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Cuantificación del transporte de hierro a través de la placenta del ratón in vivo utilizando isótopos de hierro no radiactivos

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Este artículo demuestra cómo preparar y administrar hierro isotópico no radiactivo unido a transferrina para estudios de transporte de hierro en el embarazo de ratón. También se describe el enfoque para cuantificar el hierro isotópico en compartimentos fetoplacentarios.

Abstract

El hierro es esencial para la salud materna y fetal durante el embarazo, con aproximadamente 1 g de hierro necesario en los seres humanos para mantener un embarazo saludable. La dotación de hierro fetal depende completamente de la transferencia de hierro a través de la placenta, y las perturbaciones de esta transferencia pueden conducir a resultados adversos del embarazo. En ratones, la medición de los flujos de hierro a través de la placenta tradicionalmente se basó en isótopos radiactivos de hierro, un enfoque altamente sensible pero oneroso. Los isótopos estables de hierro (57Fe y 58Fe) ofrecen una alternativa no radiactiva para su uso en estudios de embarazo humano.

En condiciones fisiológicas, el hierro unido a transferrina es la forma predominante de hierro absorbido por la placenta. Por lo tanto, 58Fe-transferrina se preparó e inyectó por vía intravenosa en madres embarazadas para evaluar directamente el transporte de hierro placentario y evitar la absorción intestinal materna de hierro como una variable de confusión. El hierro isotópico se cuantificó en la placenta y los tejidos embrionarios de ratón mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Estos métodos también se pueden emplear en otros sistemas modelo animales de fisiología o enfermedad para cuantificar la dinámica del hierro in vivo .

Introduction

El hierro es crítico para diversos procesos metabólicos, incluyendo el crecimiento y el desarrollo, la producción de energía y el transporte de oxígeno1. El mantenimiento de la homeostasis del hierro es un proceso dinámico y coordinado. El hierro se absorbe de los alimentos en el duodeno y se transporta por todo el cuerpo en la circulación unida a la proteína transportadora de hierro transferrina (Tf). Es utilizado por cada célula para procesos enzimáticos, incorporado a la hemoglobina en eritrocitos nacientes, y reciclado de eritrocitos envejecidos por macrófagos. El hierro se almacena en el hígado cuando está en exceso y se pierde del cuerpo a través de hemorragia o desprendimiento celular. La cantidad de hierro en circulación es el resultado del equilibrio entre el consumo y el suministro de hierro, este último estrechamente regulado por la hormona hepática hepcidina (HAMP), el regulador central de la homeostasis del hierro1. La hepcidina funciona para limitar la biodisponibilidad del hierro en la sangre al ocluir o inducir ubiquitinación y degradar el ferroportina exportadora de hierro (FPN)2. La reducción de la FPN funcional conduce a una disminución de la absorción de hierro en la dieta, el secuestro de hierro en el hígado y la disminución del reciclaje de hierro de los macrófagos1.

La hepcidina está regulada por el estado del hierro, la inflamación, el impulso eritropoyético y el embarazo (revisado en 3). Dado que la homeostasis del hierro es altamente dinámica, es importante comprender y medir la reserva total de hierro y la distribución y rotación del hierro. Los estudios en animales tradicionalmente se basaban en isótopos radiactivos de hierro, un enfoque altamente sensible pero oneroso para medir la dinámica del hierro. Sin embargo, en estudios más recientes, incluyendo el estudio presentado aquí4, se utilizan isótopos de hierro estables y no radiactivos (58Fe) para medir el transporte de hierro durante el embarazo 5,6,7,8,9. Los isótopos estables son herramientas valiosas para estudiar el metabolismo de los nutrientes (revisado en 10). El uso de isótopos estables de hierro en estudios en humanos demostró que i) la absorción de hierro aumenta hacia el final de la gestación5,6, ii) la transferencia de hierro en la dieta al feto depende del estado de hierro materno7, iii) el hierro hemo ingerido maternamente es más fácilmente incorporado por el feto que el hierro no hemo 8, y iv) la transferencia de hierro al feto se correlaciona negativamente con los niveles de hepcidina materna 8, 9. Estos experimentos midieron isótopos de hierro en sueros o su incorporación en glóbulos rojos; sin embargo, la medición del hierro incorporado en los glóbulos rojos por sí sola puede subestimar la verdadera absorción de hierro9. En el estudio actual, tanto el hierro hemo como el no hemo se miden en los tejidos.

