Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Radyoaktif Olmayan Demir İzotopları Kullanarak Fare Plasentası In Vivo Boyunca Demir Taşımacılığının Ölçülmesi

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Bu makalede, fare gebeliğinde demir taşıma çalışmaları için transferrine bağlı radyoaktif olmayan izotopik demirin nasıl hazırlanacağı ve uygulanacağı gösterilmektedir. Fetoplasental bölmelerde izotopik demirin miktarının belirlenmesi yaklaşımı da açıklanmaktadır.

Abstract

Demir, hamilelik sırasında anne ve fetal sağlık için gereklidir ve sağlıklı bir hamileliği sürdürmek için insanlarda yaklaşık 1 g demir gerekir. Fetal demir bağışı tamamen plasenta boyunca demir transferine bağlıdır ve bu transferin pertürbasyonları olumsuz gebelik sonuçlarına yol açabilir. Farelerde, plasenta boyunca demir akışlarının ölçümü geleneksel olarak radyoaktif demir izotoplarına dayanıyordu, bu oldukça hassas ama külfetli bir yaklaşımdı. Kararlı demir izotopları (57Fe ve 58Fe), insan gebelik çalışmalarında kullanılmak üzere radyoaktif olmayan bir alternatif sunar.

Fizyolojik koşullar altında, transferrine bağlı demir, plasenta tarafından alınan demirin baskın şeklidir. Bu nedenle, plasental demir taşınımını doğrudan değerlendirmek ve kafa karıştırıcı bir değişken olarak maternal intestinal demir emilimini atlamak için 58Fe-transferrin hazırlandı ve gebe barajlarda intravenöz olarak enjekte edildi. İzotopik demir, plasenta ve fare embriyonik dokularında endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi (ICP-MS) ile kantite edildi. Bu yöntemler, in vivo demir dinamiklerini ölçmek için fizyoloji veya hastalığın diğer hayvan modeli sistemlerinde de kullanılabilir.

Introduction

Demir, büyüme ve gelişme, enerji üretimi ve oksijen taşınması dahil olmak üzere çeşitli metabolik süreçler için kritiköneme sahiptir 1. Demir homeostazının bakımı dinamik, koordineli bir süreçtir. Demir, duodenumdaki gıdalardan emilir ve demir taşıma proteini transferrinine (Tf) bağlı dolaşımda vücudun etrafında taşınır. Her hücre tarafından enzimatik işlemler için kullanılır, yeni ortaya çıkan eritrositlerde hemoglobine dahil edilir ve makrofajlar tarafından yaşlı eritrositlerden geri dönüştürülür. Demir, aşırı olduğunda karaciğerde depolanır ve kanama veya hücre dökülmesi yoluyla vücuttan kaybolur. Dolaşımdaki demir miktarı, tüketim ile demir arzı arasındaki dengenin sonucudur, ikincisi, demir homeostazının merkezi düzenleyicisi olan hepatik hormon hepcidin (HAMP) tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir1. Hepcidin, her yerde bulunmasını engelleyerek veya indükleyerek ve demir ihracatçısı ferroportini (FPN) bozarak kandaki demir biyoyararlanımını sınırlamak için işlev görür2. Fonksiyonel FPN'deki azalma, diyetle demir emiliminin azalmasına, karaciğerde demir tutulmasına ve makrofajlardan demir geri dönüşümünün azalmasına yol açar1.

Hepcidin demir durumu, inflamasyon, eritropoietik sürücü ve gebelik ile düzenlenir (3'te gözden geçirilmiştir). Demir homeostazının oldukça dinamik olduğu göz önüne alındığında, toplam demir havuzunu ve demir dağılımını ve cirosunu anlamak ve ölçmek önemlidir. Hayvan çalışmaları geleneksel olarak demir dinamiklerini ölçmek için oldukça hassas ancak külfetli bir yaklaşım olan radyoaktif demir izotoplarına dayanıyordu. Bununla birlikte, burada sunulan çalışma da dahil olmak üzere daha yeni çalışmalarda4, gebelik sırasında demir taşınımını ölçmek için radyoaktif olmayan, kararlı demir izotopları (58Fe) kullanılmaktadır 5,6,7,8,9. Kararlı izotoplar, besin metabolizmasını incelemek için değerli araçlardır (10'da gözden geçirilmiştir). İnsan çalışmalarında stabil demir izotoplarının kullanımı, i) demir emiliminin gebeliğin sonuna doğru arttığınıgöstermiştir 5,6, ii) diyet demirinin fetüse transferinin maternal demir durumuna bağlı olduğu7, iii) maternal olarak alınan heme demiri, fetüs tarafından nonheme demir 8'den daha kolay dahil edilir ve iv) fetüse demir transferinin maternal hepcidin seviyeleri 8 ile negatif korelasyon gösterir, 9. Bu deneyler serumlardaki demir izotoplarını veya RBC'lere dahil edilmelerini ölçtü; Bununla birlikte, yalnızca RBC'lere dahil edilen demirin ölçümü, gerçek demir emilimini hafife alabilir9. Bu çalışmada, dokularda hem heme hem de nonheme demir ölçülmüştür.

