Summary
Questo articolo dimostra come preparare e somministrare ferro isotopico non radioattivo legato alla transferrina per studi sul trasporto del ferro nella gravidanza del topo. Viene anche descritto l'approccio per quantificare il ferro isotopico nei compartimenti fetoplacentari.
Abstract
Il ferro è essenziale per la salute materna e fetale durante la gravidanza, con circa 1 g di ferro necessario negli esseri umani per sostenere una gravidanza sana. La dotazione di ferro fetale dipende interamente dal trasferimento di ferro attraverso la placenta e le perturbazioni di questo trasferimento possono portare a esiti avversi della gravidanza. Nei topi, la misurazione dei flussi di ferro attraverso la placenta si basava tradizionalmente su isotopi di ferro radioattivi, un approccio altamente sensibile ma oneroso. Gli isotopi stabili del ferro (57Fe e 58Fe) offrono un'alternativa non radioattiva per l'uso negli studi sulla gravidanza umana.
In condizioni fisiologiche, il ferro legato alla transferrina è la forma predominante di ferro assorbito dalla placenta. Pertanto, 58Fe-transferrina sono state preparate e iniettate per via endovenosa in madri gravide per valutare direttamente il trasporto di ferro placentare e bypassare l'assorbimento intestinale materno del ferro come variabile confondente. Il ferro isotopico è stato quantificato nella placenta e nei tessuti embrionali di topo mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS). Questi metodi possono anche essere impiegati in altri sistemi di fisiologia o malattia modello animale per quantificare la dinamica del ferro in vivo .
Introduction
Il ferro è fondamentale per vari processi metabolici, tra cui la crescita e lo sviluppo, la produzione di energia e il trasporto di ossigeno1. Il mantenimento dell'omeostasi del ferro è un processo dinamico e coordinato. Il ferro viene assorbito dal cibo nel duodeno e trasportato in tutto il corpo nella circolazione legato alla proteina transferrina di trasporto del ferro (Tf). È utilizzato da ogni cellula per i processi enzimatici, incorporato nell'emoglobina negli eritrociti nascenti e riciclato dagli eritrociti invecchiati dai macrofagi. Il ferro viene immagazzinato nel fegato quando in eccesso e perso dal corpo attraverso emorragia o desquamazione cellulare. La quantità di ferro in circolazione è il risultato dell'equilibrio tra il consumo e l'apporto di ferro, quest'ultimo strettamente regolato dall'ormone epatico epcidina (HAMP), il regolatore centrale dell'omeostasi del ferro1. L'epcidina funziona per limitare la biodisponibilità del ferro nel sangue occludendo o inducendo ubiquitinazione e degradando l'esportatore di ferro ferroportina (FPN)2. La riduzione dell'FPN funzionale porta a una diminuzione dell'assorbimento del ferro nella dieta, al sequestro del ferro nel fegato e alla diminuzione del riciclaggio del ferro dai macrofagi1.
L'epcidina è regolata dallo stato del ferro, dall'infiammazione, dalla spinta eritropoietica e dalla gravidanza (rivisto in 3). Dato che l'omeostasi del ferro è altamente dinamica, è importante comprendere e misurare il pool totale di ferro e la distribuzione e il turnover del ferro. Gli studi sugli animali si basavano tradizionalmente su isotopi di ferro radioattivi, un approccio altamente sensibile ma oneroso per misurare la dinamica del ferro. Tuttavia, in studi più recenti, incluso lo studio presentato qui4, gli isotopi di ferro stabili non radioattivi (58Fe) sono utilizzati per misurare il trasporto di ferro durante la gravidanza 5,6,7,8,9. Gli isotopi stabili sono strumenti preziosi per studiare il metabolismo dei nutrienti (rivisto in 10). L'uso di isotopi di ferro stabili negli studi sull'uomo ha dimostrato che i) l'assorbimento del ferro aumenta verso la fine della gestazione5,6, ii) il trasferimento di ferro alimentare al feto dipende dallo stato di ferro materno7, iii) il ferro eme ingerito per via materna è più facilmente incorporato dal feto rispetto al ferro nonheme 8 e iv) il trasferimento di ferro al feto è negativamente correlato con i livelli di epcidina materna 8, 9. Questi esperimenti hanno misurato gli isotopi di ferro nei sieri o la loro incorporazione nei globuli rossi; tuttavia, la misurazione del ferro incorporato nei globuli rossi da sola può sottostimare il vero assorbimento del ferro9. Nel presente studio, sia l'eme che il ferro nonheme sono misurati nei tessuti.
Durante la gravidanza, il ferro è necessario per sostenere l'espansione del volume dei globuli rossi materni e per il trasferimento attraverso la placenta per sostenere la crescita e lo sviluppo del feto11. La dotazione di ferro fetale dipende interamente dal trasporto di ferro attraverso la placenta. Durante la gravidanza umana 12 e roditore 4,13, i livelli di epcidina diminuiscono drasticamente, aumentando la disponibilità di ferro plasmatico per il trasferimento al feto.