Durante el embarazo, el hierro es necesario para apoyar la expansión del volumen de glóbulos rojos maternos y para la transferencia a través de la placenta para apoyar el crecimiento y desarrollo del feto11. La dotación de hierro fetal depende totalmente del transporte de hierro a través de la placenta. Durante el embarazo humano 12 y roedor 4,13, los niveles de hepcidina disminuyen drásticamente, aumentando la disponibilidad de hierro plasmático para la transferencia al feto.

Los fundamentos del transporte de hierro placentario se caracterizaron inicialmente en los años 1950-70 utilizando trazadores radiactivos (59Fe y 55Fe). Estos estudios determinaron que el transporte de hierro a través de la placenta es unidireccional 14,15 y que la transferrina diférrica es una fuente importante de hierro para la placenta y el feto 16,17. La comprensión actual del transporte de hierro placentario es más completa, aunque algunos transportadores de hierro clave y mecanismos reguladores siguen siendo desconocidos. Los modelos de ratón han sido esenciales para comprender la regulación y el transporte del hierro18 porque los transportadores y mecanismos clave son notablemente similares. Tanto la placenta humana como la del ratón son hemocoriales, es decir, la sangre materna está en contacto directo con el corion fetal19. Sin embargo, hay algunas diferencias estructurales notables.

El sincitiotrofoblasto es la capa celular placentaria que separa la circulación materna y fetal y transporta activamente hierro y otros nutrientes20. En los seres humanos, el sincitiotrofoblasto es una sola capa de células fusionadas. En contraste, la placenta del ratón consiste en dos capas21 de sincitiotrofoblasto, Syn-I y Syn-II. Sin embargo, las uniones de brecha en la interfaz de Syn-I y Syn-II permiten la difusión de nutrientes entre las capas22,23. Por lo tanto, estas capas funcionan como una sola capa sincitial similar al sincitiotrofoblasto humano. Las similitudes y diferencias adicionales entre la placenta humana y la de ratón son revisadas por Rossant y Cross21. El transporte placentario de hierro es desencadenado por la unión de hierro-Tf de la sangre materna al receptor de transferrina (TfR1) localizado en el lado apical del sincitiotrofoblasto24. Esa interacción induce la internalización hierro-Tf/TfR1 por vía endocitosis mediada por clatrina25. El hierro se libera de Tf en el endosomaácido 26, se reduce a hierro ferroso por una ferrireductasa indeterminada, y se exporta del endosoma al citoplasma por un transportador aún por determinar. También queda por describir cómo se acompaña el hierro dentro del sincitiotrofoblasto. El hierro es finalmente transportado al lado fetal por el exportador de hierro, FPN, localizado en la superficie basal o fetal del sincitiotrofoblasto (revisado en27).

Para comprender cómo la regulación fisiológica y patológica de TfR1, FPN y hepcidina afecta el transporte de hierro placentario, se utilizaron isótopos estables de hierro para cuantificar el transporte de hierro desde la circulación materna hasta la placenta y el embrión in vivo4. Este artículo presenta los métodos para preparar y administrar transferrina de hierro isotópica a ratones preñados, procesamiento de tejidos para ICP-MS y cálculo de concentraciones de hierro en tejidos. El uso de isótopos estables de hierro in vivo se puede adaptar para investigar la regulación y distribución del hierro en diferentes modelos animales para investigar la regulación fisiológica y patológica del hierro.

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Protocol

Todos los protocolos y procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California en Los Ángeles.

1. Preparación de 58Fe-Tf

NOTA: El protocolo utiliza 58Fe; sin embargo, se puede utilizar un protocolo idéntico para 57Fe. Cualquiera de los isótopos se puede usar y eliminar como un producto químico de hierro estándar sin precauciones adicionales.