Hamilelik sırasında, maternal kırmızı kan hücresi hacminin genişlemesini desteklemek ve fetüsün büyümesini ve gelişmesini desteklemek için plasenta boyunca transfer için demir gereklidir11. Fetal demir bağışı tamamen plasenta boyunca demir taşınmasına bağlıdır. İnsan 12 ve kemirgen 4,13 gebelik sırasında, hepcidin seviyeleri önemli ölçüde azalır ve fetüse transfer için plazma demir mevcudiyetini arttırır.

Plasental demir taşımacılığının temelleri başlangıçta 1950-70'lerde radyoaktif izleyiciler (59Fe ve 55Fe) kullanılarak karakterize edildi. Bu çalışmalar, plasenta boyunca demir taşınmasının tek yönlü 14,15 olduğunu ve diferrik transferrinin plasenta ve fetüs 16,17 için önemli bir demir kaynağı olduğunu belirlemiştir. Plasental demir taşımacılığının mevcut anlayışı daha eksiksizdir, ancak bazı önemli demir taşıyıcıları ve düzenleyici mekanizmalar bilinmemektedir. Fare modelleri, demir regülasyonu ve nakliyesini anlamak için çok önemlidir18, çünkü kilit taşıyıcılar ve mekanizmalar oldukça benzerdir. Hem insan hem de fare plasentası hemokoriyaldir, yani maternal kan fetal koryon19 ile doğrudan temas halindedir. Bununla birlikte, bazı dikkate değer yapısal farklılıklar vardır.

Sinsitiyotrofoblast, maternal ve fetal dolaşımı ayıran ve aktif olarak demir ve diğer besin maddelerini taşıyan plasental hücre tabakasıdır20. İnsanlarda, sinsitiyotrofoblast, kaynaşmış hücrelerin tek bir tabakasıdır. Buna karşılık, fare plasentası iki sinsitiyotrofoblast katmanı21, Syn-I ve Syn-II'den oluşur. Bununla birlikte, Syn-I ve Syn-II'nin arayüzündeki boşluk kavşakları, besinlerin22,23 katmanları arasında difüzyonuna izin verir. Böylece, bu katmanlar insan sinsitiyotrofoblastına benzer tek bir sinsitial tabaka olarak işlev görür. İnsan ve fare plasentası arasındaki ek benzerlikler ve farklılıklar Rossant ve Cross21 tarafından gözden geçirilmiştir. Plasental demir transportu, demir-Tf'nin maternal kandan sinsitiyotrofoblast24'ün apikal tarafında lokalize olan transferrin reseptörüne (TfR1) bağlanmasıyla tetiklenir. Bu etkileşim, klatrin aracılı endositoz25 yoluyla demir-Tf / TfR1 içselleşmesini indükler. Demir daha sonra asidik endozom26'daki Tf'den salınır, belirlenemeyen bir ferriredüktaz tarafından demirli demire indirgenir ve endozomdan henüz belirlenmemiş bir taşıyıcı tarafından sitoplazmaya ihraç edilir. Demirin sinsitiyotrofoblast içinde nasıl chaperonize edildiği de açıklanmaya devam etmektedir. Demir sonunda demir ihracatçısı FPN tarafından fetal tarafa taşınır, sinsitiyotrofoblastın bazal veya fetale bakan yüzeyinde lokalize edilir (27'de gözden geçirilmiştir).

TfR1, FPN ve hepcidinin fizyolojik ve patolojik regülasyonunun plasental demir taşınımını nasıl etkilediğini anlamak için, maternal dolaşımdan plasentaya ve embriyoya demir taşınımını in vivo4'e arttırmak için stabil demir izotopları kullanılmıştır. Bu yazıda gebe farelere izotopik demir transferrin hazırlanması ve uygulanması, ICP-MS için dokuların işlenmesi ve dokulardaki demir konsantrasyonlarının hesaplanması için yöntemler sunulmaktadır. İn vivo stabil demir izotoplarının kullanımı, fizyolojik ve patolojik demir regülasyonunu araştırmak için farklı hayvan modellerinde demir regülasyonunu ve dağılımını araştırmak için uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan protokolleri ve deneysel prosedürler, Kaliforniya Üniversitesi Los Angeles Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. 58Fe-Tf'nin hazırlanması

NOT: Protokol 58Fe kullanır; ancak, 57Fe için aynı protokol kullanılabilir. Her iki izotop da ek önlemler alınmadan standart bir demir kimyasalı olarak kullanılabilir ve bertaraf edilebilir.