I fondamenti del trasporto placentare del ferro sono stati inizialmente caratterizzati negli anni 1950-70 utilizzando traccianti radioattivi (59Fe e 55Fe). Questi studi hanno determinato che il trasporto di ferro attraverso la placenta è unidirezionale 14,15 e che la transferrina ferrica è una delle principali fonti di ferro per la placenta e il feto 16,17. L'attuale comprensione del trasporto placentare del ferro è più completa, anche se alcuni trasportatori chiave del ferro e meccanismi di regolazione rimangono sconosciuti. I modelli murini sono stati essenziali per comprendere la regolazione e il trasporto del ferro18 perché i trasportatori e i meccanismi chiave sono notevolmente simili. Sia le placenta umane che quelle di topo sono emocoriali, cioè il sangue materno è in contatto diretto con il corion fetale19. Tuttavia, ci sono alcune notevoli differenze strutturali.
Il sinciziotrofoblasto è lo strato cellulare placentare che separa la circolazione materna e fetale e trasporta attivamente ferro e altri nutrienti20. Nell'uomo, il sinciziotrofoblasto è un singolo strato di cellule fuse. Al contrario, la placenta del topo è costituita da due strati di sincitiotrofoblasto21, Syn-I e Syn-II. Tuttavia, le giunzioni gap all'interfaccia di Syn-I e Syn-II consentono la diffusione di nutrienti tra gli strati22,23. Pertanto, questi strati funzionano come un singolo strato sinciziale simile al sinciziotrofoblasto umano. Ulteriori somiglianze e differenze tra placenta umana e di topo sono esaminate da Rossant e Cross21. Il trasporto placentare del ferro è innescato dal legame di ferro-Tf dal sangue materno al recettore della transferrina (TfR1) localizzato sul lato apicale del sinciziotrofoblasto24. Questa interazione induce l'internalizzazione del ferro-Tf/TfR1 tramite endocitosi mediata da clatrina25. Il ferro viene quindi rilasciato dal Tf nell'endosoma acido26, ridotto a ferro ferroso da una ferrieductasi indeterminata ed esportato dall'endosoma al citoplasma da un trasportatore ancora da determinare. Resta da descrivere anche come il ferro viene accompagnato all'interno del sinciziotrofoblasto. Il ferro viene infine trasportato sul lato fetale dall'esportatore di ferro, FPN, localizzato sulla superficie basale o fetale del sinciziotrofoblasto (rivisto in27).
Per comprendere come la regolazione fisiologica e patologica di TfR1, FPN ed epcidina influenzi il trasporto placentare del ferro, sono stati utilizzati isotopi di ferro stabili per quantificare il trasporto di ferro dalla circolazione materna alla placenta e all'embrione in vivo4. Questo documento presenta i metodi per la preparazione e la somministrazione isotopica di ferro-transferrina a topi gravidi, l'elaborazione dei tessuti per ICP-MS e il calcolo delle concentrazioni di ferro nei tessuti. L'uso di isotopi stabili del ferro in vivo può essere adattato per studiare la regolazione e la distribuzione del ferro in diversi modelli animali per studiare la regolazione fisiologica e patologica del ferro.
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Protocol
Tutti i protocolli sugli animali e le procedure sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California di Los Angeles.
1. Preparazione di 58Fe-Tf
NOTA: il protocollo utilizza 58Fe; tuttavia, un protocollo identico può essere utilizzato per 57Fe. Entrambi gli isotopi possono essere utilizzati e smaltiti come sostanza chimica standard del ferro senza ulteriori precauzioni.
- Sciogliere 58 Fe in 12 N HCl a 50 μL di HCl/mg di 58Fe.
- Aggiungere HCl al metallo nella fiala di vetro fornita dal fornitore e sostituire il tappo liberamente. Per sciogliere il ferro, riscaldare la soluzione di 58Fe/HCl a 60 °C per 1 ora. Se ancora non è disciolto, lasciare la soluzione per una notte a temperatura ambiente nella cappa aspirante per sciogliersi.
NOTA: La soluzione disciolta di 58Fe/HCl è di colore giallo-arancio.
Fe 3 O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2 O
- Aggiungere HCl al metallo nella fiala di vetro fornita dal fornitore e sostituire il tappo liberamente. Per sciogliere il ferro, riscaldare la soluzione di 58Fe/HCl a 60 °C per 1 ora. Se ancora non è disciolto, lasciare la soluzione per una notte a temperatura ambiente nella cappa aspirante per sciogliersi.
- Ossidare qualsiasi residuo di Fe(II)Cl2 per generare la soluzione di Fe(III)Cl3 .
- Riscaldare la soluzione di 58Fe/HCl a 60 °C con il tappo spento per facilitare l'ossidazione.
- Aggiungere 1 μL di H 2 O2al 35% per 50 μL di soluzione di 58Fe/HCl per facilitare ulteriormente l'ossidazione.
Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
- Preparare la soluzione di cloruro ferrico (58Fe(III)Cl3).
- Lasciare la soluzione di cloruro ferrico nella cappa a 60 °C con il tappo spento per far evaporare il campione.
NOTA: l'evaporazione può richiedere da uno a diversi giorni. - Ricostituire da58 Fe(III)Cl 3 a 100 mM con H 2 O ultrapuro e calcolare la quantità di H 2 O ultrapuro necessaria in base al peso iniziale del metallo utilizzato nella fase 1.1 (il peso molecolare di 58Fe(III)Cl 3 è 162,2).