  1. Disolver 58 Fe en 12 N HCl a 50 μL de HCl/mg de 58Fe.
    1. Agregue HCl al metal en el vial de vidrio suministrado por el proveedor y vuelva a colocar la tapa flojamente. Para disolver el hierro, caliente la solución de 58Fe/HCl a 60 °C durante 1 h. Si aún no se disuelve, deje la solución durante la noche a temperatura ambiente en la campana extractora para que se disuelva.
      NOTA: La solución disuelta de 58Fe/HCl es de color naranja amarillento.
      Fe 3 O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) +4H 2 O
  2. Oxide cualquier resto de Fe(II)Cl2 para generar la solución de Fe(III)Cl3 .
    1. Calentar la solución de 58Fe/HCl a 60 °C con la tapa fuera para facilitar la oxidación.
    2. Añadir 1 μL de H2O2al 35% por 50 μL de solución de 58Fe/HCl para facilitar aún más la oxidación.
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. Preparar la solución de cloruro férrico (58Fe(III)Cl3).
    1. Dejar la solución de cloruro férrico en la campana a 60 °C con la tapa quitada para evaporar la muestra.
      NOTA: La evaporación puede tardar entre uno y varios días.
    2. Reconstituir 58 Fe(III)Cl 3 a 100 mM con H 2 O ultrapuro y calcular la cantidad de H 2 O ultrapuro requerido en función del peso inicial del metal utilizado en el paso 1.1 (peso molecular de 58 Fe(III)Cl3 es 162.2).
  4. Preparar 58 Fe(III)-nitrilotriacetato (NTA) incubando 58Fe(III)Cl 3 con NTA en una relación molar de 1:5 en presencia de 20 mM de NaHCO3.
    1. Preparar 500 mM NTA en 1 N NaOH.
    2. Preparar 5x tampón de carga de transferrina (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Preparar 1 M NaHCO3 en H2O ultrapuro.
    4. A un tubo cónico de 15 ml, añadir 150 μL de solución de 100 mM de 58 Fe(III)Cl 3 (a partir de la etapa 1.3.2), 150 μL de NTA de 500 mM preparados en 1 N NaOH, 480 μL deH2Oultrapuro, 200 μL de tampón de carga de transferrina 5xy 20 μL de solución de NaHCO3 de 1 M.
    5. Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Cargue apo-Tf con 58 Fe(III)-NTA para formar 58Fe-Tf.
    NOTA: Este protocolo fue adaptado de McCarthy y Kosman28.
    1. Disolver 500 mg de apo-Tf en 4 ml de 1x tampón de carga de Tf.
    2. Al tubo cónico de 15 ml en el paso 1.4.4 que contiene 1 ml de la solución de 58Fe(III)-NTA, añadir 4 ml de solución de apo-Tf.
      NOTA: Esta es una relación molar de 3:1 de 58Fe-NTA con apo-Tf. Cada Tf contiene 2 sitios de unión de Fe; se agregó un exceso de 58Fe-NTA para garantizar que Tf estuviera completamente cargado.
    3. Para permitir una carga máxima de 58Fe-NTA en apo-Tf, compruebe que la solución esté a pH 7,5 y ajuste el pH, si es necesario, con NaHCO3 o HCl.
    4. Incubar durante 2,5 h a temperatura ambiente.
  6. Eliminar el exceso de 58Fe(III)-NTA sin consolidar y el NTA liberado.
    1. Transfiera la solución de 58Fe-Tf a una columna de corte de peso molecular (corte de 30 kDa) y centrifugar a 2.500 × g durante 15 min a temperatura ambiente.
    2. Lave la columna con 10 ml de 1x tampón de carga de transferrina y centrífugo a 2.500 × g durante 15 min a temperatura ambiente. Repetir el lavado y la centrifugación, realizar un lavado salino con 10 mL de solución salina, y centrifugar a 2.500 × g durante 15 min a temperatura ambiente.
  7. Calcular la concentración de 58Fe-Tf.
    NOTA: Debido a la adición de un exceso de 58Fe en el paso 1.5.2, supongamos que toda la transferrina es diférrica. Como se utilizaron 500 mg de apo-Tf, se produjeron ~500 mg de 58Fe-Tf en el paso 1.5.4.
    1. Medir el volumen recuperado de la centrifugación tras el lavado salino en el paso 1.6.2.
    2. Dividir 500 mg por el volumen recuperado para determinar la concentración (en mg/ml) de la solución de 58Fe-Tf.
  8. Esterilizar la solución de 58Fe-Tf utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm; conservar a 4 °C hasta que esté listo para usar.
    NOTA: Se utilizó una solución de 58Fe-Tf entre 1 y 4 semanas después de la preparación.

2. Configurar embarazos de ratón cronometrados

  1. Use ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad. Coloque a los animales en una dieta baja en hierro (4 ppm de hierro) o comida estándar (185 ppm de hierro) durante 2 semanas antes del apareamiento y mantenga a los animales en las dietas respectivas durante todo el embarazo.
  2. Opción 01: Confirmar el embarazo por aumento de peso en E7.5.
    1. Establezca múltiples jaulas de cría. Para cada jaula, combine 2 hembras con 1 macho durante la noche; al día siguiente, cuando los animales están separados, se considera embrionario el día (E)0.5. Pesar a las hembras en E7.5 para determinar si están embarazadas. Aparearse machos de nuevo con hembras que no aumentaron de peso.
      NOTA: En WT C57BL/6, un aumento de peso de 1 g en E7.5 es un buen indicador de embarazo. Este método garantiza que la implantación se produzca dentro de un plazo específico de 16 horas, lo que permite el tratamiento sincrónico de todos los animales que quedaron embarazadas durante el mismo período de apareamiento.
  3. Opción 02: Confirmar el embarazo mediante comprobaciones de enchufes.
    1. Combine 2 hembras con 1 macho y realice controles diarios del tapón para determinar si se ha producido una cópula.
      NOTA: Este método puede resultar en embarazos escalonados, y la presencia de un tapón no garantiza el embarazo.