  1. 58Fe'yi 12 N HCl'de 50 μL HCl / mg 58Fe'de çözün.
    1. HCl'yi satıcı tarafından sağlanan cam şişedeki metale ekleyin ve kapağı gevşek bir şekilde değiştirin. Demiri çözmek için, 58Fe / HCl çözeltisini 1 saat boyunca 60 ° C'ye ısıtın. Hala çözülmemişse, çözeltiyi çözülmesi için gece boyunca oda sıcaklığında duman davlumbazında bırakın.
      NOT: Çözünmüş 58Fe/HCl çözeltisi sarımsı-turuncu renktedir.
      Fe3O 4(ler) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl 3(aq) + 4H 2 O
  2. Fe(III)Cl 2 çözeltisini üretmek için kalan Fe(II)Cl3'ü oksitleyin.
    1. Oksidasyonu kolaylaştırmak için 58Fe/HCl çözeltisini kapak kapalıyken 60 °C'ye ısıtın.
    2. Oksidasyonu daha da kolaylaştırmak için 50 μL 58 Fe/HCl çözeltisi başına 1 μL %35H 2O2 ekleyin.
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. Ferrik klorür (58Fe(III)Cl3) çözeltisini hazırlayın.
    1. Ferrik klorür çözeltisini, numuneyi buharlaştırmak için kapağı kapalı olarak 60 °C'de davlumbazda bırakın.
      NOT: Buharlaşma bir ila birkaç gün sürebilir.
    2. 58Fe(III)Cl3'ü ultra saf H2 O ile 100 mM'ye yeniden oluşturun ve adım 1.1'de kullanılan ilk metal ağırlığına göre gereken ultra saf H2 O miktarını hesaplayın (58Fe(III)Cl3'ün moleküler ağırlığı 162.2'dir).
  4. 58Fe (III) -nitrilotriasetat (NTA), 20 mM NaHCO 3 varlığında 1:5 molar oranında NTA ile 58Fe (III) Cl3'ü inkübe ederek hazırlayın.
    1. 1 N NaOH'de 500 mM NTA hazırlayın.
    2. 5x transferrin yükleme tamponu hazırlayın (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Ultra safH2O'da 1 M NaHCO3 hazırlayın.
    4. 15 mL'lik bir konik tüpe 150 μL 100 mM 58 Fe(III)Cl 3 çözeltisi (adım 1.3.2'den), 1 N NaOH'da hazırlanan 150 μL 500 mM NTA, 480 μL ultrasaf H2O, 200 μL 5xtransferrin yükleme tamponu ve 20 μL 1 M NaHCO3 çözeltisi ekleyin.
    5. Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  5. 58Fe-Tf oluşturmak için apo-Tf'yi 58Fe(III)-NTA ile yükleyin.
    NOT: Bu protokol McCarthy ve Kosman28'den uyarlanmıştır.
    1. 500 mg apo-Tf'yi 4 mL 1x Tf yükleme tamponunda çözün.
    2. Adım 1.4.4'te 58 Fe(III)-NTA çözeltisinin 1 mL'sini içeren 15mL konik tüpe 4 mL apo-Tf çözeltisi ekleyin.
      NOT: Bu, apo-Tf ile 58Fe-NTA'nın 3: 1 molar oranıdır. Her Tf 2 Fe bağlama bölgesi içerir; Tf'nin tamamen yüklendiğinden emin olmak için fazla 58Fe-NTA eklendi.
    3. 58Fe-NTA'nın apo-Tf üzerine maksimum yüklenmesine izin vermek için, çözeltinin pH 7.5'te olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse pH'ı NaHCO3 veya HCl ile ayarlayın.
    4. Oda sıcaklığında 2,5 saat inkübe edin.
  6. Fazla bağlanmamış 58Fe(III)-NTA'yı çıkarın ve NTA'yı serbest bırakın.
    1. 58Fe-Tf çözeltisini moleküler ağırlıklı bir kesme kolonuna (30 kDa kesme) aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.500 × g'da santrifüj yapın.
    2. Kolonu 10 mL 1x transferrin yükleme tamponu ile yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.500 × g'da santrifüj yapın. Yıkama ve santrifüjlemeyi tekrarlayın, 10 mL tuzlu su ile tuzlu su yıkama yapın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.500 × g'da santrifüj yapın.
  7. 58Fe-Tf konsantrasyonunu hesaplayın.
    NOT: Adım 1.5.2'de fazla 58Fe eklenmesi nedeniyle, tüm transferrinlerin diferrik olduğunu varsayalım. 500 mg apo-Tf kullanıldığından, adım 1.5.4'te ~ 500 mg 58Fe-Tf üretildi.
    1. Adım 1.6.2'de tuzlu su yıkamadan sonra santrifüjlemeden geri kazanılan hacmi ölçün.
    2. 58 Fe-Tf çözeltisinin konsantrasyonunu (mg / mL cinsinden) belirlemek için 500mg'ı geri kazanılan hacme bölün.
  8. 58Fe-Tf çözeltisini 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak sterilize edin; kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: 58Fe-Tf çözeltisi hazırlıktan 1 ila 4 hafta sonra kullanılmıştır.

2. Zamanlanmış fare gebeliklerini ayarlama

  1. 6 ila 8 haftalık dişi fareler kullanın. Çiftleşmeden önce hayvanları 2 hafta boyunca düşük demirli bir diyete (4 ppm demir) veya standart chow'a (185 ppm demir) yerleştirin ve hamilelik boyunca hayvanları ilgili diyetlerde tutun.
  2. Seçenek 01: E7.5'te kilo alımı ile hamileliği onaylayın.
    1. Birden fazla üreme kafesi kurun. Her kafes için, 2 dişiyi gece boyunca 1 erkekle birleştirin; hayvanların ayrıldığı ertesi gün embriyonik gün (E)0.5 olarak kabul edilir. Hamile olup olmadığını belirlemek için kadınları E7.5'te tartın. Erkekleri kilo almayan dişilerle tekrar eşleştirin.
      NOT: WT C57BL/6'da, E7.5'te 1 g'lık bir kilo alımı gebeliğin iyi bir göstergesidir. Bu yöntem, implantasyonun belirli bir 16 saatlik zaman dilimi içinde gerçekleşmesini sağlar ve aynı çiftleşme döneminde hamile kalan tüm hayvanların senkron tedavisine izin verir.
  3. Seçenek 02: Fiş kontrolleri ile hamileliği onaylayın.
    1. 2 dişi 1 erkekle birleştirin ve çiftleşmenin gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için günlük fiş kontrolleri yapın.
      NOT: Bu yöntem kademeli gebeliklere neden olabilir ve bir tıkaçların varlığı hamileliği garanti etmez.