- Lasciare la soluzione di cloruro ferrico nella cappa a 60 °C con il tappo spento per far evaporare il campione.
- Preparare 58 Fe(III)-nitrilotriacetato (NTA) incubando 58Fe(III)Cl 3 con NTA in rapporto molare 1:5 in presenza di 20 mM NaHCO3.
- Preparare 500 mM NTA in 1 N NaOH.
- Preparare 5 tampone di carico transferrina (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
- Preparare 1 M NaHCO3 in H2O ultrapuro.
- In un tubo conico da 15 mL, aggiungere 150 μL di soluzione 100 mM 58 Fe(III)Cl 3 (dal punto 1.3.2), 150 μL di 500 mM NTA preparati in 1 N NaOH, 480 μL di H2O ultrapuro, 200 μL di tampone di carico 5xtransferrina e 20 μL di soluzione 1 M NaHCO3.
- Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Caricare apo-Tf con 58 Fe(III)-NTA per formare 58Fe-Tf.
NOTA: Questo protocollo è stato adattato da McCarthy e Kosman28.- Sciogliere 500 mg di apo-Tf in 4 mL di tampone caricante 1x Tf.
- Al tubo conico da 15 mL del punto 1.4.4 contenente 1 mL della soluzione di 58Fe(III)-NTA, aggiungere 4 mL di soluzione apo-Tf.
NOTA: Questo è un rapporto molare 3: 1 di 58Fe-NTA con apo-Tf. Ogni Tf contiene 2 siti di legame Fe; l'eccesso di 58Fe-NTA è stato aggiunto per garantire che Tf fosse completamente carico. - Per consentire il carico massimo di 58Fe-NTA su apo-Tf, controllare che la soluzione sia a pH 7,5 e regolare il pH, se necessario, con NaHCO3 o HCl.
- Incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere l'eccesso non legato 58Fe(III)-NTA e rilasciato NTA.
- Trasferire la soluzione di 58 Fe-Tf in una colonna di taglio del peso molecolare (cutoff 30 kDa) e centrifugare a 2.500× g per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare la colonna con 10 ml di 1x tampone di carico transferrina e centrifugare a 2.500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio e la centrifugazione, eseguire un lavaggio salino con 10 ml di soluzione salina e centrifugare a 2.500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Calcola la concentrazione di 58Fe-Tf.
NOTA: A causa dell'aggiunta di un eccesso di 58Fe al punto 1.5.2, si supponga che tutta la transferrina sia differenziante. Poiché sono stati utilizzati 500 mg di apo-Tf, ~500 mg 58Fe-Tf sono stati prodotti nella fase 1.5.4.- Misurare il volume recuperato dalla centrifugazione dopo il lavaggio salino nella fase 1.6.2.
- Dividere 500 mg per il volume recuperato per determinare la concentrazione (in mg/ml) della soluzione di 58Fe-Tf.
- Sterilizzare la soluzione 58Fe-Tf utilizzando un filtro a siringa da 0,22 μm; conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
NOTA: la soluzione 58Fe-Tf è stata utilizzata tra 1 e 4 settimane dopo la preparazione.
2. Impostare gravidanze a tempo con il topo
- Usa topi femmina di 6-8 settimane. Mettere gli animali su una dieta a basso contenuto di ferro (4 ppm di ferro) o chow standard (185 ppm di ferro) per 2 settimane prima dell'accoppiamento e mantenere gli animali sulle rispettive diete durante la gravidanza.
- Opzione 01: confermare la gravidanza con l'aumento di peso a E7.5.
- Impostare più gabbie di allevamento. Per ogni gabbia, combinare 2 femmine con 1 maschio durante la notte; il giorno successivo, quando gli animali sono separati, è considerato giorno embrionale (E)0,5. Pesare le femmine a E7.5 per determinare se incinta. Accoppia di nuovo i maschi con le femmine che non hanno guadagnato peso.
NOTA: In WT C57BL / 6, un aumento di peso di 1 g a E7.5 è un buon indicatore di gravidanza. Questo metodo garantisce che l'impianto avvenga entro un periodo di tempo specifico di 16 ore, consentendo il trattamento sincrono di tutti gli animali che sono rimasti incinta durante lo stesso periodo di accoppiamento.
- Impostare più gabbie di allevamento. Per ogni gabbia, combinare 2 femmine con 1 maschio durante la notte; il giorno successivo, quando gli animali sono separati, è considerato giorno embrionale (E)0,5. Pesare le femmine a E7.5 per determinare se incinta. Accoppia di nuovo i maschi con le femmine che non hanno guadagnato peso.
- Opzione 02: confermare la gravidanza tramite controlli della spina.
- Combina 2 femmine con 1 maschio ed esegui controlli giornalieri della spina per determinare se si è verificata la copulazione.
NOTA: Questo metodo può comportare gravidanze scaglionate e la presenza di una spina non garantisce la gravidanza.
- Combina 2 femmine con 1 maschio ed esegui controlli giornalieri della spina per determinare se si è verificata la copulazione.