3. Administrar 58Fe-Tf por vía intravenosa a ratones preñados E17.5

  1. Prepare 58Fe-Tf del paso 1.8 para inyección.
    1. Preparar 58solución de Fe-Tf a 35 mg/ml en solución salina; inyectar 100 μL por ratón.
    2. Llene una jeringa de insulina con 100 μL de la solución de 58Fe-Tf.
      NOTA: Cada dosis contiene 3,5 mg de 58 Fe-Tf humano (5 μg de 58Fe).
  2. Anestesiar a una ratona preñada con isoflurano.
    1. Use un regulador de isoflurano con una cámara.
    2. Utilice los siguientes ajustes: 5% de isoflurano, 2 L/ml deO2, 2 min.
    3. Confirme que el ratón está anestesiado buscando falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie.
    4. Aplique lubricante para los ojos en la superficie del ojo y coloque el ratón sobre una almohadilla térmica.
  3. Inyecte lenta y cuidadosamente la solución de 58Fe-Tf en el seno retroorbital.
  4. Permita que el ratón se recupere de la anestesia; No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
  5. Seis horas después de la inyección, eutanasia E17.5 hembras embarazadas por sobredosis de isoflurano.
    1. Realizar una punción cardíaca para desangrar al ratón como una forma de eutanasia secundaria.
    2. Sujete los pies hacia abajo con agujas para la estabilización.
  6. Recoger la placenta y los hígados embrionarios.
    1. Usando fórceps estériles y tijeras de disección, retire cuidadosamente el útero de la ratona preñada. Cortar una unidad placentaria fetal-placentaria, que comprende un solo feto y placenta en el saco amniótico rodeado por una porción del útero.
    2. Corte cuidadosamente a través del útero y el saco amniótico sin alterar el feto y la placenta.
    3. Despegue el saco amniótico y retire el feto y la placenta.
    4. Cortar el cordón umbilical.
    5. Seque el feto y la placenta en una limpieza de tareas para eliminar el exceso de líquido amniótico.
    6. Registre los pesos de toda la placenta.
    7. Corte cada placenta por la mitad con una cuchilla de afeitar, coloque cada mitad en un tubo de 2.0 ml y congele rápidamente en nitrógeno líquido.
      NOTA: Debido a que el 58 Fe no requiere precauciones especiales de manipulación y eliminación, la mitad de la placenta se puede utilizar para la medición de 58Fe y la otra mitad para cualquier otro análisis, incluida la cuantificación de la expresión del receptor de transferrina (TFR1) y ferroportina (FPN) mediante western blot y qPCR.
    8. Para recolectar hígados de embriones, sacrifique el embrión: use una hoja de afeitar para decapitar rápidamente el embrión.
      NOTA: En E17.5, todos los embriones en el útero deben ser sacrificados individualmente, incluso si no se utilizan en el estudio.
    9. Fijar el embrión para la estabilización, dejando el abdomen expuesto.
    10. Usando tijeras de disección, haga una pequeña incisión donde se unió el cordón umbilical, inserte un extremo de las tijeras de disección en la incisión y realice un corte plano mediano hacia el plano coronal aproximadamente 1/4 de pulgada. Luego, realice cortes planos transversales para exponer el hígado fetal.
    11. Use fórceps para extirpar el hígado fetal.
    12. Registre los pesos de los hígados de todo el embrión.
    13. Coloque los hígados de todo el embrión en tubos de 2 ml y congélelos en nitrógeno líquido.
      NOTA: Alternativamente, solo se puede usar una porción del hígado del embrión para la medición de 58Fe si se desean análisis adicionales. El uso de tubos de 2,0 ml permite una mejor homogeneización del tejido que los tubos de 1,5 ml.
  7. Conservar los tejidos indefinidamente a -80 °C.