3. 58Fe-Tf'yi intravenöz olarak E17.5 hamile farelere uygulayın

  1. Enjeksiyon için adım 1.8'den 58Fe-Tf hazırlayın.
    1. Tuzlu suda 35mg / mL'de 58 Fe-Tf çözeltisi hazırlayın; fare başına 100 μL enjekte edin.
    2. Bir insülin şırıngasını 58Fe-Tf çözeltisinin 100 μL'si ile doldurun.
      NOT: Her doz 3.5 mg insan 58 Fe-Tf (5 μg 58Fe) içerir.
  2. İzofluran kullanarak hamile bir fareyi anestezi altına alın.
    1. Odacıklı bir izofluran regülatörü kullanın.
    2. Aşağıdaki ayarları kullanın: %5 izofluran, 2 L/mLO2, 2 dk.
    3. Bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermemeye bakarak farenin uyuşturulduğunu onaylayın.
    4. Göz yağlayıcısını gözün yüzeyine uygulayın ve fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
  3. 58Fe-Tf çözeltisini retro-orbital sinüse yavaşça ve dikkatlice enjekte edin.
  4. Farenin anesteziden kurtulmasına izin verin; Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
  5. Enjeksiyondan altı saat sonra, E17.5 hamile kadınları izofluran doz aşımı ile ötenazileştirin.
    1. Fareyi ikincil ötenazinin bir şekli olarak exsanguinate etmek için bir kardiyak ponksiyon gerçekleştirin.
    2. Stabilizasyon için ayakları iğnelerle sabitleyin.
  6. Plasenta ve embriyo karaciğerlerini toplayın.
    1. Steril forseps ve diseksiyon makası kullanarak, uterusu hamile fareden dikkatlice çıkarın. Rahim bir kısmı ile çevrili amniyotik kesede tek bir fetüs ve plasenta içeren bir plasental fetal-plasental üniteyi kesin.
    2. Fetusu ve plasentayı rahatsız etmeden uterus ve amniyotik keseyi dikkatlice kesin.
    3. Amniyotik kesesi geri soyun ve fetüsü ve plasentayı çıkarın.
    4. Göbek kordonunu kesin.
    5. Fazla amniyotik sıvıyı çıkarmak için fetüsü ve plasentayı temiz bir görev mendiliyle lekeleyin.
    6. Tüm plasentaların ağırlıklarını kaydedin.
    7. Her plasentayı bir tıraş bıçağı ile ikiye bölün, her yarısını 2.0 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve sıvı azotta dondurun.
      NOT: 58 Fe özel elleçleme önlemleri ve bertaraf gerektirmediğinden, plasentanın yarısı 58Fe ölçümü için, diğer yarısı ise batı lekelenmesi ve qPCR ile transferrin reseptörü (TFR1) ve ferroportin (FPN) ekspresyonunun kantitasyonu da dahil olmak üzere diğer analizler için kullanılabilir.
    8. Embriyo karaciğerlerini toplamak için embriyoyu feda edin: embriyonun başını hızla kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.
      NOT: E17.5'te, uterustaki tüm embriyolar, çalışmada kullanılmasalar bile, ayrı ayrı ötenazi yapılmalıdır.
    9. Stabilizasyon için embriyoyu sabitleyin ve karnı açıkta bırakın.
    10. Diseksiyon makası kullanarak, göbek kordonunun takılı olduğu yerde küçük bir kesi yapın, diseksiyon makasının bir ucunu insizyona yerleştirin ve koronal düzleme doğru yaklaşık 1/4 inç kesilmiş bir medyan düzlem yapın. Ardından, fetal karaciğeri açığa çıkarmak için enine düzlem kesimleri yapın.
    11. Fetal karaciğeri çıkarmak için forseps kullanın.
    12. Tüm embriyo karaciğerlerinin ağırlıklarını kaydedin.
    13. Tüm embriyo karaciğerlerini 2 mL tüplere yerleştirin ve sıvı azot içinde çırpınarak dondurun.
      NOT: Alternatif olarak, ek analizler isteniyorsa, embriyo karaciğerinin sadece bir kısmı 58Fe ölçümü için kullanılabilir. 2,0 mL tüplerin kullanılması, 1,5 mL tüplerden daha iyi doku homojenizasyonu sağlar.
  7. Dokuları süresiz olarak -80 °C'de saklayın.