3. Somministrare 58Fe-Tf per via endovenosa a topi gravidi E17.5
- Preparare 58Fe-Tf dal passaggio 1.8 per l'iniezione.
- Preparare la soluzione di 58Fe-Tf a 35 mg/ml in soluzione salina; iniettare 100 μL per topo.
- Riempire una siringa da insulina con 100 μL della soluzione di 58Fe-Tf.
NOTA: Ogni dose contiene 3,5 mg di 58 Fe-Tf umano (5 μg di 58Fe).
- Anestetizzare un topo gravido usando isoflurano.
- Utilizzare un regolatore di isoflurano con una camera.
- Utilizzare le seguenti impostazioni: 5% isoflurano, 2 L/mL di O 2,2 min.
- Conferma che il topo è anestetizzato cercando la mancanza di risposta a un pizzico del piede.
- Applicare il lubrificante per gli occhi sulla superficie dell'occhio e posizionare il mouse su una piastra riscaldante.
- Iniettare lentamente e con attenzione la soluzione di 58Fe-Tf nel seno retroorbitale.
- Consentire al mouse di riprendersi dall'anestesia; Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumbentenza sternale.
- Sei ore dopo l'iniezione, eutanasia E17.5 donne gravide per sovradosaggio di isoflurano.
- Eseguire una puntura cardiaca per dissanguare il topo come forma di eutanasia secondaria.
- Fissare i piedi verso il basso con aghi per la stabilizzazione.
- Raccogli i fegati di placenta e embrione.
- Usando una pinza sterile e forbici da dissezione, rimuovere con cura l'utero dal topo gravido. Tagliare un'unità fetale-placentare placentare, che comprende un singolo feto e placenta nel sacco amniotico circondato da una porzione dell'utero.
- Tagliare con cura attraverso l'utero e il sacco amniotico senza disturbare il feto e la placenta.
- Staccare il sacco amniotico e rimuovere il feto e la placenta.
- Taglia il cordone ombelicale.
- Asciugare il feto e la placenta su una pulizia per rimuovere il liquido amniotico in eccesso.
- Registra i pesi di tutte le placentae.
- Tagliare ogni placenta a metà con una lama di rasoio, posizionare ogni metà in un tubo da 2,0 ml e congelare a scatto in azoto liquido.
NOTA: Poiché 58Fe non richiede particolari precauzioni di manipolazione e smaltimento, metà delle placenta può essere utilizzata per la misurazione di 58Fe e l'altra metà per qualsiasi altra analisi, inclusa la quantificazione dell'espressione del recettore della transferrina (TFR1) e della ferroportina (FPN) mediante western blotting e qPCR. - Per raccogliere fegati embrionali, sacrifica l'embrione: usa una lametta per decapitare rapidamente l'embrione.
NOTA: A E17.5, tutti gli embrioni nell'utero devono essere eutanizzati individualmente, anche se non vengono utilizzati nello studio. - Appuntare l'embrione per la stabilizzazione, lasciando l'addome esposto.
- Usando le forbici da dissezione, fare una piccola incisione dove è stato attaccato il cordone ombelicale, inserire un'estremità delle forbici di dissezione nell'incisione ed eseguire un piano mediano tagliato verso il piano coronale di circa 1/4 di pollice. Quindi, eseguire tagli piani trasversali per esporre il fegato fetale.
- Utilizzare una pinza per rimuovere il fegato fetale.
- Registra i pesi dell'intero fegato embrionale.
- Mettere i fegati dell'embrione intero in provette da 2 ml e congelarli in azoto liquido.
NOTA: In alternativa, solo una parte del fegato embrionale può essere utilizzata per la misurazione del 58Fe se si desiderano ulteriori analisi. L'utilizzo di provette da 2,0 ml consente una migliore omogeneizzazione dei tessuti rispetto alle provette da 1,5 ml.
- Conservare i tessuti a tempo indeterminato a -80 °C.
4. Tessuti di processo per l'analisi quantitativa del ferro mediante ICP-MS
- Elaborare le placenta e i fegati fetali per la quantificazione del ferro noneme.
- Scongelare le metà placentari e i fegati fetali interi e pesare le metà placentari (vedere il punto 3.6.12 per la registrazione del peso del fegato fetale).
- Aggiungere 400 μL di soluzione di precipitazione proteica (0,53 N HCl, 5,3% TCA).
- Omogeneizzare il tessuto usando un omogeneizzatore elettrico.
- Incubare i campioni a 100 °C per 1 ora.
- Raffreddare i campioni in acqua a temperatura ambiente per 2 minuti.
- Aprire i tappi per rilasciare la pressione, quindi chiudere nuovamente i tubi.
- Centrifugare a 17.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare i detriti di tessuto.
- Trasferire con cautela il surnatante in un nuovo tubo etichettato.
- Inviare campioni per l'analisi ICP-MS.
- Elaborare le placenta e i fegati fetali per la quantificazione del ferro eme.
NOTA: Dopo l'estrazione del ferro nonheme nella fase 1, il ferro rimanente nel pellet è prevalentemente eme.- Registrare il peso di ciascun pellet dal punto 4.1.7.