4. Tejidos de proceso para el análisis cuantitativo de hierro por ICP-MS

  1. Procesar la placenta y los hígados fetales para la cuantificación de hierro no hemo.
    1. Descongele las mitades placentarias y todo el hígado fetal, y pese las mitades placentarias (ver paso 3.6.12 para registrar el peso del hígado fetal).
    2. Añadir 400 μL de solución de precipitación proteica (0,53 N HCl, 5,3% TCA).
    3. Homogeneizar el tejido utilizando un homogeneizador eléctrico.
    4. Incubar las muestras a 100 °C durante 1 h.
    5. Enfriar las muestras en agua a temperatura ambiente durante 2 min.
    6. Abra las tapas para liberar la presión y, a continuación, vuelva a cerrar los tubos.
    7. Centrifugar a 17.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente para granular restos de tejido.
    8. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo etiquetado.
    9. Enviar muestras para el análisis ICP-MS.
  2. Procesar la placenta y los hígados fetales para la cuantificación del hemo-hierro.
    NOTA: Después de la extracción del hierro no hemo en el paso 1, el hierro que queda en el pellet es predominantemente hemo.
    1. Anotar el peso de cada pellet a partir del paso 4.1.7.
    2. Digerir los pellets en 10 mL de concentrado 70% HNO3 suplementado con 1 mL de 30%H2O2
      NOTA: Consulte con el núcleo o centro ICP-MS para optimizar el volumen de HNO3 para estudios específicos; El volumen dependerá en parte del peso de la muestra.
    3. Calentar las muestras a 200 °C durante 15 min.
    4. Envíe las muestras para el análisis ICP-MS.
      NOTA: Si no se requiere distinguir entre fuentes de hierro hemo y no hemo y solo se mide el hierro total, todo el tejido se puede digerir en HNO3 como primer paso.

5. Análisis de datos

NOTA: Los datos de ICP-MS se han proporcionado como concentraciones de 56Fe y 58Fe en ng / ml o mg, ppb (Tabla 1). 56 La fe es el isótopo de hierro más abundante en la naturaleza, y su medición refleja la acumulación de hierro en la placenta / embrión durante todo el embarazo, mientras que la medición de 58fe refleja el hierro que se transfirió durante 6 h después de la inyección.

  1. Reste la abundancia natural de 58 Fe (0,28% del Fe total) de los valores de 58Fe medidos.
  2. Calcule el total de no hemo 58Fe.
    1. Calcular el hierro no hemo (ng) total del hígado embrionario multiplicando primero la concentración de hierro (ng/ml) calculada en el paso 5.1 por el volumen (ml) durante el procesamiento inicial en el paso 4.1.2 para estimar el total de 58Fe.
    2. Calcular la cantidad de hierro en toda la placenta tomando el peso total de la placenta medido en el paso 3.6.6 y dividiéndolo por el peso de la placenta procesada en el paso 4.1.1. Multiplique este valor por el hierro no hemo (ng) total calculado en el paso 5.2.1 para obtener el contenido total de Fe no hemo 58de la placenta.
  3. Calcule el hemo total 58Fe.
    1. Calcular el hemo total 58Fe multiplicando primero la concentración de hierro (ng/mg) calculada en el paso 5.1 por el peso del pellet (en mg) medido en el paso 4.2.1.
    2. A continuación, divida el peso total de la placenta medido en el paso 3.5.1 por el peso del pellet de placenta medido en el paso 4.2.1. Multiplique este valor por el hierro hemo (ng) total calculado en el paso 5.3.1 para obtener el contenido total de hemo 58Fe de la placenta.
  4. Suma los valores calculados de 58Fe no hemo y hemo para determinar el contenido total de hierro para cada tejido.

Figure 1
Figura 1: Resumen visual de los pasos del protocolo . (A) Preparación de 58Fe-transferrina. (B) Administración in vivo de 58Fe-transferrina. (C) Recolección y almacenamiento de tejidos. (D) Procesamiento de la placenta y el hígado embrionario para la cuantificación de especies metálicas por ICP-MS. Abreviaturas: Fe = hierro; NTA = ácido nitrilotriacético; Tf = transferrina; PPS = solución de precipitación de proteínas; Sup = sobrenadante; ATC = ácido tricloroacético; ICP-MS = espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Un estudio anterior que utilizó isótopos estables de hierro para medir el transporte de hierro demostró que la deficiencia de hierro materna resultó en la regulación negativa del exportador de hierro de la placenta, FPN4. La FPN es el único exportador de hierro de mamíferos conocido, y la ausencia de FPN durante el desarrollo da lugar a la muerte embrionaria antes de E9.529. Para determinar si la disminución observada en la expresión de FPN se tradujo funcionalmente en una disminución del transporte de hierro placentario, se inyectaron 58Fe-Tf por vía intravenosa en madres embarazadas, y el hierro en la placenta y el embrión se cuantificó en presencia de deficiencia de hierro materna.