4. ICP-MS ile kantitatif demir analizi için proses dokuları

  1. Nonheme demirin kantitasyonu için plasenta ve fetal karaciğerleri işleyin.
    1. Plasental yarıları ve tüm fetal karaciğerleri çözün ve plasenta yarısını tartın (fetal karaciğer ağırlıklarını kaydetmek için adım 3.6.12'ye bakınız).
    2. 400 μL protein çökeltme çözeltisi ekleyin (0.53 N HCl,% 5.3 TCA).
    3. Elektrikli homojenizatör kullanarak dokuyu homojenize edin.
    4. Numuneleri 1 saat boyunca 100 °C'de inkübe edin.
    5. Numuneleri oda sıcaklığında suda 2 dakika soğutun.
    6. Basıncı serbest bırakmak için kapakları açın, ardından tüpleri tekrar kapatın.
    7. Pelet dokusu kalıntılarına oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 17.000 × g'da santrifüj.
    8. Süpernatantı dikkatlice yeni etiketli bir tüpe aktarın.
    9. ICP-MS analizi için örnekleri gönderin.
  2. Heme-demirin kantitasyonu için plasenta ve fetal karaciğerleri işleyin.
    NOT: Adım 1'de nonheme demirin ekstraksiyonunu takiben, pelet içinde kalan demir ağırlıklı olarak heme'dir.
    1. Adım 4.1.7'deki her peletin ağırlığını kaydedin.
    2. Peletleri 10 mL konsantre %70 HNO3 içinde sindirin ve 1 mL'lik %30 H2O2 ile desteklenin.
      NOT: Belirli çalışmalar için HNO3 hacmini optimize etmek üzere ICP-MS çekirdeğine veya merkezine danışın; hacim kısmen numune ağırlığına bağlı olacaktır.
    3. Numuneleri 15 dakika boyunca 200 °C'ye ısıtın.
    4. ICP-MS analizi için örnekleri gönderin.
      NOT: Heme ve nonheme demir kaynakları arasında ayrım yapmak gerekli değilse ve sadece toplam demir ölçülüyorsa, ilk adım olarak HNO3'te tüm doku sindirilebilir.

5. Veri analizi

NOT: ICP-MS'den elde edilen veriler ng/mL veya mg, ppb cinsinden 56Fe ve 58Fe konsantrasyonları olarak sağlanmıştır (Tablo 1). 56 adet Fe, doğada en bol bulunan demir izotopudur ve ölçümü, tüm hamilelik boyunca plasenta / embriyodaki demir birikimini yansıtırken, 58Fe ölçümü, enjeksiyondan sonraki 6 saat boyunca transfer edilen demiri yansıtır.

  1. Ölçülen 58 Fe değerinden 58Fe'lik doğal bolluğu (toplam Fe'nin% 0.28'i) çıkarın.
  2. Toplam nonheme 58Fe hesaplayın.
    1. Toplam 58Fe'yi tahmin etmek için adım 5.1'de hesaplanan demir konsantrasyonunu (ng / mL) adım 4.1.2'deki ilk işlem sırasında hacim (mL) ile çarparak embriyo karaciğeri toplam nonheme demiri (ng) hesaplayın.
    2. Adım 3.6.6'da ölçülen plasentanın toplam ağırlığını alarak ve adım 4.1.1'de işlenen plasentanın ağırlığına bölerek tüm plasentadaki demir miktarını hesaplayın. Plasentanın toplam nonheme 58Fe içeriğini elde etmek için bu değeri adım 5.2.1'de hesaplanan toplam nonheme demir (ng) ile çarpın.
  3. Toplam heme 58Fe hesaplayın.
    1. İlk önce adım 5.1'de hesaplanan demir konsantrasyonunu (ng / mg) adım 4.2.1'de ölçülen peletin ağırlığı (mg cinsinden) ile çarparak toplam heme 58Fe'yi hesaplayın.
    2. Ardından, adım 3.5.1'de ölçülen plasentanın toplam ağırlığını, adım 4.2.1'de ölçülen plasenta peletinin ağırlığına bölün. Plasentanın toplam heme 58Fe içeriğini elde etmek için bu değeri adım 5.3.1'de hesaplanan toplam heme demir (ng) ile çarpın.
  4. Her doku için toplam demir içeriğini belirlemek için hesaplanan nonheme ve heme 58Fe değerlerini toplayın.

Figure 1
Şekil 1: Protokoldeki adımların görsel özeti. (A) 58Fe-transferrin'in hazırlanması. (B) 58Fe-transferrinin in vivo uygulaması. (C) Doku toplanması ve depolanması. (D) ICP-MS tarafından metal türlerinin kantitasyonu için plasenta ve embriyo karaciğerinin işlenmesi. Kısaltmalar: Fe = demir; NTA = nitrilotriasetik asit; Tf = transferrin; PPS = protein çökeltme çözeltisi; Sup = süpernatant; TCA = trikloroasetik asit; ICP-MS = endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Demir taşınımını ölçmek için stabil demir izotopları kullanan daha önceki bir çalışma, maternal demir eksikliğinin plasenta demir ihracatçısı FPN4'ün aşağı regülasyonuna neden olduğunu göstermiştir. FPN, bilinen tek memeli demir ihracatçısıdır ve gelişim sırasında FPN'nin yokluğu, E9.529'dan önce embriyonik ölümle sonuçlanır. FPN ekspresyonunda gözlenen azalmanın fonksiyonel olarak azalmış plasental demir transportuna çevrilip çevrilmediğini belirlemek için, 58Fe-Tf gebe barajlarına intravenöz olarak enjekte edildi ve maternal demir eksikliği varlığında plasenta ve embriyodaki demir ölçüldü.