- Digerire i pellet in 10 ml di concentrato 70% HNO3 integrato con 1 mL di 30% H 2 O2
NOTA: Consultare il nucleo o il centro ICP-MS per ottimizzare il volume di HNO3 per studi specifici; Il volume dipenderà in parte dal peso del campione. - Riscaldare i campioni a 200 °C per 15 minuti.
- Inviare i campioni per l'analisi ICP-MS.
NOTA: Se non è richiesta la distinzione tra fonti di ferro eme e nonheme e viene misurato solo il ferro totale, l'intero tessuto può essere digerito in HNO3 come primo passo.
5. Analisi dei dati
NOTA: I dati di ICP-MS sono stati forniti come concentrazioni di 56Fe e 58Fe in ng/mL o mg, ppb (Tabella 1). 56 Fe è l'isotopo di ferro più abbondante in natura e la sua misurazione riflette l'accumulo di ferro nella placenta / embrione durante l'intera gravidanza, mentre la misurazione di 58Fe riflette il ferro che è stato trasferito durante 6 ore dopo l'iniezione.
- Sottrarre l'abbondanza naturale di 58 Fe (0,28% del Fe) totale dai valori misurati di 58Fe.
- Calcola il totale nonheme 58Fe.
- Calcolare il ferro noneme totale del fegato embrionale (ng) moltiplicando prima la concentrazione di ferro (ng/mL) calcolata al punto 5.1 per il volume (mL) durante l'elaborazione iniziale al punto 4.1.2 per stimare il totale di 58Fe.
- Calcolare la quantità di ferro nell'intera placenta prendendo il peso totale della placenta misurato nella fase 3.6.6 e dividendolo per il peso della placenta trattata nella fase 4.1.1. Moltiplicare questo valore per il ferro noneme totale (ng) calcolato al punto 5.2.1 per ottenere il contenuto totale di nonheme 58Fe della placenta.
- Calcola eme totale 58Fe.
- Calcolare l'eme totale 58Fe moltiplicando prima la concentrazione di ferro (ng/mg) calcolata nella fase 5.1 per il peso del pellet (in mg) misurato nella fase 4.2.1.
- Quindi, dividere il peso totale della placenta misurato nella fase 3.5.1 per il peso del pellet di placenta misurato nella fase 4.2.1. Moltiplicare questo valore per il ferro eme totale (ng) calcolato al punto 5.3.1 per ottenere il contenuto totale di eme 58Fe della placenta.
- Sommare i valori calcolati di nonheme ed eme 58Fe per determinare il contenuto totale di ferro per ciascun tessuto.
Figura 1: Riepilogo visivo dei passaggi del protocollo . (A) Preparazione di 58Fe-transferrina. (B) Somministrazione in vivo di 58Fe-transferrina. (C) Raccolta e conservazione dei tessuti. (D) Trattamento della placenta e del fegato embrionale per la quantificazione di specie metalliche mediante ICP-MS. Abbreviazioni: Fe = ferro; NTA = acido nitrilotriacetico; Tf = transferrina; PPS = soluzione di precipitazione proteica; Sup = supernatante; TCA = acido tricloroacetico; ICP-MS = spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Representative Results
Uno studio precedente che utilizzava isotopi di ferro stabili per misurare il trasporto del ferro ha dimostrato che la carenza materna di ferro ha provocato la downregulation dell'esportatore di ferro della placenta, FPN4. FPN è l'unico esportatore di ferro noto per i mammiferi e l'assenza di FPN durante lo sviluppo provoca la morte embrionale prima di E9.529. Per determinare se la diminuzione osservata nell'espressione di FPN si traducesse funzionalmente in una diminuzione del trasporto di ferro placentare, 58Fe-Tf è stato iniettato per via endovenosa in madri gravide e il ferro nella placenta e nell'embrione è stato quantificato in presenza di carenza di ferro materna.
Per capire come il trasporto placentare del ferro è influenzato dallo stato di ferro materno, la carenza di ferro è stata modellata nei topi4. I topi femmina C57BL / 6 sono stati sottoposti a una dieta a basso contenuto di ferro (4 ppm di ferro) o chow standard (185 ppm di ferro) per 2 settimane prima e durante la gravidanza. Questo regime dietetico si traduce in un minor numero di ferro nonheme epatico materno e ferro sierico ed emoglobina a E12.5, E15.5 ed E18.5 rispetto agli animali con una dieta standard4. A E18.5, gli embrioni di madri carenti di ferro avevano un ferro epatico inferiore ed erano ipoferremici e anemici rispetto agli embrioni di madri piene di ferro. Tre topi gravidi sono stati utilizzati in ciascuno dei gruppi pieni di ferro e carenti di ferro, e 2-3 placenta sono stati utilizzati da ciascun topo gravido per l'analisi.