Para comprender cómo el transporte de hierro placentario se ve afectado por el estado de hierro materno, se modeló la deficiencia de hierro en ratones4. Los ratones hembra C57BL / 6 se colocaron en una dieta baja en hierro (4 ppm de hierro) o chow estándar (185 ppm de hierro) durante 2 semanas antes y durante todo el embarazo. Este régimen dietético da como resultado un menor hierro no hemo en el hígado materno y hierro sérico y hemoglobina en E12.5, E15.5 y E18.5 en comparación con los animales con una dieta estándar4. En E18.5, los embriones de madres con deficiencia de hierro tenían menos hierro hepático y eran hipoferrémicos y anémicos que los embriones de madres repletas de hierro. Se utilizaron tres ratones preñados en cada uno de los grupos repletos de hierro y deficientes en hierro, y se utilizaron 2-3 placentas de cada ratón preñado para el análisis.

Para cuantificar el transporte placentario de hierro, seprepararon 58 Fe-transferrina e inyectadas por vía intravenosa en madres gestantes y 58Fe se midieron en la placenta y el hígado fetal mediante ICP-MS, como se describe en el protocolo y se ilustra en la Figura 1. Antes de enviar muestras de hierro no hemo para el análisis ICP-MS, los niveles totales de hierro no hemo se cuantificaron de forma independiente a través de un método de ferene descrito anteriormente30. Las concentraciones de hierro no hemo medidas por los métodos ferene versus ICP-MS se correlacionaron de manera altamente significativa en todos los tejidos medidos (R2 = 0.94, P < 0.0001, n = 36). Los resultados representativos de la cuantificación ICP-MS de isótopos de hierro se presentan en la Tabla 1. Se calculó un total de 58Fe como se describe en el paso 5 del protocolo. Los datos se presentan como hierro total en lugar de hierro hemo o no hemo (Figura 2A-D) porque el objetivo era cuantificar el hierro total transferido a la placenta y el hierro total transferido al embrión desde la placenta.

En promedio, el 21% de la dosis administrada de 58Fe se recuperó en la placenta, el hígado embrionario y el suero embrionario combinados. La medición de 56Fe proporciona información sobre la transferencia de hierro a largo plazo en la placenta y el hígado embrionario durante el embarazo. El total de 56Fe placentario fue similar en los grupos con deficiencia de hierro y repleto (Figura 2A), mientras que el hierro total del hígado embrionario disminuyó en el grupo con deficiencia de hierro (Figura 2B). Esto se esperaba en base a la disminución observada en la FPN placentaria en el grupo4 con deficiencia de hierro, lo que resultaría en retención de hierro en la placenta a expensas del embrión. Total 58Fe proporciona una instantánea del transporte de hierro a corto plazo. En este estudio, similar al 56Fe, el 58Fe placentario fue similar tanto en el grupo con deficiencia de hierro como en el grupo repleto (Figura 2C), y el embrión hepático 58Fe disminuyó en el grupo con deficiencia de hierro (Figura 2D). Estos datos indican que durante el embarazo con deficiencia de hierro, la regulación a la baja de la FPN placentaria da como resultado una disminución del transporte de hierro al embrión, lo que lleva a diferencias acumulativas en el contenido de hierro en la placenta y el embrión.

Es importante considerar la dosis de hierro administrada, ya que podría conducir a cambios no deseados en la concentración de hepcidina o en la expresión del transportador de hierro31. Se demostró que la deficiencia materna de hierro causó una disminución de la FPN placentaria4. Para determinar si la inyección de Fe-Tf afectó esta regulación, se midió la FPN placentaria 6 h después de la inyección por Western blot. La dosis de hierro de 5 μg fue insuficiente para alterar la regulación placentaria de la NPA por deficiencia de hierro materna (Figura 3).

En resumen, este método se utilizó para demostrar que la regulación fisiológica de la FPN placentaria durante la deficiencia materna de hierro da como resultado una disminución del transporte de hierro a través de la placenta in vivo. Los isótopos estables de hierro proporcionan una alternativa sensible y cuantificable a la radiactividad para la medición del transporte y la distribución del hierro, lo que permite el uso simultáneo de tejidos para análisis adicionales.