Plasental demir taşımacılığının maternal demir durumundan nasıl etkilendiğini anlamak için, farelerde demir eksikliği modellenmiştir4. Dişi C57BL / 6 fareleri, hamilelikten önce ve hamilelik boyunca 2 hafta boyunca düşük demirli bir diyete (4 ppm demir) veya standart chow (185 ppm demir) yerleştirildi. Bu diyet rejimi, standart bir diyetteki hayvanlara kıyasla E12.5, E15.5 ve E18.5'te daha düşük maternal karaciğer nonheme demir ve serum demir ve hemoglobin ile sonuçlanır4. E18.5'te, demir eksikliği olan annelerden gelen embriyolar daha düşük karaciğer demirine sahipti ve demir dolu annelerden gelen embriyolardan hipoferremik ve anemikti. Demir dolu ve demir eksikliği olan grupların her birinde üç hamile fare kullanıldı ve analiz için her hamile fareden 2-3 plasenta kullanıldı.

Plasental demir transportunu ölçmek için, protokolde açıklandığı ve Şekil 1'de gösterildiği gibi, 58 Fe-transferrin hazırlandı ve gebe barajlarda intravenöz olarak enjekte edildi ve 58Fe, ICP-MS tarafından plasenta ve fetal karaciğerde ölçüldü. ICP-MS analizi için nonheme demir örnekleri göndermeden önce, toplam nonheme demir seviyeleri, daha önce30 olarak tanımlanan bir feren yöntemiyle bağımsız olarak ölçülmüştür. Feren ve ICP-MS yöntemleriyle ölçülen nonheme demir konsantrasyonları, ölçülen tüm dokularda oldukça anlamlı korelasyona sahipti (R2 = 0.94, P < 0.0001, n = 36). Demir izotoplarının ICP-MS kantitasyonundan elde edilen temsili sonuçlar Tablo 1'de sunulmuştur. Toplam 58Fe, protokolün 5. adımında açıklandığı gibi hesaplanmıştır. Veriler heme veya nonheme demir yerine toplam olarak sunulmaktadır (Şekil 2A-D) çünkü amaç plasentaya transfer edilen toplam demir ve plasentadan embriyoya transfer edilen toplam demiri ölçmekti.

Ortalama olarak, uygulanan 58Fe dozunun% 21'i plasenta, embriyo karaciğeri ve embriyo serumunda kombine olarak geri kazanıldı. 56Fe ölçümü, hamilelik boyunca plasenta ve embriyo karaciğerindeki uzun süreli demir transferi hakkında fikir verir. Toplam plasental 56Fe, demir eksikliği olan ve dolu gruplarda benzerdi (Şekil 2A), demir eksikliği olan grupta toplam embriyo karaciğer demiri azaldı (Şekil 2B). Bu, demir eksikliği olan grup4'te plasental FPN'de gözlenen azalmaya dayanarak bekleniyordu, bu da embriyo pahasına plasentada demir tutulmasına neden olacaktı. Toplam 58Fe, kısa süreli demir taşımacılığının anlık görüntüsünü sağlar. Bu çalışmada, 56Fe'ye benzer şekilde, plasental 58 Fe hem demir eksikliği olan hem de dolu gruplarda benzerdi (Şekil 2C) ve demir eksikliği olan grupta embriyo karaciğeri 58Fe azaldı (Şekil 2D). Bu veriler, demir eksikliği olan gebelik sırasında, plasenta FPN'sinin aşağı regülasyonunun embriyoya demir taşınmasının azalmasına neden olduğunu ve plasenta ve embriyodaki demir içeriğinde kümülatif farklılıklara yol açtığını göstermektedir.

Hepcidin konsantrasyonunda veya demir taşıyıcı ekspresyonunda istenmeyen değişikliklere yol açabileceğinden uygulanan demir dozunu dikkate almak önemlidir31. Maternal demir eksikliğinin plasental FPN4'te azalmaya neden olduğu gösterilmiştir. Fe-Tf enjeksiyonunun bu düzenlemeyi etkileyip etkilemediğini belirlemek için, plasenta FPN'si enjeksiyondan 6 saat sonra western blot ile ölçüldü. 5 μg'lık demir dozu, maternal demir eksikliği nedeniyle plasental FPN regülasyonunu değiştirmek için yetersizdi (Şekil 3).

Özetle, bu yöntem, maternal demir eksikliği sırasında plasenta FPN'sinin fizyolojik regülasyonunun plasenta boyunca in vivo demir taşınmasının azalmasına neden olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Kararlı demir izotopları, demir taşınması ve dağılımının ölçülmesi için radyoaktiviteye duyarlı ve ölçülebilir bir alternatif sunarak, ek analizler için dokuların eşzamanlı kullanımına izin verir.