Per quantificare il trasporto placentare di ferro, 58 Fe-transferrina sono state preparate e iniettate per via endovenosa in madri gravide e 58Fe misurate nella placenta e nel fegato fetale mediante ICP-MS, come descritto nel protocollo e illustrato nella Figura 1. Prima di inviare campioni di ferro nonheme per l'analisi ICP-MS, i livelli totali di ferro nonheme sono stati quantificati in modo indipendente tramite un metodo ferene descritto in precedenza30. Le concentrazioni di ferro noneme misurate con i metodi ferene rispetto a ICP-MS erano altamente significativamente correlate in tutti i tessuti misurati (R2 = 0,94, P < 0,0001, n = 36). I risultati rappresentativi della quantificazione ICP-MS degli isotopi di ferro sono presentati nella Tabella 1. Il totale di 58Fe è stato calcolato come descritto nella fase 5 del protocollo. I dati sono presentati come ferro totale piuttosto che eme o noneme (Figura 2A-D) perché l'obiettivo era quantificare il ferro totale trasferito nella placenta e il ferro totale trasferito all'embrione dalla placenta.
In media, il 21% della dose di 58Fe somministrata è stata recuperata nella placenta, nel fegato dell'embrione e nel siero dell'embrione combinati. La misurazione di 56Fe fornisce informazioni sul trasferimento di ferro a lungo termine nella placenta e nel fegato embrionale durante la gravidanza. Il totale placentare 56Fe era simile nei gruppi carenti di ferro e -pieni (Figura 2A), mentre il ferro totale del fegato embrionale era diminuito nel gruppo con carenza di ferro (Figura 2B). Ciò era atteso sulla base della diminuzione osservata della FPN placentare nel gruppo4 carente di ferro, che avrebbe comportato ritenzione di ferro nella placenta a spese dell'embrione. Total 58Fe fornisce un'istantanea del trasporto di ferro a breve termine. In questo studio, simile a 56Fe, la placenta 58 Fe era simile sia nel gruppo carente di ferro che in quello pieno (Figura 2C), e il fegato embrionale 58Fe era diminuito nel gruppo con carenza di ferro (Figura 2D). Questi dati indicano che durante la gravidanza con carenza di ferro, la downregulation della FPN placentare si traduce in una diminuzione del trasporto di ferro all'embrione, portando a differenze cumulative nel contenuto di ferro nella placenta e nell'embrione.
È importante considerare la dose di ferro somministrata in quanto potrebbe portare a cambiamenti non intenzionali nella concentrazione di epcidina o nell'espressione del trasportatore di ferro31. È stato dimostrato che la carenza di ferro materna ha causato una diminuzione dellaFPN 4 placentare. Per determinare se l'iniezione di Fe-Tf influenzasse questa regolazione, la placenta FPN è stata misurata 6 ore dopo l'iniezione mediante western blot. La dose di ferro di 5 μg è risultata insufficiente per alterare la regolazione della FPN placentare da carenza di ferro materna (Figura 3).
In sintesi, questo metodo è stato utilizzato per dimostrare che la regolazione fisiologica della FPN placentare durante la carenza di ferro materna si traduce in una diminuzione del trasporto di ferro attraverso la placenta in vivo. Gli isotopi stabili del ferro forniscono un'alternativa sensibile e quantificabile alla radioattività per la misurazione del trasporto e della distribuzione del ferro, consentendo l'uso simultaneo dei tessuti per ulteriori analisi.
Figura 2: 56Fe e 58Fe trasportano attraverso la placenta in gravidanze carenti di ferro o piene di ferro. Totale 56Fe nella placenta (A) e nel fegato embrionale (B). Totale 58Fe nella placenta (C) e nel fegato fetale (D). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t di Student a 2 code per valori normalmente distribuiti e altrimenti mediante test di somma del rango U di Mann-Whitney (indicato da un asterisco dopo il valore P). Il numero di animali è indicato negli assi x dei grafici di scatola e baffi. La parte superiore del box plot indica il 75°percentile e la parte inferiore indica il 25° percentile; I baffi sopra la casella indicano il 90 ° percentile e quelli sotto la casella indicano il 10° percentile. La linea continua all'interno della casella indica la mediana e la linea tratteggiata la media. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando software di grafica scientifica e analisi dei dati. Questa cifra è stata modificata da4. Abbreviazione: Fe = ferro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Livelli di TFR1 e FPN placentare. (A) L'espressione di TFR1 e FPN è stata valutata mediante western blot in placenta carente di ferro e -piena 6 ore dopo il trattamento di madri con 58Fe-Tf. (B) L'espressione proteica è stata quantificata e presentata come espressione proteica relativa alla β-actina. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un t-test di Student a 2 code per valori normalmente distribuiti. Il numero di animali è indicato negli assi x dei grafici di scatola e baffi. La parte superiore del box plot indica il 75°percentile e la parte inferiore indica il 25° percentile; I baffi sopra la casella indicano il 90 ° percentile e quelli sotto la casella indicano il 10° percentile. La linea continua all'interno della casella indica la mediana e la linea tratteggiata la media. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando software di grafica scientifica e analisi dei dati. Questa cifra è stata modificata da4. Abbreviazioni: TFR1 = recettore della transferrina; FPN = ferroportina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Campione | 56 Fe | 58 Fe | Fe totale | ||||
| Concentrazione [ng/mL o mg, ppb] | Concentrazione [ng/mL o mg, ppb] | Somma degli isotopi [ng/mL o mg] | |||||
| Nella media* | stdev | Nella media* | stdev | ||||
| Ferro Nonheme | Placenta | carenza di ferro | 729.7 | 17.7 | 2.5 | 0.5 | 732.2 |
| 704.9 | 6.2 | 3.8 | 0.1 | 708.8 | |||
| 649.8 | 3.8 | 0.0 | 0.0 | 649.8 | |||
| 799.2 | 4.6 | 3.8 | 0.2 | 803.0 | |||
| ferro-pieno | 1919.1 | 5.3 | 11.0 | 0.2 | 1930.1 | ||
| 1610.0 | 26.8 | 11.7 | 0.6 | 1621.7 | |||
| 1925.5 | 39.0 | 14.0 | 0.3 | 1939.5 | |||
| 2551.6 | 16.1 | 8.3 | 0.4 | 2559.9 | |||
| Eme | Placenta | carenza di ferro | 253.8 | 1.8 | 1.1 | 0.0 | 254.9 |
| 32.9 | 0.4 | 0.3 | 0.0 | 33.2 | |||
| 337.7 | 5.1 | 1.4 | 0.0 | 339.1 | |||
| 402.3 | 5.3 | 1.7 | 0.0 | 404.0 | |||
| ferro-pieno | 123.5 | 1.3 | 0.6 | 0.0 | 124.0 | ||
| 75.7 | 1.3 | 0.4 | 0.0 | 76.1 | |||
| 441.9 | 3.0 | 1.9 | 0.0 | 443.8 | |||
| 250.4 | 1.1 | 1.1 | 0.0 | 251.5 | |||
| Ferro Nonheme | Fegato embrionale | carenza di ferro | 361.6 | 8.3 | 31.9 | 1.0 | 393.5 |
| 652.4 | 3.4 | 61.7 | 0.3 | 714.1 | |||
| 411.9 | 10.7 | 43.1 | 0.8 | 455.0 | |||
| 631.1 | 7.5 | 62.8 | 0.2 | 693.9 | |||
| ferro-pieno | 7657.5 | 129.3 | 226.4 | 2.2 | 7883.8 | ||
| 3820.2 | 69.5 | 119.4 | 3.4 | 3939.6 | |||
| 5519.0 | 112.9 | 145.6 | 0.5 | 5664.6 | |||
| 4617.4 | 78.6 | 91.6 | 1.0 | 4709.0 | |||
| Eme | Fegato embrionale | carenza di ferro | 44.5 | 0.3 | 1.6 | 0.0 | 46.0 |
| 31.0 | 0.4 | 2.9 | 0.0 | 34.0 | |||
| 11.8 | 0.2 | 1.1 | 0.0 | 12.9 | |||
| 42.3 | 0.1 | 3.2 | 0.0 | 45.5 | |||
| ferro-pieno | 54.3 | 1.4 | 2.1 | 0.0 | 56.4 | ||
| 31.9 | 0.8 | 1.3 | 0.1 | 33.2 | |||
| 59.4 | 0.6 | 2.2 | 0.0 | 61.6 | |||
| 66.7 | 0.6 | 2.1 | 0.0 | 68.8 | |||
Tabella 1: Risultati rappresentativi della quantificazione ICP-MS di 56 Fe e 58Fe nei fegati di placenta ed embrione. Abbreviazioni: ppb = parti per miliardo; stdev = deviazione standard; ICP-MS = spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente.
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Discussion
Il ferro è importante per molti processi biologici e il suo movimento e la sua distribuzione all'interno del corpo sono altamente dinamici e regolati. Gli isotopi stabili del ferro forniscono un'alternativa coerente e conveniente agli isotopi radioattivi per la valutazione della dinamica dell'omeostasi del ferro. Un passo fondamentale nel protocollo è tenere traccia di tutti i pesi e volumi dei tessuti. Il ferro è un elemento e quindi non può essere sintetizzato né scomposto. Pertanto, se tutti i pesi e i volumi sono accuratamente registrati, tutto il ferro all'interno del sistema può essere contabilizzato mediante calcolo. Come descritto, questo metodo può essere utilizzato per distinguere tra fonti di ferro eme e noneme. Tuttavia, se questa distinzione tra forme di ferro non è necessaria e viene misurato solo il ferro totale, il protocollo può essere semplificato trattando il tessuto solo conHNO 3 concentrato, come descritto nella fase 4.2 del protocollo. È importante notare che se i tessuti non vengono perfusi prima dell'analisi, in particolare i tessuti altamente vascolari come la placenta, la presenza di sangue può comportare la sovrastima del contenuto di ferro eme tissutale.
Il ferro legato alla transferrina è stato selezionato per lo studio in quanto è la principale fonte di ferro assorbita dalla placenta16,17. Il knockdown globale del TFR1 nei topi ha provocato letalità embrionale prima di E12.5, suggerendo che il ferro legato alla transferrina è fondamentale per lo sviluppo. È possibile che anche altre specie di ferro, come la ferritina e il ferro non legato alla transferrina (NTBI), contribuiscano in misura minore alla dotazione di ferro fetale. Tuttavia, il contributo di queste specie alternative di ferro non è stato valutato. In futuro, isotopi stabili potrebbero essere utilizzati per determinare il contributo di diverse fonti di ferro allo sviluppo e alla dotazione di ferro embrionale.
Lo scopo dello studio era determinare gli effetti dei cambiamenti nello stato del ferro materno sul trasporto di ferro placentare. Tuttavia, la diminuzione dell'epcidina durante la carenza di ferro provoca elevati livelli di FPN degli enterociti e un maggiore trasporto di ferro nella circolazione1. Pertanto, nelle dighe carenti di ferro, l'assorbimento del ferro dalla dieta sarebbe stato intrinsecamente aumentato e confuso nell'interpretazione dei risultati se 58Fe fosse stato somministrato per via orale. Pertanto, è stata selezionata la somministrazione endovenosa di 58Fe-Tf in quanto bypassa la regolazione del ferro a livello di assorbimento intestinale. Una dose di 5 μg di 58Fe/topo è stata selezionata sulla base delle concentrazioni sieriche di ferro delle madri gravide E18,5 piene di ferro. Nelle madri gravide selvatiche C57BL/6 E18.5, le concentrazioni sieriche di ferro variano da 10 a 50 μM4. Ci si aspetta che un topo E18.5 gravido abbia circa 2 ml di volume totale del sangue32. Pertanto, la quantità totale di ferro nella circolazione di madri gravide piene di ferro varia da 1,1 a 5,6 μg. Pertanto, 5 μg di 58Fe/topo equivalgono alle concentrazioni fisiologiche osservate negli animali pieni di ferro.
Una limitazione della rilevazione ICP-MS di 58 Fe è l'interferenza isobarica da 58Ni. Le concentrazioni endogene di Ni nella placenta di topo sono 0,04 ± 0,02 μg/g di peso umido33. Una placenta di topo E18.5 pesa in media 0,080 g; pertanto, la quantità totale di Ni è di circa 3,2 ng. L'abbondanza naturale di 58Ni è del 68%; pertanto, la quantità di 58 Ni nella placenta del topo è ~ 2,2 ng, che è circa 10 volte inferiore ai livelli di 58Fe rilevati. Nell'embrione, le concentrazioni di Ni sono ancora più basse a 0,01 ± 0,01 μg/g di peso umido33. L'embrione medio di topo E18,5 pesa 1 g; quindi, la quantità totale di Ni in un embrione di topo normale è di circa 10 ng. Supponendo che tutto l'embrione Ni si trovi nel fegato dell'embrione, questi livelli sono ancora 10 volte inferiori alle 58concentrazioni di Fe e quasi 1.000 volte inferiori al contenuto totale di ferro del fegato embrionale. Data la minore abbondanza di Ni in questi tessuti murini, l'interferenza di 58Ni non è stata presa in considerazione in questo studio.
Un'ulteriore considerazione è il limite di rilevamento del test. Il limite di rilevazione in questo studio era 250 pg/mL 58Fe. Tuttavia, questo limite può essere modificato per rilevare concentrazioni ancora più basse di 58Fe se la diluizione dei tessuti viene ridotta nella fase di lavorazione dei tessuti (fase del protocollo 4.1.2 e Figura 1D) o tramite modifiche presso la struttura principale ICP-MS. Quando 58Fe è stato misurato nell'intero embrione, i suoi livelli non sono stati rilevati poiché la concentrazione di 58Fe era inferiore al limite di rilevazione. Tuttavia, 58Fe è stato rilevato nel fegato dell'embrione, che è l'organo primario di stoccaggio del ferro. È possibile che la somministrazione di una dose maggiore di 58 Fe avrebbe permesso la rilevazione di 58Fe anche nell'intero embrione. Tuttavia, una quantità relativamente piccola di 58Fe è stata utilizzata per evitare il carico di ferro della placenta, che potrebbe innescare meccanismi di feedback e alterare l'espressione dei trasportatori di ferro. In questo modello, che ha utilizzato topi selvatici C57BL / 6, il ferro epatico embrionale è stato misurato come riflesso del trasporto totale di ferro placentare, poiché la concentrazione di ferro epatico embrionale è proporzionale all'intera concentrazione di ferro embrionale4. Tuttavia, nei modelli murini in cui la distribuzione del ferro è alterata34, il ferro epatico embrionale da solo potrebbe non rappresentare accuratamente il trasporto totale di ferro placentare. In tali casi, può essere necessario misurare il ferro incorporato nell'intero embrione o nel compartimento eritrocitario. Inoltre, le variazioni nei punti temporali sperimentali richiederanno anche un'ulteriore ottimizzazione e misurazione del ferro in vari compartimenti fetali. Questo approccio di tracciamento isotopico stabile è stato utilizzato per quantificare il trasporto di ferro durante la gravidanza del topo. La metodologia è facilmente adattabile allo studio del trasporto del ferro in topi non gravidi e in altri modelli animali.
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Disclosures
EN è co-fondatore scientifico di Intrinsic LifeSciences e Silarus Pharma e consulente per Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics e Disc Medicine. VS non dichiara conflitti.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono l'uso della struttura ICP-MS all'interno del Centro UC per le implicazioni ambientali della nanotecnologia nel CNSI dell'UCLA per la loro assistenza nell'ottimizzazione del protocollo per 58misurazioni Fe. Lo studio è stato sostenuto dal NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, a VS) e NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, a EN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
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