Figure 2
Figura 2: Transporte de 56Fe y 58Fe a través de la placenta en embarazos con deficiencia de hierro o repletos de hierro. Total 56Fe en la placenta (A) y el hígado embrionario (B). Total 58Fe en la placenta (C) y el hígado fetal (D). El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t de Student de 2 colas para valores distribuidos normalmente y, de lo contrario, mediante la prueba de suma de rangos U de Mann-Whitney (denotada por un asterisco después del valor P). El número de animales se indica en los ejes x de los gráficos de caja y bigotes. La parte superior del gráfico de caja indica el percentil 75, y la parte inferior indicael percentil 25; Los bigotes sobre el cuadro indican el percentil 90, y los que están debajo del cuadro indicanel percentil 10. La línea continua dentro del cuadro indica la mediana y la línea discontinua la media. El análisis estadístico se realizó utilizando gráficos científicos y software de análisis de datos. Esta cifra se ha modificado de4. Abreviatura: Fe = hierro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Niveles placentarios de TFR1 y FPN. (A) La expresión de TFR1 y FPN se evaluó mediante Western blot en placentas deficientes en hierro y repletas 6 h después del tratamiento de madres con 58Fe-Tf. (B) La expresión proteica se cuantificó y se presentó como expresión proteica en relación con la β-actina. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t de Student de 2 colas para valores distribuidos normalmente. El número de animales se indica en los ejes x de los gráficos de caja y bigotes. La parte superior del gráfico de caja indica el percentil 75, y la parte inferior indicael percentil 25; Los bigotes sobre el cuadro indican el percentil 90, y los que están debajo del cuadro indicanel percentil 10. La línea continua dentro del cuadro indica la mediana y la línea discontinua la media. El análisis estadístico se realizó utilizando gráficos científicos y software de análisis de datos. Esta cifra se ha modificado de4. Abreviaturas: TFR1 = receptor de transferrina; FPN = ferroportina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra 56 Fe 58 Fe Total Fe
Concentración [ng/ml o mg, ppb] Concentración [ng/ml o mg, ppb] Suma de isótopos [ng/mL o mg]
Promedio* stdev Promedio* stdev
Hierro no hemo Placenta deficiencia de hierro 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
Repleto de hierro 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Hemo Placenta deficiencia de hierro 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
Repleto de hierro 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Hierro no hemo Hígado embrionario deficiencia de hierro 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
Repleto de hierro 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Hemo Hígado embrionario deficiencia de hierro 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
Repleto de hierro 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Tabla 1: Resultados representativos de la cuantificación ICP-MS de 56 Fe y 58Fe en hígados de placenta y embriones. Abreviaturas: ppb = partes por billón; STDEV = desviación estándar; ICP-MS = espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente.

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Discussion

El hierro es importante para muchos procesos biológicos, y su movimiento y distribución dentro del cuerpo son altamente dinámicos y regulados. Los isótopos estables de hierro proporcionan una alternativa consistente y conveniente a los isótopos radiactivos para la evaluación de la dinámica de la homeostasis del hierro. Un paso crítico en el protocolo es realizar un seguimiento de todos los pesos y volúmenes de los tejidos. El hierro es un elemento y, por lo tanto, no se puede sintetizar ni descomponer. Por lo tanto, si todos los pesos y volúmenes se registran cuidadosamente, todo el hierro dentro del sistema se puede contabilizar mediante cálculo. Como se ha descrito, este método se puede utilizar para distinguir entre fuentes de hierro hemo y no hemo. Sin embargo, si esta distinción entre las formas de hierro no es necesaria y solo se mide el hierro total, el protocolo puede simplificarse tratando el tejido solo con HNO3 concentrado como se describe en el paso 4.2 del protocolo. Es importante tener en cuenta que si los tejidos no se perfunden antes del análisis, especialmente los tejidos altamente vasculares como la placenta, la presencia de sangre puede resultar en la sobreestimación del contenido de hierro hemo tisular.

El hierro ligado a transferrina fue seleccionado para el estudio, ya que es la principal fuente de hierro absorbido por la placenta16,17. La eliminación global de TFR1 en ratones resultó en letalidad embrionaria antes de E12.5, lo que sugiere que el hierro unido a transferrina es crítico para el desarrollo. Es posible que otras especies de hierro, como la ferritina y el hierro unido a no transferrina (NTBI), también contribuyan a la dotación de hierro fetal en menor medida. Sin embargo, no se evaluó la contribución de estas especies alternativas de hierro. En el futuro, los isótopos estables podrían usarse para determinar la contribución de diferentes fuentes de hierro al desarrollo y la dotación de hierro del embrión.