Figure 2
Şekil 2: Demir eksikliği olan veya demir dolu gebeliklerde plasenta boyunca 56Fe ve 58Fe taşınması. Plasenta (A) ve embriyo karaciğerinde (B) toplam 56Fe. Plasenta (C) ve fetal karaciğerde (D) toplam 58Fe. İstatistiksel analiz, normal olarak dağıtılmış değerler için 2 kuyruklu bir Öğrenci t-testi kullanılarak ve aksi takdirde Mann-Whitney U rütbe toplamı testi (P değerinden sonra bir yıldız işareti ile gösterilir) kullanılarak gerçekleştirildi. Hayvan sayısı, kutunun x eksenlerinde ve bıyık grafiklerinde belirtilmiştir. Kutu grafiğinin üst kısmı 75. yüzdelik dilimi ve alt kısmı 25. yüzdelik dilimi gösterir; Kutunun üstündeki bıyıklar 90. yüzdelik dilimi, kutunun altındakiler ise 10. yüzdelik dilimi gösterir. Kutunun içindeki düz çizgi medyanı ve kesikli çizgiyi ortalamayı gösterir. İstatistiksel analiz, bilimsel grafik ve veri analizi yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu rakam4'ten değiştirilmiştir. Kısaltma: Fe = demir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Plasental TFR1 ve FPN düzeyleri. (A) 58Fe-Tf'li annelerin tedavisinden 6 saat sonra demir eksikliği olan ve -dolu plasentada batı lekesi ile TFR1 ve FPN ekspresyonu değerlendirildi. (B) Protein ekspresyonu nicelleştirildi ve β-aktinine göre protein ekspresyonu olarak sunuldu. İstatistiksel analiz, normal olarak dağıtılmış değerler için 2 kuyruklu bir Öğrenci t-testi kullanılarak gerçekleştirildi. Hayvan sayısı, kutunun x eksenlerinde ve bıyık grafiklerinde belirtilmiştir. Kutu grafiğinin üst kısmı 75. yüzdelik dilimi ve alt kısmı 25. yüzdelik dilimi gösterir; Kutunun üstündeki bıyıklar 90. yüzdelik dilimi, kutunun altındakiler ise 10. yüzdelik dilimi gösterir. Kutunun içindeki düz çizgi medyanı ve kesikli çizgiyi ortalamayı gösterir. İstatistiksel analiz, bilimsel grafik ve veri analizi yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu rakam4'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: TFR1 = transferrin reseptörü; FPN = ferroportin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek 56 adet Fe 58 adet Fe Toplam Fe
Konsantrasyon [ng / mL veya mg, ppb] Konsantrasyon [ng / mL veya mg, ppb] İzotopların Toplamı [ng / mL veya mg]
Ortalama* stdev Ortalama* stdev
Nonheme demir Plasenta demir eksikliği 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
demir dolu 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Heme Plasenta demir eksikliği 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
demir dolu 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Nonheme demir Embriyo Karaciğeri demir eksikliği 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
demir dolu 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Heme Embriyo Karaciğeri demir eksikliği 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
demir dolu 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Tablo 1: Plasenta ve embriyo karaciğerlerinde 56Fe ve 58 Fe'lik ICP-MS kantitasyonundan elde edilen temsili sonuçlar. Kısaltmalar: ppb = milyarda bir parça; stdev = standart sapma; ICP-MS = endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Demir birçok biyolojik süreç için önemlidir ve vücuttaki hareketi ve dağılımı oldukça dinamik ve düzenlenmiştir. Kararlı demir izotopları, demir homeostazının dinamiklerinin değerlendirilmesi için radyoaktif izotoplara tutarlı ve uygun bir alternatif sağlar. Protokoldeki kritik bir adım, tüm doku ağırlıklarını ve hacimlerini takip etmektir. Demir bir elementtir ve bu nedenle sentezlenemez veya parçalanamaz. Böylece, tüm ağırlıklar ve hacimler dikkatlice günlüğe kaydedilirse, sistem içindeki tüm demirler hesaplama ile hesaplanabilir. Açıklandığı gibi, bu yöntem heme ve nonheme demir kaynaklarını ayırt etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, demir formları arasındaki bu ayrım gerekli değilse ve sadece toplam demir ölçülürse, protokol, protokol adım 4.2'de açıklandığı gibi sadece konsantre HNO3 ile doku muamelesi yapılarak basitleştirilebilir. Analizden önce dokular, özellikle plasenta gibi yüksek vasküler dokular perfüze edilmezse, kanın varlığının doku heme demir içeriğinin abartılmasına neden olabileceğini belirtmek önemlidir.

Plasenta16,17 tarafından alınan ana demir kaynağı olduğu için transferrine bağlı demir çalışma için seçildi. Farelerde TFR1'in küresel olarak yıkılması, E12.5'ten önce embriyonik ölümcüllüğe neden oldu, bu da transferrine bağlı demirin gelişim için kritik olduğunu düşündürdü. Ferritin ve transferrin olmayan bağlı demir (NTBI) gibi diğer demir türlerinin de fetal demir bağışına daha az katkıda bulunması mümkündür. Bununla birlikte, bu alternatif demir türlerinin katkısı değerlendirilmemiştir. Gelecekte, farklı demir kaynaklarının gelişime ve embriyo demir bağışına katkısını belirlemek için kararlı izotoplar kullanılabilir.

