 임신 댐의 순환에서 철분의 총량은 1.1에서 5.6 μg입니다. 따라서 58Fe / 마우스 5 μg은 철분이 풍부한 동물에서 관찰되는 생리적 농도와 같습니다.
58Fe의 ICP-MS 검출의 한계는 58Ni로부터의 등압 간섭입니다. 마우스 태반의 내인성 Ni 농도는 0.04 ± 0.02 μg/g 습윤 중량33입니다. 평균 E18.5 마우스 태반의 무게는 0.080g입니다. 따라서 Ni의 총량은 약 3.2ng입니다. 58Ni의 자연 풍부도는 68 %입니다. 따라서 마우스 태반에서 58 Ni의 양은 ~ 2.2 ng이며, 이는 검출 된 58Fe 수준보다 약 10 배 낮습니다. 배아에서, Ni 농도는 0.01 ±내지 0.01 μg/g 습윤 중량33에서 훨씬 더 낮다. 평균 E18.5 마우스 배아의 무게는 1g입니다. 따라서 정상 마우스 배아에서 Ni의 총량은 약 10ng입니다. 모든 배아 Ni가 배아 간에서 발견된다고 가정하면, 이러한 수준은 여전히 10 Fe 농도보다 58배 낮고 총 배아 간 철 함량보다 거의 1,000 배 낮습니다. 이러한 마우스 조직에서 Ni의 낮은 존재량을 감안할 때, 58Ni 간섭은이 연구에서 고려되지 않았다.
추가 고려 사항은 분석의 검출 한계입니다. 이 연구에서 검출 한계는 250 pg / mL 58Fe였습니다. 그러나 이 한계는 조직 처리 단계(프로토콜 단계 4.1.2 및 그림 1D)에서 또는 ICP-MS 핵심 시설에서 수정을 통해 조직의 희석이 감소하는 경우 더 낮은 농도의 58Fe를 검출하도록 변경될 수 있습니다. 전체 배아에서 58 Fe를 측정했을 때, 58Fe 농도가 검출 한계 미만이었기 때문에 그 수준은 검출되지 않았다. 그러나 58Fe는 주요 철 저장 기관인 배아 간에서 검출되었습니다. 더많은 용량의 58 Fe를 투여하면 전체 배아에서도 58Fe를 검출 할 수 있었을 가능성이 있습니다. 그러나 태반의 철 로딩을 피하기 위해 상대적으로 적은 양의 58Fe가 사용되어 피드백 메커니즘을 유발하고 철 수송 체의 발현을 변경할 수 있습니다. 야생형 C57BL/6 마우스를 활용한 이 모델에서 배아 간 철 농도는 전체 배아철 농도에 비례하기 때문에 전체 태반 철 수송의 반영으로 배아 간 철을 측정했습니다4. 그러나, 철 분포가 변경된 마우스 모델에서(34), 배아 간 철 단독은 전체 태반 철 수송을 정확하게 나타내지 않을 수 있다. 이러한 경우 전체 배아 또는 적혈구 구획에 통합 된 철을 측정해야 할 수도 있습니다. 또한 실험 시점의 변화는 다양한 태아 구획에서 철분의 추가 최적화 및 측정을 필요로합니다. 이 안정 동위원소 추적 접근법은 마우스 임신 중 철 수송을 정량화하는 데 활용되었습니다. 이 방법론은 임신하지 않은 마우스 및 기타 동물 모델에서 철 수송을 연구하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
EN은 Intrinsic LifeSciences 및 Silarus Pharma의 과학 공동 설립자이자 Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics 및 Disc Medicine의 컨설턴트입니다. VS는 충돌이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 58Fe 측정을위한 프로토콜을 최적화하는 데 도움을 받기 위해 UCLA의 CNSI에있는 나노 기술의 환경 영향을위한 UC 센터 내에서 ICP-MS 시설을 사용했음을 인정합니다. 이 연구는 NIH 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK) (K01DK127004, VS) 및 NIH 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 (NICHD) (R01HD096863, EN)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
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