El objetivo del estudio fue determinar los efectos de los cambios en el estado del hierro materno en el transporte de hierro placentario. Sin embargo, la disminución de la hepcidina durante la deficiencia de hierro da como resultado niveles elevados de FPN de enterocitos y un mayor transporte de hierro a la circulación1. Por lo tanto, en las presas deficientes en hierro, la absorción de hierro de la dieta habría aumentado inherentemente y confundido la interpretación de los resultados si 58Fe se administrara por vía oral. Por lo tanto, se seleccionó la administración intravenosa de 58Fe-Tf ya que evita la regulación del hierro a nivel de absorción intestinal. Se seleccionó una dosis de 5 μg de 58Fe/ratón basada en las concentraciones séricas de hierro de madres preñadas E18.5 repletas de hierro. En madres preñadas C57BL/6 E18.5 de tipo salvaje, las concentraciones séricas de hierro oscilan entre 10 y 50 μM4. Se espera que una ratona E18.5 embarazada tenga aproximadamente 2 ml de volumen sanguíneo total32. Por lo tanto, la cantidad total de hierro en la circulación de las madres embarazadas repletas de hierro varía de 1.1 a 5.6 μg. Por lo tanto, 5 μg de 58Fe/ratón es equivalente a las concentraciones fisiológicas observadas en animales repletos de hierro.

Una limitación de la detección ICP-MS de 58 Fe es la interferencia isobárica de 58Ni. Las concentraciones endógenas de Ni en la placenta del ratón son 0,04 ± 0,02 μg/g de peso húmedo33. Una placenta de ratón E18.5 promedio pesa 0.080 g; por lo tanto, la cantidad total de Ni es de aproximadamente 3,2 ng. La abundancia natural de 58Ni es del 68%; por lo tanto, la cantidad de 58 Ni en la placenta del ratón es ~ 2.2 ng, que es aproximadamente 10 veces menor que los niveles de 58Fe detectados. En el embrión, las concentraciones de Ni son aún más bajas a 0,01 ± 0,01 μg/g de peso húmedo33. El embrión de ratón E18.5 promedio pesa 1 g; por lo tanto, la cantidad total de Ni en un embrión de ratón normal es de aproximadamente 10 ng. Suponiendo que todo el embrión Ni se encuentra en el hígado embrionario, estos niveles siguen siendo 10 veces más bajos que las concentraciones de 58Fe y casi 1.000 veces más bajos que el contenido total de hierro del hígado del embrión. Dada la menor abundancia de Ni en estos tejidos de ratón, la interferencia de 58Ni no se tuvo en cuenta en este estudio.

Una consideración adicional es el límite de detección del ensayo. El límite de detección en este estudio fue de 250 pg/mL 58Fe. Sin embargo, este límite puede modificarse para detectar concentraciones aún más bajas de 58Fe si la dilución de los tejidos se reduce en la etapa de procesamiento del tejido (paso del protocolo 4.1.2 y Figura 1D) o mediante modificaciones en la instalación central del ICP-MS. Cuando se midió 58 Fe en todo el embrión, sus niveles no se detectaron ya que la concentración de 58Fe estaba por debajo del límite de detección. Sin embargo, se detectó 58Fe en el hígado embrionario, que es el principal órgano de almacenamiento de hierro. Es posible que la administración de una dosis mayor de 58 Fe hubiera permitido la detección de 58Fe incluso en todo el embrión. Sin embargo, se utilizó una cantidad relativamente pequeña de 58Fe para evitar la carga de hierro de la placenta, lo que podría desencadenar mecanismos de retroalimentación y alterar la expresión de los transportadores de hierro. En este modelo, que utilizó ratones C57BL / 6 de tipo salvaje, el hierro hepático embrionario se midió como un reflejo del transporte total de hierro placentario, ya que la concentración de hierro en el hígado del embrión es proporcional a la concentración de hierro en todo el embrión4. Sin embargo, en modelos de ratón donde la distribución del hierro está alterada34, el hierro del hígado del embrión por sí solo puede no representar con precisión el transporte total de hierro placentario. En tales casos, puede ser necesario medir el hierro incorporado en todo el embrión o en el compartimiento de eritrocitos. Además, las variaciones en los puntos de tiempo experimentales también requerirán una mayor optimización y medición del hierro en varios compartimentos fetales. Este enfoque de rastreo de isótopos estables se utilizó para cuantificar el transporte de hierro durante el embarazo del ratón. La metodología es fácilmente adaptable para estudiar el transporte de hierro en ratones no preñados y otros modelos animales.

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Disclosures

EN es cofundador científico de Intrinsic LifeSciences y Silarus Pharma y consultor de Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics y Disc Medicine. VS no declara conflictos.

Acknowledgments

Los autores reconocen el uso de la instalación ICP-MS dentro del Centro de Implicaciones Ambientales de la Nanotecnología de la UC en CNSI en UCLA por su asistencia con la optimización del protocolo para mediciones de 58Fe. El estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) de los NIH (K01DK127004, a VS) y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD) de los NIH (R01HD096863, a EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

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Biología Número 183
Cuantificación del transporte de hierro a través de la placenta del ratón <em>in vivo</em> utilizando isótopos de hierro no radiactivos
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Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

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