Çalışmanın amacı, maternal demir durumundaki değişikliklerin plasental demir transportu üzerindeki etkilerini belirlemektir. Bununla birlikte, demir eksikliği sırasında hepcidinin azalması, enterosit FPN seviyelerinin yükselmesine ve dolaşıma demir taşınmasının artmasına neden olur1. Bu nedenle, demir eksikliği olan barajlarda, diyetten demir emilimi, 58Fe oral yoldan uygulansaydı, doğal olarak artmış ve sonuçların karışık bir şekilde yorumlanması gerekirdi. Böylece, 58Fe-Tf'nin intravenöz uygulaması, bağırsak emilimi düzeyinde demir düzenlemesini atladığı için seçildi. Demir dolu E18.5 hamile barajlarının serum demir konsantrasyonlarına dayanarak 58Fe / farenin 5 μg'lık bir dozu seçildi. Vahşi tip C57BL/6 E18.5 hamile barajlarda, serum demir konsantrasyonları 10 ila 50 μM4 arasında değişmektedir. Hamile bir E18.5 farenin yaklaşık 2 mL toplam kan hacmine sahip olması bekleniyor32. Böylece, demir dolu hamile barajların dolaşımındaki toplam demir miktarı 1.1 ila 5.6 μg arasında değişmektedir. Bu nedenle, 58Fe / farenin 5 μg'ı, demir dolu hayvanlarda gözlenen fizyolojik konsantrasyonlara eşdeğerdir.

58Fe'lik ICP-MS tespitinin bir sınırlaması, 58Ni'den izobarik girişimdir. Fare plasentasındaki endojen Ni konsantrasyonları 0.04 ± 0.02 μg / g ıslak ağırlık33'tür. Ortalama bir E18.5 fare plasentası 0.080 g ağırlığındadır; bu nedenle, toplam Ni miktarı yaklaşık 3.2 ng'dir. 58Ni'nin doğal bolluğu% 68'dir; Bu nedenle, fare plasentasındaki 58 Ni miktarı ~ 2.2 ng'dir, bu da tespit edilen 58Fe seviyesinden yaklaşık 10 kat daha düşüktür. Embriyoda, Ni konsantrasyonları 0.01 ± 0.01 μg / g ıslak ağırlıkta33'te daha da düşüktür. Ortalama E18.5 fare embriyosu 1 g ağırlığındadır; Böylece, normal bir fare embriyosundaki toplam Ni miktarı yaklaşık 10 ng'dir. Tüm embriyo Ni'nin embriyo karaciğerinde bulunduğunu varsayarsak, bu seviyeler hala 58Fe konsantrasyonundan 10 kat daha düşüktür ve toplam embriyo karaciğer demir içeriğinden yaklaşık 1.000 kat daha düşüktür. Bu fare dokularındaki düşük Ni bolluğu göz önüne alındığında, bu çalışmada 58Ni girişimi hesaba katılmamıştır.

Ek bir husus, tahlilin tespit sınırıdır. Bu çalışmada saptanma sınırı 250 pg/mL 58Fe idi. Bununla birlikte, bu sınır, doku işleme adımında (protokol adımı 4.1.2 ve Şekil 1D) veya ICP-MS çekirdek tesisindeki modifikasyonlar yoluyla dokuların seyreltilmesi azaltılırsa, 58Fe'lik daha düşük konsantrasyonları tespit etmek için değiştirilebilir. Tüm embriyoda 58 Fe ölçüldüğünde, 58Fe konsantrasyonu tespit sınırının altında olduğu için seviyeleri tespit edilmedi. Bununla birlikte, birincil demir depolama organı olan embriyo karaciğerinde 58Fe tespit edildi. Daha büyük bir doz olan58 Fe'nin uygulanmasının, tüm embriyoda bile 58Fe'nin saptanmasına izin vermesi mümkündür. Bununla birlikte, plasentanın demir yüklenmesini önlemek için nispeten az miktarda 58Fe kullanıldı, bu da geri besleme mekanizmalarını tetikleyebilir ve demir taşıyıcılarının ekspresyonunu değiştirebilir. Vahşi tip C57BL/6 farelerin kullanıldığı bu modelde, embriyo karaciğer demir konsantrasyonu tüm embriyo demir konsantrasyonu ile orantılı olduğu için embriyo karaciğer demiri toplam plasental demir transportunun bir yansıması olarak ölçülmüştür4. Bununla birlikte, demir dağılımının34 değiştiği fare modellerinde, embriyo karaciğer demiri tek başına toplam plasental demir taşınımını doğru bir şekilde temsil etmeyebilir. Bu gibi durumlarda, tüm embriyoya veya eritrosit bölmesine dahil edilen demiri ölçmek gerekebilir. Ek olarak, deneysel zaman noktalarındaki değişiklikler de çeşitli fetal kompartmanlarda demirin daha fazla optimizasyonunu ve ölçümünü gerektirecektir. Bu kararlı izotop izleme yaklaşımı, fare hamileliği sırasında demir taşınımını ölçmek için kullanıldı. Metodoloji, hamile olmayan farelerde ve diğer hayvan modellerinde demir taşınımını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

EN, Intrinsic LifeSciences ve Silarus Pharma'nın bilimsel kurucu ortağı ve Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics ve Disc Medicine için bir danışmandır. VS çakışma olmadığını bildirir.

Acknowledgments

Yazarlar, UCLA'daki CNSI'daki UC Nanoteknolojinin Çevresel Etkileri Merkezi'ndeki ICP-MS tesisinin kullanımını, 58Fe ölçümleri için protokolü optimize etmedeki yardımları için kabul etmektedir. Çalışma, NIH Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK) (K01DK127004, VS'ye) ve NIH Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü (NICHD) (R01HD096863, EN'ye) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Tags

Biyoloji Sayı 183
Radyoaktif Olmayan Demir İzotopları Kullanarak Fare Plasentası <em>In Vivo</em> Boyunca Demir Taşımacılığının Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter